CN104188962A - 厚朴酚与唑类药物在制备抗真菌联合用药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了厚朴酚与唑类药物在制备抗真菌联合用药物中的应用。本发明表明唑类药物氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、伏立康唑与厚朴酚联合应用时，可以产生协同的抗真菌的作用，利用厚朴酚作为外排泵Cdr1p作用底物，与唑类药物竞争外排体系，从而减少外排药物浓度，提升药物疗效；此外，厚朴酚能作用于麦角甾醇合成通路，与唑类药物组合成双刃剑，双重抑制麦角甾醇的合成。

Description

厚朴酚与唑类药物在制备抗真菌联合用药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及厚朴酚与唑类药物如氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、伏立康唑在制备抗真菌联合用药物中的应用。 

背景技术

近年来，由于抗生素与免疫抑制剂的广泛使用，器官移植和骨髓移植、肿瘤化疗、艾滋病和糖尿病等发病率的不断上升，真菌感染尤其是机会性真菌感染的发病率和病死率急剧上升[C.E.Linares,S.R.Giacomelli,D.Altenhofen,S.H.Alves,V.M.Morsch,M.R.Schetinger,Fluconazole and amphotericin-B resistance are associated with increased catalase and superoxide dismutase activity in Candida albicans and Candida dubliniensis,Rev Soc Bras Med Trop 46(2013)752-758]。真菌感染性疾病，包括浅表真菌感染和深部真菌感染。浅表真菌感染在我国属于常见病、多发病。以往深部真菌感染比较少见，而近年来由于免疫缺陷病人的增多，其发病率呈逐年增加的趋势。据统计，近20年来，深部真菌感染率上升了约40倍[寥万清,吴绍熙.真菌病研究进展.第二军医大学出版社,1998,6:11-15]。并且在美国医院内菌血症/败血症病例中，真菌占血培养常见致病菌的第四位，其中念珠菌属是真菌感染中最为常见的致病菌。真菌感染已成为严重影响人类生活质量、威胁生命健康的重要疾病之一[Pfaller MA,Jones RN,Messer SA et al.National surveillance of nosocomial blood stream infection due to Candida albicans:frequency of occurrence and antifungal susceptibility in the SCOPE Program[J].Diagn Microbiol Infect Dis,1998；31(1):327-332]。唑类药物由于它们的生物利用度高，毒副作用小，在临床上广泛使用。随着唑类药物在临床上的广泛使用，唑类药物的耐药现象时有发生，而耐药菌株的出现迫使病人选择毒副作用更大的药物或者迫使病人放弃治疗。 

白色念珠菌是念珠菌属最常见的致病菌之一，其对唑类药物的耐药机制主要表现为：①靶酶基因ERG11发生突变而产生耐药；靶酶基因过度表达导致耐药。②多种外排泵基因(如CDR1，CDR2和MDR1)的过度表达与耐药相关。而其中，白色念珠菌细胞膜上主动外排泵的高表达是其耐药的主要原因之一。由于外排泵的高表达，导致菌体内药物积聚减少，从而不能达到有效杀菌浓度，使治疗失败。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明采用以下技术方案： 

本发明提供了厚朴酚(magnolol)与唑类药物在制备抗真菌联合用药物中的应用。 

其中，厚朴酚的结构式如下： 

其中，所述唑类药物选自氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、伏立康唑中的一种或几种。 

其中，所述真菌为白色念珠菌。 

本发明运用了标准微量稀释法测定药物敏感性，运用棋盘式微量稀释法评价厚朴酚与氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、伏立康唑联合应用抗白色念珠菌的体外关系，评价结果表明显示：厚朴酚与氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、伏立康唑联合应用抗白色念珠菌有协同作用关系。然后用琼脂扩散法和时间-杀菌曲线方法再次证实协同作用。 

协同作用机制在于：厚朴酚作为ABC药物外排泵Cdr1p作用底物，与唑类药物竞争外排，导致真菌细胞内唑类药物浓度升高；再者厚朴酚能显著提高麦角甾醇合成通路中相关基因尤其是ERG3,显著减少麦角甾醇的含量，与唑类药物作用于同一条麦角甾醇生物合成通路上，但是作用靶点不一样，对白色念珠菌起到双重抑制麦角甾醇合成的作用。 

本发明还提供了一种药物组合物，包括厚朴酚和唑类药物。 

其中，所述唑类药物选自氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、伏立康唑中的一种或几种。 

有益效果：本发明提供了唑类药物与厚朴酚在制备抗白色念珠菌(包括耐药真菌)联合用药物中的应用，利用厚朴酚作为外排泵Cdr1p作用底物，与唑类药物竞争外排体系，从而减少外排药物浓度，提升药物疗效；此外，厚朴酚能作用于麦角甾醇合成通路，与氟康唑组合成双刃剑，双重抑制麦角甾醇的合成。 

具体而言，本发明相对于现有技术，具有以下突出的优点与效果： 

(1)本发明表明，唑类药物包括氟康唑、酮康唑、伏立康唑、咪康唑或者伊曲康 唑与厚朴酚联合应用时，可以产生协同的抗白色念珠菌(包括耐药真菌)的作用。对唑类耐药菌株CA10(氟康唑的MIC>256μg/mL)，联合用药物可以使氟康唑最低抑菌浓度降低至1μg/mL；伏立康唑和伊曲康唑的MIC值从64μg/mL降低到8μg/mL；酮康唑和咪康唑的MIC值从16μg/mL降低到1μg/mL，从而逆转耐药。 

(2)本发明表明，厚朴酚可能作为细胞膜ABC-外排泵Cdr1p作用底物，与唑类药物竞争外排，从而增加细胞内唑类药物的浓度，并且作用于麦角甾醇生物合成通路中ERG3基因，而唑类药物作用于ERG11基因，两者对麦角甾醇合成起到双重抑制作用，是联合抗真菌作用的协同机制，为新药开发及老药新用提供可能的研究方向。 

(3)在中药中厚朴主要功能有燥湿消痰，下气除满，用于湿滞伤中、脘痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳。厚朴酚是厚朴的主要活性成分之一，它自身具有，抗炎，抗菌，抗病原微生物，抗溃疡，抗氧化，抗肿瘤，可抑制血小板聚集等药理作用。在抗真菌方面，它与唑类联合应用时对耐药真菌同样有效，并且可以降低各自的用药剂量，从而降低药物不良反应，扩大药物的适用范围，放缓耐药性的发生。 

附图说明

图1为厚朴酚(magnolol)与氟康唑(FLC)抗耐药白色念珠菌的协同作用。A,棋盘式微量稀释法测定厚朴酚与氟康唑的体外关系；通过酶标仪测定吸收值并计算百分比生长率后用Matlab 7软件处理数据；灰色标尺代表不同的生长百分率。B,氟康唑与厚朴酚联合用药物的杀菌效果。氟康唑1μg/mL，厚朴酚4μg/mL；所用菌株为CA10。C,琼脂扩散法测定联用效果。白色念珠菌CA10(1-5×10⁶cells/mL)涂布Mueller Hinton agar(MHA)平板，35℃培养24h后观察并拍照；厚朴酚所用浓度为8μg/mL。Control为对照组。图2为厚朴酚减少罗丹明123的外排。A,厚朴酚用药组对白色念珠菌SC5314和CA10中葡萄糖诱导的罗丹明123外的影响。B，荧光显微镜观察厚朴酚对罗丹明123外排的影响；葡萄糖诱导罗丹明123外排30分钟后，样本用显微镜观察，左边是SC5314，右边是CA10。 

图3为外排泵基因在厚朴酚和氟康唑耐受性中起到重要作用。A，厚朴酚及氟康唑对外排泵基因缺失菌株的敏感性分析；YEM30为YEM27的亲本菌株。B，厚朴酚及氟康唑对外排泵基因缺失菌株的敏感性分析；CAI4，亲本菌株，DSY448，CDR1缺失菌株；DSY659，CDR1和CDR2缺失菌株；DSY1050，CDR1，CDR2和MDR1缺失菌株；DSY465，CDR2 缺失菌株；DSY653,MDR1缺失菌株。C，厚朴酚及氟康唑对外排泵高表达菌株的敏感性分析；YEM12是YEM13的亲本菌株，YEM13是高表达MDR1基因菌株，YEM14是YEM15的亲本菌株，YEM15是高表达CDR1和CDR2外排泵的菌株。 

图4为厚朴酚及氟康唑联合用药物对外排泵高表达菌株的效果。A，棋盘式微量稀释法测定后每孔5微升点YPD板培养24小时后观察杀菌效果。B，琼脂扩散法测定厚朴酚和氟康唑联合应用效果。厚朴酚浓度与氟康唑剂量与图1C一致。 

图5为厚朴酚对外排泵基因及麦角甾醇生物合成途径相关基因表达的影响。A，定量PCR测定厚朴酚对外排泵基因及麦角甾醇生物合成途径相关基因表达的影响；厚朴酚所用浓度为8μg/mL。B，荧光显微镜观察厚朴酚对GFP-CDR1菌株的影响。C，流式细胞仪测定GFP-CDR1荧光强度变化。 

图6为厚朴酚减少麦角甾醇的含量。A，紫外吸收光谱测定麦角甾醇含量。B，麦角甾醇含量计算。厚朴酚所用浓度为8μg/mL。 

图7为罗丹明123的标准曲线。 

具体实施方式

下面结合附图对本发明做出进一步说明。 

实施例1体外协同实验 

抗真菌药物的体外敏感性实验及棋盘式微量稀释法参照文献Clinical and Laboratory Standards Institute.M27-A3,Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts:approved standard,3rd ed.,2008.Wayne,PA。具体操作如下： 

(1)菌液制备及敏感性分析 

-70℃保存的白色念珠菌菌株解冻后，接种到YPD固体培养基上，37℃培养24h。取发育良好的单一菌落再次接种到YPD上，35℃培养24h，以获得纯培养。选择直径大于1mm的菌落5个，将其用0.85％灭菌生理盐水制成细菌悬液。将菌悬液在振荡器上振荡15秒钟，用血细胞计数板计数菌数，调整菌悬液浓度为1～5×10⁶cfu/ml。将其用RPMI-1640培养液稀释菌液1000倍，作为接种的菌悬液，以保证接种后每孔菌液的终浓度为0.5～2.5×10³cfu/ml。将96孔板置37℃恒温培养箱中48小时后，当生长对照良好且质控菌株的MIC值在CLSI M27-A2方案给定范围之内时，用酶标仪测定600nm处的光密度(OD)。生长率＝各孔的OD值/生长对照OD，以真菌生长80％以上受抑制为标准判断各株菌的最小抑菌浓度。 

(2)棋盘式微量稀释法(Checkerboard microdilution assay) 

根据CLSI M27-A3方案的棋盘式微量稀释法，确定了各个药物的最低抑制浓度。根据其最低抑制浓度来确定此实验中所用到的药物浓度范围，并用RPMI-1640液体培养基稀释药物使其成为4倍工作浓度。按浓度从高到底的顺序吸收唑类药物50μl，分别加入96孔板的第12-2列，第1列中加入50μl的液体培养基；按浓度从高到低的顺序吸取厚朴酚药液50μl，分别加入96孔板的第A-G行，H行中相应加入50μl液体培养基。然后将调好浓度的菌悬液0.5～2.5×10³cfu/ml 100μl加入各孔中。H1是不含药物的生长对照。这样就产生了两种药物联合用药物不同浓度的77种组合。将96孔板置于37℃恒温培养箱中培养48小时后用酶标仪600nm处测定并记录结果。所有实验重复三次。对于联合用药物的杀菌效果评价，把96-孔板中每个样本通过平板点滴的方法取5微升点滴到YPD平板上，然后在37℃恒温培养箱中培养48小时后拍照分析它们的杀菌效果。 

(3)评价与判定方法 

LA模型的非参数法采用分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)，公式为∑FIC＝FIC_A+FIC_B＝(MIC A联用/MIC A单用)+(MIC B联用/MIC B单用)。 

决定FIC指数：计算数据表中所有的FIC值，当数据表中所有的FIC值都小于4时，此时FIC最小的那个值就是FIC值；否则，FIC值最大值为FIC。FIC≤0.5，表现为协同作用；FIC>4则为拮抗；处于两者之间则为不相关。FIC指数越小表示两药协同作用越强[Odds FC.2003.Synergy,antagonism,and what the chequerboard puts between them.J Antimicrob Chemother.52:1]。 

(4)敏感性分析及棋盘式微量稀释法的结果(见表1) 

敏感性分析结果，见表1，显示：厚朴酚对8株临床分离的白色念珠菌的MIC值范围在16-32μg/mL之间，对唑类敏感菌与唑类耐药菌有一定差异，耐药菌株MICs值是32μg/mL，而敏感菌株在16μg/mL。 

棋盘式微量稀释法结果，见表1，显示：对耐药菌株CA10、CA137，联合用药物能显著降低药物的MIC，如对于CA10菌株，联用之后，氟康唑的MIC值从256μg/mL降低到1μg/mL，能降低200多倍以上。此外见表2，厚朴酚除了与氟康唑有协同作用外，与其他唑类药物同样具有协同作用，如伏立康唑和伊曲康唑的MIC值从64μg/mL降低到8μg/mL；酮康唑和咪康唑的MIC值从16μg/mL降低到1μg/mL。它们的体外作用关 系是对耐药菌株CA10的作用是协同的关系。 

表1棋盘式微量稀释法测定厚朴酚及氟康唑抗临床分离的白色念珠菌 

^aMIC,最低抑菌浓度。 

^bFICI,分级抑菌指数。 

^cSYN,协同。协同定义：如果FICI≤0.5，则是协同,FICI of>4.0,则是拮抗；FICI>0.5且<4则是不相关。 

表2.厚朴酚与其它唑类药物抗白色念珠菌作用的体外关系¹

¹用棋盘式微量稀释法评估FIC，分级抑菌浓度；FICI，分级抑菌浓度指数。协同定义：如果FICI≤0.5，则是协同；FICI of>4.0，则是拮抗；FICI>0.5且<4则是不相关。 

(5)琼脂扩散法(Agar diffusion assay)：挑取临床耐药菌株CA10单克隆接种于10mlYPD液体培养基中，37℃，200rpm震荡过夜培养，然后取该菌液再次活化。取1ml菌液，离 心，用生理盐水重悬，并用血球计数板计数，用生理盐水稀释并调整菌液浓度至5×10⁶CFU/ml。取100μl菌液涂布预先准备好的MHA固体培养皿中，在其表面放上含有不同剂量药物的无菌滤纸片(直径6mm)，空白对照含相应的等量溶剂。将琼脂培养皿于37℃培养箱中培养48小时后观察抑菌圈状态。 

琼脂扩散法实验结果： 

图1中C图显示了运用琼脂扩散的方法进行验证的实验结果。对于耐药菌CA10，氟康唑1，2，4μg没有明显的抑菌圈，但是联合用药物能明显地增加抑菌圈大小，并且抑菌圈内无菌生长。 

(6)时间-杀菌测定(Time-killing test) 

将临床耐药白念珠菌CA10在YPD培养液中活化两次，37℃，200rpm振荡培养，使真菌处于指数生长期后期。取该菌液至1ml，离心并用生理盐水重悬，血细胞计数并调至菌密度为108cfu/ml。此菌液用RPMI-1640稀释至10⁴cfu/ml，并分成4份，每份20ml，分别加入相应的药物至终浓度：厚朴酚浓度为4μg/mL,氟康唑为1μg/mL；空白对照加入相同体积的DMSO，所有菌液中DMSO含量均低于1％。然后于37℃培养，分别于0、12、24、48和72小时后测定。 

测定方法：活菌计数法：从各管菌液中取100μl液体，再以0.9％生理盐水10倍系列稀释之，从不同稀释倍数的菌液中各取50μl均匀涂铺于YPD固体培养基表面。平皿于37℃真菌培养箱中培养48小时后计数菌落数目，以YPD平皿上生长菌落数达20个为最低限。计算活菌落数目(CFU)，以Log10CFU/ml对时间作图。评价二者的相关性。 

联合用药物的效果评价方法：与单用抗真菌药物活性最强者相比，两药合用后菌浓度下降值≥2Log10CFU/ml时确认两药具有协同作用；与单用抗真菌药物活性最强者相比，两药合用后菌浓度下降值≤2Log10CFU/ml时确认两药具有无关作用[Haynes MP,Buckley HR,Higgins ML,Pieringer RA.1994.Synergism between the Antifungal Agents Amphotericin B and Alkyl Glycerol Ethers.Antimicrob Agents Chemother.38:1523–1529]。 

时间杀菌实验结果： 

图1中B图显示了运用时间-杀菌的方法进行验证的实验结果。72小时后，对照组白色念珠菌CA10细胞数8.36LogCFU/mL，厚朴酚单用组CA10细胞数为8.16LogCFU/mL，氟康唑单用处理CA10细胞数7.56LogCFU/mL,而厚朴酚-氟康唑联合用药物处理后CA10细胞数为5.16LogCFU/mL。与单用氟康唑药相比，氟康唑与厚朴酚联合 应用后LogCFU/mL菌数下降2.4LogCFU/mL；与单用厚朴酚相比，联合用药物后LogCFU/mL菌数下降3.0LogCFU/mL,都小于2LogCFU/mL，验证联合用药物有协同的效果。 

实施例2协同机制方面研究 

荧光酶标仪测定细胞外液中罗丹明123的吸光值 

菌株培养：挑取单克隆菌株接种于RPMI-1640培养液中，35℃培养24小时，3000rpm离心10分钟收集细胞，并将细胞转种于100ml新鲜的RPMI-1640培养液中，35℃振荡培养4小时，用血细胞计数板计数细菌个数，调整菌悬液浓度为10⁷cfu/ml，取100ml菌悬液，3000rpm离心10分钟收集真菌细胞，PBS洗两次。 

标本中若丹明123浓度的确定 

外排过程收集的上清液样品，均用荧光酶标仪测定荧光值(激发波长488nm,发射波长525nm)。根据标准曲线确定标本中罗丹明123的浓度。 

离心收集细胞后，用PBS缓冲液冲悬，加入罗丹明123溶液(终浓度是10μM)黑暗中染色装载荧光30min，离心用PBS洗涤3次后分组，药物处理组加入厚朴酚，使其终浓度为8μg/ml。用2％葡萄糖刺激外排，每隔5min，取1ml标本12000g离心取上清测定荧光值，同时离心后样本用荧光显微镜观察拍照。 

罗丹明123的标准曲线见图7，R²＝0.9972,罗丹明123的浓度范围0.78-100nmol/mL. 

结果显示厚朴酚能显著降低细胞外液中罗丹明123浓度，作为外排泵的底物，罗丹 明123在能量依赖下能被主动外排泵排出细胞，故结果提示厚朴酚可能作为主要外排系统中的底物，与罗丹明123竞争外排，从而提高细胞内的罗丹明123浓度(图2A和B)。 

厚朴酚对外排泵缺失或过表达菌株的敏感性分析 

实施方法见敏感性分析，培养48小时后，每孔取5微升点YPD平板，35度培养24-48小时后拍照。 

结果显示YEM27菌株(YEM27,Δcdr1/Δcdr2/Δmdr1/Δflu1)比YEM30(YEM27的亲本菌株)对氟康唑和厚朴酚的敏感性高(图3A)，厚朴酚对YEM27的MIC为8μg/mL，YEM30的MIC为32μg/mL；氟康唑对YEM27的MIC为0.125μg/mL，YEM30的MIC为2μg/mL(表3)。外排泵的缺失对厚朴酚及氟康唑的敏感性有一定的影响。相比亲本菌株CAI4，厚朴酚对DSY448,Δcdr1，DSY659,Δcdr1/Δcdr2,DSY1050,Δcdr1/Δcdr2/Δmdr1的敏感性要强，对这三个菌株MIC为8μg/mL，对CAI4的MIC为16μg/mL。对DSY465,Δmdr1和DSY653,Δcdr2菌株的敏感性与亲本菌株CAI4没有明显区别，MIC都为16μg/mL。而氟康唑对DSY448,Δcdr1，DSY659,Δcdr1/Δcdr2,DSY1050,Δcdr1/Δcdr2/Δmdr1的敏感性比亲本菌株强，MIC为0.125μg/mL,而对DSY653,Δcdr2菌株的敏感性比亲本菌株稍强，MIC为0.25μg/mL，而DSY465,Δmdr1与亲本菌株敏感性没有差异(图3B，表3)。综上实验结果可以看出，厚朴酚对Δcdr1缺失菌株的敏感性强于其余外排泵缺失基因菌株。推测厚朴酚可能是外排泵Cdr1p的底物，与氟康唑竞争外排。 

对于外排泵MDR1高表达菌株YEM13，与亲本菌株YEM12相比，厚朴酚的敏感性没有差异MIC为16μg/mL,而氟康唑的敏感性差别很大(图3C，表3)，对亲本菌株YEM12，氟康唑的MIC为2μg/mL，而高表达MDR1后，MIC提高到64μg/mL。说明MDR1的高表达对厚朴酚没有影响，暗示厚朴酚不是MDR1的底物。此外，对CDR1和CDR2高表达的菌株，氟康唑和厚朴酚的敏感性相似(图3D，表3)，MIC都为64μg/mL。 

表3.厚朴酚和氟康唑抗外排泵缺失或过表达菌株的MIC 

此外，通过棋盘式微量稀释法和琼脂扩散法测定厚朴酚和氟康唑的联合用药物对外排泵基因高表达的菌株是否有协同作用。图4A显示通过棋盘式微量稀释法测定并平板点滴的方法可见，厚朴酚与氟康唑的联合用药物对外排泵CDR1和CDR2高表达的菌株没有效果，而对野生型菌株SC5314及外排泵基因MDR1高表达的菌株有明显的协同作用。此数据进一步显示，厚朴酚并非是异化扩散家族基因MDR1外排泵的作用底物。图4B用琼脂扩散的方法再次验证了微量稀释法实验的结果。 

实施例3分子机制研究 

(1)荧光定量PCR的方法测定麦角甾醇生物合成途径中相关基因的表达(ERG3，ERG5，ERG1，ERG25，ERG6，ERG11)及其真菌细胞膜外排泵相关基因(MDR1，CDR1，CDR2)样品处理 

挑取耐药菌株CA10单克隆接种于30ml YPD培养液中，37℃培养过夜，3000g离心5min，用新鲜的YPD重悬调整菌密度1.0×10⁶cfu/ml分别药物组和对照组。37℃震荡培养12小时，4℃离心。 

TES配制 

10mM Tris.Cl pH 7.5；10mM EDTA；0.5％(W/V)SDS用无RNA酶污染的水配制，室温贮存。 

热性酚法提取RNA 

菌体沉淀用1ml冰冷的PBS重悬，转移到1.5ml蛋白酶K处理过的Eppendorf管中，3000g，离心10min。弃掉上情，菌体沉淀用400μlTES溶液混悬均匀，再加入400μl酸 性酚，用涡旋振荡器激烈振荡10s。转移至65℃水浴中，孵育30-60min,每隔5min，用涡旋振荡器激烈振荡10s。取出，冰浴5min，4℃于10000g离心5min。将上层水相转移到1.5ml蛋白酶K处理过的Eppendorf管中，加入氯仿沉淀蛋白。激烈振荡，4℃于10000g离心5min。将上层转移1.5ml蛋白酶K处理过的Eppendorf管中加入2/3体积的异丙醇中，4℃静置2h。4℃10000g离心8min。弃上清，沉淀用冰冷的70％乙醇混悬，快速振荡洗涤RNA沉淀。4℃10000g离心8min，尽可能彻底地吸走上清，室温干燥，沉淀用15μl无RNA酶污染的水溶解。样品分别在260nm和280nm测定吸收值，确定RNA的纯度，并计算RNA的质量，RNA于-80℃保存。在整个RNA提取过程严格防止RNA酶的污染。 

逆转录反应合成cDNA 

按逆转录试剂盒说明书进行逆转录，将总RNA逆转录成cDNA。步骤： 

1)取抽提的真菌总RNA 2μg，加入Oligo(dT)1μl，加无RNA酶去离子水定容至12μl。混匀后离心3～5sec。 

2)70℃变性5min，冰上冷却30sec，离心3～5sec。 

3)将反应混合物冰浴，再加入如下组分：5×buffer 4μl，RNA酶抑制剂(20U/μl)1μl，dNTPs(10mmol/L)2μl，混匀后离心3～5sec。 

4)37℃水浴5分钟后，加入逆转录酶(20U/μl)1μl，总体积为20μl。 

5)反应混和物37℃反应60min，在70℃灭活10min，冰上骤冷，－20℃保存备用。荧光定量PCR 

以cDNA为模板，以18S rRNA基因为内参照进行PCR扩增。所用引物序列如下表3。 

表3qPCR特异性引物 

反应体系： 

扩增条件：95℃预变性5min； 

95℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸45s，共35个循环。 

72℃再延伸5min。 

阴性对照：不加cDNA模板进行PCR扩增。 

结果显示：厚朴酚能显著上调外排泵基因CDR1，CDR2，MDR1，麦角甾醇合成相关通路中ERG1，ERG3，ERG5，ERG6，ERG11，和ERG25，尤其是CDR1和ERG3上调的倍数分别是2.73和3.76倍(图5A和B)。氟康唑处理白色念珠菌后同样引起这两组基因的全面上调。 

CaSA1菌株是CDR1的荧光报告基因，我们通过药物处理此菌株后观察GFP荧光的强度来判断药物是否影响CDR1的表达。荧光显微镜观察和流式细胞仪分析结果显示厚朴酚显著地增加了GFP荧光的表达，并且随浓度增加荧光强度增加(图5C)。 

(2)麦角甾醇的测定方法及结果： 

麦角甾醇的测定方法参照文献[Prasad T,Chandra A,Mukhopadhyay CK,Prasad R.2006.Unexpected link between iron and drug resistance of Candida spp.:iron depletion enhances membrane fluidity and drug diffusion,leading to drug-sensitive cells.Antimicrob Agents Chemother.50:3597–3606.]的基础上稍有改进，具体方法如下： 

挑取耐药菌株SC5314单克隆菌株接种于30ml YPD培养液中，37℃培养过夜，3000g离心5min，用新鲜的YPD重悬调整菌密度1.0×10⁶cfu/ml分别药物组和对照组。37℃震荡培养12小时，收集细胞称湿菌重量后提取甾醇。加2.5ml的PBS和新鲜配制的皂化剂(含15％氢氧化钠的90％乙醇溶液)6ml，混匀，80℃水浴皂化60min。加石油醚(沸程30-60℃)6ml提取2次，合并提取液，加蒸馏水6ml洗涤1次，醚层于氮气下挥干，得未皂化脂，加环己烷溶解使溶液体积为1ml/g湿菌，-20℃保存。 

紫外测定：在波长240nm-300nm处有四个特征峰。麦角甾醇和24(28)-去氢麦角甾醇(dehydroergosterol,DHE)在281.5nm处都有吸收峰，但是在230nm处只有24(28)-DHE有吸收峰。麦角甾醇的百分比含量可以通过总的24(28)-DHE和麦角甾醇(通过计算281.5nm处的吸收)减去230nm处的24(28)-DHE吸收。即通过等式： 

$\%\mathrm{ergosterol}=\frac{100}{1+\frac{A230}{A281.5}\&times;0.56}$

结果显示：对于厚朴酚单独处理白色念珠菌SC5314能显著减少麦角甾醇96％的含量，提示厚朴酚可能作用于麦角甾醇生物合成通路(图6)。 

Claims (5)

1.厚朴酚与唑类药物在制备抗真菌联合用药物中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述唑类药物选自氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、伏立康唑中的一种或几种。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于：所述真菌为白色念珠菌。

4.一种药物组合物，其特征在于：包括厚朴酚和唑类药物。

5.根据权利要求4所述的一种药物组合物，其特征在于：所述唑类药物选自氟康唑、酮康唑、伊曲康唑、咪康唑、伏立康唑中的一种或几种。