CN108796029A - 一种人食管癌ec9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用 - Google Patents

一种人食管癌ec9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用，以人食管癌EC9706细胞系为亲本细胞，采用紫杉醇模拟体内化疗过程，逐步提高药物浓度、间歇性反复冲击筛选出耐紫杉醇细胞株，测定该细胞株对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5‑FU等食管癌常用化疗药物的耐药指数，选出敏感药物5‑FU及顺铂进一步联合诱导建立获得性人食管癌多药耐药细胞系EC9706/PDFC，测定该细胞株的干细胞标志表达明显增高及转移迁移特性增强。本发明采用“筛选多种敏感化疗药物提高浓度间歇冲击+持续诱导”的诱导方法，可用于研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制，筛选具有可靠性的耐药逆转剂及耐药肿瘤细胞的治疗靶点。

Description

一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其 应用
技术领域
本发明涉及耐药细胞株领域，特别是指一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用。
背景技术
食管癌是最常见的致命性恶性肿瘤之一，在我国的发病及死亡例数占世界一半以上。食管癌早期诊断困难，发现时常进展到中晚期。手术、化疗、放疗是治疗癌症的标准流程。手术后进行化疗可以有效地杀伤残余的肿瘤细胞，但是肿瘤细胞会对化疗药物产生多药耐药性，耐药细胞具有更强的转移性，肿瘤的远处转移是肿瘤治疗失败，造成肿瘤病人死亡的主要原因。因此克服、防止或逆转肿瘤细胞的多药耐药性对于提高化疗效果十分重要。而建立肿瘤多药耐药细胞株对于研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制，筛选可性的耐药逆转剂及寻找耐药肿瘤细胞的治疗靶点具有重要的应用价值。
食管癌的化疗是治疗过程中的一个重要手段，食管癌的化疗药物治疗目前还停留在细胞毒药物化疗上，包括紫杉醇(PTX)、顺铂(CDDP)、5-氟尿嘧啶等。紫杉醇是新型抗微管药物，通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。顺铂属细胞周期非特异性药物，可抑制癌细胞的DNA复制过程，并损伤其细胞膜上结构，有较强的广谱抗癌作用。5-FU通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成，对RNA的合成也有一定抑制作用。阿霉素属周期非特异性药物，可抑制RNA和DNA的合成，对RNA的抑制作用最强，抗瘤谱较广，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。
目前实验室所获得耐药细胞多为一种化疗药物筛选而来，而临床上肿瘤患者化疗时常常为多种化疗药物联合应用，或者一种化疗方案产生耐药时更换化疗方案再进行新一轮的化疗，肿瘤细胞经历了多种化疗药物，长时间的作用后，细胞生物学特征与经历一种化疗药物作用的肿瘤细胞相比发生了很大的改变，实验室尚未见和临床化疗经过相似的耐药细胞系。
发明内容
本发明提出人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法及其应用，解决体外筛选抗肿瘤药尚未有耐紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU的细胞株的技术问题。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供了一种人食管癌多药耐药细胞株的构建方法如下：
(1).将人食管癌细胞EC9706加入含10％血清的1640培养液进行培养，用0.25％的胰蛋白酶消化传代；
(2).当细胞生长至密度达到80％时，更换新鲜的培养液，并在细胞培养液中加入紫杉醇，使得紫杉醇的作用浓度为2.5μg/ml，继续培养24小时，大部分细胞会死亡，弃去含紫杉醇的细胞培养液，换用新鲜的培养基；
(3).待耐药细胞增殖后传代，将获得的细胞依次按照步骤(1)和步骤(2)的方法，重复培养3次，得到在紫杉醇作用浓度为2.5μg/ml时，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(4).将步骤(2)中紫杉醇的作用浓度逐步增至5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml，再将步骤(3)得到的细胞依次按照步骤(1)和步骤(2)的方法，重复3次，得到在紫杉醇作用浓度为5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(5).将步骤(4)得到的细胞用MTT法测定其对紫杉醇、阿霉素、顺铂、5-FU及长春新碱的耐药性，发现该细胞对紫杉醇和阿霉素产生中高度耐药性，对5-FU仍保持高度敏感性；
(6).在培养基中持续加入5μg/ml的紫杉醇，在细胞培养液中加入5-FU，使得5-FU的作用浓度为5μg/ml，继续培养24小时，大部分细胞会死亡，换用新鲜的培养基继续培养；
(7).待耐药细胞增殖后传代，将获得的细胞依次按照步骤(6)的方法，重复培养3次，得到在5-FU作用浓度为5μg/ml时，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(8).将步骤(6)中5-FU作用浓度逐步增至10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml，再将步骤(7)得到的细胞依次按照步骤(6)的方法，重复3次，得到在紫杉醇作用浓度为10μg/ml，5-FU作用浓度为10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml时能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(9).将步骤(8)得到的细胞用MTT法测定其对紫杉醇、阿霉素、顺铂、5-FU及长春新碱的耐药性；该细胞对紫杉醇、阿霉素及5-FU产生中高度耐药性，对顺铂和长春新碱产生低度耐药性；
(10).在培养基中持续加入5μg/ml的紫杉醇和15μg/ml的5-FU，并在细胞培养液中加入顺铂，使得顺铂的作用浓度为1μg/ml，继续培养24小时，大部分细胞会死亡，换用新鲜的培养基继续培养；
(11).待耐药细胞增殖后传代，将获得的细胞依次按照步骤(10)的方法，重复培养3次，得到在顺铂作用浓度为1μg/ml时，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(12).将步骤(10)中顺铂的作用浓度逐步增至2μg/ml、3μg/ml及4μg/ml，再将步骤(11)得到的细胞依次按照步骤(10)的方法，重复3次，得到在紫杉醇和5-FU维持浓度下，顺铂为4μg/ml作用浓度下，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(13).将步骤(12)得到的细胞用MTT法测定其对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU的耐药性；该细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂产生高度耐药性，对5-FU和长春新碱产生中度耐药性；
(14).将步骤(12)得到的细胞同时加入紫杉醇、顺铂及5-FU，使其作用浓度分别为10μg/ml、4μg/ml及25μg/ml，24h后更换新鲜的不含药物培养基，继续培养，重复(14)步骤3次，撤去药物培养1个月，适时换液，复测对对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU的耐药指数不变，表明该细胞株的耐药性稳定，历时39个月获得人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC。
本发明的有益效果在于：
一、本发明通过细胞形态学观察、MTT法测定耐药指数、细胞周期的测定、荧光定量PCR及Transwell小室实验，评价人食管癌多药耐药细胞株的生物学特性，成功建立EC9706/PDFC耐药株。本发明还提供了人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC在筛选抗肿瘤药物中的应用，以及人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC在制备抗肿瘤药物中的应用。
二、本发明的建立人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的方法更贴近临床肿瘤患者应用化疗药物治疗的过程，虽费时很长，但所获得的耐药细胞对多种化疗药物具有中高度耐药性，更接近于多种化疗药治疗后仍产生耐药的细胞的生物学特性，更具有研究价值；本发明可用于分析人食管癌多药耐药后的形态学及生物学特征的变化；研究肿瘤对多种化疗药耐药后的分子机制；筛选具有可靠性的耐药逆转剂；寻找耐药肿瘤细胞的治疗靶点中的应用，具有较高的科研和生产应用价值。
三、本发明采用“筛选多种敏感化疗药物提高浓度间歇冲击+持续诱导”的诱导方法，接近于临床上化疗的方式，可用于研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制，筛选具有可靠性的耐药逆转剂及耐药肿瘤细胞的治疗靶点。
附图说明
图1为倒置相差显微镜下亲本细胞人食管癌细胞EC9706和本发明的人食管癌多药耐药细胞株活细胞观察图。
图2亲本细胞人食管癌细胞EC9706(A)和本发明的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC(B)的细胞周期分析图。
图3为Transwell小室实验比较亲本细胞人食管癌细胞EC9706和本发明的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的侵袭特性对比图。
图4为荧光定量PCR比较亲本细胞人食管癌细胞EC9706和本发明的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的肿瘤干细胞标志在mRNA水平的表达。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例
本实施例所用的人食管癌EC9706细胞，来自于本实验室保存；
本实施例所用的紫杉醇为市售的Sigma公司的5mg规格的产品，货号SML2017-5MG。顺铂Sigma公司，货号P4394-25MG，5-FU(Sigma公司，货号F6627-1G)，阿霉素(Sigma公司，货号D1515-10MG)，长春新碱(Sigma公司，货号V0400000-1EA)。
(1).将人食管癌细胞EC9706加入含10％血清的1640培养液进行培养，用0.25％的胰蛋白酶消化传代；
(2).当细胞生长至密度达到80％时，更换新鲜的培养液，并在细胞培养液中加入紫杉醇，使得紫杉醇的作用浓度为2.5μg/ml，继续培养24小时，大部分细胞会死亡，弃去含紫杉醇的细胞培养液，换用新鲜的培养基；
(3).待耐药细胞增殖后传代，将获得的细胞依次按照步骤(1)和步骤(2)的方法，重复培养3次，得到在紫杉醇作用浓度为2.5μg/ml时，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(4).将步骤(2)中紫杉醇的作用浓度逐步增至5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml，再将步骤(3)得到的细胞依次按照步骤(1)和步骤(2)的方法，重复3次，得到在紫杉醇作用浓度为5μg/ml、7.5μg/ml、10μg/ml，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(5).将步骤(4)得到的细胞用MTT法测定其对紫杉醇、阿霉素、顺铂、5-FU及长春新碱的耐药性；发现该细胞对紫杉醇和阿霉素产生中高度耐药性，对5-FU仍保持高度敏感性；
(6).在培养基中持续加入5μg/ml的紫杉醇，在细胞培养液中加入5-FU，使得5-FU的作用浓度为5μg/ml，继续培养24小时，大部分细胞会死亡，换用新鲜的培养基继续培养。
(7)待耐药细胞增殖后传代，将获得的细胞依次按照步骤(6)的方法，重复培养3次，得到在5-FU作用浓度为5μg/ml时，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(8).将步骤(6)中5-FU作用浓度逐步增至10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml，再将步骤(7)得到的细胞依次按照步骤(6)的方法，重复3次，得到在紫杉醇作用浓度为10μg/ml，5-FU作用浓度为10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml和25μg/ml时能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(9).将步骤(8)得到的细胞用MTT法测定其对紫杉醇、阿霉素、顺铂、5-FU及长春新碱的耐药性。该细胞对紫杉醇、阿霉素及5-FU产生中高度耐药性，对顺铂和长春新碱产生低度耐药性。
(10).在培养基中持续加入5μg/ml的紫杉醇和15μg/ml的5-FU，并在细胞培养液中加入顺铂，使得顺铂的作用浓度为1μg/ml，继续培养24小时，大部分细胞会死亡，换用新鲜的培养基继续培养。
(11).待耐药细胞增殖后传代，将获得的细胞依次按照步骤(10)的方法，重复培养3次，得到在顺铂作用浓度为1μg/ml时，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(12).将步骤(10)中顺铂的作用浓度逐步增至2μg/ml、3μg/ml及4μg/ml，再将步骤(11)得到的细胞依次按照步骤(10)的方法，重复3次，得到在紫杉醇和5-FU维持浓度下，顺铂为4μg/ml作用浓度下，能稳定生长、传代、复苏的活细胞；
(13).将步骤(12)得到的细胞用MTT法测定其对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU的耐药性。该细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂产生高度耐药性，对5-FU和长春新碱产生中度耐药性。
(14).将步骤(12)得到的细胞同时加入紫杉醇、顺铂及5-FU，使其作用浓度分别为10μg/ml、4μg/ml及25μg/ml，24h后更换新鲜的不含药物培养基，继续培养，重复(14)步骤3次，撤去药物培养1个月，适时换液，复测对对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU的耐药指数不变，表明该细胞株的耐药性稳定，历时39个月获得人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC。
本实施例的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC在培养过程中分别将步骤(4)、(8)、(12)、(14)所得细胞及时冻存于液氮中，以便复苏取用。冻存液由70％的胎牛血清、10％的DMSO和20％的1640组成。
应用效果例1
人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC细胞的形态学观察
使用倒置相差显微镜观察活细胞形态：取对数生长期的EC9706细胞和EC9706/PDFC细胞，在倒置显微镜放大100倍下观察活细胞形态。如图1(A)所示，通过光镜可以观察到EC9706细胞大小基本一致，成铺路石样，部分为圆形。而如图1(B)所示，通过光镜可以观察到EC9706/PDFC细胞大小不一，有梭形与多角形，多有突起，且多角形形态各异。
应用效果例2
人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC耐药指数的测定
将本实施例的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC和亲本细胞人食管癌细胞EC9706培养至对数生长期，用0.25％胰蛋白酶消化并计数，用1640培养液调整细胞浓度至2×104/ml。
各细胞株均设亲本细胞组和耐药细胞组，同时设置仅接种细胞的无药对照孔和仅加培养液的调零孔。在96孔板的每个孔中分别接种0.2ml单细胞悬液，每个孔含细胞4×103/ml，置于培养箱中培养过夜。吸弃每孔中的上清液，PBS洗一次，之后分别加入含紫杉醇、顺铂、5-FU、阿霉素及长春新碱的细胞培养液0.2ml，各种药物的浓度梯度见表1和表2，每一种药物的浓度设3个复孔。表中的化疗药物浓度是经过多次测定确定的稳定浓度范围，每次耐药指数测定3次，该范围可能根据会有小幅度的调整，以利于更准确的测定耐药指数。
表1亲本细胞各种化疗药物的浓度(微克/ml)
表2多药耐药细胞各种化疗药物的浓度(微克/ml)
96孔板放入培养箱培养48h后，每孔加20μl浓度为5mg/ml的MTT液，继续培养4h。弃去上清，每孔加入DMSO 200μl，置于振荡器避光震荡10min，用酶标仪检测490nm波长OD值，每3个复孔取其平均值。用软件GraphPad Primer 5计算药物的半数抑制率IC50，耐药指数RI＝IC50(耐药细胞)/IC50(亲本细胞)。
表3 EC9706和EC9706/PDFC对不同化疗药物的耐药指数RI测定
测定结果显示该细胞对紫杉醇、阿霉素、顺铂产生高度耐药性，对5-FU和长春新碱产生中度耐药性。
应用效果例3
亲本细胞人食管癌细胞EC9706和本发明的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的细胞周期分析
用流式细胞仪分析细胞周期
将本实施例的人食管癌细胞EC9706和本发明的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC培养至对数生长期，用不含EDTA的胰酶消化计数，各取2×106个，用4℃预冷的PBS洗细胞2次，每次800g/min离心5min，加入1ml预冷的70％浓度的乙醇，4℃固定2h。用4℃预冷的PBS洗细胞1次，800g/min离心5min。细胞沉淀中加100μl RNase A溶液，重悬细胞，37℃水浴30min，再加入400μl PI染色液混匀，4℃避光孵育30min。
采用标准程序进行流式细胞仪检测，记录激发波长488nm处红色荧光。本实施例的亲本细胞人食管癌细胞EC9706和本发明的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的细胞周期分析，如图2。两者的细胞周期分布见表4。
表4人食管癌细胞EC9706和人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC细胞周期分布表
结果显示人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的S期细胞为17.56％，人食管癌细胞EC9706的S期细胞为23.29％，差异有统计学意义(t＝22.87，P＝0.000)，人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的G0-G1细胞为66.6，人食管癌EC9706的G0-G1细胞为62.64，差异有统计学意义(t＝15.94，P＝0.000)。人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的G2-M细胞为15.84，人食管癌EC9706的G2-M细胞为14.07，差异有统计学意义(t＝11.82，P＝0.000)。
应用效果例4
亲本细胞人食管癌细胞EC9706和本发明的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的Transwell小室侵袭实验
将Transwell小室内外各加入无血清的1640培养液500μl，在培养箱中水化2小时，人食管癌细胞EC9706和多药耐药细胞株EC9706/PDFC培养至对数增长期，胰酶消化用无血清1640培养基重悬计数，各取1×105个细胞用无血清培养基稀释至500μl。将水化好的小室拿出，弃去培养基，下室加入含20％血清的1640培养液700μl，上室加入含1×105待测细胞的无血清1640培养基500μl。
将小室放入培养箱中继续培养，期间观察穿过小室膜的细胞数，大约培养30h左右取出小室，用PBS清洗3次，加入甲醛固定15分钟，结晶紫染色30分钟，用清水洗3遍以上，后在显微镜下观察细胞，每个细胞取5个视野记数，取平均数。
结果如图3所示，与亲本细胞人食管癌细胞EC9706相比，多药耐药细胞株EC9706/PDFC穿过Transwell小室膜的细胞数明显增多，有统计学意义(t＝8.2，P＝0.001)。
应用效果例5
荧光定量PCR实验比较亲本细胞人食管癌细胞EC9706和本发明的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC的肿瘤干细胞标志在mRNA水平的表达。
将本实施例的人食管癌细胞EC9706和本发明的人食管癌多药耐药细胞株EC9706/PDFC在10cm的培养皿中培养至对数生长期，用无菌的冷PBS洗三次，倒放于滤纸上，吸取残余PBS，各加入Trizol约1.5ml，转动培养皿，使Trizol和细胞充分接触，室温静置5分钟，吸出Trizol和细胞的混合液，加入无RNA酶的EP管中，根据混合液的体积加入氯仿约200μl，上下颠倒混匀，室温静置15min，4℃，12000rpm/min，离心15min。吸取上层水相液体置于新的EP管中，加入异丙醇500μl，混匀后室温静置10min沉淀RNA，4℃，12000rpm/min，离心15min，弃去异丙醇，加入不含RNA酶的75％乙醇1ml，12000rpm/min，离心5min，重复2次，洗去杂质，室温静置5-10分钟，待乙醇完全挥发，加入DEPC水约30μl溶解RNA。用紫外分光光度计测定RNA的含量，立即进行反转录，将RNA反转录成cDNA。
用Invitrogen反转率试剂盒进行转录，取RNA1.5μg，加入无菌的DEPC水至9.5μl，放入PCR仪70℃10min后放于冰上，将4μl的5×buffer、2μl的10×MgCl2、、1μl的Primer、2μl的dNTP mix、1μl的RNA酶inhibitor和0.5μl反转录酶加入EP管混匀，放入PCR仪，25℃10min，42℃1h，95℃3min。
用北京康为试剂公司的荧光定量试剂进行荧光定量PCR反应。反应体系为20μl，每个样品做3个复管，每管加入2μl的10×mix、1μl的上下游primer、1μl的cDNA、无菌水补齐体积为20μl。引物由苏州唯智生物科技有限公司合成。反应条件：95℃预变性10min，95℃变性30s，退火30s，72℃延伸20s，40个循环，72℃终末延伸10min。
表5肿瘤干细胞标志引物序列
结果如图4所示，与亲本细胞人食管癌细胞EC9706相比，多药耐药细胞株EC9706/PDFC的干细胞标志在mRNA水平表达明显升高。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (7)

1.一种人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法，其特征在于：以人食管癌EC9706细胞系为亲本细胞，采用紫杉醇模拟体内化疗过程，逐步提高药物浓度、间歇性反复冲击筛选出耐紫杉醇细胞株，用MTT法测定该细胞株对紫杉醇、阿霉素、长春新碱、顺铂及5-FU食管癌常用化疗药物的耐药指数，选出耐敏感药物5-FU、顺铂的细胞株，通过模拟体内化疗进一步诱导建立人食管癌多药耐药细胞系EC9706/PDFC。
2.如权利要求1所述的人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法，其特征在于，所述采用紫杉醇模拟体内化疗过程，逐步提高药物浓度、间歇性反复冲击筛选出耐紫杉醇细胞株的具体步骤为：
（1） 将人食管癌EC9706细胞加入含有10%血清的1640培养液进行培养，用0.25%的胰蛋白酶消化传代，当细胞生长至密度达到80%时，更换新鲜的培养液，并在细胞培养液中加入紫杉醇，使得紫杉醇的作用浓度为2.5µg/ml，继续培养24小时后，弃去含紫杉醇的细胞培养液，得初级耐紫杉醇人食管癌EC9706细胞；
（2） 将步骤（1）得到的初级耐药人食管癌EC9706细胞重复步骤（1）的培养3次，得紫杉醇的作用浓度为2.5µg/ml时的中级耐紫杉醇人食管癌EC9706细胞；
（3） 将步骤（1）中紫杉醇的作用浓度逐步增至5µg/ml、7.5µg/ml、10µg/ml，然后将步骤（2）得到的中级耐药人食管癌EC9706细胞，重复不同紫杉醇浓度条件下的步骤（1）的培养步骤，分别重复3次，得到在紫杉醇作用浓度为5µg/ml、7.5µg/ml、10µg/ml条件下的耐紫杉醇细胞株。
3.如权利要求1所述的人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法，其特征在于，所述选出耐敏感药物5-FU的细胞株的步骤为：
（1）将耐紫杉醇细胞株置于新鲜培养液中，逐步加入紫杉醇和5-FU，至紫杉醇和5-FU的终浓度均为5µg/ml，继续培养24小时，得初级耐5-FU细胞株；
（2）将步骤（1）中5-FU作用浓度逐步增至10µg/ml、15µg/ml、20µg/ml和25µg/ml，再把初级耐5-FU细胞株按照步骤（1）的操作在不同浓度下，分别重复3次，得到能在5-FU作用浓度为10µg/ml、15µg/ml、20µg/ml和25µg/ml条件下存活的耐紫杉醇和5-FU细胞株。
4.如权利要求3所述的人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法，其特征在于，所述选出耐敏感药物顺铂的细胞株的步骤为：
（1）将耐紫杉醇和5-FU细胞株置于新鲜培养基培养，持续加入紫杉醇和5-FU，使紫杉醇终浓度为5µg/ml、5-FU终浓度为15µg/ml，然后再加入顺铂使其终浓度为1µg/ml，继续培养24小时，弃去培养液，换新鲜培养液继续培养，得初级耐敏感药物顺铂的细胞株；
（2）将步骤（1）中顺铂的作用浓度增至2µg/ml、3µg/ml及4µg/ml，然后把初级耐敏感药物顺铂的细胞株按照步骤（1）的操作在不同浓度下，分别重复3次，得能在顺铂作用浓度为2µg/ml、3µg/ml和4µg/ml条件下存活的耐顺铂细胞株。
5.如权利要求1-4任一项所述的人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法在筛选抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求1-4任一项所述的人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.如权利要求1-4任一项所述的人食管癌EC9706细胞多药耐药细胞株的建立方法在研究耐药肿瘤的细胞内信号激活机制，筛选具有可靠性的耐药逆转剂及耐药肿瘤细胞的治疗靶点中的应用。
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