CN104560878B - 一种人肝内胆管癌细胞系及其用途 - Google Patents
一种人肝内胆管癌细胞系及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104560878B CN104560878B CN201510003158.9A CN201510003158A CN104560878B CN 104560878 B CN104560878 B CN 104560878B CN 201510003158 A CN201510003158 A CN 201510003158A CN 104560878 B CN104560878 B CN 104560878B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- cell line
- duct cancer
- people
- intrahepatic duct
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
本发明涉及一种人肝内胆管癌细胞系及其用途。本发明建立了人肝内胆管癌细胞系LICCF，其代数明确，无交叉污染，对PI3K/mTOR通路的抑制剂和MEK1/2通路的抑制剂等显示独特的敏感性，对5‑FU、顺铂及FGFR抑制剂等高度耐药，可用于构建体内、外肿瘤药物实验及耐药模型，为揭示人肝内胆管癌耐药机制、逆转耐药出现、开发新的抗癌药物以及筛选人肝内胆管癌相关生物标志物提供了实验基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞系，具体地说，涉及一种人肝内胆管癌细胞系及其用途。
背景技术
肝内胆管癌(Intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)，起源于肝内二级胆管至小叶间胆管被覆上皮，是第二常见的肝脏恶性肿瘤。全球肝内胆管癌的发病率不断上升，在某些国家甚至超过了肝细胞癌。手术是ICC唯一可能获得根治的手段，但ICC早期诊断困难，仅10％患者可行根治性切除术，大多数患者确诊时已达晚期而失去手术机会。即使手术切除，术后5年复发转移率仍高达80％。遗憾的是，肝内胆管癌尚无公认的有效化疗方案，靶向治疗更是无药可用(相反，其他消化道肿瘤均已有有效的靶向药物，如肝细胞癌的索拉菲尼、胃癌的赫赛汀、大肠癌的爱必妥)。因此，鉴定肝内胆管癌的有效治疗靶点、开发针对性的靶向药物具有重要的临床价值和社会意义，更是进一步提高疗效的关键。
抗肿瘤药物的疗效主要由肿瘤基因组的异常表达、扩增和突变所决定，因肿瘤基因组的不稳定性及肿瘤间的异质性，抗肿瘤药物往往仅在某一群病人身上有效。例如，靶向BCR-Abl的药物格列卫在BCR-ABL融合表达的慢性粒细胞白血病患者中非常有效，五年生存率可达90％以上；靶向EGFR的易瑞沙成功用于EGFR突变的非小细胞肺癌，ALK抑制剂Crizotinib也仅批准用于EML4-ALK融合的非小细胞肺癌患者。在生物标志物(如BCR-ABL的融合、EGFR突变、EML4-ALK融合)的指征下，可以有效地判断出“有效人群”和“无效人群”，从而提高疗效、降低毒副作用。肝内胆管癌药物开发也面临着一样的问题，如能在药物开发早期的体外阶段筛选出其生物标志物，可以大大降低整个药物开发的成本，加速肝内胆管癌药物的上市及临床应用。
目前，筛选生物标志物主要有效手段是基于患者肿瘤组织来源的肿瘤细胞系，目前ATCC可用的商用肝内胆管癌细胞系仅有数株，而国内的肝内胆管癌细胞株更是寥寥无几。某一药靶基因突变在肝内胆管癌总体人群中仅占一定比例，需要一定量的样本才能筛选出敏感细胞株，因此需要建立更多的肝内胆管癌细胞用于相关研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种人肝内胆管癌细胞系。
本发明的再一的目的是，提供所述的人肝内胆管癌细胞系的用途。
为实现上述第一目的，本发明采取的技术方案是：
一种人肝内胆管癌细胞系，所述的人肝内胆管癌细胞系的保藏号为CCTCCC2014224。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上所述的人肝内胆管癌细胞系的用途，所述的用途选自：
a)筛选抗人肝内胆管癌的药物；
b)构建耐药细胞模型；
c)构建人肝内胆管癌动物模型；
d)筛选人肝内胆管癌相关生物标志物；或
e)研究人肝内胆管癌耐药机制。
本发明优点在于：本发明建立了人肝内胆管癌细胞株LICCF，其代数明确，无交叉污染；该人肝内胆管癌细胞株LICCF对PI3K/mTOR通路的抑制剂和MEK1/2通路的抑制剂等显示独特的敏感性，对5-FU、顺铂及FGFR抑制剂等高度耐药，可用于构建体内、外肿瘤药物实验及耐药模型，为揭示人肝内胆管癌耐药机制、逆转耐药出现、开发新的抗癌药物以及筛选人肝内胆管癌相关生物标志物提供了实验基础。
附图说明
图1.LICCF细胞形态。
具体实施方式
下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1
一、实验方法
1.肿瘤细胞原代培养
取术前未经任何治疗的，在复旦大学附属中山医院肝脏外科行手术切除的肝内胆管癌患者的肿瘤标本(患者为汉族女性，62岁，HBV-HCV-HIV-，术前CA199为0.6U/ml，肝内胆管腺癌的诊断获病理证实，并取得患者知情同意和复旦大学附属中山医院伦理委员会批准)。分离好的新鲜肝内胆管癌组织，无菌超净台中PBS洗净后，使用眼科镊子、剪刀等器械在培养皿中剪碎分离成0.5-1mm3的小块平铺于皿底，并向培养皿中加入含10ml的10％FBS(GIBCO公司)，1％双抗DMEM细胞培养基(GIBCO公司)，放入37℃5％CO2的培养箱中进行培养，次日在倒置显微镜下观察到细胞从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕。5～7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片。传代培养时，利用成纤维细胞与肿瘤细胞消化能力的不同，不断去除成纤维细胞。多次传代后，培养皿中肉眼已无法观察到成纤维细胞，并能持续生长传代时，即可用于药物筛选和基因组检测。
2.肿瘤细胞核型鉴定
六孔板中，0.01mg/ml的秋水仙素处理细胞16小时，镜检观察M期细胞比例为50％以上时，收集M期细胞。KCl低渗液低渗处理M期细胞15～20分钟，于3∶1甲醇/冰醋酸固定液室温固定后玻片上制片。将玻片置于0.02％胰酶溶液中消化30～60s，经PBS漂洗，Giemsa染色，晾干，完成制片。于显微镜下观察，计算每个细胞中染色体数目，每种细胞系随机选取20个细胞进行计算。
3.细胞倍增时间检测
取生长状态良好的细胞，消化，制成细胞悬液，并计数。在12孔板中准确接种以3000/孔的细胞进行接种。每天取2个孔计数，测出每孔中的细胞总数，持续计数7天。利用GraphPad绘制生长曲线，并计算细胞倍增时间。
4.克隆形成
取生长状态良好的细胞，消化，制成细胞悬液，并计数。将细胞悬液以1200个细胞每孔接种于6孔板中。将6孔板置于培养箱中，静置培养2周，每周换液2次。2周后，弃去细胞培养液，用PBS漂洗后，无水甲醇固定10min，然后用0.1％结晶紫染色10min，洗去染色液，室温干燥，并拍照记录。
5.Alamar blue测试原代细胞药物敏感性
1)细胞接种：将处于对数生长期的原代肿瘤细胞经PBS清洗、0.25％胰酶消化及计数板计数后，以500-2000个细胞每孔的密度配制细胞悬液，使用Multidrop(Thermo公司)细胞接种仪将细胞悬液以90μl每孔接种至96孔板中，室温放置15-20min后转入37℃5％CO2培养箱中。
2)加药：用DMSO配置每个药物最高浓度(Cmax)的200×母液，将Cmax的200×母液进行3.16倍梯度稀释，共9个药物浓度点。使用DMEM培养基将9个浓度梯度的200×母液稀释10倍，配制出药物培养基中间板(intermedium plate)。细胞接种3个小时后，每个药物浓度点取10μl培养基中间板药物加入细胞板中，放入37℃5％CO2培养箱培养。
3)检测：药物处理6天后，每孔加入10μl 0.03％Alamar blue溶液，37℃培养0.5-2小时后，使用荧光酶标仪(Thermo公司)于激发波长560nM，发射波长590nM的条件下进行检测。
4)数据处理：在Sigmoid软件中，使用以下公式(y为荧光检测值，X为药物浓度)拟合出药物反应曲线，并计算出每个细胞对应每个药物的IC50值。
二、实验结果
1.LICCF细胞建立
从一位肝内胆管癌患者原位肿瘤组织分离实体瘤后，经多次去纤维化处理，传代培养，成功建立了一株人肝内胆管癌细胞系LICCF(已于2014年12月21日保藏于中国典型培养物保藏中心(中国武汉大学，430072)，保藏编号为CCTCC C2014224)。如图1所示，从形态上观察细胞呈上皮形态。
2.核型鉴定
经核型分析鉴定，随机选取20个处于M期的细胞，计算其染色体数目。结果显示，该细胞的染色体异常，染色体数目基本上在50-110条之间，分别为49；63；67；67；58；59；62；47；50；66；84；61；58；54；54；59；69；58；113；64，而去除的成纤维细胞染色数目均为46条，说明细胞均为肿瘤细胞。
3.细胞增殖能力
对于稳定传代的细胞，在12孔板中检测LICCF细胞的倍增时间。结果显示，LICCF细胞的倍增时间为：36h。
4.药物敏感性
抗肿瘤药物往往仅在某些特定基因特征的细胞中敏感，我们测试了LICCF细胞对30个抗肿瘤靶向药物的敏感性。结果显示，LICCF细胞对大部分靶向药不敏感，仅对少部分靶向药物如mTOR抑制剂Everolimus，PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235敏感，提示LICCF细胞可以用于这些抑制剂的敏感性研究中。
表1 LICCF细胞对30个抗肿瘤靶向药物的敏感性
| 药物名称 | 药物靶点 | IC50(μM) |
| 5-Fluorouracil | DNA synthesis | 5.469 |
| AZD-4547 | FGFR1-II | 2.601 |
| NVP-BGJ398 | FGFR | 1.228 |
| Bortezomib | Proteasomes | 0.008 |
| Carboplatin | DNA crosslinker | 9.034 |
| CHIR-99021 | GSK3 | 10.715 |
| Cisplatin | DNA crosslinker | >300 |
| Dacarbazine | DNA crosslinker | 38.805 |
| Elesclomol | HSP70 | 0.004 |
| Everolimus | mTOR | 0.077 |
| Fludarabine | DNA synthesis | 0.060 |
| Foretinib | MET,KDR | 0.984 |
| GSK429286A | ROCK1 | 2.458 |
| JQ1 | BET bromodomains | 0.060 |
| KU-55933 | ATM | 15.541 |
| Lenvatinib | FGFR1/2/3/4、KIT、PDGFR、RET、VEGFR1/2/3 | 103.300 |
| NVP-BEZ235 | PI3K/mTOR | 0.045 |
| Orantinib | FGFR,PDGFR | 10.925 |
| PD-0325901 | MEK1/2 | 0.272 |
| PD-173074 | FGFR1/2/3 | 10.325 |
| Pemetrexed | DNA synthesis | >100 |
| PH-797804 | P38 | >30 |
| Pralatrexate | DNA synthesis | >1 |
| R-406 | SYK | 0.552 |
| Refametinib | MEK1,MEK2 | 1.420 |
| Temsirolimus | mTOR | 9.650 |
| Tideglusib | GSK3beta | >100 |
| Tioguanine | DNA synthesis | 12.002 |
| Tivantinib | c-met | 0.306 |
| Trametinib | MEK1,MEK2 | 0.073 |
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种人肝内胆管癌细胞系，其特征在于，所述的人肝内胆管癌细胞系的保藏号为CCTCC NO.C2014224。
2.权利要求1所述的人肝内胆管癌细胞系的用途，其特征在于，所述的用途选自：
a）筛选抗人肝内胆管癌的药物；
b）构建耐药细胞模型；
c）筛选人肝内胆管癌相关生物标志物；或
d）研究人肝内胆管癌耐药机制。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510003158.9A CN104560878B (zh) | 2015-01-04 | 2015-01-04 | 一种人肝内胆管癌细胞系及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201510003158.9A CN104560878B (zh) | 2015-01-04 | 2015-01-04 | 一种人肝内胆管癌细胞系及其用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104560878A CN104560878A (zh) | 2015-04-29 |
| CN104560878B true CN104560878B (zh) | 2017-02-22 |
Family
ID=53077958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201510003158.9A Expired - Fee Related CN104560878B (zh) | 2015-01-04 | 2015-01-04 | 一种人肝内胆管癌细胞系及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104560878B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107177551B (zh) * | 2016-03-11 | 2020-10-13 | 中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院 | 一种具有高成瘤能力的人肝内胆管癌细胞系及其应用 |
| CN107541494B (zh) * | 2016-06-27 | 2022-11-29 | 上海市东方医院 | 一种人胆管癌细胞系及其应用 |
| US20220177852A1 (en) * | 2019-04-11 | 2022-06-09 | Genex Health CO., LTD. | Method for culturing primary cells of gastric cancer and gallbladder and bile duct cancer, and supporting reagents |
| CN113082037B (zh) * | 2021-04-23 | 2022-09-13 | 浙江大学 | 小分子组合物在制备治疗肝内胆管细胞癌药物中的应用 |
| CN114717191B (zh) * | 2022-04-26 | 2023-06-16 | 兰州大学第一医院 | 一株人肝内胆管癌细胞株icc-x3及其应用 |
| CN114606194B (zh) * | 2022-04-26 | 2023-06-09 | 兰州大学第一医院 | 一株人肝内胆管癌细胞株icc-x1及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103937744A (zh) * | 2014-04-10 | 2014-07-23 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | 一种人胆管癌耐药细胞株及其应用 |
-
2015
- 2015-01-04 CN CN201510003158.9A patent/CN104560878B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103937744A (zh) * | 2014-04-10 | 2014-07-23 | 上海赛安生物医药科技有限公司 | 一种人胆管癌耐药细胞株及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| MiR-376c Down-Regulation Accelerates EGF-Dependent Migration by Targeting GRB2 in the HuCCT1 Human Intrahepatic Cholangiocarcinoma Cell Line;Jun Iwaki 等;《PLOS.one》;20130731;第8卷(第7期);e69496 * |
| 微RNA－26a在肝内胆管癌中的表达及其意义;黄昌俊 等;《中华肝胆外科杂志》;20131231;第19卷(第12期);898-903 * |
| 肝内胆管癌细胞系ICC-9810与肝细胞系L02蛋白质组学的差异分析;刘博 等;《世界华人消化杂志》;20080308;第16卷(第7期);759-762 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104560878A (zh) | 2015-04-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104560878B (zh) | 一种人肝内胆管癌细胞系及其用途 | |
| Dong et al. | Patient-derived first generation xenografts of non–small cell lung cancers: promising tools for predicting drug responses for personalized chemotherapy | |
| Zhou et al. | Oncogenic driver mutations in patients with non-small-cell lung cancer at various clinical stages | |
| Boone et al. | Ovarian and cervical cancer patient derived xenografts: The past, present, and future | |
| US8187800B2 (en) | Methods for selecting active agents for cancer treatment | |
| CN104704368A (zh) | 肿瘤细胞分离/纯化方法和其使用方法 | |
| Chen et al. | A comprehensive review of metal-induced cellular transformation studies | |
| CN104975063A (zh) | 抗肿瘤药物生物标志物的筛选方法及其应用 | |
| CN108707582A (zh) | 一种体液来源的肿瘤细胞的高效培养方法及其应用 | |
| Zhao et al. | Colorectal Cancer Patient‐Derived 2D and 3D Models Efficiently Recapitulate Inter‐and Intratumoral Heterogeneity | |
| Hu et al. | Clinical outcomes of different generations of EGFR tyrosine kinase inhibitors in advanced lung adenosquamous carcinoma | |
| Chiappori et al. | Features of potentially predictive biomarkers of chemotherapeutic efficacy in small cell lung cancer | |
| CN109971851A (zh) | MiR-125b-2-3p作为鉴别诊断肾癌亚型的分子标志物及其在肿瘤转移中的用途 | |
| Hamurcu et al. | Basal level micronucleus frequency in stimulated lymphocytes of untreated patients with leukemia | |
| O’Donnell et al. | Advanced ovarian cancer displays functional intratumor heterogeneity that correlates to ex vivo drug sensitivity | |
| CN105287632A (zh) | 一种非小细胞肺癌吉非替尼耐药pdx模型的构建方法 | |
| CN108642016A (zh) | Imatinib耐药的KIT和PDGFRA野生型GIST细胞株及其构建方法和应用 | |
| Al Shihabi et al. | The landscape of drug sensitivity and resistance in sarcoma | |
| Forsythe et al. | Using organoid models to predict chemotherapy efficacy: the future of precision oncology? | |
| CN104004715A (zh) | 人白血病hl-60细胞耐药细胞株hl-60/rs细胞及其制备方法 | |
| CN107496924A (zh) | AhR抑制剂在制备抗肿瘤药物中的应用和抗肿瘤组合物 | |
| CN107058565A (zh) | 肢端型黑色素瘤的诊断和治疗 | |
| Yi et al. | Establishment of an orthotopic transplantation tumor model in nude mice using a drug‑resistant human ovarian cancer cell line with a high expression of c‑Kit | |
| CN104531619B (zh) | 用于研究人肝癌癌内异质性的细胞模型 | |
| Celik et al. | Assessment of ex-vivo efficacy (oncogram) of immunotherapeutic and chemotherapeutic agents in bladder cancer: A pilot study of personalized treatment |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170222 Termination date: 20220104 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |