CN104704368A - 肿瘤细胞分离/纯化方法和其使用方法 - Google Patents

肿瘤细胞分离/纯化方法和其使用方法 Download PDF

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Abstract

本文公开了用于各种试验和程序，包括肿瘤药物效力筛选，比如微量培养动力学试验的分离和纯化血液学或非血液学肿瘤细胞的方法。此外，也公开了适于比较普通抗癌药物对专有抗癌药物的相对效力的微量培养动力学试验和方法。

Description

肿瘤细胞分离/纯化方法和其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请是2012年5月15日提交的美国临时专利申请号61/647,248的国际阶段，其通过参考以其整体并入本文。
技术领域
本公开涉及评估至少一种普通(generic)和/或专有(proprietary)抗癌药物候选物诱导癌症细胞中细胞凋亡能力的方法。更具体而言，本公开提供了涉及肿瘤细胞纯化和分离的方法，其尤其针对给定样本的组织来源被优化。仍进一步，本公开提供了允许精确和强健比较至少一种普通药物和专有药物诱导癌症细胞中细胞凋亡的相对能力的试验和方法。
背景技术
细胞死亡可以以各种方式发生，但是最成功的抗癌药物倾向于使得癌症细胞通过非常特异的细胞凋亡过程死亡。细胞凋亡是这样一种机制，通过该机制，细胞分解和包裹其本身，从而由身体有序处理。当不再需要细胞、细胞太老或已经受损或患病时，身体通常利用细胞凋亡丢弃所述细胞。事实上，具有可能导致癌症的危险突变的一些细胞，和甚至一些早期-阶段癌细胞，可由于天然过程而经历细胞凋亡。
细胞凋亡期间，细胞切割和存储DNA、使细胞核浓缩、丢弃过多的水，并且经历对细胞膜的各种改变，比如起泡、细胞膜中形成不规则凸出。(见图l)细胞凋亡一般在数个触发器(trigger)之一向将会经历细胞凋亡的细胞发送信号之后发生。在许多癌症细胞中，该信息系统不能正确起作用，因为细胞不能检测触发器，不能在接收触发器之后适当发送信号，或不能对信号起作用，或细胞可能甚至具有这些问题的组合。总体作用是在一些癌症细胞中对正在经历的细胞凋亡的抵抗。
癌症，如本文所使用，包括所有血液学和非血液学癌症或恶性肿瘤，以及骨髓增生异常综合征(MDS)。这考虑所有血液/髓癌症、实体瘤和积液的四个主要类别：白血病、淋巴瘤、上皮恶性肿瘤和间充质恶性肿瘤。
尽管许多有效的癌症药物可诱导癌细胞经历细胞凋亡而不考虑它们对细胞凋亡过程的抵抗，但是没有药物对所有类型的癌症细胞都起作用并且没有试验基于细胞凋亡的动力学单位测量而预测这些药物的相对效力。因此，需要检测具体的药物候选物是否可造成各种类型癌症细胞中的细胞凋亡，并且也需要测定与其他药物或药物候选物相比，该物候选物的效力，尤其就个体患者而言。
美国专利6,077,684和美国专利6,258,553中描述的微量培养动力学试验(MiCK试验)目前用于检测来自患者的白血病细胞是否响应已知有效抵抗一种或多种类型白血病的具体药物而经历细胞凋亡。在MiCK试验中，将来自患者的癌症细胞放置在给定浓度的单一细胞或小细胞簇的悬液中，并且允许适应微量滴定板的多个孔中的条件。对照溶液或具有各种浓度的已知抗癌药物——通常为针对患者的癌症类型推荐的那些药物——的溶液被引入孔中，其中每孔具有一种检测样本。然后周期性地，通常每数分钟测量每个孔的光密度，持续数小时至数天的时间。随着细胞经历细胞凋亡相关的起泡，其光密度以可检测和特定的方式增加。如果细胞不经历细胞凋亡或由于其他原因死亡，其光密度不以这种方式改变。因此，如果孔的光密度(OD)对时间的图产生这样的直线曲线(straight line curve)：其具有针对时间的正斜率，随后是平台(plateau)和/或负斜率，那么该孔中的抗癌药物诱导患者的癌症细胞的细胞凋亡并且可能是针对该患者的适当疗法。OD对时间的数据也可用于计算动力学单位，该单位可用于测量细胞凋亡，其类似地与针对患者的疗法的适合性相关。本领域普通技术人员熟悉上面对MiCK试验的一般描述。此外，为了所有的目的，美国专利6,077,684和美国专利6,258,553的内容通过参考以它们的整体并入本文，它们提供MiCK试验更详细的描述。
尽管MiCK试验已经用于检测已知的抗癌药物对具体患者的白血病癌症细胞的作用，但是仍需要开发具体适于各种肿瘤细胞样本来源的各种试验。之前提到的MiCK试验仅仅考虑血液癌症，具体而言，白血病。因为目前MiCK试验受限的范围，本领域需要尤其适于和敏于探测如在不仅仅来自血液癌症，而且也来自其他肿瘤源的样本中遇到的细胞凋亡相关的细胞/化学相互作用的MiCK试验。开发为具体来源的样本定制的改善的MiCK试验和方法将使得研究人员能够为可通过使用MiCK试验获得的个体化的治疗方案提供进一步的精确性和强健性。此外， 任何筛选试验的关键方面是将样本中的其他非癌症细胞和材料与癌症细胞分离以及对其进行化合物或药物测定的细胞的纯度。
本领域也非常需要开发适于在专有药学化疗药物和它们的普通相对物之间进行比较分析的MiCK试验。术语“专有”包括单一来源药物和/或商标药物或化学药品；术语“普通”包括多个来源药物和/或非商标药物或化学药品。开发这种试验和方案使得医师能够基于专有药物对普通相对物的相对反应做成本有效的预治疗决定。在具体的癌症治疗中使用专有药物还是普通药物的这些决定，不仅对于面对大量治疗成本的个体患者，而且对于作为整体的卫生保健行业，都具有极大的意义。
发明内容
所以，本公开的目的是提供用于MiCK试验的从样本分离和纯化肿瘤细胞的改善的方法。此外，也公开对MiCK试验本身的改进，其使得产生更敏感和强健的试验，这些方法和试验允许测定所有类型的癌症细胞而并不限于白血病中的细胞凋亡。
根据本发明方面的方法相对于迄今为止已知的MiCK试验方案更加改善并且使从业者具有定制肿瘤细胞纯化和分离方案的能力，这取决于肿瘤细胞的来源。
对MiCK试验的改善包括，例如，对计算和推导KU值和确定所述KU值时使用的系数的改进。该改善允许从业者通过利用公开的推导更敏感系数和KU值的方法针对具体的患者疾病量身定制化疗的计划。
容易认识到在本申请中公开的方法允许更强健和精确的MiCK试验。通过公开的方法对MiCK试验方案的改善导致试验能力的相应提高，从而为医学从业者提供有价值的数据以帮助开发患者治疗策略。因为化疗药物产生严重的副作用——无论它们是否有效抵抗正在治疗的癌症类型，所以本领域技术人员认识到在开始治疗之前鉴定最有效抵抗个体患者的癌症的化疗药物(一种或多种)是必要的。但是，缺少的是实现该目标的有效的和可靠的方法。
本公开进一步的目的是提供能够比较专有化疗药物对普通化疗药物的相对效力的MiCK试验和方法。比较感兴趣的专有药物对普通药物诱导具体的癌症类型的细胞凋亡的相对能力的能力是对现有技术宝贵的改善。具备基于本文公开的试验和方法表明的结果在普通药物和专有药物选择之间进行抉择的能力的从业者非 常适于为他们的患者提供最佳治疗策略。患者治疗的这些微小规模功效与大规模功效类似，所述大规模功效将有益于作为整体的整个卫生保健行业。本公开允许对整个卫生保健行业很大可能的成本节约，因为通过本方法医生将能够基于个体化的患者的MiCK试验结果而不是商业影响或非决定性的同行评议的文献，在普通化疗药物和专有药物之间进行选择，以鉴定最有效的药物。
在实施方式中，本发明的材料和方法用于免疫学程序，以分离和纯化(并且也富集)源自实体瘤、血液、骨髓和积液样本的肿瘤细胞。获得未污染的癌症细胞样品的能力是肿瘤发育研究、癌症生物学和药物筛选中的一个主要瓶颈。来自癌症患者和动物肿瘤模型中的肿瘤活组织检查通常包含异源细胞群体，其包括正常组织、血液和癌症细胞。该混合群体使得难以获得和解释诊断和正确的实验结论。本方法通过为个体组织样品的生理学来源提供量身定制的具体方案解决了这些问题。
本发明的另一实施方式涉及肿瘤细胞分离和纯化的方法，其包括下述步骤：a)获得肿瘤样本；b)在24-48小时内用抗生素混合物处理样本；c)切碎、消化和过滤样本；d)任选地通过密度梯度离心去除不能生存的细胞；e)孵育细胞悬液以通过粘附去除巨噬细胞；f)进行阳性、阴性和/或去除(depletion)分离，以分离感兴趣的细胞；g)如果需要，使用缀合CD14抗体的磁珠去除任何残留的巨噬细胞；h)将终悬液铺平板(例如，将终悬液添加至384孔板的孔)；和i)将平板在37℃下5％二氧化碳(CO2)潮湿的气氛中孵育过夜。
所以，在实施方式中，本方法涉及：评估抗癌药物候选物的相对细胞凋亡-诱导活性的方法，其包括：
a)从肿瘤样本获得癌症细胞；
b)切碎、消化和过滤样本；
c)任选地通过密度梯度离心去除不能生存的细胞；
d)孵育细胞悬液以通过粘附去除巨噬细胞；
e)进行阳性、阴性和/或去除分离，以分离感兴趣的细胞；
f)如果需要，使用CD 14抗体缀合磁珠去除任何残留的巨噬细胞；
g)将终悬液铺平板；
h)孵育平板； 
i)将至少一个孔的铺平板的终悬液暴露于至少一种第一抗癌药物候选物或第一候选物和其他物质的混合物；
j)将至少一个孔的铺平板的终悬液暴露于至少一种第二抗癌药物候选物或第二候选物和其他物质的混合物；
k)测量暴露于至少一种第一和第二抗癌药物候选物的孔的光密度，或包含至少一种第一或至少一种第二抗癌药物候选物和其他物质的混合物的孔的光密度，其中所述光密度的测量以连续方式以选择的时间间隔进行选择的持续时间；
l)从光密度和时间测量确定至少一种第一和第二抗癌药物候选物的动力学单位值；
m)使每个药物候选物的动力学单位值与下述关联：
a)如果动力学单位值大于预定的阈值，抗癌药物候选物诱导癌症细胞中细胞凋亡的能力；
b)如果动力学单位值小于预定的阈值，抗癌药物候选物诱导癌症细胞中细胞凋亡的无能；
n)比较针对每个药物候选物测定的动力学单位值；和
o)基于步骤(n)中的比较，确定具有诱导癌症细胞中细胞凋亡的更大相对能力的药物候选物。
本发明的实施方式也可涉及前述步骤a)-o)，其中至少一种第一和第二抗癌药物候选物包括至少一种普通药物候选物和一种专有药物候选物。
本发明也包括其中有步骤p)的实施方式，所述步骤p)包括确定因选择普通药物或专有药物候选物而产生的货币(monetary)结果，其中选择具有最高相对动力学单位值的药物候选物。在某些实施方式中，基于用选择的具有较高动力学单位值的药物治疗单个患者对基于具有较低动力学单位值的药物候选物发生的成本确定货币结果。普通药物一般定义为可从多个制造商来源获得的药物；而，专有药物定义为仅仅可从一个制造商获得的那些药物。
本发明进一步的实施方式包括步骤q)，其涉及将从步骤p)确定的货币结果外推至目标群体。这种目标群体可包括为至少2个患者的任何群体。具体地，本发明的实施方式涉及为以下规模的群体：社区规模(例如，2至10个人，10至20个人，20至50个人，50至100个人，100至300个人，300至1000个人)、区域规 模(例如，1000至2000个人，2000至10000个人)、州范围规模(例如，10,000至20,000个人，20,000至50,000个人或定义为州内作为检验的药物治疗的潜在候选人的人的数目)，和国家范围规模(定义为国内作为检验的药物的潜在候选人的所有人)。在本发明具体的实施方式中，目标群体是来自美国的国家范围群体。这种外推可通过适当编程的计算机进行。
本发明的方法可使用来自各种来源的肿瘤样本，例如：实体瘤样本、血液样本、骨髓样本和源自积液的样本仅仅是适于当前公开方法的具体的肿瘤样本类型中的几个而已。
本发明的实施方式可用于检测各种恶性肿瘤。例如，本公开可用于检测下述癌：
卵巢癌(浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宫内膜样癌)，卵巢颗粒细胞肿瘤、输卵管腺癌、腹膜癌、子宫(内膜)腺癌、肉瘤样癌、子宫颈鳞状细胞癌、子宫颈内腺癌、外阴癌、乳腺癌——原发性和转移性(导管癌、粘液癌、小叶癌、恶性叶状肿瘤)、头颈癌、口腔癌，包括舌癌、原发性癌和转移性癌、食管癌、鳞状细胞癌和腺癌、胃腺癌、恶性淋巴瘤、GIST、原发性小肠癌、结肠腺癌——原发性和转移性(腺癌、粘液癌、大细胞神经内分泌癌、胶体癌)、阑尾腺癌、结直肠癌、直肠癌、肛门癌(鳞状的、基底细胞样)、类癌瘤、原发性和转移性(阑尾、小肠、结肠)、胰腺癌、肝癌(肝细胞癌、胆管癌)、向肝的转移癌、肺癌——原发性和转移性(鳞状细胞、腺癌、腺磷癌、巨细胞癌、非小细胞癌、NSCLC、小细胞癌神经内分泌癌、大细胞癌、支气管肺泡癌)、原发性和转移性肾细胞(肾)癌，原发性和转移性膀胱癌、原发性和转移性前列腺腺癌、原发性和转移性脑瘤(多形性成胶质细胞瘤、大脑神经外胚层恶性肿瘤、神经外胚层肿瘤、少突胶质细胞瘤、恶性星形细胞瘤)、皮肤肿瘤(恶性黑素瘤、皮脂细胞癌)、甲状腺癌(乳头状和滤泡状)，胸腺癌、蝶骨癌(Shenoidal carcinoma)、原发灶不明癌、神经内分泌癌、睾丸恶性肿瘤(精原细胞瘤、胚胎性癌、恶性混合肿瘤)和其他癌。本公开可用于检测下述恶性淋巴瘤，例如：大细胞恶性淋巴瘤、小细胞淋巴瘤、混合的大细胞和小细胞淋巴瘤、Malt淋巴瘤、非霍奇金恶性淋巴瘤、T细胞恶性淋巴瘤、慢性骨髓性(或髓细胞性)白血病(CML)、骨髓瘤、其他白血病、间皮瘤、套细胞淋巴瘤、缘区细胞淋巴瘤、其他未指明类型的淋巴瘤，和其他淋巴瘤。
本公开进一步可用于检测下述白血病，例如：AML-急性骨髓性白血病、ALL-急性成淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征-MDS、具有骨髓纤维化的MDS、瓦尔登斯特伦(Waldenstrom’s)巨球蛋白血症，和其他白血病。
而且，可用本公开检测比如下述的肉瘤：
平滑肌肉瘤(Leimyosarcoma)(子宫肉瘤)、原发性和转移性GIST-胃肠道间质瘤(胃肿瘤、小肠肿瘤、结肠肿瘤)、脂肪肉瘤、粘液样肉瘤(Myxoid sarcoma)、软骨肉瘤、骨肉瘤、尤恩肉瘤/PNET、成神经细胞瘤、恶性外周神经鞘瘤，纺锤细胞癌、胚胎性横纹肌肉瘤、间皮瘤，和其他肉瘤。
因此，可容易认识到本公开的MiCK试验和方法代表对本领域之前已知的仅仅涉及白血病的MiCK试验的显著改善。
在另一实施方式中，本方法涉及：评估抗癌药物候选物在源自肿瘤样本的癌症细胞系中诱导细胞凋亡的能力的方法，包括：
a)获得肿瘤样本；
b)切碎、消化和过滤样本；
c)任选地通过密度梯度离心去除不能生存的细胞；
d)孵育细胞悬液以通过粘附去除巨噬细胞；
e)进行阳性、阴性和/或去除分离，以分离感兴趣的细胞；
f)如果需要，使用CD 14抗体缀合磁珠去除任何残留的巨噬细胞；
g)将终悬液铺平板；
h)孵育平板； 
i)将至少一个孔的铺平板的终悬液暴露于至少一种抗癌药物候选物或候选物和其他物质的混合物；
j)测量暴露于至少一种抗癌药物候选物的孔的光密度，或包含至少一种抗癌药物候选物和其他物质的混合物的孔的光密度，其中所述光密度的测量以连续方式以选择的时间间隔进行选择的持续时间；
k)从光密度和时间测量确定至少一种抗癌药物候选物的动力学单位值；和
1)使每个药物候选物的动力学单位值与下述相关联：
a)如果动力学单位值大于预定的阈值，抗癌药物候选物诱导癌症细胞中细胞凋亡的能力；
b)如果动力学单位值小于预定的阈值，抗癌药物候选物诱导癌症细胞中细胞凋亡的无能。
在一些实施方式中，平板的每个孔包含不同的抗癌药物候选物。此外，方法也考虑其中每个孔包含不同浓度的抗癌药物候选物的实施方式。所以，本公开可涉及高通量试验，通过该实验可同时检测多种可能的浓度强度下的多种可能的药物候选物。本发明实施方式的该高通量能力相对于单一药物候选物检测具有显著优势，并且提供了降低检测成本和增加时间节约的前景。
可装载到试验的每个孔中的可能的抗癌药物候选物的浓度将根据制造商推荐的剂量和实现对应该剂量的孔中浓度需要的相应的稀释度而改变。例如，通过摩尔浓度测定每个孔中的目标药物浓度，其范围可为例如，从0.01至10,000μΜ，或0.001至100,000μΜ，或0.1至10,000μΜ，但是可也偏离这些公开的示例性范围或包括这些范围中包含的任何整数。本领域技术人员理解如何通过利用制造商推荐的血液水平浓度实现目标药物浓度，如果存在足够的样本细胞其可加上或减去一个连续稀释而改变。
本发明的实施方式能够检测各种抗癌药物候选物。例如，可通过公开的方法检测下述抗癌药物候选物：凯素(Abraxane)、力比泰(Alimta)、氨吖啶(Amsacrine)、天冬酰胺酶、BCNU、苯达莫司汀、博来霉素、凯莱(Caelyx)(盐酸多柔比星脂质体(Doxil))、卡铂、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨(Cladribine)、氯法拉滨(Clofarabine)、阿糖胞苷、环磷酰胺(4HC)、达卡巴嗪(Dacarbazine)、放线菌素D、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨(Decitabine)、地塞米松、多柔比星、表柔比星、雌氮芥、依托泊甙、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、格列卫(Gleevec)(伊马替尼)、六甲基密胺、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺(4HI)、干扰素-2a、伊立替康、伊沙匹隆(Ixabepilone)、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋呤、丝裂霉素、米托蒽醌、氮芥、奥沙利铂(oxaliplatin)、喷司他丁、索拉非尼(Sorafenib)、链脲霉素(Streptozocin)、舒尼替尼、塔西法(tarceva)、泰素(Taxol)、泰索帝、替莫唑胺、坦罗莫司、沙利度胺、硫代鸟嘌呤、托泊替坎(Topotecan)、维甲酸、万珂(Velcade)、维达扎(Vidaza)、长春花碱、长春新碱、长春瑞宾、伏立诺他、希罗达(Xeloda) (5DFUR)、依维莫司、拉帕替尼(Lapatinib)、来那度胺(Lenalidomide)、雷帕霉素和Votrient(帕唑帕尼)。
但是，许多其他抗癌药物候选物，包括但不限于可产生细胞凋亡或被检查其产生细胞凋亡的能力的其他非化疗药物和/或化学药品，也能够通过公开的方法检测。仍进一步，本发明的方法并不严格用于抗癌药物候选物，而是公开方法的实施方式可用于检测针对各种疾病的任何数量的潜在药物候选物。
附图说明
参考下述说明书、所附的权利要求书和附图，将更好地理解本发明实施方式的这些和其他特征、方面和优势，其中：
图1：显示移动穿过细胞凋亡阶段的癌症细胞按时间顺序的显微照片。左侧第一张图(1)显示凋亡之前的细胞。中间图(2)显示凋亡期间的细胞，并且起泡明显。右侧的最后一张图(3)显示凋亡结束之后或接近结束时的细胞。
图2：显示患者的总体生存。红线，基于使用MiCK试验结果进行治疗的患者。蓝线，未基于使用MiCK试验结果进行治疗的患者。曲线形式的交叉线指示截尾的(censored)患者。横坐标上方小的数值指示在每个时间点处在风险中的患者。通过对数秩(log rank)分析，曲线统计学上不同，p＝0.04。
图3：显示患者的无复发间隔。红线，基于使用MiCK试验结果进行治疗的患者。蓝线，未基于使用MiCK试验结果进行治疗的患者。曲线形式的交叉线指示截尾的患者。横坐标上方的小的数值指示在每个时间点处于风险的患者。通过对数秩分析，曲线统计学上不同，p<0.01。
图4：显示乳房和肺样本之间的比较，并且关于普通药物或专有药物在一种类型中是否比在另一种类型中更有效图示组织样本类型之间是否存在差异。注意：对于乳腺癌仅仅单一药物用于ID普通和专有，而对于肺和结肠考虑多种药物。使用Fisher's精确检验(p值＝0.57)，卡方(χ2)分析显示乳房(97.7％)的％g≥p与肺(93.8％)的％没有统计学上显著的差异。
图5：显示乳房和结肠样本之间的比较，并且关于普通药物或专有药物在一种类型中是否比在另一种类型中更有效图示组织样本类型之间是否存在差异。使用 Fisher's精确检测(p值<0.05)，卡方分析显示乳房(97.7％)的％g≥p统计学上显著不同于结肠(71.4％)的％。
图6：显示乳房和结肠+肺样本之间的比较，并且关于普通药物或专有药物在一种类型中是否比在另一种类型中更有效图示组织样本类型之间是否存在差异。使用Fisher's精确检测(p值＝0.19)，卡方分析显示乳房(97.7％)的％g≥p与结肠+肺(89.7％)的％在统计学上没有显著不同。
图7：显示结肠和肺样本之间的比较，并且关于普通药物或专有药物在一种类型中是否比在另一种类型中更有效图示组织样本类型之间是否存在差异。肺与结肠针对最佳专有(p＝0.16)和最佳普通(p＝0.45)的分布显示没有足够的证据推论出肺和结肠不同。由于结肠组小的样本尺寸而使用非参数Wilcoxon检验。
图8：显示过夜孵育之前孔板中细胞的显微照片。
图9：显示孵育15小时之后孔板中细胞的显微照片。
图10：显示癌症细胞对各种浓度下的37种检测的抗癌药物候选物的凋亡应答。
发明详述
一般MiCK试验程序
本公开涉及使用分光光度分析在一段时间内测量光密度(OD)，评估抗癌药物候选物引起癌症细胞中细胞凋亡的效力。在一种实施方式中，本公开包括这样的方法，其通过在如之前引用的美国专利号6,077,684和6,258,553中公开的微量培养动力学(MiCK)试验类似的试验中将药物候选物施用至癌症细胞，来评估此类抗癌药物候选物，并且这两篇以它们的整体通过引用并入本文。
根据一种具体的实施方式，可通过选择抗癌药物候选物和选择对其进行药物检测的、源自获得的肿瘤样本的至少一种癌症细胞进行试验。
在一种实施方式中，癌症细胞可在比如RPMI的培养基中作为单细胞悬液被悬浮。如本文所使用，“单细胞悬液”是液体中一个或多个细胞的悬液，其中细胞分离为个体或为10个或更少细胞的簇。培养基可包含其他组分，比如胎牛血清或癌症细胞具体需要的组分。这些组分可限于对于在试验期间——通常至少24小时和不长于120小时——维持细胞必须的那些。
可通过将样品放置在分光板的孔中检测悬浮的细胞。可以任何浓度悬浮细胞，使得在光密度(OD)的分光光度测量期间，板阅读器的束一次正常仅仅穿过一个细 胞层。对于大部分细胞，可使用2x 105和1x 106细胞/mL之间的浓度。浓度对于小细胞可增加和对于大细胞可降低。为了更精确测定适当的细胞浓度，药物候选物检测样品中待使用的细胞悬液的量可被添加至平板的至少一个浓度检测孔。如果在检测药物候选物期间孔预填充另外的培养基，那么浓度检测孔可类似地预填充另外的培养基。在填充浓度检测孔之后，可将平板离心(例如在500RPM下30-120秒)，以使细胞沉淀在孔底部。如果细胞浓度适合试验，细胞应形成单层而没有重叠。可适当调节细胞浓度直到获得该结果。可使用不同浓度检测孔一次检测多种浓度的细胞。
根据细胞可过夜显著生长或在将细胞放置在平板中和开始药物候选物试验之间的另一时间期间显著生长的实施方式中，可调节细胞浓度，以初始实现小于单层，以允许生长，以便在开始药物候选物试验时存在足够的单层细胞。
在测定适当的细胞浓度之后，可通过以适当体积的培养基和适当数量的细胞填充平板中的检测孔和对照孔而继续药物候选物试验。在其他实施方式中，孔可仅仅由培养基部分预填充。
填充之后，可允许细胞适应平板条件一段时间，比如至少12小时，至少16小时，至少24小时，或12-16小时，12-24小时，或16-24小时。对于某些细胞类型，比如白血病/淋巴瘤细胞系或通常作为单个细胞存在的其他细胞类型，可省略适应期(adjustment period)。适应期通常足够短，使得细胞在该时间内不经历显著生长。适应期可取决于药物候选物试验中使用的癌症细胞的类型而改变。可在适于使细胞保持存活和健康的条件下进行适应。例如，平板可放置在37℃下5％CO2气氛的潮湿的培养箱中。对于一些细胞类型，尤其不经历适应期的细胞类型，比如白血病或淋巴瘤细胞系，可将平板离心(例如在500RPM下2分钟)，以使细胞沉淀在孔底部上。
在适应期之后，可将药物候选物和任何对照药物或其他对照样品添加至孔。通常，与孔中液体的总体积相比，将药物候选物加入到小体积的培养基或其他液体中。例如，添加的药物的体积可小于孔中液体的总体积的10％。可以多重稀释度加入药物候选物，以允许测定任何浓度作用。尽管许多药物候选物可以是水溶性的，但是也可检测不容易溶于水的药物候选物。此类候选物可与任何合适的载体混合。此类候选物可优选地与期望用于实际临床应用的载体混合。粘性药物候 选物可需要充分稀释以便被检测。具有明显颜色的药物候选物可受益于监测仅仅包含药物候选物的检测孔中的OD并且从检测样品孔的测量值中减去该OD。
在添加药物候选物之后，可允许细胞进行另一短时间的适应，例如15分钟或30分钟。可将细胞放置在适于使细胞保持存活和健康的条件下。例如，平板可放置在37℃下5％CO2气氛的潮湿的培养箱中。在该短的适应期之后，可将矿物油层布置在每个孔的顶部以维持培养基中的CO2并且阻止蒸发。
然后可将平板放置在配置为在限定波长下测量OD的分光光度计中。分光光度计可配置为以给定时间间隔在一定的波长下为每个孔测量OD，达给定的总时间段，所述一定的波长，例如从550至650nm，或600至650nm，或更具体而言，分光光度计配置为在600nm的波长下读取OD。例如，可在秒、分钟，或小时的时间范围内周期性(即连续地)测量每个孔的OD，达大约24小时至120小时、约24小时至72小时，或约24小时至48小时的时期。或者，对于某些细胞，少至12小时的时间段的测量是足够的。在具体的实施方式中，可每5分钟至10分钟进行测量。分光光度计可具有孵育室，以避免细胞的自发死亡。
分光光度数据可转化成动力学单位。通过曲线的斜率确定动力学单位，当在测量的波长，例如600nm下由细胞起泡造成OD的变化被绘制为时间的函数时产生所述曲线。关于动力学单位计算的具体信息提供在Kravtsov,Vladimir D.等的“细胞凋亡的微量培养动力学试验测定白血病的化学敏感性的应用(Use of the Microculture Kinetic Assay of apoptosis to Determine Chemosensitivities of Leukemias)”,Blood 92:968-980(1998)中，为了所有目的，其通过参考以其整体并入本文。下面更详细讨论了动力学单位测定。给定浓度的给定药物候选物的光密度可针对时间作图。如果细胞正经历凋亡，则该图给出独特的上升曲线。相比之下，如果药物候选物对细胞没有作用(例如它们是抗性的)，那么曲线与针对没有药物或药物候选物的对照样品获得的曲线类似。可也通过目前的试验确定由于细胞凋亡之外原因的细胞死亡，并且用于消除药物候选物筛选中的假阳性。例如，细胞坏死产生容易与细胞凋亡相关的曲线区分的独特的向下倾斜的曲线。此外，一般的细胞死亡也造成向下的曲线。
细胞凋亡的动力学单位(KU)
可通过在改良的MiC试验中产生的动力学单位的值确定药物候选物的效力。KU是用于量化细胞凋亡的计算值。动力学单位可如下确定：
细胞凋亡(KU)＝(Vmax药物候选物处理的-Vmax对照)×60×X/(OD对照-OD空白)
KU是用于量化细胞凋亡的计算值。来自每个孔的光密度(OD)针对时间被绘图。为药物处理的微量培养物的每个图计算细胞凋亡曲线的最大斜率(Vmax)。然后，将其与没有药物的对照孔的Vmax(在与暴露于药物的细胞的Vmax相同的时间计算)比较。为了方便，Vmax乘以60以将单位从mOD/分钟转换成mOD/小时。数据用下面讨论的系数归一化(系数＝X/(OD对照-OD空白)。
系数
如上所述，系数是测量细胞凋亡和以动力学单位量化所述细胞凋亡时用于使每个孔细胞的量归一化的计算值。
系数如下计算：
系数：X/(OD对照-OD空白)
X＝检测的细胞类型的最佳光密度值(由经验确定)
OD对照＝所有对照孔的平均光密度
OD空白＝所有空白孔的平均光密度
1.000的系数意思是孔中的细胞浓度是最佳的。小于1.000的系数值意思是细胞浓度大于最佳浓度。如果系数值大于1.000，意思是孔中的细胞浓度不是最理想的。最佳MiCK试验可接受的系数值在0.8和1.5之间。如果值小于0.8，那么系数不正确地缩小计算的KU的值。如果值大于1.5，则每个孔中将没有足够的细胞以检测细胞凋亡的信号。式中的“X”根据细胞类型而改变。对于实体瘤样本，该值是0.09。对于大部分白血病，该值是0.15。对于CLL(慢性淋巴细胞性白血病)和淋巴瘤，该值是0.21。
该“X”值适合肿瘤类型并且由经验确定。因此，该系数通过使用不同浓度的细胞的反复试验(trial and error)，和通过在显微镜下检查它们同时观察孔中完全适当的覆盖而开发。通过阅读器读取适当的孔并且该OD成为新的X值。关于该方程式的进一步信息可见于Kravtsov等(Blood，92:968-980)，其之前通过引用并入本文。
除了允许确定药物候选物是否造成细胞凋亡之外，可比较使用目前试验产生的动力学单位值，以确定具体的药物候选物是否比目前的药物表现更好或类似。 也可进行不同浓度药物候选物的比较，并且可给出合适剂量的一般指示。偶尔，在一些癌症中，一些药物在更高浓度下可能不如在更低浓度下表现好。不同浓度的药物候选物的动力学单位值的比较可鉴定具有类似特征(profile)的药物候选物。
总体上，抗癌药物候选物的评估可包括该药物候选物对癌症细胞的细胞凋亡的作用的任何测定。该作用可包括但不限于诱导细胞凋亡、与已知癌症药物相比诱导细胞凋亡的程度、在不同药物候选物浓度下诱导细胞凋亡的程度，和诱导细胞凋亡的失效。抗癌药物评估试验也可能够检测癌症细胞中非药物相关或非细胞凋亡事件，比如试验或细胞坏死期间癌症细胞生长。
任何统计学上显著的正动力学单位值均可指示药物候选物诱导癌症细胞的细胞凋亡的一些趋势。但是，对于许多临床目的，仅仅能够诱导非常低水平细胞凋亡的药物候选物或药物的浓度是不令人感兴趣的。因此，在本公开的某些实施方式中，阈值动力学单位值可设置为区分能够在癌症细胞中诱导临床相关水平细胞凋亡的药物候选物。例如，阈值量可为1.5、2或3动力学单位。针对具体的药物候选物或药物候选物浓度选择的实际阈值可取决于许多因素。例如，较低的阈值，比如1.5或2，对于能够在不对其他药物反应或仅仅对具有明显不利副作用的药物反应的癌症类型中诱导细胞凋亡的药物候选物是可接受的。对于在更高浓度下展示降低效力或它们本身可能具有明显不利副作用的药物候选物，更低的阈值也是可接受的。更高的阈值，比如3，对于能够在已经具有适当的疗法的癌症类型中诱导细胞凋亡的药物候选物是可接受的。
在另一实施方式中，可以使用下述阈值范围：
0-1KU：非敏感的 
1-2KU：低敏感性 
2-3KU：低/中等敏感性 
3-5：KU：中等敏感性
>5KU：敏感的
优选地，可以使用下述阈值范围：
0-1KU：非敏感的； 
1-2,6KU：低敏感性； 
2.6-4.2KU：低/中等敏感性； 
4.2-5.8：KU：中等敏感性；
>5.8KU：敏感的。 
优选地，KU值≥7，更优选地KU值≥8，甚至更优选地KU值≥9，和最优选地KU值≥10。
基于癌症细胞的统计学分析确立这些范围。该范围为针对具体细胞类型待检测的化疗药物的相对比较确立基线。检测结果可受减轻因素(extenuating factor)的影响，比如：
·从获得样品到检测流逝的时间，
·检测可用的存活细胞的量，
·样本的微生物污染，
·被检测细胞的质量或生活力，
·细胞类型，和
·最近的治疗，比如化疗或辐射疗法
这些因素提示报告的动力学应答的预测值的弹性。对化疗药物的临床敏感性不完全限于作为上述范围预测的结果。试验中药物诱导的细胞凋亡的KU测量可连同其它重要因素一起被医师使用，以开发个体患者治疗方案，上述其它重要因素比如患者历史、之前的治疗结果、总体患者健康、患者并存病、患者偏好、以及其他临床因素。
所以，使用的KU值的具体范围取决于背景。即，取决于检测的具体的肿瘤细胞类型、使用的具体的药物和分析的具体的患者或患者群体。所以KU值表示可靠的和灵活的分析变量，其可由公开方法的从业者量身定制，以创建适当的度量标准，从而通过该标准评估给定的药物作用。
药物候选物
根据具体的实施方式，抗癌药物候选物可以是被评估在癌症细胞中诱导细胞凋亡能力的任何化学药品(一种或多种)、化合物(一种或多种)、或组合物(一种或多种)。这些候选物可包括各种化学或生物实体，比如化学疗法试剂、其他小分子、基于蛋白质或肽的药物候选物，包括连接化疗分子的抗体或抗体片段、基于核酸的治疗剂、其他生物制剂(biologics)、基于纳米颗粒的候选物等等。药物候选物可以与现有药物为相同的化学家族，或它们可以是新的化学或生物实体。
药物候选物不限于单个化学实体、生物实体或其他实体。它们可包括不同化学实体或生物实体的组合，例如推荐的组合疗法。此外，尽管本文的许多例子涉及其中施用单一药物候选物的试验，但是也可针对组合的多个药物候选物进行试验。理解本发明的实施方式可在所描述的方法中使用各种药物候选物的代谢物也是重要的。
可在使用单个平板的单个试验中评估大于一种药物候选物、药物候选物的浓度，或药物或药物候选物的组合。不同的检测样品可放置在不同的孔中。在实施方式中，检测的药物候选物的浓度可以例如是范围从0.1至10,000μΜ的任何浓度，或范围从0.01至10,000μΜ的任何浓度，或范围从0.001至100,000μΜ的任何浓度。检测的浓度可根据药物类型而改变，并且前述示例性浓度不认为是限制性的，因为根据检测的具体抗癌药物，技术人员知道如何构建适当的浓度，以用于教导的方法和试验。
平板和分光光度计系统
在具体的实施方式中，可选择平板和分光光度计使得分光光度计可读取平板。例如，当使用更早期分光光度计时，人们可使用具有更大孔的平板，因为装置不能读取较小孔的板。更新的分光光度计可能够读取具有较小孔的平板。在一种实施方式中，每个孔底部的直径不小于分光光度计光束的直径。在更具体的实施方式中，每个孔底部的直径不大于分光光度计光束直径的两倍。这有助于确保精确读取在测量波长，例如600nm下，每个孔中细胞的代表性部分的OD。分光光度计可在除了600nm以外的波长下测量。例如，波长可+/-5或+/-10。但是，可选择其他波长以便能够区分起泡。
分光光度计可包括一个或多个计算机或程序以操作装置或记录结果。在一种实施方式中，分光光度计可功能上连接至一个或多个计算机，所述计算机能够控制测量过程、记录其结果，和显示或传送将每个孔的光密度绘制为时间函数的图。
可以使用为组织培养设计的平板，或其他平板可被灭菌和处理以使得它们与组织培养兼容。允许细胞在分光光度计不可达到的地方，比如在角落聚集的平板，可能不如避免这种聚集的平板表现好。可选地，更多的癌症细胞可添加至这些平板，以确保在试验期间存在分光光度计可达到的单层。具有窄底部的平板，比如Corning半区域96孔板，也可有助于在孔底部促进单层形成而不需要不便 的低样品体积。也可使用其他平板，比如其他96孔板或更小的孔板，比如384孔板。
改良的MiCK试验方案
在之前美国专利号6,077,684和美国专利号6,258,553中描述的MiCK试验方案和目前公开的MiCK试验方案之间有许多不同，例如：
a.过夜孵育实体瘤样品样本；
b.低体积孔，因为实体瘤比血液样品产生更少的细胞；
c.经目视判释调整细胞浓度；
d.细胞将粘附至孔底部并且过夜扩散/延伸；
e.利用特殊的孵育室以使热均匀地扩散；
f.在将细胞装载到孔中时避开平板的边缘；
g.利用自动移液器平铺细胞、培养基(RPMI+10％胎牛血清+Penstrep)和药物；
h.利用产生的专用代码翻译机器人可理解格式的模板；
i.当我们具有准备铺平板的纯细胞悬液时，细胞分离结束；
j.细胞计数用于调整细胞浓度；
k.将浓度调整至1×106细胞/ml；
l.完成检测孔，以观察细胞分布；
m.如果细胞形状不好，将更多的细胞添加至每个孔；
n.如果检测孔看起来是足够的(覆盖所有区域的均匀分布的细胞单层)，进行接下来的步骤(铺平板)；
o.如果检测孔不是足够的，调整细胞浓度(稀释细胞，或浓缩细胞)，并且重新检测新孔直到孔中的细胞分布令人满意；
p.此时(在前述步骤之后)，将原料液准备平铺至该平板中的另外的孔中，直到细胞耗尽；
q.使用选择的细胞浓度，细胞悬液分布在平板中尽可能多的孔中，保留足够的细胞，以制作至少1个细胞离心涂片(cytospin)和ICC(免疫细胞化学)——如果可能；
r.使用自动移液器，以分配细胞同时避开平板的边缘孔；
s.用培养基填充边缘孔；
t.制造配置文件(configuration file)，以消除使用自动移液器遇到的气泡问题(飞溅(spotting))。该特征是重要的，因为其在试验期间消除培养基中气泡的形成，其人为使导致显著增加的KU值的斜率值增加；
u.该平板(经历前述步骤的)现在准备好过夜孵育(约15小时)；
v.孵育使细胞有时间粘附至孔底部的以及代谢上稳定；
w.在从培养箱去除孵育平板之后，用倒置显微镜通过对平板的观察评估细胞分布和生活力。对代表性孔进行显微拍照；
x.然后平板准备好通过自动移液器添加药物(例如可能的抗癌剂)；
y.通过治疗肿瘤医师(例如)，和NCCN目录(panel)，然后目录外药物(适应症以外的(off label))选择药物，
z.在37℃和5％CO2下进行30分钟孵育，以允许pH平衡；
aa.将油添加至每个孔，以防止空气交换和蒸发；
bb.将平板放置在阅读器中并且开始试验；
cc.在576次读取(48小时，5分钟间隔)之后试验自动停止；这些设置可根据需要调整；
dd.在48小时之前，如果认为所有反应已经完成，可手动停止试验；
ee.系数可定义为：X/(OD对照-OD空白)，其中X是给定细胞系的最佳值。OD是光密度。该系数通过使用不同浓度细胞的反复试验，和通过在显微镜下检查它们同时观察孔中完全适当的覆盖而开发。通过阅读器读取适当的孔并且该OD成为新的X值；
ff.训练的观察人员可在纯化的所有阶段评估细胞的细胞学特征；
gg.训练的观察人员可分析药物的分级；
hh.训练的观察人员可分析最佳药物或组合；和
ii.训练的观察人员可分析最有活性的药物候选物(也可包括分析药物代谢物)和其他开发的药物或试剂。
现有技术既没有教导也没有暗示上述与现有技术的区别，并且这些区别本身对于实施之前公开技术的任何人不是显而易见的。
原始MiCK试验和目前版本之间的另一区别是原始MiCK试验避免细胞粘附至平板孔，而目前版本使用对平板孔壁的黏附。细胞粘附至孔壁对于不是血液或 骨髓起源的癌症和肉瘤是必要的。细胞不粘附至孔壁对于检测白血病和淋巴瘤(血液或骨髓起源的癌症)是必要的。该区别的原因是白血病和淋巴瘤细胞在体外以悬液的形式生长。细胞不需要永久性彼此密切接触。相反，来源于实体瘤样本的细胞的确需要细胞与细胞接触和对孔表面的附着。这刺激细胞生存和有时生长。
既然已经一般性阐释了本公开的和之前的MiCK试验方案之间的数个区别，提供本发明方案的实施方式的实施例将室说明性的。包括这些实施例，以仅仅描述示例性实施方式，其不应被解释为涵盖本发明的整个宽度。
实施例
药物诱导的细胞凋亡试验结果与肿瘤医师治疗决定和患者应答和生存的相关性
实验方案和结果的简述
进行前瞻性观察性非盲临床试验，以确定药物诱导的细胞凋亡试验结果对肿瘤医师设计的治疗的作用。将来自患者活组织检查的纯化的癌症细胞投入到微量培养动力学(MiCK)试验中，进行短期培养，其确定单一药物或药物的组合对肿瘤细胞凋亡的作用。肿瘤医师接收试验结果，然后完成治疗方案。
根据本发明的实施方式，MiCK试验的用途被评估并且与患者结果相关联。结果：评估了成功进行MiCK试验的44名患者，所述患者来自：乳腺癌(16名)、非小细胞肺癌(6名)、非霍奇金淋巴瘤(4名)，和其他。4名患者在MiCK之后接收佐剂化疗，和40名接收姑息化疗，其中疗法的中线(median line)为2。肿瘤医师使用本公开的MiC试验，以决定在28名患者(64％)中化疗(使用者)和在16名患者(36％)中不化疗(非使用者)。在接收姑息化学疗法的使用者中，完全加部分应答率(complete plus partial response rate)是44％，相比之下，非使用者中的为6.7％(p<0.02)。使用者中中位总生存期是10.1个月，而在非使用者中为4.1个月(p＝0.02)。使用者中无复发间期是8.6个月，而非使用者中是4.0个月(p<0.01)。结论：根据本发明的MiCK试验经常被肿瘤医师使用。当肿瘤医师基于本发明的MiCK试验结果使用化疗时，与他们不使用试验结果时比较，结果似乎是统计学上更优的。当肿瘤医师可使用时，根据本发明的MiCK试验和其结果有助于决定患者治疗方案。
具体的实验方案和详细结果
进行非随机、多机构前瞻性观察性试验，以便确定当在设计和启动化学疗法之前医师知道试验的结果时，医师使用目前公开的MiCK试验的实施方式的结果的频率。
具有任何阶段的原发性或复发的癌症的患者均适于实验。从患者取具有多至1.0cm3存活肿瘤组织，或1000ml恶性积液，或5ml白血病骨髓抽吸物的无菌肿瘤样本。然后使肿瘤样本进行下述实验方案。
实施例1.一般细胞分离方案
在收集的24至48小时内，切碎样本，用0.25％胰蛋白酶和0.08％脱氧核糖核酸酶在37℃下消化1-2小时，并且然后通过100微米细胞过滤器过滤。当需要时，通过密度梯度离心去除不能生存的细胞。然后在37℃下在组织培养瓶中孵育细胞悬液30分钟，以通过粘附去除巨噬细胞。对于上皮肿瘤，通过用针对T淋巴细胞的CD2抗体缀合磁珠和针对B淋巴细胞的CD 19抗体缀合磁珠孵育30分钟去除淋巴细胞。如果需要，使用CD 14抗体缀合磁珠去除残留的巨噬细胞。将终细胞悬液铺至96孔半区域平板中，每孔120微升等分试样。在37℃下用5％二氧化碳的潮湿气氛孵育平板过夜。每孔接种5x 104至1.5x105个细胞，这取决于细胞体积，以产生充分的孔底部覆盖。
原始细胞危象细胞系中的人JURL-MK2慢性白血病(DSMZ，德国)用作用患者肿瘤细胞进行的MiCK试验的阳性对照。没有酚红的RPMI-1640培养基用于所有的培养。其补充以10％胎牛血清、100单位/mL的青霉素，和100微克/mL的链霉素。通过锥虫蓝染料排斥评估细胞计数和活力。
在污染和坏死细胞的纯化之后，分析每种肿瘤细胞制备物，以确认存在细胞学上恶性肿瘤。如果可利用足够数量的细胞，也进行免疫细胞化学染色，以更好表征肿瘤表型。通过有经验的病理学家的目视评估，所有样本实现至少90％的纯肿瘤细胞含量，和通过锥虫蓝排斥，实现90％活力。
上述一般分离方案可被下述样本具体的分离方案修饰。
实施例2.实体瘤细胞具体的分离方案
在收集的24至48小时内，如下处理样本，以便从实体瘤纯化和分离细胞：
·将样本从运输管取出。
·向培养皿中加入13ml的PBS+高浓度的抗生素(200单位/ml青霉素+200ug/ml链霉素)，并进行测量和对样本照相。在实验室中使用专用方案又混合在一起的溶液制备PBS+抗生素溶液。
·用13ml的PBS+高浓度的抗生素(200单位/ml青霉素+200μg/ml链霉素)洗涤3次培养皿(3个不同培养皿)。
·如果怀疑污染，在具有PBS+高浓度的抗生素的管中孵育20分钟。
·将样本转移至另一具有1至3ml(取决于样本尺寸)的RPMI 50％胎牛血清(FBS)的培养皿中用于切碎。
1)接下来，切碎样本，并且在37℃下用0.25％胰蛋白酶(酶可根据使用的组织而改变)和0.08％脱氧核糖核酸酶消化1-2小时，
·酶将随肿瘤类型按照由研究人员用各种组织的经验开发的方案而改变。
·如果在样本中鉴定了污染的非肿瘤组织，则用小刀去除这些部分。
·用小刀尺寸10或21切碎成1mm片(piece)。
·用钳子收集片，放入15ml管+10-12ml的酶(酶取决于肿瘤类型；见表1)中，在37℃下“旋转器”上的培养箱中孵育45-60分钟。
·用RPMI(4-5ml)洗涤用于切碎的培养皿2-3次，
·将洗涤液放入15ml管中，沉淀2-3分钟。
·去除上清液并且放入新15ml管中，用血球计和锥虫蓝染料检查细胞的生活力(这给出处理应多困难和/或容易的早期指示)，
·将沉淀物放入具有酶的15ml管中并且在37℃下旋转器上孵育45-60分钟。
·孵育之后，收集上清液并且将残留片放回到新鲜酶中在37℃下达另外的45-60min。
2)接下来，通过100微米细胞过滤器过滤样本。
·取决于肿瘤类型和残留“非癌症细胞组织”的量，可也使用40和70μΜ过滤器或filcon。
·如果上清液是粘性的或如果它包含许多碎片，其将堵塞细胞过滤器。在该情况下，可决定使用无菌纱布在50ml管上进行“预过滤”。然后进行上面提到的细胞过滤器过滤过程。
·在1500RPM下使过滤细胞悬液离心5分钟。
·丢弃上清液。向沉淀物添加5ml的红细胞溶解液(标准的包含NH4C1的溶解液：Nh4Cl 0.15M+KHCO310mM+EDTA-4Na 0.1mM，pH 7,2)，孵育2-3min并且添加5ml的RPMI 10％FBS。
·在1500RPM下离心5分钟。使沉淀物再悬浮在RPMI 10％FBS(1-10ml，取决于沉淀物尺寸)中。
·收集酶中的第二部分并且重复上述步骤。
·检查所有部分的生活力并且收集。用Wright Giemsa进行细胞离心涂片染色，以确认群体的细胞含量。注意：这在纯化过程期间进行许多次。
3)当需要时，通过密度梯度离心去除不能生存的细胞。
·密度梯度离心(optiprep)：第一层＝RPMI中2ml细胞+4.45ml optiprep 40％，第二层＝RPMI中optiprep 22.5％，第三层＝0.5ml的RPMI。在2000RPM下离心20分钟。
·收集存活的细胞层，添加10ml的RPMI 10％FBS，在1500RPM下离心5分钟。
·使沉淀物再悬浮在RPMI 10％FBS中(体积取决于沉淀物尺寸和需要的下一步骤)。
·如果样本中存在黏蛋白：使沉淀物再悬浮在10ml的PBS+20mM DTT中并且在4℃下孵育30min，以使黏蛋白分解。用RPMI在1500rpm下洗涤5分钟。使沉淀物再悬浮在RPMI 10％FBS中。
·如果样本高度坏死同时存在碎片：HBSS中的Percoll 20％在800x g下离心10分钟。
4)然后细胞悬液在组织培养瓶中37℃下孵育20min，以通过粘附去除巨噬细胞。
·使用的烧瓶的尺寸和数量和体积取决于细胞的数量。例子：
o 1-5x 106细胞：25cm2烧瓶，3-4ml每个
o 1X 107细胞：75cm2烧瓶，8ml每个
o 1x 108细胞：175cm2烧瓶，20ml每个
·孵育之后，收集细胞悬液，用RPMI 10％FBS洗涤烧瓶3次，收集所有洗涤部分，在1500RPM下离心5分钟。
5)对于上皮肿瘤，通过用针对T淋巴细胞的缀合CD2抗体的磁珠和针对B淋巴细胞的缀合CD 19抗体的磁珠孵育30分钟，以去除淋巴细胞。
·待使用的珠子：T淋巴细胞＝CD2；B淋巴细胞＝CD19；嗜中性粒细胞＝CD 15；单核细胞/巨噬细胞＝CD14，所有白细胞＝CD45(如果没有块(clump)，则使用CD45)。
·通常通过粘附，而不用珠子去除巨噬细胞。原因是如果存在肿瘤细胞块，它们可也包含巨噬细胞。如果我们使用珠子以去除巨噬细胞，其也可同时去除肿瘤细胞。
·将沉淀物再悬浮在小体积的PBS 2％FBS(0.2至2ml)中。
·用PBS 2％FBS洗涤珠子悬液3次，
·将珠子添加至细胞悬液中并且在室温下旋转器上孵育30分钟。
·将管放置在磁铁上，等待1分钟。
·收集细胞悬液，放入具有5ml RPMI 10％FBS的15ml管中
·将细胞悬液的管再次放置在磁铁上，以去除残留珠子，收集细胞悬液并且放入新的15ml管中。
·在1500RPM下离心5分钟。
·再悬浮在RPMI 10％FBS中，体积取决于沉淀物尺寸。进行细胞计数和测定生活力，制作细胞离心涂片以确定细胞含量。
6)如果需要，使用缀合CD 14抗体的磁珠去除残留的巨噬细胞。
·在其他珠子如上步骤5中概括的被处理同时进行该步骤。
·查看细胞生活力。如果生活力小于80-85％可需要另外步骤。如果情况是这样，重复如步骤3中描述的密度梯度离心(optiprep)。这将去除死的细胞。
7)将终细胞悬液铺至96孔半区域平板，或384孔板中，其中每孔62.5微升等分试样，或384孔板中，其中每孔20微升等分试样，如表2中所指示。 
·调整细胞浓度至1x 106细胞/ml。
·进行检测孔。对于corning 384＝15μl的RPMI 10％FBS+45μl的细胞悬液→在500rpm下离心1分钟。对于Greiner＝2.5μl或RPMI 10％FBS+15μl的细胞悬液→在500rpm下离心30秒。
·在倒置显微镜下查看孔。细胞应彼此接触，但不重叠。根据需要通过浓缩(离心机和去除培养基)或稀释(添加培养基)调整细胞浓度。
·重复直到出现最佳细胞浓度。
·将细胞放入孔板中。
8)将平板在37℃下5％二氧化碳潮湿的气氛中孵育过夜。根据细胞体积每孔接种5xl04至1.5xl05个细胞，以产生足够的孔底部覆盖。
·在其中热分布和湿度最优化的潮湿室内部孵育平板，以减少“边际效应”(孔中不好的细胞分布)。
9)原始细胞危象细胞系中的人JURL-MK2慢性白血病(DSMZ，德国)用作用患者肿瘤细胞进行的MiCK试验的阳性对照。
·如果使用半区域96孔平板，每孔的总体积是120μl。
10)没有酚红的RPMI-1640培养基用于所有的培养。
11)其补充以10％胎牛血清、l00单位/mL的青霉素，和100微克/mL的链霉素。 
12)通过锥虫蓝染料排斥评估细胞计数和生活力。
注意：在纯化程序期间进行数次细胞计数和生活力检查，然后添加细胞至平板的孔中。
13)在纯化污染和坏死细胞之后，使用迪夫快速(diff quick)或Pap染色分析每种肿瘤细胞制备物。这是非常改善的方法，允许鉴定感兴趣的细胞群体和确认存在少数残留的污染细胞。
14)如果足够数量的细胞可用，也进行免疫细胞化学染色，以更好表征肿瘤表型。
15)通过有经验的病理学家的目视评估，所有样本实现至少90％的纯肿瘤细胞含量，和通过锥虫蓝排斥，实现90％生活力。
实施例3.血液/骨髓细胞具体的分离方案
在收集的24至48小时内，如下处理样本：
·将血液收集到50ml管中。
·取等分试样用于涂片。
·在2.86％乙酸中用血球计进行细胞计数。
·取等分试样，用于流式细胞术。
·用等体积的RPMI稀释血液。
·进行淋巴细胞分离剂(lymphoprep)离心(在2000RPM下30min)→4ml淋巴细胞分离剂覆盖多达8ml的血液/RPMI混合物。
·收集单核细胞层，添加10ml的RPMI 10％FBS并且在1500RPM下离心5分钟。
·将沉淀物再悬浮在5ml的RBC溶解液中，孵育2-3min并且添加5ml的RPMI10％FBS，在1500下离心5分钟。
·将沉淀物再悬浮在RPMI 10％FBS中，进行细胞计数+细胞离心涂片。
·根据流式细胞术结果，用磁珠去除不需要的细胞(单核细胞＝CD 14，T淋巴细胞＝CD2，B淋巴细胞＝CD 19，嗜中性粒细胞＝CD 15)。
·将沉淀物再悬浮在小体积的PBS 2％FBS(0.2至2ml)中。
·用PBS 2％FBS洗涤珠子悬液3次。
·将珠子添加至细胞悬液中，并且在室温下在旋转器上孵育30分钟。
·将管放置在磁铁上，等待1分钟
·收集细胞悬液，放入具有5ml的RPMI 10％FBS的15ml管中。
·将细胞悬液的管再次放置在磁铁上，以去除残留珠子，收集细胞悬液和放入新15ml管中。
·在1500RPM下离心5分钟。
·再悬浮在RPMI 10％FBS中，体积取决于沉淀物尺寸。进行细胞计数和确定生活力，制备细胞离心涂片，以确定细胞含量。
·取等分试样用于流式细胞术。如果结果确认了感兴趣的细胞群体的纯度，调整细胞浓度至大约2xl06细胞/ml并且使用微平板阅读器检测系数。系数的目标值应在0.8和1.0之间
·通过浓缩或稀释悬液调节细胞浓度。再次检测系数直到获得令人满意的值。
·将细胞放入平板中并且立即开始MiCK试验程序。
实施例4.积液具体的分离方案
在收集的24至48小时内，如下处理样本：
·将样本转移至50ml管中，并且也取10ml等分试样于15ml管中(使等分试样在2000RPM下离心5min，进行细胞计数和制备细胞离心涂片以产生理想的细胞含量和样本计数)。
·使管在2000RPM下离心1分钟。
·去除上清液但是每管留下～5ml。组合所有管并且在许多需要的50ml管中用PBS以1:1稀释。在2000RPM下离心10min。
·进行RBC溶解2-3分钟。体积取决于沉淀物尺寸。添加等体积的RPMI 10％FBS。
·在1500RPM下离心5分钟。
·将沉淀物再悬浮在RPMI 10％FBS中，体积取决于沉淀物尺寸。
·进行细胞计数和确定生活力。
·生活力对于整个方法是关键的。必须确定生活力是否小于～70％。如果小于，则进行optiprep离心。
·如果生活力符合可接受的标准，并且如果主要污染细胞是巨噬细胞，则经粘附去除这些细胞。
·如果存在来自主要细胞类型的高度污染并且总细胞计数高(5X107细胞或更多)，用CD45珠子(每个细胞1个珠子)进行第一纯化步骤。然后如果需要第二次和第三次重复珠子。
·进行细胞计数和确定生活力。
·如果必要如病理学家推荐的那样重复optiprep。
·系数调整-基于病理学家的推荐调整实体瘤样本的系数。
·当达到最佳细胞浓度时，将细胞放入平板中并且在培养箱的孵育室中(37℃)孵育过夜。
实施例5.用于评估抗癌药物候选物介导的细胞凋亡的改良的MICK试验
从美国专利号6,077,684和美国专利号6,258,553中描述的方法调整MiCK试验程序，这两篇专利通过引用以它们的整体并入本文。而且，MiCK试验还描述在：Kravtsov,V“等细胞凋亡的微量培养动力学试验确定白血病的化学敏感性的应用(Use of the Microculture Kinetic Assay of apoptosis to Determine Chemosensitivities of Leukemias)”,Blood 92:968-980(1998)中，为了所有目的，其通过参考以其整体并入本文。使用的具体MiCK试验方案描述在实施例1-4中。
在过夜孵育之后，使用自动移液器，将化疗药物以5微升等分试样添加至96-孔板的孔中或以2.5微升等分试样添加至384孔板的孔中。药物或药物组合的数量 以及检测的浓度数量取决于从肿瘤样本分离的存活的恶性细胞的数量。通过摩尔浓度测定的药物浓度是制造商指示为期望的血液水平浓度加上或减去一个连续稀释——如果足够多的细胞可用——的那些浓度。
在药物添加之后，在37℃下5％二氧化碳潮湿气氛培养箱中孵育平板30分钟。然后用无菌矿物油覆盖每个孔，并且将平板放入微平板分光光度阅读器的培养室中。读取在600纳米处的光密度并且在48小时的时间段内每5分钟记录一次。通过专用软件ProApo用之前通过引用并入的Kravtsov参考文献描述的公式(即Kravtsov V.等“细胞凋亡的微量培养动力学试验确定白血病的化学敏感性的应用(Use of the Microculture Kinetic Assay of apoptosis to Determine Chemosensitivities of Leukemias)”,Blood 92:968-980(1998))，将与细胞凋亡相关的光密度增加转换成细胞凋亡的动力学单位(KU)，并且与患者结果相关联。活性细胞凋亡指示为>1.0KU。产生≤1KU的药物被描述为无活性的，或肿瘤抵抗该药物，这基于之前的KU与药物诱导细胞毒性的其他标记物的实验室相关性(培养中的生长、胸苷吸收)。
用从本公开的MiCK试验获得的数据治疗患者
前述研究和相关的MiCK方案是前瞻性多机构非盲试验。在启动任何疗法之前获得的MiCK试验结果都传送给医师。医师用医师自己认为临床上需要的药物的选择治疗患者，并且自由使用或不使用来自MiCK试验的任何数据。通过RECIST或其他临床标准测量肿瘤应答。评估患者在试验之后的复发时间和试验之后的生存。
就如何使用MiCK试验结果，没有规则或方向。研究评估肿瘤医师是否使用试验的结果，是否也使用其他数据(例如，雌激素受体分析或Her2试验结果，或添加其他药物)或是否不使用试验结果。因为没有给出关于使用试验的指示或规则，感觉这是试验如何被用于肿瘤医师在治疗规划中具有完全判断的“真实世界”中的更可靠的检测。
统计评估
研究的目标之一是鉴定医师使用MiCK试验结果以帮助决定患者治疗的频率，和使MiCK试验的使用与应答率、无复发间期和总团体生存相关联。医师完成问卷，其中他们描述在返回试验数据之前计划什么样的治疗，在报告试验之后使用什么样的治疗，和试验是否用于形成给予患者的最终治疗。将数据输入SAS软件 用于分析。如果样品具有多剂量的相同药物，那么将具有最高KU值的浓度分配给该药物。非参数Kaplan-Meier乘积极限方法用于生存分析和无复发间期分析。在该分析中，对数秩检验用于比较生存曲线和Wilcoxon检验用于比较中值。使用列联表和Fisher's精确检验比较应答率。
调查审查委员会批准
在从Western IRB in Seattle，Washington获得IRB批准并经其监控之后，调查人员进行该试验。在提交肿瘤样本用于MiCK分析之前，给予每个患者书面的自愿知情同意书。该临床试验在clinicaltrials.gov记录为NCT00901264。
结果
患者特征描述在表3中。平均年龄超过65，并且29名患者是女性。研究了各种肿瘤，包括乳腺癌(16)、非小细胞肺癌(6)、非霍奇金淋巴瘤(4)和其他。医师最普通地招募考虑姑息化学疗法的患者。仅仅招募考虑佐剂化学疗法的4个患者。在MiCK试验之后计划用于姑息护理的疗法的中线是第二线，范围从第一线治疗至第八线治疗。患者的平均随访时间是4.5个月(其医师没有使用MiCK试验的患者是4.0个月，而其医师使用MiCK试验规划治疗的患者是5.6个月)。
MiCK试验结果被医师频繁使用(表4)。64％的患者至少部分基于MiCK试验接收化疗。18名(41％)仅仅使用MiCK试验。在10患者(23％)中，医师使用MiCK结果，但也将该信息结合在该试验中未检测的其他药物，或基于个体患者特征，比如器官功能和基于肿瘤生物特征修饰试验结果。开发终治疗方案时，肿瘤医师考虑这些改变肿瘤的生物特征。例如，在乳腺癌中，激素-受体阳性患者除了化学疗法还接受激素试剂，和在Her2阳性患者中除了化疗，还接受曲妥珠单抗。在考虑进行药物诱导的细胞凋亡试验之前，具有非小细胞肺癌的egfr-突变阳性的患者接收埃罗替尼(erlotnib)。CD20阳性非霍奇金淋巴瘤患者除了化学疗法还接受利妥昔单抗。在22名患者(50％)中，基于使用MiCK试验结果产生化疗的改变。
即使患者已经签署获得试验的知情同意书，但是在16个病例中，医师没有使用该试验以决定患者治疗。在1个病例中，患者参加了临床试验。在被告知试验结果和基于试验的建议的治疗之后，7名患者优选用另一疗法治疗(通常由于在MiCK试验中鉴定为最佳疗法的毒性)。在其他8名患者中，基于文献或医师个人的经验，医师优选使用另一治疗。
在治疗的最大患者子集的乳腺癌中，9/16[56％]的患者基于MiCK试验被治疗。在3/9中，MiCK试验与其他非检测的药物一起使用，在3/9中，MiCK结果结合靶向生物疗法使用。在2/9中，MiCK结果结合激素疗法，和在1/9中，仅仅使用在MiCK试验中有活性的药物。
对化学疗法普通对专有选择的影响
在16名患者(36％)中，肿瘤医师将在知道MiCK试验之前打算使用的专有化疗在研究试验结果之后改变至实际使用普通药物。在3名(7％)患者中，医师将打算使用的普通药物改变成实际使用的专有药物。在9名患者(20％)中，医师在MiCK试验之后使用单一药物疗法，相比之下，在知道MiCK试验结果之前打算使用组合疗法。在4名患者(9％)中，肿瘤医师在MiCK试验结果之后使用组合疗法，相比之下，在知道MiCK试验结果之前打算使用单一药物。
当医师使用MiCK试验时，他们使用在16名患者中产生最高KU值的化疗。在23名患者中，医师使用具有较高细胞凋亡程度(大于2KU)的治疗。
对患者结果的影响
在接收姑息化学疗法的患者中，比较使用或不使用MiCK试验的完全加部分应答率(表5)。如果医师使用MiCK试验的结果，完全加部分应答率是44％。相比之下，如果医师不使用MiCK试验，则仅仅6.7％CR加PR比率(p<0.02)。
比较使用或不使用MiCK试验结果的总体生存(图2)。如果医师使用MiCK试验用于确定患者疗法，平均总体生存是10.1个月，相比之下，如果医师不使用MiCK试验结果，仅仅为4.1个月(p＝0.02)。
比较医师使用MiCK试验决定疗法的患者的无复发间期与医师不使用MiCK试验结果的患者的无复发间期(图3)。医师使用MiCK试验的患者的中值无复发间期是8.6个月，相比之下，医师不使用MiCK试验的患者为4.0个月(p<0.01)。
为了排除当肿瘤医师使用MiCK试验时向基于MiCK试验选择的化疗添加其他药物导致观察的优势的可能性，我们比较了肿瘤医师仅仅使用MiCK试验的患者的结果与肿瘤医师没有使用MiCK试验的患者的结果。完全应答率和部分应答率在仅仅基于MiCK试验治疗的患者中(43.8％)比不使用MiCK试验(6.7％，p＝0.04)治疗的患者中更高。与没有使用MiCK试验治疗的患者的总体生存(中值4.1个月，p＝0.02)相比，仅仅基于MiCK试验治疗的患者的总体生存(中值10.1个月)更长。 与没有使用MiCK试验治疗的患者的无复发间期(中值4.0个月，p＝0.03)相比，仅仅基于MiCK试验治疗的患者的无复发间期(中值8.0个月)更长。因此，我们得出结论，MiCK试验的使用(并且没有添加其他药物)与改善的结果观察相关。
讨论
该使用研究是非盲的，从而肿瘤医师在活组织检查的72小时内接收药物诱导的细胞凋亡结果和体外哪种疗法最佳的实验室解释，和检测的每种单一药物或组合的细胞凋亡的实际KU。
结果表明MiCK试验频繁被医师使用，以决定患者治疗。肿瘤医师使用该前瞻性生物分析设计化疗治疗方案的64％比率认为是临床应用的证据(医师在患者护理中使用该结果)。
该研究中的结果指示不仅仅是肿瘤医师愿意使用试验的结果，而且当他们这样做时，结果可能优于当医师不使用试验时的结果。这些患者中改善的程度足够大，是统计学上显著的。
改善结果的这种发现也可通过避免使用较无效疗法降低治疗的成本。当普通药物可能至少与专有药物一样有用时，通过提示，关于医师通常使用较便宜的普通药物的观察可能对于肿瘤医师是重要的。
因此，当医师知道MiCK试验结果时，他们频繁使用该结果以规划患者治疗。当医师使用该结果时，患者结果似乎更好。
实施例6.复发的/转移性乳腺癌(CA)中体外化疗(CT)-诱导的细胞凋亡(APOP)的模式：普通多来源药物(普通药)与专有单一来源药物(专有药)的比较。
实验背景
转移性乳腺癌的疗法涉及普通和专有之间，和组合化学疗法(Combos)和单试剂化学疗法之间的选择。该实验确定普通对专有，以及Combos对单试剂的相对体外化疗诱导的细胞凋亡。
方法
使用实施例1-4描述的微量培养动力学(MiCK)试验，通过化疗，将来自67名患者(Pt)活组织检查的纯化乳腺癌细胞投入到短期培养中。在48小时内每5分钟分析细胞凋亡。细胞凋亡由细胞凋亡的动力学单位(KU)定义。显著细胞凋亡>1.0KU。基于复制分析，个体试验之间的显著差异>0.57KU。
基于下述方案将药物归类为普通药(g)或专有药(p)：
普通药＝5-氟尿嘧啶、卡铂(carboblatin)、顺铂、环磷酰胺、多柔比星、依托泊甙、表柔比星、异环磷酰胺、氨甲喋呤、米托蒽醌、泰素(taxol)、泰索帝、长春新碱、长春瑞宾、长春花碱。
专有药＝凯素、盐酸多柔比星脂质体、艾瑞布林、健择(gemzar)、伊沙匹隆、奥沙利铂、希罗达。
结果
评估43名患者(pts)用于比较普通药对专有药。36/43Pts(84％)中，普通药产生的APOP>专有药并且在6Pts(14％)中＝专有药。1Pt(2％)中，专有药产生的APOP>普通药。这些结果阐释在表6和16中。而且，表7进一步阐释患者的乳腺癌样本特征。
类别内部比较指示表柔比星的平均APOP>多柔比星(P＝0.01)，顺铂的APOP>卡铂(P<0.01)；长春瑞滨的APOP>长春新碱(P＝0.02)；多西紫杉醇的APOP>纳米白蛋白结合型紫杉醇(nab-paclitaxel)(P＝0.01)；而多西紫杉醇和紫杉醇APOP没有不同(P＝0.85)。这些和其他详细比较可见表8-33。
但是，在个体Pts中，在37％的Pts中多西紫杉醇的APOP>紫杉醇，而31％的患者紫杉醇比多西紫杉醇更好。对于Combos，25％的患者环磷酰胺+多柔比星产生的APOP>单试剂，而67％的患者单试剂的APOP＝或>环磷酰胺加多柔比星。在33％的患者中，环磷酰胺加多西紫杉醇的APOP>单试剂，但是66％的患者单试剂的APOP＝或>环磷酰胺加多西紫杉醇。这些和其他详细比较可见于表8-33。
结论
普通APOP通常等于或好于专有APOP。在个体患者中，单试剂比Combos频繁产生更高的APOP。目前公开的MiCK APOP试验可鉴定具有转移性乳腺CA的个体Pts，对于其普通或单试剂比专有或Combos产生更高的APOP。这些差异可导致健康护理成本的很大节约。
实施例7.普通多来源(普通)化疗(CT)药物与专有单来源(专有)药物一样有效吗？来自非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌(结肠CA)比较复发的/转移性乳腺癌(乳腺CA)中体外CT-诱导的细胞凋亡(APOP)的证据。
实验背景
我们已经表明来自复发或转移性乳腺癌患者(Pts)的癌症细胞用普通药比专有药频繁显示更多或更好的细胞凋亡(上面讨论的实施例6)。我们已经比较了NSCLC和结肠癌患者中体外细胞凋亡的这些观察。
方法
使用实施例1-4描述的微量培养动力学(MiCK)试验，将来自患者活组织检查的纯化肿瘤细胞投入到短期培养中。48小时内每5分钟分析细胞凋亡。细胞凋亡由细胞凋亡的动力学单位(KU)定义。
基于复制分析，显著的细胞凋亡>1.0KU，个体试验之间的显著差异定义为>0.57KU。比较来自乳腺CA、结肠CA和NSCLC的结果。
基于下述方案将药物归类为普通药(g)或专有药(p)：
普通药＝环磷酰胺、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、卡铂、卡铂/泰素、卡铂/泰索帝、顺铂、顺铂/泰素、顺铂/泰索帝、表柔比星/依托泊甙、依托泊甙、伊达比星、异环磷酰胺、伊立替康、美法仑、氨甲喋呤、丝裂霉素、米托蒽醌、托泊替坎、长春花碱、长春新碱、长春瑞宾。专有药＝5-氟尿嘧啶/伊立替康/奥沙利铂、5-氟尿嘧啶/奥沙利铂、力比泰、力比泰/泰素、力比泰/卡铂、力比泰/顺铂、顺铂/健择、伊立替康/希罗达、力比泰/健择、格列卫、奥沙利铂/希罗达、索拉非尼、舒尼替尼、塔西法、希罗达、凯素、健择、奥沙利铂。
结果
41名NSCLC患者(pts)、8名结肠CA Pts和67名乳腺CA Pts具有成功的培养物。在25/32NSCLC Pts(78％)中、4/7结肠CA Pts(57％)中和36/43乳腺CA Pts(84％)中，普通药产生的APOP大于专有药。在5名NSCLC Pts(16％)中、1名结肠CA Pt(14％)中和6名乳腺CA Pts(14％)中，普通药产生的APOP＝专有药。在2名NSCLCPts(6％)中、2名结肠CA Pts(29％)中和1名乳腺CA Pt(2％)中，专有药产生的APOP大于普通药。0名NSCLC、结肠CA或乳腺CA Pts中没有药物产生的显著APOP(KU小于1.0)。专有药在结肠CA中比在乳腺CA中产生更多的APOP(p<0.05)。这些结果可见于：表6(所有的疾病样本)；表16(乳腺癌样本)；表34(肺癌样本)；和表35(结肠癌样本)。与普通药物更有效还是专有药物更有效相关的、检测组织样本类型之间的统计显著性的比较可见于图4-7。
结论
在大部分NSCLC、结肠CA和乳腺CA Pts中，普通药物在体外可产生等于或优于专有药物的APOP。普通药物至少如专有药物一样有活性的频率根据疾病而改变，并且在乳腺CA中相比结肠CA更高。但是，MiCK APOP试验可鉴定哪个个体Pts可能需要使用专有药物。这些结论证明前瞻性临床试验确认这些体外结果。基于APOP试验增加使用普通药物可有助于控制卫生保健成本。
实施例8.乳腺、结肠和非小细胞肺癌中通过使用化学疗法诱导的细胞凋亡试验的成本节省。
实验背景
在美国化疗成本变得非常高。我们已经在之前的实施例1-7中证明已经开发了改进的化学疗法诱导的细胞凋亡试验(微量培养动力学，或MiCK试验)。显示使用该试验设计化疗治疗与临床结果的改善相关：改善的应答率、至复发时更长的时间，和更长的生存(实施例5)。之前呈现的实验也指示，在该试验中，来自普通多来源药物的药物诱导的细胞凋亡通常大于或等于来自专有单一来源药物的细胞凋亡(实施例5-7)。所以，进行该实验，以评估通过使用MiCK试验用普通多来源药物代替专有单一来源药物在治疗乳腺、结肠和非小细胞肺癌患者时可能的成本节约。我们使用普通术语(term)、货币结果，以指示由利用一种药物候选物相对于另一药物候选物的货币差异。例如，如果选择的药物(通常是普通药)比比较的专有相对物相对更便宜，则这些货币结果可对患者或卫生保健系统有益。在其中选择的普通药物比起专有相对物更便宜的情况下，可将货币结果(例如使用普通药和专有药之间的成本差异)称为成本节约。但是，货币结果未必导致成本节约，因为具有较高KU值的药物可能是花费相对更多钱的药物候选物。在该情况下，基于MiC试验选择药物候选物用于患者的货币结果将导致货币的相对损失，因为将选择更昂贵的药物。普通货币结果术语也可进一步利用下面详述的平均药物节省、试验调整的平均药物节省，和净平均药物节省统计学描述。
方法
使用实施例1-4描述的微量培养动力学(MiCK)试验，将来自患者活组织检查的纯化肿瘤细胞投入到短期培养中。即，获得具有至少0.5cm3存活的肿瘤组织、5个针芯活检(core needle biopsy)，或1000ml的恶性积液的无菌肿瘤样本。在收集的24至48小时内，切碎样本，用0.25％胰蛋白酶和0.08％脱氧核糖核酸酶在37℃ 下消化1-2小时，并且然后通过100微米细胞过滤器过滤。当需要时，通过密度梯度离心去除不能生存的细胞。然后在37℃下在组织培养瓶中孵育细胞悬液30min，以通过粘附去除巨噬细胞。对于上皮肿瘤，通过用针对T淋巴细胞的缀合CD2抗体的磁珠和针对B淋巴细胞的缀合CD 19抗体的磁珠孵育30分钟去除淋巴细胞。如果需要，使用缀合CD 14抗体的磁珠去除残留的巨噬细胞。将终细胞悬液平铺至96孔或384孔半区域平板中，每孔120微升等分试样。将平板在37℃下用5％二氧化碳潮湿的气氛孵育过夜。每个孔接种5x104至1.5xl05个细胞，这取决于细胞体积，以产生完全孔底部覆盖。原始细胞危象细胞系中的人JURL-MK2慢性白血病(DSMZ，德国)用作用患者肿瘤细胞进行的MiCK试验的阳性对照。没有酚红的RPMI-1640培养基用于所有的培养。其补充以10％胎牛血清、100单位/ml的青霉素和100微克/ml的链霉素。通过锥虫蓝染料排斥评估细胞计数和生活力。在纯化污染和坏死细胞之后，通过病理学家使用苏木精/伊红染色的细胞离心涂片制备物分析每种肿瘤细胞制备物，以确认存在细胞学上的恶性肿瘤。如果足够数量的细胞可用，也进行免疫细胞化学染色，以更好表征肿瘤表型。为了评估，肿瘤样本包含至少90％肿瘤细胞含量——通过病理学评估——和90％生活力——通过锥虫蓝排斥。
在过夜孵育之后，化疗药物以5微升等分试样添加至96孔板的孔中。药物或药物组合的数量和检测的浓度的数量取决于从肿瘤样本分离的存活的恶性细胞的数量。通过摩尔浓度测定的药物浓度是制造商指示为期望的血液水平浓度加上或减去一个连续稀释——如果足够多的细胞可用——的那些浓度。药物添加之后，平板在37℃下5％二氧化碳潮湿的气氛培养箱中孵育30分钟。然后用无菌矿物油覆盖每个孔，并且将平板放入微平板分光光度阅读器的培养室(BioTek工具)中。读取在600纳米处的光密度并且在48小时时间内每5分钟记录一次。通过专用软件ProApo用上述公式将与细胞凋亡相关的光密度增加转换成细胞凋亡的动力学单位(KU)。活性细胞凋亡指示为>1.0KU。产生<1KU的药物被描述为无活性的，或肿瘤抵抗该药物，这基于之前的KU与药物诱导的细胞毒性的其他标记物的实验室相关性(培养中的生长、胸苷吸收)。
分析来自在研究截止日期前完成的具有复发疾病的乳腺癌、结肠癌或非小细胞肺癌患者的所有试验的结果。仅仅在专有单一来源药物和普通多来源药物都在 试验中被检测的情况下，研究才是有价值的。药物的优势定义为细胞凋亡高于比较药物0.57U或更多。等效定义为一种药物的细胞凋亡在第二药物的0.57KU内。劣势定义为一种药物的细胞凋亡比第二药物的低0.57单位或更多。
使用6个周期治疗的医疗保险支付评估化疗的成本(基于2011年第四季度的支付方案)。化疗周期由3或4周的治疗组成(取决于药物或组合)。假设患者的表面积为1.8m2，因为这是人的平均尺寸。该测量用于计算药物的剂量。
专有单一来源药物是纳米白蛋白结合型紫杉醇、吉西他滨、奥沙利铂、卡培他滨(capcitabine)、伊沙匹隆、艾瑞布林、脂质体多柔比星和培美曲塞(pemetrexed)。
普通多来源药物是环磷酰胺、多柔比星、表柔比星、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、伊立替康、托泊替坎、长春瑞滨和长春花碱。
用于乳腺癌的专有药物或组合是纳米白蛋白结合型紫杉醇、卡培他滨和吉西他滨；用于结肠癌的是5-氟尿嘧啶加亚叶酸(leucovorin)加奥沙利铂；和用于非小细胞肺癌的是培美曲塞加顺铂和吉西他滨加顺铂。
用于乳腺癌的普通药物或组合是长春瑞滨、多西紫杉醇加环磷酰胺和表柔比星加环磷酰胺；用于结肠癌的是5-氟尿嘧啶加亚叶酸加伊立替康；和用于非小细胞肺癌的是卡铂加紫杉醇、长春瑞滨或多西紫杉醇。
计算每种药物或组合的6个周期的医疗保险报销，然后比较对于每种癌症的专有药物的平均值和普通药物的平均值。
平均药物节省定义为平均专有药物成本减去平均普通药物成本的差。试验调整的平均药物节省定义为乘以普通药物优于或等效于专有药物的频率的药物节省(如通过MiCK试验确定)。净平均药物节省定义为试验调整的平均药物节省减去$5000，其为估计的MiCK试验成本。成本节省百分比定义为被平均专有药物成本相除的净药物节省。下述公式阐释了这些关系：
平均药物节省＝平均专有药物成本-平均普通药物成本
试验调整的平均药物节省＝(平均专有药物成本-平均普通药物成本)x普通药物优于或等效于专有药物的频率
净平均药物节省＝(平均专有药物成本-平均普通药物成本)×普通药物优于或等效于专有药物的频率-MiCK试验的成本
统计分析
针对每种癌症确定三个最广泛使用的治疗程序。然后，确定每个治疗的标准平均剂量，以及个体患者的每种癌症的医疗保险允许的成本。然后，运行MiCK试验并且结果允许基于各种癌症类型确定最佳治疗方案。然后比较这些MiCK试验推导的最佳治疗方案的常规治疗成本。比较之后，结果和基于MiCK试验结果选择的最佳治疗方案由国家认可的癌症成本咨询师审查。
结果
评估了7名结肠癌患者、32名非小细胞肺癌患者和43名乳腺癌患者(表6和如实施例7中呈现)。表指示普通多来源药物在71％的结肠癌、98％的乳腺癌和94％的非小细胞肺癌中等于或大于专有单一来源药物。专有药物在29％的结肠癌患者、2％的乳腺癌患者和6％的非小细胞肺癌患者中产生更多的药物诱导的细胞凋亡。
然后如该方法中描述地模拟药物的护理成本。结果指示六个月单独药物护理的成本差异(不包括化疗施用、支持护理药物、肿瘤检测、住院或急救护理)列在表36和表37中。
在所有3种癌症中，通过用普通药物代替专有药物有大量的节省。
对于每种癌症，试验调整的平均药物节省保持较高(表36)。估计的每个患者的净节省从$8,321至$20,338不等。成本节约百分数从42.8％至54％不等。基于本发明的方法，乳腺癌治疗表明43％的节省；结肠癌治疗表明54％的节省；和非小细胞肺癌治疗表明47％的节省。
讨论
该研究指示使用本发明实施方式的药物诱导的细胞凋亡试验可导致大量的成本节约(表36)。这假设所有的医师在没有该试验的情况下会使用专有药物或组合，并且假设当医师注意到该试验结果时，医师会遵循试验的指导并且使用普通药物或组合——如果普通药物或组合比专有药物和组合更好或相等，并且使用专有药物或组合——如果专有药物或组合在试验中更好。
该研究假设所有医师使用在药物诱导的细胞凋亡试验中最佳的药物。在之前的实施例(实施例5)中，发现医师在64％情况下，使用来自药物诱导的细胞凋亡试验的最佳结果。所以，净成本节约(表36中估计的)可能下降多达36％。但是，随着之前实施例5中的研究继续，更多数量的医师遵循试验的指导，指示使用来自药物诱导的细胞凋亡试验结果的64％的使用比例可能是最小估计。
潜在的成本节约也必须承认仅仅对于试验中检测的化疗药物。随着某些疾病(例如乳腺癌)可以使用更多的专有药物，可能更多比例的患者可对专有药物更有应答，所以净成本节约更少。也有可能一些专有药物变成普通的(例如结肠癌)，因此，可能减少差异成本和降低使用试验的潜在成本节约影响。
然而，该研究提示更广泛使用本发明实施方式的药物诱导的细胞凋亡试验很可能导致对患者和对健康方案的大量的成本节约——如果在肿瘤群体中广泛实施。更重要地，不仅仅成本更低，而且如实施例5中指示，当医师使用本公开MiCK试验实施方式设计患者疗法时患者结果更好。根据本发明的实施方式使用MiCK试验与统计学上显著更高的完全应答率和部分应答率、至复发更长的时间，和更长的生存相关(实施例5)。
因此，利用本公开的MiCK药物诱导的细胞凋亡试验可能够鉴定每个乳腺、结肠和肺癌患者的主导疗法。利用本公开试验选择的疗法具有更好的结果和较低成本。本文描述的MiCK试验将是健康护理改革和个性化医疗的重要工具。
实施例9.显微照相实验
进行实验以验证在如所要求的方法中使用显微照相。显微照片(图8和9)分别阐释过夜孵育之前和过夜孵育之后的细胞分布和细胞生活力。所以，显微照片可用于评估细胞生活力，并可被认为是细胞分离/纯化过程的最后步骤，或可被认为是MiCK试验的开始。
图8是过夜孵育之前平板一个孔中的细胞的显微照片。图9是15小时的过夜孵育之后相同孔的显微照片。图9中的细胞好像更椭圆和稍微扁平，因为它们现在粘附至孔底部。图9表示在该方法中抗癌药物候选物准备添加至孔时刻的孔中细胞的状况。
实施例10.患者具体的癌症细胞检测
进行实验，以确认哪种潜在的抗癌药物候选物对于具体的患者最有效。实验因此验证公开的方法和试验作为产生个体化的癌症治疗方案的有效工具。
对从55岁女性的脾和腹部肿瘤活组织检查样本收集的赘生性细胞进行实验。肿瘤样本是原发灶不明的。实验由使用根据本公开的MiCK试验检测37种潜在抗癌药物、这些药物的组合，和这些药物的各种浓度的效力组成。
基于结果，顺铂是对该患者最有效力的单一药物。顺铂的KU值大于l0KU(表38)。但是，任何用作单个试剂的基于铂的药物均非常有效。舒尼替尼或环磷酰胺，作为非基于铂的药物也产生非常有效的结果并且如果患者不耐受铂，将是好的备选方案。
MiCK试验中，细胞凋亡读数大于5.0KU认为是非常敏感并且与好的临床应答相关。所有试剂和试剂的组合针对活的对照细胞系进行对照检测并且发现诱导适当水平的细胞凋亡。应当注意，烷基化试剂环磷酰胺和异环磷酰胺需要肝代谢物分别转变成它们的活性代谢物4HC和4HI，并且所以不能直接体外检测。对于MiCK试验，分别使用它们的活性代谢物4HC和4HI。
实验也检测各种浓度的37种抗癌药物候选物并且该数据可见于图10。可观察到一些检测的抗癌药物对细胞凋亡具有不同的应答，这取决于浓度，而其他药物候选物显示对改变的浓度没有应答。
表1.取决于样本肿瘤类型的酶利用
表2.终细胞悬液铺平板方案
表3.患者特征
患者数量 44
年龄(平均值) 65.1岁
性别 29名女性
肿瘤类型  
乳腺癌 16
非小细胞肺癌 6
非霍奇金淋巴瘤 4
胰腺癌 3
卵巢癌 2
皮肤癌 3
其他 10
表现状态(ECOG平均数) 1.3
治疗线  
佐剂 4
第一线 16
第二线 9
第三线 5
第四线 1
第五线或更高 5
表4.MICK试验使用的模式
医师使用的MiCK试验 28
仅仅使用试验结果 18
使用试验和其他数据 8
使用试验加其他药物 9
使用试验，但是由于器官功能被改良 2
医师不使用MiCK试验结果 16
患者偏爱不使用药物 7
在临床试验的患者 1
医师不使用结果 8
表5.对MICK试验使用的应答的相关性
  CR PR 稳定的 进展
医师使用试验结果 3 8 8 6
医师不使用试验结果 0 1 3 11
表6.在MiCK药物诱导的细胞凋亡试验中比较普通多来源药物与专有单一来源药物
表7.患者特征(n＝72)
(N＝67，用MiCK试验分析来自乳腺癌患者的组织样本。患者特征显示在下面)
表8.各种药物的KU总结统计学
仅仅考虑有至少9个样品的药物
在下述表9-15中，为了比较两种药物，使用成对t-检验方法分析它们对患者水平的KU值。
表9.患者KU的成对比较：表柔比星对多柔比星对米托蒽醌
药物比较 平均差(95％CI) 统计显著性
表柔比星-多柔比星(n＝34) 0.37(0.08至0.66) 0.01
表柔比星-米托蒽醌(n＝21) 0.83(0.38至1.28) <0.01
多柔比星-米托蒽醌(n＝18) 0.63(0.11至1.15) 0.02
(这些药物似乎彼此不同，其中最大差异在表柔比星和米托蒽醌之间。)
表10.患者KU的成对比较：环磷酰胺对异环磷酰胺
(环磷酰胺和异环磷酰胺之间有边界(borderline)统计显著性。)
表11.患者KU的成对比较：卡铂对顺铂对奥沙利铂
药物比较 平均差(95％CI) 统计显著性
顺铂-卡铂(n＝24) 0.88(0.37至1.39) <0.01
奥沙利铂-卡铂(n＝11) 0.34(-0.14至0.82) 0.15
顺铂-奥沙利铂(n＝10) 0.33(-0.07至0.73) 0.09
(顺铂统计学上比卡铂更高(p<0.01)。其边界统计学上比奥沙利铂更高(p＝0.09)。)
表12.患者KU的成对比较：长春花碱对长春新碱对长春瑞滨
药物比较 平均差(95％CI) 统计显著性
长春花碱-长春新碱(n＝7) 0.14(-0.26至0.54) 0.43
长春瑞滨-长春新碱(n＝11) 0.63(0.10至1.16) 0.02
长春瑞滨-长春花碱(n＝10) 0.14(-0.20至0.49) 0.37
(仅有的统计学上显著的差异是长春瑞滨平均比长春新碱更高(p＝0.02)。)
表13.患者KU的成对比较：泰素对泰索帝对凯素
药物比较 平均差(95％CI) 统计显著性
泰索帝-泰素(n＝35) 0.05(-0.54至0.65) 0.85
泰索帝-凯素(n＝12) 0.98(0.26至1.69) 0.01
泰素-凯素(n＝12) 1.20(0.26至2.14) 0.02
(泰素和泰索帝统计学上都显著大于凯素。)
表14.患者KU的成对比较：盐酸多柔比星脂质体对多柔比星
(盐酸多柔比星脂质体和多柔比星之间的差异是边界统计学上显著的(p＝0.08)。)
表15.患者KU的成对比较：希罗达对5fu：
药物比较 平均差(95％CI) 统计显著性
希罗达-5FU(n＝13) 0.26(-0.26至0.77) 0.30
(没有足够的统计学证据得出结论：希罗达和5FU之间有差异。)
表16.对于单一药物，在乳腺癌样本中，在多少情况下最佳普通药比最佳专有药更有效。
情况 计数
最佳普通药>最佳专有药超过0.57，并且最佳普通药>1.0 36/43(84％)
多少＝(+/-0.57之内) 6/43(14％)
最佳专有药>最佳普通药超过0.57，并且最佳专有药>1.0 1/43(2％)
多少是全部的KU<1.0 0/67(0％)
表17.环磷酰胺对异环磷酰胺的比较
情况 计数
环磷酰胺>异环磷酰胺超过0.57，并且环磷酰胺>1.0 2/11(18％)
环磷酰胺＝异环磷酰胺+/-0.57并且都>1 6/11(55％)
异环磷酰胺>环磷酰胺+0.57 0/11(0％)
环磷酰胺和异环磷酰胺都<1.0 3/11(27％)
表18.卡铂对顺铂的比较
情况 计数
卡铂>顺铂超过0.57并且卡铂>1.0 2/24(8％)
卡铂＝顺铂+/-0.57并且都>1 4/24(17％)
顺铂>卡铂+0.57 14/24(58％)
卡铂和顺铂都<1.0 4/24(17％)
表19.卡铂或顺铂对奥沙利铂的比较
表20.长春瑞滨(Vinor)对长春新碱(Vcr)和长春花碱(Vnbl)的比较
情况 计数
Vinor>最大(Vcr或Vnbl)超过0.57并且长春瑞滨>1.0 4/14(29％)
Vinor＝最大(Vcr或Vnbl)+/-0.57并且都>1 5/14(36％)
最大(Vcr或Vnbl)>Vinor+0.57 0/14(0％)
Vcr和Vnbl和Vinor都<1.0 2/14(14％)
表21.凯素对泰素和泰索帝的比较
情况 计数
凯素>最大(泰素、泰索帝)超过0.57并且凯素>1.0 0/13(0％)
凯素＝最大(泰素、泰索帝)+/-0.57并且都>1 2/13(15％)
最大(泰素、泰索帝)>凯素+0.57 10/13(77％)
凯素和泰素和泰索帝<1.0 1/13(8％)
表22.泰索帝对泰素的比较
情况 计数
泰索帝>泰素超过0.57并且泰索帝>1.0 13/35(37％)
泰索帝＝泰素+/-0.57并且都>1 6/35(17％)
泰素>泰索帝+0.57 11/35(31％)
泰素和泰索帝<1.0 5/35(14％)
表23.盐酸多柔比星脂质体对多柔比星的比较
表24.希罗达对5fu的比较
情况 计数
希罗达>5fu超过0.57并且希罗达>1.0 2/13(15％)
希罗达＝5fu+/-0.57并且都>1 0/13(0％)
5fu>希罗达+0.57 2/13(15％)
5fu和希罗达<1.0 8/13(62％)
表25.表柔比星对多柔比星的比较
情况 计数
表柔比星>多柔比星超过0.57并且表柔比星>1.0 6/34(18％)
表柔比星＝多柔比星+/-0.57并且都>1 22/34(65％)
多柔比星>表柔比星+0.57 3/34(9％)
多柔比星和表柔比星<1.0 1/34(3％)
表26.对于药物的组合，在多少情况下是5fu/氨甲喋呤>5fu以及氨甲喋呤和>1.0；5fu/氨甲喋呤＝5fu或氨甲喋呤；5fu或氨甲喋呤>5fu/氨甲喋呤；都<l.0
表27.对于药物的组合，在多少情况下是卡铂/泰素>卡铂和泰素和>1.0；c/t＝c或t；c或t>c/t；都<1.0
情况 计数
卡铂/泰素>最大(卡铂、泰素)超过0.57并且卡铂/泰素>1.0 4/12(33％)
卡铂/泰素＝最大(卡铂、泰素)+/-0.57并且都>1 6/12(50％)
最大(卡铂、泰素)>卡铂/泰素+0.57 1/12(8％)
卡铂、泰素、卡铂/泰素都<1.0 1/12(8％)
表28.对于药物的组合，在多少情况下是卡铂/泰索帝>卡铂和泰索帝和>1.0；
c/泰索帝＝c或泰索帝；c或泰索帝>c/泰索帝；都<1.0
表29.对于药物的组合，在多少情况下是环磷酰胺/多柔比星>环磷酰胺和多柔比星和>1.0；环磷酰胺/多柔比星＝环磷酰胺或多柔比星；环磷酰胺或多柔比星>环磷酰胺/多柔比星；都<1.0
表30.对于药物的组合，在多少情况下是环磷酰胺/表柔比星>环磷酰胺和表柔比星和>1.0；环磷酰胺/表柔比星＝环磷酰胺或表柔比星；环磷酰胺或表柔比星>环磷酰胺/表柔比星；都<1.0
表31.对于药物的组合，在多少情况下是环磷酰胺/泰素>环磷酰胺和泰素和>1.0；环磷酰胺/泰素＝环磷酰胺或泰素；环磷酰胺或泰素>环磷酰胺/泰素；都<1.0
表32.对于药物的组合，在多少情况下是环磷酰胺/泰索帝>环磷酰胺和泰索帝和>1.0；环磷酰胺/泰索帝＝环磷酰胺或泰索帝；环磷酰胺或泰索帝>环磷酰胺/泰索帝；都<1.0
表33.对于药物的组合，在多少情况下是长春瑞滨/希罗达>长春瑞滨和希罗达和>l.0；长春瑞滨/希罗达＝长春瑞滨或希罗达：长春瑞滨或希罗达>长春瑞滨/希罗达：都<l.0
表34.在肺癌样本中，在多少情况下是最佳普通药比最佳专有药更有效。
情况 计数
最佳普通药>最佳专有药超过0.57并且最佳普通药>1.0 25/32(78％)
多少＝(+/-0.57之内) 5/32(16％)
最佳专有药>最佳普通药超过0.57并且最佳专有药>1.0 2/32(6％)
多少是所有的KU<1.0 0/41(0％)
表35.在结肠癌样本中，在多少情况下是最佳普通药比最佳专有药更有效。
情况 计数
最佳普通药>最佳专有药超过0.57并且最佳普通药>1.0 4/7(57％)
多少＝(+/-0.57之内) 1/7(14％)
最佳专有药>最佳普通药超过0.57并且最佳专有药>1.0 2/7(29％)
多少是所有的KU<1.0 0/8(0％)
表36.基于MiCK药物诱导的细胞凋亡试验，来自普通多来源药物使用对专有单一来源药物使用的药物成本节约。
表37.基于MiCK药物-诱导的细胞凋亡实验，来自普通多来源药物使用对专有单一来源药物使用的药物成本节约
表38.癌症细胞对37种检测的抗癌药物候选物在各种浓度下的细胞凋亡应答。

Claims (26)

1.评估抗癌药物候选物的相对细胞凋亡诱导活性的方法，所述方法包括：
a)从肿瘤样本获得癌症细胞；
b)切碎、消化和过滤所述样本；
c)任选地通过密度梯度离心去除不能生存的细胞；
d)孵育细胞悬液以通过粘附去除巨噬细胞；
e)进行阳性、阴性和/或去除分离，以分离感兴趣的细胞；
f)如果需要，使用缀合CD 14抗体的磁珠去除任何残留的巨噬细胞；
g)将终悬液铺平板；
h)孵育所述平板；
i)将至少一个孔的铺平板的终悬液暴露于至少一种第一抗癌药物候选物或所述第一候选物和其他物质的混合物；
j)将至少一个孔的铺平板的终悬液暴露于至少一种第二抗癌药物候选物或所述第二候选物和其他物质的混合物；
k)测量暴露于所述至少一种第一抗癌药物候选物和第二抗癌药物候选物的孔的光密度，或包含至少一种第一抗癌药物候选物或至少一种第二抗癌药物候选物和其他物质的混合物的孔的光密度，其中所述光密度的测量以连续方式以选择的时间间隔进行选择的持续时间；
l)从所述光密度和时间测量确定所述至少一种第一抗癌药物候选物和第二抗癌药物候选物的动力学单位值；
m)使每种药物候选物的所述动力学单位值与下述相关联：
a)如果所述动力学单位值大于预定的阈值，所述抗癌药物候选物诱导癌症细胞中细胞凋亡的能力；
b)如果所述动力学单位值小于预定的阈值，所述抗癌药物候选物诱导癌症细胞中细胞凋亡的无能；
n)比较每种药物候选物的所述确定的动力学单位值；和
o)基于步骤(n)中的所述比较，确定具有诱导癌症细胞中细胞凋亡的更大相对能力的药物候选物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种第一抗癌药物候选物和第二抗癌药物候选物包括至少一种普通药物候选物和一种专有药物候选物。
3.权利要求2所述的方法，进一步包括下述步骤：
p)确定由于选择普通药物候选物或专有药物候选物而产生的货币结果，其中选择具有最高相对动力学单位值的药物候选物。
4.权利要求3所述的方法，其中基于用所述选择的具有较高动力学单位值的药物治疗单个患者对基于具有较低动力学单位值的所述药物候选物发生的成本确定所述货币结果。
5.权利要求3所述的方法，进一步包括下述步骤：
q)将从步骤q)确定的所述货币结果外推至目标群体。
6.权利要求5所述的方法，其中所述目标群体是来自美国的国家范围群体。
7.权利要求3所述的方法，其中通过下述方法确定步骤p)的所述货币结果，所述方法包括：
i)获得所述选择的具有较高动力学单位值的抗癌药物和具有较低动力学单位值的药物的医疗保险成本支付计划；
ii)基于用具有较高相对动力学单位值的药物候选物治疗单个患者对用具有较低动力学单位值的药物候选物治疗所述患者，确定为所述患者带来的相对货币成本节约或相对货币支出，其中所述治疗包括用所述选择的抗癌药物候选物进行的至少一个周期的治疗；和
iii)将来自步骤ii)的所述成本节约或相对货币支出外推至感兴趣的目标群体。
8.权利要求1所述的方法，其中所述肿瘤样本是实体瘤样本，或血液样本，或骨髓样本，或源于积液的样本。
9.权利要求1所述的方法，其中所述第一抗癌药物候选物或第二抗癌药物候选物中的至少一种是包括所述抗癌药物候选物和至少一种另外抗癌药物候选物的组合。
10.权利要求1所述的方法，其中所述平板的每个孔包含不同的抗癌药物候选物。
11.权利要求1所述的方法，其中所述平板的每个孔包括不同浓度的抗癌药物候选物。
12.权利要求1所述的方法，其中所述抗癌药物候选物浓度是从0.01至10,000μΜ。
13.权利要求1所述的方法，其中所述光密度被连续测量和记录，约每5分钟一次，进行约48小时的时期。
14.权利要求1所述的方法，其中通过分光光度计在从550至650纳米的波长下测量所述光密度。
15.权利要求1所述的方法，其中所述至少一种抗癌药物候选物选自：凯素、力比泰、氨吖啶、天冬酰胺酶、苯达莫司汀、博来霉素、博舒替尼、凯莱(盐酸多柔比星脂质体)、卡铂、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、环磷酰胺(4HC)、达卡巴嗪、放线菌素D、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、地塞米松、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、艾日布林、厄洛替尼(Erlotinib)、雌氮芥、依托泊甙、依维莫司、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、格列卫(伊马替尼)、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺(4HI)、干扰素-2a、伊立替康、伊沙匹隆、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋呤、丝裂霉素、米托蒽醌、尼罗替尼(Nilotinib)、氮芥、奥沙利铂、紫杉醇、喷司他丁、甲基苄肼、瑞戈非尼(Regorafenib)、索拉非尼、链脲霉素、舒尼替尼、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷(Teniposide)、沙利度胺、硫代鸟嘌呤、托泊替坎、万珂、维达扎、长春花碱、长春新碱、长春瑞宾、伏立诺他、依维莫司、拉帕替尼、来那度胺、雷帕霉素，和Votrient(帕唑帕尼)。
16.权利要求2所述的方法，其中所述至少一种抗癌普通药物候选物选自：环磷酰胺、多柔比星、表柔比星、紫杉醇、多西紫杉醇、顺铂、卡铂、伊立替康、托泊替坎、长春瑞宾和长春花碱。
17.权利要求2所述的方法，其中至少一种抗癌专有药物候选物选自：纳米白蛋白结合型紫杉醇、吉西他滨、奥沙利铂、卡培他滨、伊沙匹隆、艾瑞布林、脂质体多柔比星和培美曲塞。
18.肿瘤细胞分离和纯化的方法，所述方法包括：
a)获得肿瘤样本；
b)切碎、消化和过滤所述样本；
c)任选地通过密度梯度离心去除不能生存的细胞；
d)孵育细胞悬液以通过粘附去除巨噬细胞；
e)进行阳性、阴性和/或去除分离，以分离感兴趣的细胞；
f)如果需要，使用缀合CD14抗体的磁珠去除任何残留的巨噬细胞；
g)将终悬液铺平板；和
h)孵育所述平板。
19.评估抗癌药物候选物诱导源自肿瘤样本的癌症细胞系中细胞凋亡的能力的方法，所述方法包括：
a)获得肿瘤样本；
b)切碎、消化和过滤所述样本；
c)任选地通过密度梯度离心去除不能生存的细胞；
d)孵育细胞悬液以通过粘附去除巨噬细胞；
e)进行阳性、阴性和/或去除分离，以分离感兴趣的细胞；
f)如果需要，使用缀合CD14抗体的磁珠去除任何残留的巨噬细胞；
g)将终悬液铺平板；
h)孵育所述平板；
i)将至少一个孔的铺平板的终悬液暴露于至少一种抗癌药物候选物或所述候选物和其他物质的混合物；
j)测量所述暴露于至少一种抗癌药物候选物的孔的光密度，或包含至少一种抗癌药物候选物和其他物质的混合物的孔的光密度，其中所述光密度的测量以连续方式以选择的时间间隔进行选择的持续时间；
k)从所述光密度和时间测量确定所述至少一种抗癌药物候选物的动力学单位值；和
l)使每种药物候选物的动力学单位值与下述相关联：
a)如果所述动力学单位值大于预定的阈值，所述抗癌药物候选物诱导癌症细胞中细胞凋亡的能力；
b)如果所述动力学单位值小于预定的阈值，所述抗癌药物候选物诱导癌症细胞中细胞凋亡的无能。
20.权利要求19所述的方法，其中所述平板的每个孔包含不同的抗癌药物候选物。
21.权利要求19所述的方法，其中所述平板的每个孔包括不同浓度的抗癌药物候选物。
22.权利要求19所述的方法，其中所述抗癌药物候选物浓度是从0.01至10,000μΜ。
23.权利要求19所述的方法，其中所述光密度被连续测量和记录，约每5分钟一次，进行约48小时的时期。
24.权利要求19所述的方法，其中通过分光光度计在从550至650纳米的波长下测量所述光密度。
25.权利要求19所述的方法，其中肿瘤样本是实体瘤样本，或血液样本，或骨髓样本，或源自积液的样本。
26.权利要求19所述的方法，其中所述抗癌药物候选物选自：凯素、力比泰、氨吖啶、天冬酰胺酶、苯达莫司汀、博来霉素、博舒替尼、凯莱(盐酸多柔比星脂质体)、卡铂、卡莫司汀、CCNU、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、环磷酰胺(4HC)、达卡巴嗪、放线菌素D、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、地塞米松、多西紫杉醇、多柔比星、表柔比星、艾瑞布林、厄洛替尼、雌氮芥、依托泊甙、依维莫司、氟达拉滨、5-氟尿嘧啶、吉西他滨、格列卫(伊马替尼)、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺(4HI)、干扰素-2a、伊立替康、伊沙匹隆、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋呤、丝裂霉素、米托蒽醌、尼罗替尼、氮芥、奥沙利铂、紫杉醇、喷司他丁、甲基苄肼、瑞戈非尼、索拉非尼、链脲霉素、舒尼替尼、替莫唑胺、坦罗莫司、替尼泊苷、沙利度胺、硫代鸟嘌呤、托泊替坎、万珂、维达扎、长春花碱、长春新碱、长春瑞宾、伏立诺他、依维莫司、拉帕替尼、来那度胺、雷帕霉素和Votrient(帕唑帕尼)。
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