KR20150035537A - 종양 세포 분리/정제 프로세스 및 이의 사용 방법들 - Google Patents

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매튜 퍼리
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디아테크 온콜로지, 엘엘씨
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Abstract

미소배양 속동성 분석들과 같은 종양 치료제 효능 스크리닝을 포함하는 다양한 분석들과 과정들에 유용한 혈액 또는 비혈액성 종양 세포들을 분리하고 정제하는 방법들이 여기에 개시된다. 또한, 제네릭 대 전유의 항암 치료제들의 상대적인효능을 비교하기 위해 적합한 미소배양 속동성 분석들 및 방법들이 개시된다.

Description

종양 세포 분리/정제 프로세스 및 이의 사용 방법들{TUMOR CELL ISOLATION/PURIFICATION PROCESS AND METHODS FOR USE THEREOF}
본 발명은 암 세포들에 아포프토시스(apoptosis)를 유도하는 적어도 하나의 제네릭(generic) 및/또는 전유의(proprietary) 항암 치료제 후보 물질의 능력을 평가하기 위한 방법들에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 특정한 시편의 발생 조직을 위해 특히 최적화된 종양 세포 정제 및 분리에 관한 방법들을 제공한다. 또한, 본 발명은 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 적어도 하나의 제네릭 및 전유의 치료제의 상대적은 능력의 정확하고 탄탄한 비교를 가능하게 하는 분석들 및 방법론들을 제공한다.
본 출원은 2015년 5월 15일에 출원되고 전체적으로 여기에 참조로 포함되는 미국 임시 특허 출원 번호 제61/647,248호를 우선권으로 수반하는 국제 특허 출원이다.
세포사는 다양한 방식들로 일어날 수 있지만, 매우 특별한 과정의 아포프토시스(apoptosis)에 의해 암 세포들의 사망을 야기하도록 의도된 대부분의 성공적인 항암 치료제들로 일어날 수 있다. 아포프토시스는 신체에 의한 순차적인 폐기를 위해 세포가 분해되고 패키지되는 메커니즘이다. 아포프토시스는 통상적으로 이들이 더 이상 필요하지 않거나, 손상을 입었거나 질병에 걸렸을 때에 세포들을 폐기하도록 신체의 의해 이용된다. 실제로, 암을 유발할 수 있는 위험한 돌연 변이들을 갖는 일부 세포들과 심지어는 조기 단계의 암종 세포들은 자연적인 프로세스들의 결과로서 아포프토시스를 겪을 수 있다.
아포프토시스 동안에, 상기 세포는 DNA를 절단하고 저장하며, 핵을 농축시키고, 과잉의 물을 버리며, 블레빙(blebbing), 세포막 내의 불규칙한 벌지들(bulges)의 형성과 같은 세포막에 대한 다양한 변화들을 겪는다(도 1 참조). 아포프토시스는 일반적으로 몇몇의 트리거들(triggers)의 하나가 아포토시스를 겪어야 하는 세포에 대해 신호를 보낸 후에 일어난다. 많은 암 세포들에 있어서, 상기 세포가 상기 트리거를 검출할 수 없고, 상기 트리거가 수신된 후에 적절하게 신호를 보내는 데 실패하거나, 상기 신호로 동작하는 데 실패하거나, 상기 세포가 심지어 이들 문제들의 조합들을 가질 수 있기 때문에 이러한 메시지 시스템이 정확하게 작동하지 않는다. 전체적인 효과는 일부 암 세포들에서 아포토시스를 겪는 것에 대한 저항이다.
암은 여기에 기재되는 바에서 모든 암들 또는 악성 종양들, 혈액성(hematologic) 및 비혈액성 모두 뿐만 아니라, 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndromes: MDS)을 포함한다. 이는 모든 혈액/골수암들, 고상의 종양들 및 삼출물들(effusions); 백혈병(leukemia), 림프종(lymphomas), 상피 악성 종양들(pithelial malignancies) 및 간엽 악성 종양들(mesenchymal malignancies)에 대한 4가지 주요한 카테고리들을 고려한다.
비록 많은 효과적인 암 치료제들이 아포프토시스 프로세스에 대한 이들의 저항성에도 불구하고 암 세포들에 아포프토시스를 겪도록 유도할 수 있지만,
모든 유형들의 암 세포들에 대해 작용하는 약물들은 없으며, 아포프토시스의 속동성 단위(kinetic unit) 측정에 기초하여 이들 약물들의 상대적인 효능을 예상하는 실험도 없다. 이에 따라, 특정한 치료제 후보 물질이 다양한 유형들의 암 세포들에서 아포프토시스를 야기할 수 있는 지를 검출하며, 또한 특히 개별적인 환자들에 관하여 다른 치료제들이나 치료제 후보 물질들과 비교하여 치료제 후보 물질의 효능을 판단할 필요성이 존재한다.
미국 특허 제6,077,684호 및 미국 특허 제6,258,553호에 기재된 미소배양 속동성 분석(Microculture Kinetic Assay： MiCK 분석)은 현재 환자로부터의 백혈병 세포들이 하나 또는 그 이상의 유형들의 백혈병에 대해 효과적인 것으로 알려진 특정한 치료제에 반응하여 아포프토시스를 겪는 지를 검출하는 데 이용되고 있다. 상기 MiCK 분석에 있어서, 환자로부터의 암 세포들은 단일 세포들이나 소세포 클러스터들(clusters)의 정해진 농도의 서스펜션(suspension) 내에 배치되고, 마이크로티터(microtiter) 플레이트의 다중 벽들 내의 조건들이 조절되게 한다. 대조군 용액을 또는 다양한 농도들의 알려진 항암제들을, 환자의 암 유형을 위해 통상적으로 권장되는 이들 치료제들을 갖는 용액들이 웰 당 하나의 테스트 샘플을 갖는 웰들 내로 도입된다. 각 웰의 광학 밀도가 이후에 시간으로부터 일들의 주기 동안 주기적으로, 통상적으로는 매 몇 분마다 측정된다. 세포가 아포프토시스-연관 블레빙을 겪으면서, 이의 광학 밀도가 검출 가능하고 특정한 방식으로 증가한다. 상기 페소가 아포프토시스를 겪지 않거나 다른 원인들로 사망할 경우, 이의 광학 밀도는 이러한 방식으로 변화되지 않는다. 따라서, 각 웰에 대하여 시간에 대한 광학 밀도(OD)의 도표화가 시간에 대해 안정기 및/또는 음의 기울기에 이어 양의 기울기를 갖는 선형의 곡선을 산출할 경우, 상기 웰 내의 항암 치료제는 환자의 암 세포들의 아포프토시스를 유발하며, 이러한 환자에 대한 적합한 치료가 될 수 있다. 시간에 대한 OD 데이터는 또한 속동성 단위들을 계산하는 데 이용될 수 있으며, 상기 단위들은 상기 환자에 대한 치료의 적합성과 유사하게 연관되는 아포프토시스를 측정하는 데 이용될 수 있다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 앞서 언급한 상기 MiCK 분석의 일반적인 기재에 익숙할 것이다. 또한, 여기에 모든 목적을 위해 전체적으로 참조로 포함되는 미국 특허 제6,077,684호 및 미국 특허 제6,258,553호의 내용들은 상기 MiCK 분석의 보다 상세한 서술을 제공한다.
비록 상기 MiCK 분석이 특정한 환자의 백혈병 암 세포들에 대한 알려진 항암 치료제들의 효과들을 검출하는 데 이용되었지만, 다양한 종양 세포 시편 근원들에 특별하게 적용되는 상기 분석의 변화들을 개발하는 요구가 남아 있다. 앞서 참조한 MiCK 분석은 단지 혈액 암들 및 구체적으로는 백혈병을 고려하였다. 현재의 MiCK 분석들의 제한된 범주로 인하여, 혈액 암들뿐만 아니라 다른 종양 소스들로부터 유래되는 시편들에서 접하면서 아포프토시스-연관 세포/화학 물질 상호 작용들의 검출에 대하여 특히 적합하고 민감한 MiCK 분석에 대한 종래 기술 분야의 필요성이 존재한다. 특정한 근원의 시편에 대해 맞춤화되는 개선된 MiCK 분석들 및 방법론들의 개발은 조사자들에게 MiCK 분석들의 이용으로 얻을 수 있는 개별화된 치료 프로토콜들에 대한 훨씬 정확성 및 탄탄함을 제공할 수 있을 것이다. 더욱이, 임의의 스크리닝 분석의 중요한 측면은 시편 내의 다른 암이 아닌 세포들 및 물질들로부터 암 세포들을 분리하는 것과 그 상부에서 화합물들이나 치료제들 상의 세포들의 순도이다.
전유의 약학적 항암 화학 요법(chemotherapy) 치료제들과 이들의 제네릭 균등물들 사이의 비교적인 분석을 위해 적합한 MiCK 분석들을 개발하는 것에 대한 큰 필요성이 해당 기술 분야에 존재한다. "전유의(proprietary)"라는 용어는 단일 소스 치료제들 및/또는 상품명의 치료제들 또는 화학 물질들을 포함하며, "제네릭(generic)"이라는 용어는 다중 소스 치료제들 및/또는 상풍명이 아닌 치료제들 또는 화학 물질들을 포함한다. 이러한 분석들 및 프로토콜들의 개발은 내과의들이 상기 전유의 치료제 대 제네렉 균등물의 상대적인 반응에 기초하여 비용 측면에서 효과적인 예비 치료 판단할 수 있게 한다. 특정한 암들의 치료에 전유의 치료제 또는 제네릭을 사용할 것인 가에 대한 이들 판단들은 많은 치료비용에 직면하는 개개의 환자들을 위해서 뿐만 아니라 전체로서 건강관리 산업을 위해 커다란 영향을 미칠 수 있다.
따라서 본 발명의 목적은 MiCK 분석들에 이용될 수 있는 시편들로부터 종양 세포 분리 및 정제의 개선된 방법을 제공하는 것이다. 또한, 보다 세심하고 탄탄한 분석을 생성할 수 있는 상기 MiCK 분석 자체에 대한 개선점들도 개시된다. 이들 방법들 및 분석들은 백혈병(leukemia)에 한정되지 않고 모든 유형의 암 세포들 내의 아포프토시스(apoptosis)의 결정을 가능하게 한다.
본 발명의 측면들에 따른 방법들은 지금까지 알려진 MiCK 분석 프로토콜들(protocols)에 대하여 훨씬 개선되며, 상기 종양 세포의 근원에 따라 종양 세포 정제 및 분리 프로토콜들을 맞춤화하는 능력을 종사자들에게 제공한다.
상기 MiCK 분석에 대한 개선은, 예를 들면, KU 값들의 계산 및 유도에 대한 개량과 상기 KU 값을 결정하는 데 사용되는 계수를 포함한다. 이러한 개선은 보다 민감한 계수와 KU 값들을 유도하는 개시된 방법들을 활용함에 의해 종사자들이 특정한 환자의 질병에 대한 항암 화학 요법(chemotherapy)의 계획을 조절하게 한다.
본 출원에 개시된 방법론들이 보다 탄탄하고 정확한 MiCK 분석을 가능하게 하는 점이 용이하게 이해될 것이다. 개시된 방법론들로부터의 상기 MiCK 분석 프로토콜들에 대한 개선들은 환자 치료 계획들의 발전을 보조하도록 가치 있는 데이터를 의료 종사자들에 제공하는 분석의 능력에서 상응하는 증가들을 가져온다. 항암 화학 요법 치료제들은 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 이를 긴요한 것으로 인식하는 치료의 개시 전의 개개의 환자의 암에 대해 가장 효과적인 항암 화학 요법 치료제(들)로 치료되는 암의 유형들에 대해 이들이 효과적인 지에 관계없이 상당한 부작용들을 생성한다. 그러나, 랙킹(lacking)은 효과적이며, 이러한 목적을 구현하기 위한 신뢰성 있는 방법이다.
본 발명의 다른 목적은 전유(proprietary) 대 제네릭(generic) 항암 화학 요법 치료제들의 상대적인 효능을 비교할 수 있는 MiCK 분석들 및 방법들을 제공하는 것이다. 특정한 암 유형에서 아포프토시스를 유도하는 전유 대 관심의 대상인 제네릭 치료제들의 상대적인 능력을 비교하는 역량은 최근의 기술에 대한 매우 유용한 개량이다. 여기에 개시된 상기 분석들 및 방법들로부터 입증된 결과들에 근거하여 제네릭 및 전유의 치료제 선택들 사이에서 선택의 능력을 갖춘 종사자들은 이들의 환자들을 위한 가장 우수한 치료 계획들을 제공하는 데 적합할 것이다. 환자들의 치료에서 이들 미세 단위의 효능들은 전체 건강관리 산업에서 전체적으로 익히게 될 것인 대단위의 효능들과 나란하다. 상업적인 영향들이나 결정적이 아닌 것으로 동업자가 평가한 문헌들 보다 개별적인 환자의 MiCK 분석 결과들에 근거하여 보다 효과적인 것들을 획인하도록 의사들이 본 발명의 방법들에 의해 제네릭 항암 화학 요법 치료제들과 전유의 치료제들 사이의 선택 가능하게 하기 때문에 본 발명은 전체적인 건강관리 산업에 거대한 잠재적인 비용 절감을 가능하게 한다.
일 실시예에 있어서, 본 발명의 물질들 및 방법들은 고상의 종양, 혈액, 골수 및 삼출물 시편들로부터 유래된 종양 세포들의 분리 및 정제(그리고 또한 농후화)를 위한 면역학적 과정들에의 이용을 위한 것이다. 오염되지 않은 암 세포 샘플들을 수득하는 능력은 종양 개발, 암 생물학 및 치료제 스크리닝의 연구에서 주요한 병목들의 하나이다. 암 환자들 및 동물 종양 모델들로부터의 종양 생체 검사는 자주 정상 조직, 혈액 및 암세포들을 포함하는 세포들의 이종의 집단을 함유한다. 이러한 혼합된 집단은 진단과 실제의 실험 결론들을 수득하고 해석하기 어렵게 만든다. 본 발명의 방법들은 개별적인 조직 샘플들의 병리학적 근원에 대해 조절되는 특정한 프로토콜들을 제공함에 의해 이들 문제들을 경감시킨다.
본 발명의 다른 실시예는 종양 세포 분리 및 정제 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, a) 종양 시편을 수득하는 단계; b) 24－48시간 내에 상기 시편을 항생제 혼합물로 처리하는 단계; c) 상기 시편을 다지고(mincing), 소화시키며 필터링하는 단계; d) 밀도 구배 원심 분리(density gradient centrifugation)에 의해 생존 불능의 세포들을 선택적으로 제거하는 단계 e) 부착에 의해 대식 세포들(macrophages)을 제거하도록 상기 세포 서스펜션을 배양시키는 단계; f) 관심의 대상인 세포들을 분리하도록 양성, 음성 및/또는 고갈(depletion) 분리를 수행하는 단계; g) 필요한 경우에 마그네틱 비드들(magnetic beads)에 콘주게이트된(conjugated) CD14 항체를 이용하여 임의의 잔류하는 대식 세포들을 제거하는 단계; h) 상기 최종 서스펜션을 도포하는 단계(예를 들면, 상기 최종 서스펜션을 384-웰 플레이트의 웰들에 첨가하는 단계); 그리고 i) 5%의 이산화탄소(CO2) 습도 조절된 분위기 하의 37℃에서 플레이트를 하룻밤 동안 배양시키는 단계를 포함한다.
이에 따라, 일 실시예에 있어서, 본 발명의 방법들은 항암 치료제 후보 물질(anti-cancer drug candidate)의 상대적 아포프토시스(apoptosis) 유도 능력을 평가하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은,
a) 종양 시편으로부터 암 세포들을 수득하는 단계를 포함하고;
b) 상기 시편을 다지고, 소화시키고 필터링하는 단계를 포함하며;
c) 밀도 구배 원심 분리에 의해 생존 불능의 세포들을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하고;
d) 부착에 의해 대식 세포들을 제거하도록 세포 서스펜션을 배양시키는 단계를 포함하며;
e) 관심의 대상인 세포들을 분리하도록 양성, 음성 및/또는 고갈 분리를 수행하는 단계를 포함하고;
f) 필요한 경우에 마그네틱 비드들(magnetic bead)에 콘주게이트된 CD14를 이용하여 임의의 잔류하는 대식 세포들을 제거하는 단계를 포함하며;
g) 최종 서스펜션을 도포하는 단계를 포함하고;
h) 상기 플레이트를 배양시키는 단계를 포함하며;
i) 도포된 최종 서스펜션의 적어도 하나의 웰(well)을 적어도 하나의 제1 항암 치료제 후보 물질 또는 상기 제1 후보 물질과 다른 물질들의 혼합물들에 노출시키는 단계를 포함하고;
j) 도포된 최종 서스펜션의 적어도 하나의 웰을 적어도 하나의 제2 항암 치료제 후보 물질 또는 상기 제2 후보 물질과 다른 물질들의 혼합물들에 노출시키는 단계를 포함하며;
k) 상기 적어도 하나의 제1 및 제2 항암 치료제 후보 물질들에 노출된 웰들, 또는 적어도 하나의 제1 또는 적어도 하나의 제2 항암 치료제 후보 물질 및 다른 물질들의 혼합물을 함유하는 웰들의 광학 밀도를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 광학 밀도를 측정하는 단계는 선택된 시간 동안 선택된 시간 간격들에서 순차적인 방식으로 일어나며;
l) 상기 광학 밀도 및 시간 측정들로부터 상기 적어도 하나의 제1 및 제2 항암 치료제 후보 물질들에 대한 속동성 단위 값(kinetic units value)을 결정하는 단계를 포함하고;
m) 각 치료제 후보 물질에 대한 상기 속동성 단위 값을,
a) 상기 속동성 단위 값이 소정의 역치(threshold)보다 클 경우에 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 상기 항암 치료제 후보 물질의 능력; 및
b) 상기 속동성 단위 값이 소정의 역치보다 작을 경우에 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 상기 항암 치료제 후보 물질의 불능과 상호 연관시키는 단계를 포함하며;
n) 각 치료제 후보 물질에 대한 상기 결정된 속동성 단위 값을 비교하는 단계를 포함하고;
o) 상기 단계 n)에서의 비교에 기초하여 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 보다 큰 상대적인 능력을 가지는 치료제 후보 물질을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 실시예는 또한 상술한 단계들 a)－o)를 수반할 수 있고, 상기 적어도 하나의 제1 및 제2 항암 치료제 후보 물질들은 적어도 하나의 제네릭(generic) 치료제 후보 물질 및 하나의 전유의(proprietary) 치료제 후보 물질을 포함한다.
본 발명은 또한 p) 상기 제네릭 또는 전유의 치료제 후보 물질의 선택으로부터 야기되는 금전적인 결과들(monetary consequences)을 판단하는 단계가 존재하는 실시예를 포함하며, 가장 높은 상대적인 속동성 단위 값을 갖는 상기 치료제 후보 물질이 선택된다. 특정 실시예들에 있어서, 상기 금전적인 결과들은 보다 낮은 속동성 단위 값을 갖는 치료제 후보 물질에 근거하여 발생될 수 있었던 비용에 비해 보다 높은 속동성 단위 값을 갖는 선택된 치료제로 단일의 환자를 치료하는 것에 기초하여 결정된다. 제네릭 치료제들은 일반적으로 다수의 제조자 소스들로부터 얻을 수 있는 치료제들로 정의되는 반면, 전유의 치료제들은 하나의 제조자만으로부터 얻을 수 있는 치료제들로서 정의된다.
본 발명의 또 다른 실시예들은 q) 상기 단계 p)로부터 판단되는 상기 금전적 결과들을 예상 고객층(target population)으로 추정하는 단계를 포함한다. 이러한 예상 고객층은 적어도 2명의 환자들인 임의의 인구를 포함할 수 있다. 특히, 본 발명의 실시예들은 지역 규모(community scale)(예를 들면, 2명 내지 10명의 사람들, 10명 내지 20명의 사람들, 20명 내지 50명의 사람들, 50명 내지 100명의 사람들, 100명 내지 300명의 사람들, 300명 내지 1,000명의 사람들), 광역 규모(regional scale)(예를 들면, 1,000명 내지 2,000명의 사람들, 2,000명 내지 10,000명의 사람들), 주 전체 규모(statewide scale)(예를 들면, 10,000명 내이 20,000명의 사람들, 20,000명 내지 50,000명의 사람들, 또는 주 내의 시험된 약물 치료에 대한 잠재성 후보자들인 사람들의 수로서 정의되는), 그리고 전국적 규모(nationwide scale)(국가 내의 시험된 약물에 대한 잠재성 후보자들인 사람들의 수로서 정의되는) 상의 인구들에 관련된다. 본 발명의 특정 실시예에 있어서, 상기 예상 고객층은 미합중국으로부터의 전국적인 규모의 인구이다. 이러한 추정은 적합하게 프로그램된 컴퓨터로 수행될 수 있다.
본 발명의 방법들은, 다양한 소스들로부터의 종양 시편들을 활용할 수 있으며, 예를 들면 고상의 종양 시편들, 골수 시편들 및 삼출물(effusion) 유래 시편들은 단지 현재에 개시된 방법들을 위해 적합한 몇몇의 특정한 종양 시편 유형들이다.
본 발명의 실시예들은 폭넓게 다양한 악성 종양들을 실험하는 데 활용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 다음의 암종들(carcinomas)을 테스트하는 데 이용될 수 있다.
난소 암종(ovarian carcinoma)(중증 췌장낭선암(cystadenocarcinoma), 점액낭샘암종(mucinous cystadenocarcinoma), 자궁내막성 난소암(endometrioid carcinoma)), 난소 과립막 세포 종양(ovarian granulosa cell tumor), 난관 선암(Fallopian tube adenocarcinoma), 복막암(Peritoneal carcinoma), 자궁(자궁내막) 선암종(Uterine(endometrial) adenocarcinoma), 육종성 암종(sarcomatoid carcinoma), 자궁경부 편평상피암(Cervical squamous cell carcinoma), 자궁내막유사 샘암종(Endocervical adenocarcinoma), 외음부 암종(Vulvar carcinoma), 유방 암종(Breast carcinoma), 원발성 및 전이성(상피내 암종(ductal carcinoma), 점액 암종(mucinous carcinoma), 소엽 암종(lobular carcinoma), 악성 유방 엽상 종양(malignant phyllodes tumor)), 두경부 암종(Head and neck carcinoma), 혀를 포함하는 구강암(Oral cavity carcinoma), 원발성 및 전이성, 식도암(Esophageal carcinoma), 편평 세포 암종(squamous cell carcinoma) 및 선암(adenocarcinoma), 위 선암(Gastric adenocarcinoma), 악성 림프종(malignant lymphoma), GIST, 원발성 소장 암종(Primary small bowel carcinoma), 결장 선암(Colonic adenocarcinoma), 원발성 및 전이성(선암, 점액 암종, 대세포 신경 내분비 암종(large cell neuroendocrine carcinoma), 콜로이드질 암종(colloid carcinoma)), 충수 선암(Appendiceal adenocarcinoma), 결직장암(Colorectal carcinoma), 직장 암종(Rectal carcinoma), 항문암(Anal carcinoma)(편평(squamous), 기저양(basaloid)), 유암종들(Carcinoid tumors), 원발성 및 전이성(충수, 소장, 결장), 췌장암(Pancreatic carcinoma), 간암(Liver carcinoma)(간세포 암종(hepatocellular carcinoma), 담관암(cholangiocarcinoma)), 간에 대한 전이암(Metastatic carcinoma), 폐암, 원발성 및 전이성(편평 세포(squamous cell), 선암, 편평세포암종(adenosquamouscarcinoma), 거대 세포암(giant cell carcinoma), 비소형 세포 암종(nonsmall cell carcinoma), NSCLC, 소세포 암종(small cellcarcinoma), 신경내분비 암종, 대세포 암종, 기관지폐포암(bronchoalveolarcarcinoma)), 신세포(Renal cell)(신장) 암종, 원발성 및 전이성, 방광암(Urinary bladder carcinoma), 원발성 및 전이성, 전립선 선암종(Prostatic adenocarcinoma), 원발성 및 전이성, 뇌 종양들(Brain tumors), 원발성 및 전이성(교아종(glioblastoma), 다형성(multiforme), 뇌 신경외배엽(cerebral neuroectodermal) 악성 종양, 외배엽(neuroectodermal) 종양, 핍지교종(oligodendroglioma), 악성 성상세포종(malignant astrocytoma), 피부 종양들(악성 흑색종(melanoma), 피지성 세포 암종(sebaceous cell carcinoma)), 갑상선암(Thyroid carcinoma)(유두상(papillary) 및 여포성(follicular)), 흉선암(Thymic carcinoma), 쉐노이달 암종(Shenoidal carcinoma), 원발 병소 불명 암종(Carcinoma of unknown Primary), 신경내분비 암종(Neuroendocrine carcinoma), 고환의(Testicular) 악성 종양들(정상피종(seminoma), 태생성 암종(embryonal carcinoma), 악성 혼합 종양들(mixed tumors)) 그리고 다른 암종들.
본 발명은 다음의 악성 림프종들(malignant lymphomas)을 실험하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 대세포 악성 림프종, 소세포 림프종, 혼합 대소 세포 림프종, 말트(Malt) 림프종, 비-호지킨(Non-Hodgkins) 악성 림프종, T 세포 악성 림프종, 만성 골수성(또는 골수의) 백혈병(leukemia)(CML), 골수종(myeloma), 다른 백혈병들, 중피종(mesothelioma), 외투막 세포(mantle cell) 림프종들, 연변 세포(marginal cell) 림프종들, 그 이외의 형태가 특정되지 않는 림프종들, 그리고 다른 림프종들.
또한, 본 발명은 다음의 백혈병들을 실험하는 데 활용될 수 있다. 예를 들면： AML-급성 골수성 백혈병(AML-acute myelogenous leukemia), ALL-급성 림프구성 백혈병(ALL-acute lymphoblastic leukemia), 만성 림프구성 백혈병(Chronic lymphocytic leukemia), 다발성 골수종(Multiple myeloma), 골수이형성 증후군들(Myelodysplastic syndromes)-MDS, 골수섬유증(myelofibrosis)을 갖는 MDS, 왈덴스트룀 마크로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 그리고 다른 백혈병들.
또한, 다음과 같은 육종들(sarcomas)이 본 발명으로 테스트될 수 있다. 평활 근육종(Leimyosarcoma)(자궁 육종), GIST-위장관 기질 종양(gastrointestinal stromal tumor), 원발성 및 전이성(위, 소장, 결장), 지방육종(Liposarcoma), 점액상 육종(Myxoid sarcoma), 연골육종(Chondrosarcoma), 골육종(Osteosarcoma), 유윌 육종(Ewings sarcoma)/PNET, 신경모세포종(Neuroblastoma), 악성 말초 신경집 종양(peripheral nerve sheath tumor), 방추형 세포암(Spindle cell carcinoma), 태아 횡문근육종(Embryonal rhabdomyosarcoma), 중피종(Mesothelioma), 그리고 다른 육종들.
이에 따라, 여기서 개시된 MiCK 분석들 및 방법론이 백혈병만을 향해 관계되었던 해당 기술 분야에서 이전에 알려진 MiCK 분석에 대한 급격한 개선을 나타내는 점이 쉽게 인식될 수 있을 것이다.
다른 실시예에 있어서, 본 발명의 방법들은 종양 시편으로부터 유래되는 암 세포주(cancer cell line)에서 아포토시스를 유발하는 항암 치료제 후보 물질의 능력을 평가하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은,
a) 종양 시편을 수득하는 단계를 포함하고;
b) 상기 시편을 다지고, 소화시키며, 필터링하는 단계를 포함하며;
c) 밀도 구배 원심 분리로 생존 불능의 세포들을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하고;
d) 부착에 의해 대식 세포들을 제거하도록 세포 서스펜션을 배양시키는 단계를 포함하며;
e) 관심의 대상인 세포들을 분리하도록 양성, 음성 및/또는 고갈 분리를 수행하는 단계를 포함하고;
f) 필요한 경우에 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD14 항체를 이용하여 임의의 잔류하는 대식 세포들을 제거하는 단계를 포함하며;
g) 최종 서스펜션을 도포하는 단계를 포함하고;
h) 상기 플레이트를 배양시키는 단계를 포함하며;
i) 도포된 최종 서스펜션의 적어도 하나의 웰을 적어도 하나의 항암 치료제 후보 물질 또는 상기 후보 물질 및 다른 물질들의 혼합물들에 노출시키는 단계를 포함하고;
j) 상기 적어도 하나의 항암 치료제 후보 물질들에 노출된 웰들, 또는 적어도 하나의 항암 치료제 후보 물질 및 다른 물질들의 혼합물을 함유하는 웰들의 광학 밀도를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 광학 밀도를 측정하는 단계는 선택된 시간 동안 선택된 시간 간격들에서 순차적인 방식으로 일어나고;
k) 상기 광학 밀도 및 시간 측정들로부터 상기 적어도 하나의 항암 치료제 후보 물질에 대한 속동성 단위 값을 결정하는 단계를 포함하며;
l) 각 치료제 후보 물질에 대한 속동성 단위 값을,
a) 상기 속동성 단위 값이 소정의 역치보다 클 경우에 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 상기 항암 치료제 후보 물질의 능력; 및
b) 상기 속동성 단위 값이 소정의 역치보다 작을 경우에 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 상기 항암 치료제 후보 물질의 불능과 상호 연관시키는 단계를 포함한다.
일부 실시예들에 있어서, 상기 플레이트의 각각의 웰은 다른 항암 치료제 후보 물질을 포함한다. 또한, 상기 방법도 상기 항암 치료제 후보 물질의 다른 농도가 각 웰에 함유되는 실시예를 고려한다. 그러므로, 본 발명은 다중의 잠재적인 농도 강도들에서 다중의 잠재적인 치료제 후보 물질들이 테스트될 수 있는 높은 처리율의 분석들에 관련될 수 있다. 본 발명의 실시예들의 이러한 높은 처리율의 능력은 단일의 치료제 후보 물질 실험에 대해 상당히 유리하며, 감소된 실험 비용과 증가된 시간 절약의 확약을 제공한다.
상기 분석의 각 웰에 적재될 수 있는 상기 잠재적인 항암 치료제 후보 물질 농도는 제조자들의 권장 복용량 및 이러한 복용량에 대응할 수 있는 상기 웰 내의 농도를 구현하도록 요구되는 대응하는 희석들에 따라 변화될 것이다. 예를 들면, 각 웰 내의 목표 치료제 농도는 몰농도로 결정되며, 예를 들면, 0.01μM 내지 10,000μM, 또는 0.001μM 내지 100,000μM, 혹은 0.1μM 내지 10,000μM의 범위가 될 수 있지만, 이들 개시된 예시적인 범위들로부터 벗어날 수 있거나 이들 범위들에 포함되는 임의의 정수들을 포함할 수 있다. 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 충분한 시편 세포들이 존재할 경우에 플러스 또는 마이너스의 순차적인 희석으로 변화될 수 있는 상기 제조자의 권장 혈액 수준 농도들을 활용하여 어떻게 목표 치료제 농도를 달성할 수 있는 지를 이해할 수 있을 것이다.
본 발명의 실시예들은 항암 치료제 후보 물질들의 모든 방식을 테스트할 수 있다. 예를 들면, 다음의 항암 치료제 후보 물질들이 개시된 방법들로 테스트될 수 있다. 아브락산(Abraxane), 알림타(Alimta), 암사크린(Amsacrine), 아스파라기나아제(Asparaginase), BCNU, 벤다무스틴(Bendamustine), 블레오마이신(Bleomycin), 캘릭스(Caelyx)(독실(Doxil)), 카르보플라틴(Carboplatin), 카르무스틴(Carmustine), CCNU, 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin), 클라드리빈(Cladribine), 클로파라빈(Clofarabine), 시타라빈(Cytarabine), 시톡산(Cytoxan)(4HC), 다카르바진(Dacarbazine), 닥티노마이신(Dactinomycin), 다사티닙(Dasatinib), 다우노루비신(Daunorubicin), 데시타빈(Decitabine), 덱사메타손(Dexamethasone), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 에리불린(Eribulin), 에를로티닙(Erlotinib), 에스트라무스틴(Estramustine), 에토포시드(Etoposide), 플루다라빈(Fludarabine), 5-플루오로우라실(Fluorouracil), 겜시타빈(Gemcitabine), 글리벡(Gleevec)(이마티닙(imatinib)), 헥사메틸아민ㅍ(Hexamethylmelamine), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이로스파미드(Ifosfamide)(4HI), 인터페론(Interferon)-2a, 이리노테칸(Irinotecan), 익사베필론(Ixabepilone), 멜팔란(Melphalan), 메캅토푸린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미토마이신(Mitomycin), 미톡산트론(Mitoxantrone), 니트로겐 무스타드(Nitrogen Mustard), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 펜토스타틴(Pentostatin), 소라페닙(Sorafenib), 스트렙토조신(Streptozocin), 수니티닙(Sunitinib), 타르세바(Tarceva), 탁솔(Taxol), 탁소테르(Taxotere), 테모졸로미드(Temozolomide), 템시롤리무스(Temsirolimus), 탈리도미드(Thalidomide), 티오구아닌(Thioguanine), 토포테칸(Topotecan), 트레티노인(Tretinoin), 벨카드(Velcade), 비다자(Vidaza), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 비노렐빈(Vinorelbine), 보리노스타트(Vorinostat), 섹롤다(Xeloda)(5DFUR), 에베롤리무스(Everolimus), 라파티닙(Lapatinib), 레날리도미드(Lenalidomide), 라파마이신(Rapamycin) 그리고 보트리엔트(Votrient)(파조파닙(Pazopanib)).
그러나, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아포프토시스를 생성할 수 있거나 아포프토시스를 생성하는 이들의 능력에 대해 조사될 수 있는 다른 비항암 화학 요법(nonchemotherapy) 치료제들 및/또는 화학 물질들을 포함하는 많은 다른 항암 치료제 후보 물질들 또한 개시된 방법들에 의해 테스트될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법들이 항암 치료제 후보 물질들에 정확하게 적용 가능하지만, 개시된 방법들의 실시예들은 질병들의 전체 호스트를 위한 임의의 수의 잠재적인 치료제 후보 물질들을 테스트하는 데 활용될 수 있다.
본 발명의 실시예들의 이들 및 다른 특징들, 측면들 그리고 다른 이점들은 다음의 설명들, 첨부된 특허 청구 범위들 및 첨부된 도면들을 통하여 보다 잘 이해될 것이다.
도 1은 아포프토시스의 단계들을 통해 이동하는 암 세포의 시간 순서의 현미경 사진이다. 좌측의 제1 패널(1)은 아포프토시스 이전의 세포를 나타낸다. 중간 패널(2)은 아포프토시스 및 블레빙이 출현하는 동안의 세포들을 나타낸다. 우측의 마지막 패널(3)은 아포프토시스가 완료되거나 거의 완료된 후의 세포를 나타낸다.
도 2는 환자들의 전체적인 생존을 나타낸다. 적색 라인은 치료가 MiCK 분석 결과들의 이용에 기초하였던 환자들이다. 청색 라인은 치료가 MiCK 분석 결과들의 이용에 기초하지 않았던 환자들이다. 곡선들 내의 크로스 해치들은 삭제된 환자들을 나타낸다. 가로 좌표 상의 작은 숫자들은 각 시점에서 위험한 환자들을 나타낸다. 로그 등급 분석에 의해 상기 곡선들은 통계적으로 상이하다(p＝0.04).
도 3은 환자들에서 무재발 간격을 나타낸다. 적색 라인은 치료가 MiCK 분석 결과들을 이용함에 기초하였던 환자들이다. 청색 라인은 치료가 MiCK 분석 결과들을 이용함에 기초하지 않았던 환자들이다. 곡선들 내의 크로스 해치들은 삭제된 환자들을 나타낸다. 가로 좌표 상의 작은 숫자들은 각 시점에서 위험한 환자들을 나타낸다. 로그 등급 분석에 의해 상기 곡선들은 통계적으로 상이하다(p＜0.01).
도 4는 유방 및 폐 시편들 사이의 비교를 나타내며, 조직 시편 유형들 사이의 차이가 제네릭들 또는 전유의 치료제들이 하나의 유형 대 다른 것에서 보다 효과적인 지에 관련되는 지를 예시한다. 주의： 유방암에 대해서는 단일 치료제들만이 ID 제네릭 및 전유에 대해 사용되었던 반면에 폐 및 결장에 대해서는 다중 치료제들이 고려되었다. 카이-스퀘어(chi-square)(2) 분석은 피셔의 정확성 검증(p－값＝0.57)을 이용하여 유방(97.7%)에 대한 %g＝p가 폐(93.8%)에 대한 %와 통계적으로 충분하게 다르지 않은 점을 나타낸다.
도 5는 유방 및 결장 시편들 사이의 비교를 나타내며, 조직 시편 유형들 사이의 차이가 제네릭들 또는 전유의 치료제들이 하나의 유형 대 다른 것에서 보다 효과적인 지에 관련되는 지를 예시한다. 카이-스퀘어 분석은 피셔의 정확성 검증(p－값＜0.05)을 이용하여 유방(97.7%)에 대한 %g＝p가 결장(71.4%)에 대한 %와 통계적으로 충분하게 다른 점을 나타낸다.
도 6은 유방과 결장＋폐 시편들 사이의 비교를 나타내며, 조직 시편 유형들 사이의 차이가 제네릭들 또는 전유의 치료제들이 하나의 유형 대 다른 것에서 보다 효과적인 지에 관련되는 지를 예시한다. 카이-스퀘어 분석은 피셔의 정확성 검증(p－값＝0.19)을 이용하여 유방(97.7%)에 대한 %g＝p가 결장＋폐(89.7%)에 대한 %와 통계적으로 충분하게 다르지 않은 점을 나타낸다.
도 7은 결장 및 폐 시편들 사이의 비교를 나타내며, 조직 시편 유형들 사이의 차이가 제네릭들 또는 전유의 치료제들이 하나의 유형 대 다른 것에서 보다 효과적인 지에 관련되는 지를 예시한다. 가장 우수한 전유(p＝0.16) 및 가장 우수한 제네릭(p＝0.45)에 대한 폐에서 결장까지의 분포들은 폐 및 결장이 다른지를 결정내리기에 불충분한 증거가 존재함을 나타낸다. 결장 그룹을 갖는 작은 샘플 크기로 인해 비모수적 윌콘 검정이 이용되었다.
도 8은 하룻밤 동안의 배양 이전의 웰 플레이트 내의 세포들의 현미경 사진이다.
도 9는 15시간의 배양 후의 웰 플레이트 내의 세포들의 현미경 사진이다.
도 10은 다양한 농도들에서 37가지의 테스트된 항암 치료제 후보 물질들에 대한 암 세포들의 아포프토시스 반응을 나타낸다.
일반 MiCK 분석 프로토콜
본 발명은 기간 동안 광학 밀도(optical density： OD)를 측정하는 분광 광도 분석(spectrophotometric assay)을 이용하여 암 세포들에 아포프토시스(apoptosis)를 야기하는 항암 치료제 후보 물질(drug candidate)의 효능의 평가에 관한 것이다. 일 실시예에 있어서, 본 발명은 상기 치료제 후보 물질들을 앞서 언급되고 전제적으로 여기에 참조로 포함한 미국 특허 제6,077,684호 및 미국 특허 제6,258,553호에 개시된 바와 같은 미소배양 속동성(Microculture Kinetic： MiCK) 분석과 유사한 분석에 적용하여 이러한 항암 치료제 후보 물질들을 평가하는 방법을 포함한다.
특정한 일 실시예에 따르면, 상기 분석은 항암 치료제 후보 물질을 선택하고, 상기 치료제들이 테스트되는 수득된 종양 시편으로부터 유도되는 적어도 하나의 암 세포를 선택하여 진행될 수 있다.
일 실시예에 있어서, 상기 암세포들은 RPMI와 같은 배양 배지 내에 단일-세포 서스펜션으로서 현탁될 수 있다. 여기에 사용되는 바에 있어서, "단일 세포 서스펜션(single cell suspension)"은 상기 세포들이 개별적으로 또는 10개나 그보다 적은 세포들의 응괴(clump)로 분리되는 액체 내의 하나 또는 그 이상의 세포들의 서스펜션이다. 상기 배양 배지는 소태아 혈청(fetal-bovine serum) 또는 상기 암 세포들에 특별하게 요구되는 성분들과 같은 다른 성분들을 함유할 수 있다. 이들 성분들은 통상적으로 적어도 24시간이지만 120시간 보다 길지는 않은 상기 분석 동안 상기 세포들을 유지하는 데 필수적인 것들에 한정되지 않을 수 있다.
현탁된 세포들은 샘플들을 분광 광도 플레이트의 웰(well)들 내에 배치하여 테스트될 수 있다. 상기 세포들은 상기 광학 밀도(OD)의 분광 광도 측정들 동안, 상기 플레이트 판독기의 빔이 한 번에 하나의 세포층만을 정상적으로 통과하도록 임의의 농도로 현탁될 수 있다. 대부분의 세포들을 위하여, 2×105세포들/㎖ 내지 1×106세포들/㎖ 사이의 농도가 이용될 수 있다. 농도는 작은 세포들에 대해서는 증가될 수 있고, 큰 세포들에 대해서는 감소될 수 있다. 적절한 세포 농도를 보다 정확하게 결정하기 위하여, 치료제 후보 물질 테스트 샘플들에 사용되는 세포 서스펜션의 부피가 상기 플레이트의 적어도 하나의 농도 테스트 웰에 첨가될 수 있다. 상기 웰이 상기 치료제 후보 물질들의 테스트 동안에 추가적인 배지로 미리 채워질 경우, 상기 농도 테스트 웰은 유사하게 추가적인 배지로 미리 채워질 수 있다. 상기 농도 테스트 웰이 채워진 후, 상기 플레이트는 상기 세포들을 상기 웰의 바닥에 정착시키도록 원심 분리(예를 들면, 500RPM에서 30－120초 동안)될 수 있다. 상기 세포 농도가 상기 분석을 위해 적절할 경우, 상기 세포들은 중첩되지 않고 단일층을 형성해야 한다. 세포 농도는 이러한 결과가 구현될 때까지 적절하게 조절될 수 있다. 세포들의 다중 농도들은 다른 농도 테스트 웰들을 이용하여 한 번에 테스트될 수 있다.
상기 세포들이 밤새 또는 상기 플레이트 내의 상기 세포들의 배치와 상기 치료제 후보 물질 분석의 개시 사이의 다른 기간 동안에 상당하게 성장할 수 있는 다른 실시예들에 따르면, 상기 세포 농도가 성장을 가능하게 하는 보다 적은 단일층을 초기에 구형하도록 조절될 수 있으므로 단일층을 위해 충분한 세포들이 상기 치료제 후보 물질 분석이 개시되는 때에 존재할 것이다.
상기 적절한 세포 농도가 결정된 후, 상기 치료제 후보 물질 분석은 배지의 적절한 농도 및 세포들의 적절한 수로 상기 플레이트 내의 실험 및 대조 웰들을 채워 진행될 수 있다. 다른 실시예들에 있어서, 상기 웰은 배지만으로 부분적으로 미리 채워질 수 있다.
충진 후에, 상기 세포들은 적어도 12시간, 적어도 16시간, 적어도 24시간, 또는 12－16시간, 12－24시간, 혹은 16－24시간과 같은 정해진 기간 동안 상기 플레이트 상태들을 조절하게 될 수 있다. 조절 기간은 백혈병(leukemia)/림프종(lymphoma) 주들(lines) 또는 개별적인 세포들의 경우에서 정상적으로 존재하는 다른 세포 형태들과 같은 특정 세포 유형들에 대해서 생략될 수 있다. 상기 조절 기간은 통상적으로 상기 세포들이 상기 시간 동안에 상당한 성장을 경험하지 않도록 충분히 짧다. 상기 조절 기간은 상기 치료제 후보 물질 분석에 이용되는 암 세포들의 유형에 따라 변화될 수 있다. 조절은 상기 세포들을 살아있고 건강하게 유지하기에 적절한 조건들 하에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 플레이트는 5%의 CO2 분위기 하의 37℃에서 습도 조절된 인큐베이터 내에 배치될 수 있다. 일부 세포 유형들, 특히 백혈병 또는 림프종 세포주들과 같은 조절 기간을 갖지 않는 특정한 세포 유형들을 위하여, 상기 플레이트는 상기 세포들을 상기 웰들의 바닥에 정착시키도록 원심 분리(예를 들면, 500RPM에서 2분 동안)될 수 있다.
상기 치료제 후보 물질 및 임의의 대조군 물질 또는 다른 대조군 샘플들은 상기 조절 기간 후에 상기 웰들에 첨가될 수 있다. 통상적으로, 상기 치료제 후보 물질은 상기 웰 내의 액체의 전체 부피와 비교하여 작은 부피의 배지 또는 다른 액체 내에 첨가될 것이다. 예를 들면, 첨가되는 치료제의 부피는 상기 웰 내의 액체의 전체 부피의 10% 보다 작을 수 있다. 치료제 후보 물질들은 임의의 농도 효과들을 결정하게 하는 다중 희석도들로 첨가될 수 있다. 많은 치료제 후보 물질들이 물에 용해될 수 있지만, 물에 쉽게 용해되지 않는 치료제 후보 물질들도 테스트될 수 있다. 이러한 후보 물질들은 임의의 적절한 운반체와 혼합될 수 있다. 이와 같은 후보 물질들은 바람직하게는 실제의 임상적 용도로 예상되는 운반체들과 혼합될 수 있다. 점성이 있는 치료제 후보 물질들은 테스트되기 위하여 실질적인 희석을 요구할 수 있다. 진한 색상을 갖는 치료제 후보 물질들은 상기 치료제 후보 물질만을 함유하는 실험 웰들 내의 OD 및 실험 샘플들에 대한 측정들로부터 이러한 OD의 감산의 모니터링으로부터 유리할 수 있다.
상기 치료제 후보 물질의 첨가 후, 상기 세포들은, 예를 들면 15분 또는 30분의 다른 짧은 조절의 기간을 가질 수 있다. 상기 세포들은 상기 세포들을 살아 있고 건장하게 유지하기에 적합한 조건들 하에 배치될 수 있다. 예를 들면, 상기 플레이트는 5%의 CO2 분위기 하의 37℃에서 습도가 조절된 인큐베이터 내에 배치될 수 있다. 이러한 짧은 조절 기간 후, 광물유의 층이 상기 배지 내에 CO2를 유지하고 증발을 방지하도록 각 웰의 상부에 배치될 수 있다.
상기 플레이트는 이후에 정해진 파장에서 상기 OD를 측정하도록 구성된 분광 광도계(spectrophotometer) 내에 배치될 수 있다. 상기 분광 광도계는, 예를 들면, 550㎚ 내지 650㎚의 파장에서 OD를 측정하도록 구성될 수 있거나, 보다 상세하게는 상기 분광 광도계는 정해진 전체 기간 동안 정해진 시간 간격으로 각 웰을 위해 600㎚의 파장에서 상기 OD를 판독하도록 구성된다. 예를 들면, 각 웰을 위한 OD는 초들, 분들 또는 시간들의 시간 프레임에 대해 대략 24시간 내지 120시간, 대략 24시간 내지 72시간, 또는 대략 24시간 내지 48시간의 기간 동안 주기적으로(즉, 순차적으로) 측정될 수 있다. 또는, 특정한 세포들을 위해, 12시간과 같이 적은 주기에 대한 측정들이 충분할 수 있다. 특정한 실시예들에 있어서, 측정들은 매 5분 내지 10분 동안 수행될 수 있다. 상기 분광 광도계는 상기 세포들의 자발적인 사망을 방지하도록 배양 인큐베이터를 가질 수 있다.
분광 광도 데이터는 속동성 단위들(kinetic units)로 전환될 수 있다. 속동성 단위들은 세포 블레빙(blebbing)에 의해 야기되는 상기 측정된 파장, 예를 들면 600㎚에서 상기 OD의 변화가 시간의 함수로서 도표화될 때에 생성된 곡선의 기울기에 의해 결정된다. 속동성 단위의 계산에 관한 구체적인 정보는 여기에 모든 목적들로 전체적으로 참조로 포함된 Kravtsov, Vladimir D. 등의 "Use of the Microculture Kinetic Assay of Apoptosis to Determine Chemosensitivities of Leukemias"(Blood 92： 968－980(1998)에 제공되어 있다. 속동성 단위 결정은 또한 다음에 보다 상세하게 논의된다. 정해진 농도에서 정해진 치료제 후보 물질에 대한 광학 밀도는 시간에 대해 도표화될 수 있다. 이러한 도표화는 상기 세포들이 아포프토시스를 겪는 경우에 구별되는 증가 곡선을 제공한다. 비교에 있어서, 상기 치료제 후보 물질이 상기 세포들에 영향을 미치지 않을(예를 들면, 이들이 내성을 갖는 경우, 상기 곡선은 치료제 또는 치료제 후보 물질이 없는 대조 샘플에 대해 수득된 것과 유사하다. 아포프토시스와는 다른 원인에 기인하는 세포사도 현재의 분석으로 결정될 수 있고, 치료제 후보 물질 검사로부터 가긍정적 판단(false positives)을 소거하는 데 유용하다. 예를 들면, 세포 괴사(cell necrosis)는 상기 아포프토시스-연관 곡선과 쉽게 구별 가능한 구별되는 하향 기울기를 야기한다. 또한, 일반적인 세포사도 하향 곡선을 생성한다.
아포프토시스의 속동성 단위(KU)
치료제 후보 물질의 효능은 변형된 MiCK 분석에서 이를 생성하는 속동성 단위들의 값에 의해 결정될 수 있다. 상기 KU는 아포프토시스를 수량화하기 위해 계산된 값이다. 속동성 단위들은 다음과 같이 결정될 수 있다.
아포프토시스(KU)＝(Vmax처리되는 치료제 후보 물질－Vmax대조군)×60×X/(OD대조－OD블랭크)
상기 KU는 아포프토시스를 수량화하기 위해 계산된 값이다. 각각의 웰들로부터의 광학 밀도(OD)들은 시간에 대해 도표화된다. 상기 아포프토시스 곡선의 최대 기울기(Vmax)는 치료제 처리된 미소배양의 각각의 도표에 대해 계산된다. 이는 이후에 치료제가 없는 대조 웰의 Vmax(상기 치료제에 노출된 세포들의 Vmax와 동일한 시간에 계산된다)와 비교된다. 편의상, 상기 Vmax에는 mOD/분부터 mOD/시의 단위들로 전환시키기 위해 60이 곱해진다. 상기 데이터는 다음에 논의되는 계수(계수＝X/(OD대조－OD블랭크)로 정규화된다.
계수
전술한 바와 같이, 상기 계수는 아포프토시스를 측정하고 속동성 단위들로 상기 아포프토시스를 수량화할 때에 웰 당 세포들의 양을 정규화하기 위해 계산된 값이다.
상기 계수는 다음과 같이 계산된다.
계수： X/(OD대조－OD블랭크)
X＝실험된 세포 유형에 대한 최적 광학 밀도 값(경험적으로 결정된)
OD대조＝모든 대조 웰들의 평균 광학 밀도
OD블랭크＝모든 블랭크 웰들의 평균 광학 밀도
1.000의 계수는 상기 웰 내의 세포 농도가 최적인 것을 의미한다. 1.000 아래의 계수 값은 상기 세포 농도가 상기 최적 농도보다 높은 것을 의미한다. 상기 계수 값이 1.000 이상일 경우, 이는 상기 웰 내의 세포 농도가 최적 이하인 것을 의미한다. 최적의 MiCK 분석을 위한 허용 가능한 계수 값들은 0.8 내지 1.5 사이이다. 상기 값이 0.8 아래일 경우, 상기 계수는 상기 계산된 KU의 값을 잘못되게 감소시킬 것이다. 상기 값이 약 1.5일 경우, 아포프토시스의 신호를 검출하기 위한 웰 당 세포들이 충분하지 않을 것이다. 상기 식에서 "X"는 상기 세포 유형에 따라 변화될 것이다. 고체 종양 시편들에 대하여, 이러한 값은 0.09이다. 대부분의 백혈병들에 대하여, 상기 값은 0.15이다. CLL(만성 림프성백혈병들) 및 림프종에 대하여, 상기 값은 0.21이다.
이러한 "X" 값은 상기 종양 유형에 적응되고 경험적으로 결정된다. 따라서, 상기 계수는 세포들의 다른 농도들을 이용하는 시행착오에 의해서와 상기 웰내의 완전하고 적절한 커버리지를 구하는 동안에 현미경 하에서 이들을 점검함에 의해 발전된다. 적절한 웰은 판독기에 의해 판독되며, 상기 OD는 새로운 X 값으로 된다. 이러한 식에 관한 상세한 정보는 앞서 여기에 참조로 포함된 Kravtsov 등(Blood, 92： 968－980)에서 찾아볼 수 있다.
치료제 후보 물질이 아포프토시스를 야기하거나 그렇지 않은지가 결정 가능하게 되는 것 이외에도, 현재의 분석을 이용하여 생성된 속동성 단위 값들이 특정한 치료제 후보 물질이 현재의 치료제들 보다 우수하거나 유사한 지를 판단하도록 비교될 수 있다. 치료제 후보 물질의 다른 농도들의 비교도 수행될 수 있으며, 적절힌 복용량의 일반적인 지시들을 얻을 수 있다. 때때로 일부 치료제들은 일부 암들에서 보다 낮은 농도들에 비해 보다 높은 농도들에서 낫지 않게 될 수 있다. 치료제 후보 물질들의 다른 농도들의 속동성 단위 값들의 비교는 유사한 프로파일을 갖는 치료제 후보 물질들을 확인할 수 있다.
전체적으로, 항암 치료제 후보 물질의 평가는 치료제 후보 물질의 암 세포의 아포프토시에 대한 임의의 영향들의 결정을 포함할 수 있다. 효과들은, 이에 한정되는 것은 아니지만, 아포프토시스의 유도, 알려진 암 치료제들과 비교할 경우의 아포프토시스의 유도의 정도, 치료제 후보 물질 농도들에서 아포프토시스의 유도의 정도, 그리고 아포프토시스의 유도의 실패를 포함할 수 있다. 항암제(antidrug) 평가 분석은 또한 상기 분석 또는 세포 괴사의 암 세포 성장과 같은 상기 암 세포들에서의 약물에 연관되지 않거나 비아포프토시스성의 경우들을 검출할 수 있다.
임의의 통계적으로 중요한 양의 속동성 단위 값은 암 세포의 아포프토시스를 유도하는 치료제 후보 물질의 일부 경향을 나타낼 수 있다. 그러나, 많은 임상적 목적들을 위하여, 아포프토시스의 매우 낮은 수준만을 유도할 수 있는 치료제 후보 물질들 또는 치료제의 농도들은 관심의 대상이 아니다. 이에 따라, 본 발명의 특정 실시예에 있어서, 역치(threshold) 속동성 단위 값들이 암 세포들 내에 아포프토시스의 적절한 수준들을 임상적으로 유도할 수 있는 치료제 후보 물질들을 판별하도록 설정될 수 있다. 예를 들면, 상기 역치 양은 1.5, 2 또는 3 속동성 단위들이 될 수 있다. 특정한 치료제 후보 물질 또는 치료제 후보 물질의 농도에 대해 선택되는 실제 역치는 많은 인자들에 의존한다. 예를 들면, 1.5 또는 2와 같은 보다 낮은 역치가 다른 치료제들에 반응하지 않거나 상당한 부정적인 부작용들을 갖는 치료제들에만 반응하는 아포프토시스를 유도할 수 있는 치료제 후보 물질에 대해 허용될 수 있다. 보나 낮은 역치는 또한 보나 높은 농도들에서 감소된 효능을 보이거나 이들 자체가 상당한 부정적인 부작용들을 가질 수 있는 치료제 후보 물질들에 대해 허용될 수 있다. 3과 같이 보다 높은 역치는. 이미 적합한 치료들이 수행된 암 유형들에서 아포프토시스를 유도할 수 있는 치료제 후보 물질들에 대해 허용될 수 있다.
다른 실시예에 있어서, 다음의 역치 범위들이 활용될 수 있다.
0－1 KU：민감하지 않음
1－2 KU：낮은 민감성
2－3 KU：낮은/중간 민감성
3－5 KU：중간 민감성
＞5 KU：민감함
바람직하게는, 다음의 역치 범위들이 활용될 수 있다.
0－1 KU：민감하지 않음
1－2.6 KU：낮은 민감성
2.6－4.2 KU：낮은/중간 민감성
4.2－5.8： KU：중간 민감성
＞5.8 KU：민감함
바람직하게는 상기 KU 값＝7이고, 보다 바람직하게는 상기 KU 값＝8이며, 보다 더 바람직하게는 상기 KU 값＝9이고, 가장 바람직하게는 상기 KU 값＝10이다.
이들 범위들은 암 세포들의 통계적인 분석을 바탕으로 수립되었다. 상기 범위들은 특정 세포 유형에 실험되는 화학 요법의 치료제들의 상대적인 비교를 위한 베이스라인(baseline)을 수립한다. 실험 결과들은 다음과 같은 참작 이자들에 의해 영향을 받을 수 있다.
ㆍ실험되는 샘플의 수득으로부터의 경과된 시간,
ㆍ실험에 이용될 수 있는 생존 가능한 세포들의 양,
ㆍ시편의 미생물 오염,
ㆍ실험되는 세포들의 품질이나 생존성,
ㆍ세포 유형, 그리고
ㆍ항암 화학 요법 또는 방사선 치료와 같은 최근의 치료.
이들 인자들은 보고된 속동성 반응의 예측 값에 어느 정도 탄력성을 제시한다. 항암 화학 요법 치료제에 대한 임상적인 민감성은 전술한 범위들 내로 예상되는 바와 같은 결과들로 완전히 한정하는 것은 아니다. 상기 분석에서 약물 유발성(drug-induced) 아포프토시스의 KU 측정은 환자의 이력, 이전의 치료 결과들, 전체적인 환자의 건강, 환자의 공병(comorbidity)들, 환자의 선호도뿐만 아니라 다른 임상적인 인자들과 같은 다른 중요한 인자들과 함께 개별적인 환자 치료 요법을 발진시키도록 내과의들에 의해 이용될 수 있다.
이에 따라, 활용되는 KU 값의 특정한 범위들은 상황, 즉 테스트되는 종양 세포의 특정한 유형에 따라, 활용되는 특정 치료제 및 특정 환자 또는 분석되는 환자 인구에 의존할 것이다. 상기 KU 값은 이에 따라 정해진 치료제의 효과를 평가하도록 적절한 측정치를 생성하는 개시된 방법들의 의사들에 의해 조정될 수 있는 신뢰성 있고 유연한 분석 변수들을 나타낸다.
치료제 후보 물질들
특정 실시예에 따르면, 상기 항암 치료제 후보 물질들은 암 세포들에서 아포프토시스를 유도하는 능력에 대해 평가되는 임의의 화학 물질, 화학 물질들, 화합물, 화합물들, 조성물 또는 조성물들일 수 있다. 이들 후보 물질들은 화학 요법제들(chemotherapeutics), 다른 저분자 의약품들, 화학 치료제 분자들에 연결되는 항체나 항체 조각들을 포함하는 단백질 또는 펩타이드계 치료제 후보 물질들, 핵산계 치료제들, 다른 생물학적 치료제들, 나노입자계 후보 물질들, 그리고 유사한 것들과 같은 다양한 화학적 또는 생물학적 물질들을 포함할 수 있다. 치료제 후보 물질들은 현존하는 약물들과 동일한 화학 패밀리에 속할 수 있거나, 이들은 새로운 화학적 또는 생물학적 물질들일 수 있다.
치료제 후보 물질들은 단일의 화학적, 생물학적 또는 다른 물질들에 한정되지 않는다. 이들은 다른 화학적 또는 생물학적 물질들의 결합들, 예를 들면 제시된 결합 치료제들을 포함할 수 있다. 또한, 비록 여기서의 많은 실험예들은 단일의 치료제 후보 물질이 적용되는 분석에 관한 것이지만, 분석들은 결합되는 다중의 치료제 후보 물질들에 대해 수행될 수도 있다. 본 발명의 실시예들이 기술한 바와 같은 방법에서 다양한 치료제 후보 물질들의 대사 물질들을 활용할 수 있는 점을 이해하는 것도 중요하다.
하나 이상의 치료제 후보 물질, 치료제 후보 물질의 농도, 또는 치료제나 치료제 후보 물질들의 결합은 단일 플레이트를 이용하는 단일 분석에서 평가될 수 있다. 다른 테스트 샘플들은 다른 웰들 내에 배치될 수 있다. 상기 테스트된 치료제 후보 물질의 농도는, 예를 들면, 특정 실시예들에서, 0.1μM 내지 10,000μM의 범위 내의 임의의 농도, 또는 0.01μM 내지 10,000μM의 범위 내의 임의의 농도, 혹은 0.001μM 내지 100,000μM의 범위 내의 임의의 농도가 될 수 있다. 상기 테스트된 농도는 치료제 유형에 의해 변화될 수 있고, 전술한 실험 농도들은 제한적인 것으로 간주되지는 않으며, 해당 기술 분야의 숙련자라면 실험되는 특정한 항암 치료제에 따라 설시된 방법들 및 분석들로 활용을 위해 어떻게 적절한 농도를 구성할 수 있는 지를 이해할 수 있을 것이다.
플레이트 및 분광 광도계 시스템들
특정 실시예들에 있어서, 상기 플레이트 및 분광 광도계는 상기 분광 광도계가 상기 플레이트를 판독할 수 있도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 이전의 분광 광도계들을 사용할 때, 이들은 상기 장비가 보다 작은 웰의 플레이트들을 판독할 수 없기 때문에 보다 큰 웰들을 갖는 플레이트들을 사용할 수 있다. 보다 새로운 분광 광도계들은 보다 작은 웰들을 갖는 플레이트를 판독할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 각 웰의 바닥의 직경은 상기 분광 광도계의 라이트 빔(light beam)의 직경 보다 작지 않다. 보다 구체적인 실시예에 있어서, 각 웰의 바닥의 직경은 상기 분광 광도계의 라이트 빔의 직경의 두 배 정도이다. 이는 각 웰 내의 상기 세포들의 일부를 나타내는 상기 측정된 파장, 예를 들면 600㎚에서의 OD가 정확하게 판독되는 점을 확보하는 데 기여한다. 상기 분광 광도계는 600㎚ 이외의 파장들에서 측정할 수 있다. 예를 들면, 상기 파장은 +/- 5 또는 +/- 10이 될 수 있다. 그러나, 다른 파장들이 블레빙(blebbing)을 구별할 수 있게 하기 위하여 선택될 수 있다.
분광 광도계들은 상기 장비를 동작시키거나 결과들을 기록하도록 하나 또는 그 이상의 컴퓨터들이나 프로그램들을 포함할 수 있다. 일 실시예에 있어서, 상기 분광 광도계는 상기 측정 프로세스를 제어하고, 그 결과들을 기록하며 각 웰에 대한 시간의 함수로서 광학 밀도들을 도표화하는 그래프들을 표시하거나 전송할 수 있는 하나 또는 그 이상의 컴퓨터들에 기능적으로 연결될 수 있다.
조직 배양을 위해 설계된 플레이트들이 사용될 수 있거나, 다른 플레이트들은 이들을 조직 배양과 양립 가능하게 하도록 살균되고 처리될 수 있다. 모서리들과 같이 상기 분광 광도계가 접근할 수 없는 영역들 내에 세포들을 모이게 하는 플레이트들은 이러한 응집을 방지하는 플레이트들 보다 잘 동작하지 못할 수 있다. 선택적으로는, 보다 많은 암 세포들이 상기 분석 동안에 상기 분광 광도계가 접근할 수 있는 단일층의 존재를 확보하도록 이들 플레이트들에 첨가될 수 있다. 코닝 코스타®(Corning Costar®) 하프 에어리어(half area) 96-웰 플레이트와 같은 좁은 바닥들을 갖는 플레이트들도 불편하게 낮은 샘플 부피들을 요구하지 않고 상기 웰의 바닥에 단일층의 형성을 고무시키는 데 보조할 수 있다. 다른 96-웰 플레이트들 또는 보다 384-웰 플레이트들과 같은 작은 웰 플레이트들과 같은 다른 플레이트들도 사용될 수 있다.
변형된 MiCK 분석 프로토콜
미국 특허 제6,077,684호 및 미국 특허 제6,258,553호에 이미 기재된 MiCK 분석 프로토콜 및 현재 개시하는 상기 MiCK 분석 프로토콜 사이의 많은 차이점들은, 예를 들면 다음과 같다.
a) 고상의 종양 샘플 시표들에 대한 하룻밤의 배양;
b) 고상의 종양들이 혈액 샘플들 보다 적은 세포들을 제공하기 때문에 낮은 부피의 웰들;
c) 상기 세포 농도 가시적인 해석을 통해 조절되고;
d) 상기 세포가 상기 웰들의 바닥에 부착되고, 밤새 확산/펼쳐질 것이며;
e) 열을 고르게 확신시키는 특별한 배양 챔버의 활용;
f) 상기 세포들을 상기 웰들 내로 적재할 때에 상기 플레이트들의 에지들의 회피;
g) 상기 세포들, 배지들(RPMI＋10%의 소태아 혈청＋펜스트렙(Penstrep)) 및 치료제들을 도포하는 자동화된 피페터(pipettor)의 활용;
h) 로봇이 이해할 수 있는 포맷으로 템플레이트(template)를 해석하도록 생성된 전유 코드(proprietary code)의 활용;
i) 도포(plating)를 위해 준비된 순수한 세포 서스펜션을 가질 때의 세포 분리 종결들;
j) 상기 세포 농도를 조절하는 데 사용되는 세포 계수(count);
k) ㎖ 당 1×106 세포들까지의 상기 농도의 조절;
l) 상기 세포 분포를 관찰하도록 실험 웰이 이루어지고;
m) 상기 세포들이 양호한 형상이 아닐 경우, 보다 많은 세포들이 각 웰에 첨가되며;
n) 상기 실험 웰이 충분한 것(모든 면적을 덮는 균일하게 분산된 세포들의 단일층)으로 보일 경우, 다음 단계(도포)로 진행하고;
o) 실험 웰이 충분하지 않을 경우, 상기 웰 내의 세포 분포가 충분할 때까지의 상기 세포 농도의 조절(상기 세포들의 희석이나 상기 세포들의 농축) 및 새로운 웰의 재실험;
p) 이러한 시점(전술한 단계들 후)에서 상기 세포들이 격감할 때까지 저장액(stock solution)이 상기 플레이트 내의 추가적인 웰들 내로 도포될 준비가 되고;
q) 상기 선택된 세포 농도를 이용하여, 상기 세포 서스펜션이 가능하다면 적어도 1 시토스핀(cytospin) 및 ICC(면역세포화학(immunocytochemistry))을 수행하기에 충분한 세포들을 유지하는 가능한 한 많은 웰들 내로 상기 플레이트 내에 분산되며;
r) 상기 플레이트들의 에지 웰들을 회피하면서 상기 세포들을 분산시키도록 자동화된 피페터가 사용되고;
s) 상기 에지 웰들이 배지들로 채워지며;
t) 자동화된 피페터(반점)로 일어났던 거품 문제를 제거하도록 구성 파일이 제조되었다. 이러한 특징은 현저하게 상승된 KU 값들을 가져오는 기울기 값들을 인위적으로 상승시키는 상기 분석 동안에 상기 배지들 내의 거품들의 형성을 제거하기 때문에 중요하며;
u) 이러한 플레이트(전술한 단계들이 수행되었던)가 이제 하룻밤의 배양(대략 15시간)을 위해 준비되고;
v) 상기 배양이 상기 세포들을 상기 웰들의 바닥에 부착시키고 물질 대사 작용으로 안정화되게 하는 시간을 허용하며;
w) 배양 플레이트가 상기 인큐베이터로부터 제거된 후, 상기 세포 분포 및 생존성이 도립 현미경으로 상기 플레이트의 관찰로부터 평가된다. 웰을 나타내는 현미경 사진이 수득되고;
x) 상기 플레이트가 이후에 상기 자동화된 피페터로 상기 치료제들(예를 들면, 가능한 항암제들)의 첨가를 위해 준비되며;
y) 치료제들이 치료하는 종양내과 전문의(예를 들면)에 의해서 및 NCCN 패널들에 의해서 선택되고, 이후에 패널 치료제들이 제거된다(오프 레벨).
z) 37℃ 및 5% CO2에서 30분 동안의 배양이 pH 평형을 가능하도록 수행되며;
aa) 오일이 공기 교환과 증발을 방지하도록 모든 웰에 첨가되고;
bb) 상기 플레이트가 판독기 내에 배치되고 상기 분석이 시작되며;
cc) 상기 분석이 576 판독들 후(48시간, 5분 간격)에 자동적으로 종료되고; 이들 설정들이 필요에 따라 조절될 수 있으며;
dd) 상기 분석이 48시간 이전에 모든 반응들이 완료된 것으로 여겨질 경우에는 수동으로 종료될 수 있고;
ee) 상기 계수가 X가 정해진 세포주의 최적의 값인 X/(OD대조－OD블랭크들)로서 정의될 수 있다. OD는 광학 밀도이다. 상기 계수는 세포들의 다른 농도들을 이용하여 시행착오에 의해서 및 상기 웰 내의 완전하고 적절한 커버리지를 찾는 동안에 현미경 하에서 이들을 점검하여 개발되었다. 상기 적절한 웰은 판독기에 의해 판독되었고 상기 OD가 새로운 X 값으로 되었으며;
ff) 훈련된 관찰자가 정제의 모든 스테이지들에서 세포들의 세포학적 특성들을 평가할 수 있으며;
gg) 훈련된 관찰자가 치료제들의 등급을 분석할 수 있고;
hh) 훈련된 관찰자가 최상의 치료제들이나 결합들을 분석할 수 있으며;
ii) 훈련된 관찰자가 가장 활성인 치료제 후보 물질들을 분석할 수 있고(치료제 대사 작용들을 분석하는 것을 포함할 수 있고) 다른 개발된 치료제들이나 약제들을 분석할 수 있다.
전술한 해당 기술 분야의 현재 상태에 대한 차이점들은 종래 기술에 의해서는 교시되거나 제시되지 않으며, 자체가 이전에 개시된 기술을 수행하는 임의의 사람에게 명백한 것은 아니다.
상기 초기 MiCK 분석과 현재 버전 사이의 다른 차이점은 상기 초기 MiCK 분석이 상기 플레이트 웰들에 대한 상기 세포들의 부착을 방지하였던 반면에 상기 현재의 버전은 상기 플레이트 벽들에 대한 부착을 이용하였던 점이다. 상기 웰 벽들에 대한 상기 세포들의 부착은 혈액 또는 골수 기원이 아닌 암들 및 육종들(sarcomas)을 위해 요구된다. 상기 웰 벽들에 상기 세포들이 부착되지 않은 것은 백혈병 및 림프종(혈액 또는 골수 근원의 암들)을 실험하기 위해 요구된다. 이러한 차이점에 대한 원인은 백혈병 및 림프종 세포들이 생체 외로 서스펜션의 형태로 성장할 것인 점이다. 상기 세포들은 서로 영구적인 밀접한 접촉을 요구하지 않는다. 대조적으로, 고상의 종양 시편들로부터 유래되는 세포들은 세포 대 세포의 접촉 및 상기 웰의 표면에 대한 부착을 요구한다. 이는 세포 생존과 때때로 성장을 자극할 것이다.
본 발명과 이전의 MiCK 분석 프로토콜들 사이의 몇몇의 차이점들이 설시되었지만, 이하 본 발명의 프로토콜들의 실시예들의 실험예들이 예시적으로 제공된다. 이들 실험예들은 기재된 예시적인 실시예들에만 포함되며, 본 발명의 전체 범주를 포괄하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
실험예들
종양 내과 전문의의 치료 판정으로 약물 유발 아포프토시스 분석 결과들과 환자 반응 및 생존의 상관관계
실험 프로토콜 및 결과들의 개괄
전향적 관찰의 비익명의(non-blinded) 임상 시험이 종양 내과 전문의들에 의해 계획된 치료들 상에서 약물 유발 아포프토시스 분석 결과들을 결정하기 위해 수행되었다. 환자 생체 검사들로부터 정제된 암 세포들이 단기간의 배양으로 종양 세포 아포프토시스에 대한 단일의 치료제들 또는 치료제들의 결합들의 영향을 결정하는 미소배양 속동성(MiCK) 분석 내로 배치되었다. 종양 내과 전문의는 치료 계획을 확정하기 이전에 상기 분석 결과들을 받아보았다.
MiCK 분석의 이용이, 본 발명의 실시예에 따르면, 평가되었고, 환자 결과들과 상호 연관되었다. 결과들：유방암으로부터 성공적인 MiCK 분석들이 이루어진 44명의 환자들(16), 비소세포 폐암(6), 비호지킨(non-Hodgkin) 림프종(4) 및 기타 사항들이 평가되었다. 4명의 환자들은 MiCK 후에 received 보조 항암 화학 요법을 받았고, 40명은 2의 치료의 중간선으로 고식적(palliative) 항암 화학 요법을 받았다. 종양 내과 전문의들은 28명(64%)에서 항암 화학 요법(이용자들)을 판단하도록 본 발명의 MiCK 분석을 이용하였으며, 17명의 환자들(36%)에서는 비용하지 않았다(비이용자들). 고식적 항암 화학 요법을 받은 이용자들에 있어서, 비이용자들에서의 6.7%에 비하여 완전 플러스 부분 반응 비율은 44%였다(p＜0.02). 중간의 전체 생존은 비이용자들에서의 4.1개월에 비해 이용자들에서 10.1개월이었다(p＝0.02). 무재발(relapse-free) 간격은 비이용자들에서의 4.0개월에 비해 이용자들에서 8.6개월이었다(p＜0.01). 결론：본 발명에 따른 MiCK 분석들은 자주 종양 내과 전문의에 의해 이용된다. 결과들은 종양 내과 전문의가 본 발명의 MiCK 분석 결과들에 기초하여 항암 화학 요법을 사용할 때에 이들이 상기 분석 결과들를 이용하지 않는 경우에 비하여 통계적으로 우수하게 나타난다. 종양 내과 전문의에게 이용 가능할 때, 본 발명에 따른 MiCK 분석 및 그 결과들은 환자 치료 계획들을 결정하는 데 도움이 된다.
특정 실험 프로토콜 및 세부 결과들
내과의들이 항암 화학 요법을 계획하고 시작하기 이전에 상기 분석의 결과들을 알고 있을 때, 전향적 관찰의 비무작위이고 다중 기관의 시험이 얼마나 자주 내과의들이 상기 MiCK 분석의 여기에 개시된 실시예의 결과들을 이용할 수 있는 지를 결정하기 위하여 수행되었다.
원발성(primary) 또는 재발 이전의 임의의 단계의 암이 있는 환자들이 실험을 위해 적합하였다. 1.0㎤ 정도의 생존 가능한 종양 조직 또는 1000㎖의 악성 삼출물들(effusions) 혹은 5㎖의 백혈병 골수 흡입물(aspirate)을 갖는 살균된 종양 시편들이 환자들로부터 취해졌다. 상기 종양 시편들은 이후에 다음의 실험 프로토콜들에 따랐다.
실험예 1： 제네릭 세포 분리 프로토콜
수집의 24시간 내지 48시간 이내에, 상기 시편은 다져졌고(minced), 37℃에서 1－2시간 동안 0.25% 트립신(trypsin) 및 0.08% DNA 가수분해효소(DNase)로 소화되었으며, 이후에 100마이크로미터의 셀 스트레이너(cell strainer)를 통해 필터링되었다. 필요한 때, 생존 불능의 세포들은 밀도 구배 원심 분리(density gradient centrifugation)에 의해 제거되었다. 세포 서스펜션은 이후에 부착(adherence)에 의해 대식 세포들(macrophages)을 제거하기 위해 조직 배양 플라스크(flask) 내에서 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 상피 종양들(epithelial tumors)에 대하여, 림프구들(lymphocytes)이 T 림프구들을 위한 마그네틱 비드들(magnetic beads)에 콘주게이트된(conjugated) CD2 항체 및 B 림프구들을 위한 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD19 항체로 30분의 배양에 의해 제거되었다. 잔류하는 대식 세포들은, 필요한 경우, 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD14 항체를 이용하여 제거되었다. 상기 최종 세포 서스펜션은 웰(well) 당 120마이크로리터의 부분 표본(aliquot)으로 96-웰 하프-에어리어(half-area) 플레이트 내로 도포(plate)되었다. 상기 플레이트는 5% 이산화탄소 습도 조절된 분위기 하의 37℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 5×104세포들 내지 1.5×105세포들이 적절한 웰-바닥 커버리지(coverage)를 제공하도록 세포 부피에 따라 웰 마다 심어졌다.
급성기 세포주(blast crisis cell line)(DSMZ, 독일) 내의 인간 JURL-MK2 만성 백혈병이 환자 종양 세포들로 수행된 MiCK 분석들을 위한 양성 대조군으로 사용되었다. 페놀 레드(phenol red)가 없는 RPMI-1640 배지가 모든 배양들에 대해 사용되었다. 이는 10%의 소태아 혈청, 100단위(units)/㎖의 페니실린(penicillin) 및 100마이크로그램/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)으로 보충되었다. 세포 계수들(counts) 및 생존성은 트리판 블루 염색 배제법(trypan blue dye exclusion)으로 평가되었다.
오염되고 괴저성인(necrotic) 세포들의 정제 후, 각 종양 세포 제조가 세포학적으로 악성 종양(malignancy)의 존재를 확인하기 위해 분석되었다. 적절한 수의 세포들이 이용 가능하였을 경우, 면역 세포 화학 착색들(immunocytochemical stains)도 종양 표현형(phenotype)을 보다 특징화하기 위해 수행되었다. 모든 시편들은 능숙한 병리학자의 시각적인 평가에 의해 적어도 90%의 순수한 종양 세포 함량 및 트리판 블루 염색 배제법에 의해 90%의 생존성을 달성하였다.
상술한 제네릭(generic) 분리 프로토콜은 아래에 기술하는 시편 특정 분리 프로토콜들에 의해 변형될 수 있다.
실험예 2：고상의 종양 세포의 특정 분리 프로토콜
수집의 24시간 내지 48시간 이내에, 상기 시편은 고상의 종양들로부터 세포들을 정제하고 분리하기 위해 다음과 같이 처리되었다.
ㆍ상기 시편을 이송 튜브의 외부로 꺼낸다.
ㆍ13㎖의 PBS＋높은 농도의 항생제들(200단위/㎖의 페니실린＋200g/㎖의 스트렙토마이신)의 페트리 접시(petri dish) 내에 두며, 측정하고 상기 시편의 사진을 취한다. 상기 PBS＋항생제 용액은 실험실 내에서 전유의 프로토콜들을 이용하여 함께 혼합된 용액들로부터 만들어진다.
ㆍ페트리 접시들(3개의 다른 페트리 접시들) 내에서 13㎖의 PBS＋높은 농도의 항생제들(200단위/㎖의 페니실린＋200g/㎖의 스트렙토마이신)로 3회 세척한다.
ㆍ오염이 의심될 경우, PBS＋높은 농도의 항생제들로 튜브 내에서 20분 동안 배양시킨다.
ㆍ상기 시편을 다지기(mincing) 위하여 1㎖ 내지 3㎖(시편의 크기에 따라)의 RPMI 50%의 소태아 혈청(FBS)으로 다른 페트리 접시 내로 이송한다.
1) 다음에, 상기 시편은 다져지고, 37℃에서 1－2시간 동안 0.25% 트립신(효소는 사용되는 조직에 의해 변화될 수 있다) 및 0.08% DNA 가수분해효소(DNase)로 소화된다.
ㆍ효소는 다양한 조직들로 조사자들의 경험에 의해 개발되는 종양 유형의 다음의 프로토콜들과 함께 변화될 것이다.
ㆍ오염시키는 비종양 조직이 상기 시편 내에 확인될 경우, 이들 부분들을 외과용 메스(scalpel)들로 제거한다.
ㆍ10 또는 21 크기의 외과용 메스로 1㎜의 조각들로 다진다.
ㆍ포셉(forcep)으로 상기 조각을을 수집하며, 15㎖ 튜브＋10－12㎖의 효소(효소는 종양 유형에 의존하며, 표 1 참조) 내에 넣고, "로테이터(rotator)" 상의 37℃의 인큐베이터 내에서 45－60분 동안 배양시킨다.
ㆍ다지기를 위해 상기 페트리 접시를 RPMI(4－5㎖)로 2－3회 세척한다.
ㆍ상기 세척되는 것을 15㎖ 튜브 내에 넣고, 2－3분간 고착시킨다.
ㆍ상청액(supernatant)을 제거하며, 새로운 15㎖ 튜브에 넣고, 해마시토미터(hemacytometer) 및 트리판 블루 염색으로 세포들의 생존성을 점검한다(이는 얼마나 어렵거나 및/또는 쉬운 처리가 행해져야 하는 지에 대한 조기의 표시를 제공한다).
ㆍ펠릿(pellet)을 효소와 함께 15㎖ 튜브 내에 넣고, 로테이터 상의 37℃에서 45－60분 동안 배양시킨다.
ㆍ배양 후, 상기 상청액을 수집하고, 잔류하는 조각들을 37℃에서 45－60분 동안 신선한 효소 내에 다시 둔다.
2) 다음에, 상기 시편이 100마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 필터링되었다.
ㆍ종양 유형 및 잔류하는 "비암세포 조직"의 양에 따라, 40μM 및 70μM 스트레이너 또는 필콘(filcon)을 사용할 수도 있었다.
ㆍ상청액이 점성이 있을 경우, 또는 이가 많은 부스러기들을 함유할 경우, 이는 셀 스트레이너로 돌아갈 것이다. 이 경우, 50㎖ 튜브에 대해 살균 거즈를 이용하여 "예비 여과(pre-filtration)"를 하는 지를 결정할 수 있다. 이후에, 전술한 바를 참조하여 상기 셀 스트레이너로 필터링 프로세스를 진행한다.
ㆍ상기 필터링된 세포 서스펜션을 1500RPM에서 5분간 원심 분리한다.
ㆍ상기 상청액을 버린다. 상기 펠릿에 add 5㎖의 적혈구 용해 용액(red blood cell lysis solution)(표준 NH4Cl 함유 용해 용액：NH4Cl 0.15M＋KHCO3 10mM＋EDTA－4Na 0.1mM, pH 7.2)을 첨가하고, 2－3분 동안 배양시키며, 5㎖의 RPMI 10% FBS를 첨가한다.
ㆍ5분간 1500RPM에서 원심 분리한다. 상기 펠릿을 RPMI 10% FBS(상기 펠릿의 크기에 따라 1－10㎖) 내에 재현탁시킨다.
ㆍ상기 효소 내의 제2 부분을 수집하고, 전술한 단계들을 반복한다.
ㆍ모든 부분들 및 풀(pool)의 생존성을 점검한다. 사람의 세포 함량을 확인하기 위해 라이트 김사(Wright Giemsa)로 시토스핀 염색(cytospin stain)을 한다. 주의：이는 정제의 과정 동안에 많은 회수로 행해진다.
3) 필요할 때, 생존 불능의 세포들은 밀도 구배 원심 분리에 의해 제거된다.
ㆍ밀도 구배 원심 분리(옵티프렙(optiprep))： 제1 층＝2㎖ 세포들＋RPMI 내의 4.45㎖ 옵티프렙 40%, 제2 층＝RPMI 내의 옵티프렙 22.5%, 제3 층＝0.5㎖의 RPMI. 2000RPM에서 20분 동안 윈심 분리.
ㆍ생존 가능한 세포층을 수집하고, 10㎖의 RPMI 10% FBS를 첨가하며, 1500RPM에서 5분 동안 원심 분리한다.
ㆍ상기 펠릿을 RPMI 10% FBS(상기 펠릿 크기 및 요구되는 다음 단계에 따른 부피) 내에 다시 현탁시킨다.
ㆍ상기 시편 내에 뮤신(mucin)이 존재할 경우, 상기 펠릿을 10㎖의 PBS＋20mM DTT 내에 재현탁시키고, 상기 뮤신을 분해하도록 4℃에서 30분 동안 배양시킨다. RPMI로 1500RPM에서 5분 동안 세척한다. 상기 펠릿을 RPMI 10% FBS 내에 재현탁시킨다.
ㆍ부스러기들의 존재로 매우 괴저성일 경우, HBSS 내의 퍼콜(Percoll) 20%, 800xg에서 10분 동안 원심 분리한다.
4) 상기 세포 서스펜션은 이후에 부착에 의해 대식 세포들을 제거하도록 조직 배양 플라스크 내에서 20분 동안 37℃에서 배양되었다.
ㆍ사용된 상기 플라스크의 크기와 양은 및 부피는 세포들의 양에 의존한다. 예들:
o 1－5×106세포들：25㎠ 플라스크들, 각기 3－4㎖
o 1×107세포들：75㎠ 플라스크들, 각기 8㎖
o 1×108세포들：175㎠ 플라스크들, 각기 20㎖
배양 후, 상기 세포 서스펜션을 수집하고, RPMI 10% FBS로 상기 플라스크를 3회 세척하며, 모든 세척되는 부분들을 모으고, 1500RPM에서 5분 동안 원심 분리한다.
5) 상피 종양들에 대해, 림프구들이 T 림프구들을 위한 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD2 항체 및 B 림프구들을 위해 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD19 항체로 30분 배양하여 제거되었다.
ㆍ사용되는 비드들：T 림프구들＝CD2; B 림프구들＝CD19; 호중구들＝CD15; 단핵 백혈구들(monocytes)/대식 세포들＝CD14, 모든 백혈구들＝CD45(클럼프들(clumps)이 존재하지 않을 경우에 CD45를 사용).
ㆍ대식 세포들은 대체로 상기 비드들로가 아니라 부착에 의해 제거된다. 이유는 종양 세포들의 클럼프들이 존재할 경우에 이들도 대식 세포들을 함유할 수 있기 때문이다. 상기 대식 세포들을 제거하기 위해 비드들을 사용할 경우, 이는 또한 상기 종양 세포들을 동시에 제거할 수 있다.
ㆍ상기 펠릿을 작은 부피의 PBS 2% FBS(0.2㎖ 내지 2㎖) 내에 재현탁시킨다.
ㆍ상기 비드들 서스펜션을 상기 PBS 2% FBS로 3회 세척한다.
ㆍ상기 비드들을 상기 세포 서스펜션에 첨가하고, 상기 로테이터 상에서 실온에서 30분 동안 배양시킨다.
ㆍPut 상기 튜브를 상기 마그네트 상에 두고, 1분 동안 기다린다.
ㆍ상기 세포 서스펜션을 수집하고, 5㎖의 RPMI 10% FBS와 함께 15㎖ 튜브 내에 넣는다.
ㆍ상기 세포 서스펜션의 튜브를 잔류하는 비드들을 제거하도록 상기 마그네트 상에 다시 두고, 상기 세포 서스펜션을 수집하며 새로운 15㎖ 튜브에 넣는다.
ㆍ1500RPM에서 5분 동안 원심 분리한다.
ㆍRPMI 10% FBS 내에 재현탁시키며, 상기 부피는 상기 펠릿 크기에 좌우된다. 세포 계수를 수행하고, 생존성을 결정하며, 세포 계수를 경정하도록 시토스핀을 수행한다.
6) 잔류하는 대식 세포들을, 필요한 경우, 상기 마그네트 비드들에 콘주게이트된 CD14 항체를 사용하여 제거한다.
ㆍ이러한 단계는 단계 5에서 개괄적으로 서술된 바와 같이 처리되는 다른 비드들이 처리되는 동시에 행해질 수 있다.
ㆍ상기 세포 생존성을 검토한다. 상기 생존성이 80－85% 보다 작을 경우에 추가적인 단계가 요구될 수 있다. 이러한 경우, 단계 3에 기술한 바와 같은 상기 밀도 구배 원심 분리(옵티프렙)를 반복한다. 이는 죽은 세포들을 제거할 것이다.
7) 상기 최종 세포 서스펜션은, 표 2에 나타낸 바와 같이, 96-웰 하프 에어리어 플레이트, 또는 웰 당 62.5마이크로리터 부분 표본을 갖는 384-웰 플레이트, 혹은 웰 당 20마이크로리터 부분 표본을 갖는 384-웰 플레이트 내로 도포된다.
ㆍ상기 세포 농도를 ㎖ 당 1×106세포들로 조절한다.
ㆍ실험 웰을 수행한다. 코닝(Corning) 384에 대하여＝15㎕의 RPMI 10% FBS＋45㎕의 세포 서스펜션→500RPM에서 1분 동안 원심 분리. 그리너(Greiner)에 대하여＝2.5㎕ 또는 RPMI 10% FBS＋15㎕의 세포 서스펜션→500RPM에서 30초 동안 원심 분리.
ㆍ도립 현미경 아래서 상기 웰을 검토한다. 상기 세포들은 서로를 터치하지만 중첩되지는 않는다. 필요에 따라 농축(원심 분리 및 배지의 제거) 또는 희석(배지의 첨가)에 의해 상기 세포 농도를 조절한다.
ㆍ최적의 세포 농도가 발견될 때까지 반복한다.
ㆍ상기 세포들을 상기 웰 플레이트 내에 넣는다.
8) 상기 플레이트는 5% 이산화탄소 습도 조절된 분위기로 37℃에서 하룻밤 동안 배양되었다. 5×104세포들 내지 1.5×105세포들이 적절한 웰-바닥 커버리지를 가져오도록 상기 세포 부피에 따라 웰 마다 심어졌다.
ㆍ상기 플레이트는 "에지 효과(edge effect)"(상기 웰 내의 불량 셀 분포)를 감소시키도록 열 분포 및 습도가 최적화된 습도 챔버 내부에서 배양되었다.
9) 급성기 세포주(DSMZ, 독일) 내의 인간 JURL-MK2 만성 백혈병이 환자 종양 세포들로 수행된 MiCK 분석들을 위한 양성 대조군으로 이용되었다.
ㆍ하프 에어리어 96-웰 플레이트가 사용되는 경우, 웰 당 전체 부피는 120㎕이다.
10) 페놀 레드가 없는 RPMI-1640 배지가 모든 배양들에 대해 사용되었다.
11) 이는 10% 소태아 혈청, 100 단위/㎖의 페니실린 및 100마이크로그램/㎖의 스트렙토마이신으로 보충되었다.
12) 세포 계수들 및 생존성은 트리판 블루 염색 배제법에 의해 평가되었다.
주의：상기 세포 계수들 및 생존성 점검들은 상기 세포들을 상기 플레이트의 웰들로 첨가하기 전에 제조 과정 동안에 수 회 행해졌다.
13) 오염되고 괴사성의 세포들의 정제 후, 각 종양 세포 제조가 디프 퀵(diff quick) 또는 팝 염색(Pap stain)을 이용하여 분석되었다. 이는 관심의 대상인 세포 수를 확인할 수 있게 하고, 일부 잔류하는 오염되는 세포들이 존재하는 것을 인증하게 하는 매우 개선된 프로세스이다.
14) 적절한 수의 세포들이 이용 가능하였을 경우, 면역 세포 화학 착색들도 상기 종양 표현형을 보다 특성화하기 위해 수행되었다.
15) 모든 시편들은 능숙한 병리학자의 시각적인 산정에 의한 적어도 90%의 순수한 종양 세포 함량 및 트리판 블루 배제법에 의해 90%의 생존성을 달성하였다.
실험예 3：혈액/골수 세포 특정 분리 프로토콜
수집 후 24시간 내지 48시간 이내에, 시편은 다음과 같이 처리되었다.
ㆍ혈액을 50㎖ 튜브 내로 모은다.
ㆍ도말(smear)을 위해 부분 표본을 취한다.
ㆍ아세트산(acetic acid) 2.86% 내에서 혈구계수기(hemacytometer)로 세포 계수를 수행한다.
ㆍ유동 세포분석(flow cytometry)을 위한 부분 표본을 취한다.
ㆍ상기 혈액을 동일한 부피의 RPMI로 희석한다.
ㆍ림포프렙(Lymphoprep) 원심 분리(2000RPM에서 30분)를 수행한다.→8㎖의 혈액/RPMI 혼합물까지 중첩된 4㎖ 림포프렙.
ㆍ단일 청정 세포층을 수집하고, 10㎖의 RPMI 10% FBS을 첨가하며, 1500RPM에서 5분 동안 원심 분리한다.
ㆍ상기 펠릿을 5㎖의 RBC 세포용해 용액(lysis solution) 내에 재현탁시키고, 2－3분 동안 배양하며, 5㎖의 RPMI 10% FBS을 첨가하고, 5분 동안 1500RPM에서 원심 분리한다.
ㆍ상기 펠릿을 RPMI 10% FBS 내에 재현탁시키고, 세포 계수＋시토스핀(cytospin)을 수행한다.
ㆍ유동 세포분석 결과들에 따라, 마그네틱 비드들로 원하지 않는 세포들을 제거한다(단핵 백혈구들＝CD14, T 림프구들＝CD2, B 림프구들＝CD19, 호중구들＝CD15).
ㆍ상기 펠릿을 작은 부피의 PBS 2% FBS(0.2㎖ 내지 2㎖) 내에 재현탁시킨다.
ㆍ상기 비드들 서스펜션을 상기 PBS 2% FBS로 3회 세척한다.
ㆍ상기 비드들을 상기 세포 서스펜션에 첨가하고, 상기 로테이터 상의 실온에서 30분 동안 배양시킨다.
ㆍ튜브를 상기 마그네트 상에 두고, 1분 동안 대기한다.
ㆍ상기 세포 서스펜션을 수집하고, 5㎖의 RPMI 10% FBS를 갖는 15㎖ 튜브 내에 넣는다.
ㆍ잔류하는 비드들을 제거하기 위해 상기 세포 서스펜션의 튜브를 다시 상기 마그네트 상에 놓고, 상기 세포 서스펜션을 수집하며, 새로운 15㎖ 튜브 내에 넣는다.
ㆍ1500RPM에서 5분 동안 원심 분리한다.
ㆍRPMI 10% FBS 내에 재현탁시키며, 부피는 상기 펠릿 크기에 의존한다. 세포 계수를 행하고, 생존성을 결정하며, 상기 세포 계수를 결정하도록 시토스핀을 수행한다.
ㆍ유동 세포 분석을 위한 부분 표본을 취한다. 상기 결과들이 관심의 대상인 세포 구성의 순도를 확인하는 경우, 상기 세포 농도를 ㎖ 당 대략 2×106세포들까지 조절하고, 상기 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 계수를 테스트한다. 상기 계수의 목표 값은 0.8 내지 1.0이 되어야 한다.
ㆍ상기 세포 농도를 상기 서스펜션을 농축시키거나 희석하여 조절한다. 충분한 값이 얻어질 때까지 상기 계수를 다시 실험한다.
ㆍ상기 세포들을 상기 플레이트 내에 두고, 상기 MiCK 분석 과정을 즉시 개시한다.
실험예 4： 삼출물 특정 분리 프로토콜
수집의 24시간 내지 48시간 이내에, 상기 시편은 다음과 같이 처리되었다.
ㆍ상기 시편을 50㎖ 튜브들 내에 이송하며, 또한 15㎖ 튜브 내의 10㎖ 부분 표본을 취한다(상기 부분 표본을 2000RPM에서 5분 동안 원심 분리하고, 세포 계수를 수행하며, 이상적인 세포 함량 및 상기 시편의 계수를 얻도록 시토프신을 준비한다).
ㆍ상기 튜브들을 2000RPM에서 15분 동안 원심 분리한다.
ㆍ상청액을 제거하지만, 튜브 당 ~5㎖를 남긴다. 모든 튜브들을 결합하고, 필요에 따라 가능한 한 많은 50㎖ 튜브들 내에서 PBS로 1：1로 희석한다. 10분간 2000RPM에서 원심 분리한다.
ㆍRBC 세포 용해를 2－3분 동안 행한다. 부피는 펠릿 크기에 의존한다. 동일한 부피의 RPMI 10% FBS를 첨가한다.
ㆍ1500RPM에서 5분 동안 원심 분리한다.
ㆍ상기 펠릿을 RPMI 10% FBS 내에 재현탁시키며, 상기 부피는 상기 펠릿 크기에 의존한다.
ㆍ세포 계수를 수행하고 생존성을 결정한다.
ㆍ생존성은 전체 프로세스에 중요하다. 상기 생존성이 ~70% 보다 작은 지가 결정되어야 한다. 그럴 경우, 옵티프렙 원심 분리를 수행한다.
ㆍ상기 생존성이 허용 가능한 기준을 만족하는 경우 및 주요 오염되는 세포들이 대식 세포들인 경우, 이들 세포들은 부착에 의해 제거된다.
ㆍ주요 세포 유형으로부터 높은 오염과 전체 세포 계수가 높을 경우(5×107세포들 또는 그 이상), CD45 비드들(세포 당 1 비드)로 제1 정제 단계를 수행한다. 이후에 필요한 경우에 제2 시간 및 제3 시간에서 상기 비드들을 반복한다.
ㆍ세포 계수를 행하고, 생존성을 결정한다.
ㆍ필요한 경우에 병리학자에 의해 권장되는 바에 따라 옵티프렙을 반복한다.
ㆍ계수 조절－병리학자의 권유에 기초하여 고상의 종양 시편에 관한 계수를 조절한다.
ㆍ상기 최적의 세포 농도에 도달될 때, 상기 세포들을 상기 플레이트 내에 두고, 인큐베이터(37℃)의 배양 챔버 내에서 하룻밤 동안 배양시킨다.
실험예 5：항암 치료제 후보 물질들에 의해 매개된 아포프토시스를 평가하기 위한 변형된 MiCK 분석
상기 MiCK 분석 과정은 여기에 전체적으로 참조로 포함되는 미국 특허 제6,077,684호 및 미국 특허 제6,258,553호에 기재된 방법으로부터 적용되었다. 또한, 상기 MiCK 분석들은 여기에 모든 목적들을 위해 전체적으로 참조로 포함되는 Kravtsov V. 등의 "Use of the Microculture Kinetic Assay of apoptosis to determine chemosensitivities of leukemias"(Blood 1998; 92： 968－980)에 기재되어 있다. 활용되는 특정한 MiCK 분석 프로토콜들은 실험예 1－실험예 4에 기재된 바와 같다.
하룻밤 동안의 배양 후, 항암 화학 요법 치료제들이 5마이크로리터 부분 표본들 내의 96-웰 플레이트의 웰들 및 2.5마이크로리터 부분 표본들 내의 384-웰 플레이트의 웰들에 자동화된 피페터(pipettor)를 이용하여 첨가되었다. 치료제들이나 치료제 결합들의 수 및 실험된 농도들의 수는 상기 종양 시편으로부터 분리되었던 생존 가능한 악성 세포들의 수에 의존하였다. 몰농도로 결정된 상기 치료제 농도들은 충분한 세포들이 사용 가능하였을 경우에 원하는 혈액 농도 플러스 또는 마이너스 한 배 희석으로 제조자에 의해 표시된 것들 이었다.
치료제 첨가에 수반하여, 상기 플레이트는 5% 이산화탄소 습도 조절된 인큐베이터 내에서 30분 동안 37℃에서 배양되었다. 각 웰은 이후에 살균된 광물유와 중첩되었고, 상기 플레이트는 마이크로플레이트 분광 광도 판독기의 인큐베이터 챔버 내로 배치되었다. 600나노미터에서의 광학 밀도가 판독되었고, 48시간의 주기에 대해 매 5분마다 기록되었다. 아포프토시스와 상호 연관되는 광학 밀도 증가들은 전유 소프트웨어 프로아포(ProApo)에 의해 참조로 포함된 이전의 Kravtsov 참조 문헌(즉, Kravtsov V. 등의 "Use of the Microculture Kinetic Assay of apoptosis to determine chemosensitivitis of leukemias"(Blood 1998; 92： 968－980))에 기재된 공식으로 아포프토시스의 속동성 단위들(KU)로 전환되었고, 환자 결과들과 상호 연관되었다. 활발한 아포프토시스는 ＞1.0KU로서 표시되었다. 치료제 생성＝1KU는 불활성이거나, 상기 종양이 약물 유발 세포 독성 검사(cytotoxicity)(배양 내에서 성장, 티미딘(thymidine) 흡수)의 다른 마커들과 KU의 이전의 실험실 상호 연관에 기초한 상기 치료제에 대해 내성을 가졌던 것으로 기술되었다.
환자의 파악된 사실의 MiCK 분석으로부터 수득된 데이터로 환자들의 치료
앞서 언급한 연구 및 관련된 MiCK 프로토콜은 전향성의 다중 기구 비무작위적 시험이다. 임의의 치료가 개시되기 전에 수득된 MiCK 분석 결과들은 항상 내과의들에게 전송되었다. 내과의들은 이들이 임상적으로 표시된 것으로 간주하였던 바와 같이 내과의들 자신들의 치료제들의 선택으로 환자들을 치료하였고, 상기 MiCK 분석으로부터의 임의의 데이터를 사용하였거나 그렇지 않았던 지가 자유로웠다. 종양 반응들은 RECIST 또는 다른 임상적 기준에 의해 측정되었다. 환자들은 분석 후 및 분석 후의 생존 이후에 재발까지의 시간 동안 평가되었다.
상기 MiCK 분석 결과들을 어떻게 이용할 것인 가에 대한 규칙들이나 지침들은 존재하지 않았다. 상기 연구는 종양 내과 전문의가 상기 분석의 결과들을 이용하였던 지 또는 다른 데이터도 이용되었던 지(예를 들면, 에스트로겐(estrogen) 수용체 분석 또는 Her2 테스트 결과들 혹은 다른 치료제들의 첨가), 혹은 상기 분석 결과들을 이용하지 않았던 지를 평가하였다. 상기 분석을 이용하는 것에 대한 지시들이나 규칙들이 주어지지 않았기 때문에, 이는 상기 분석이 종양 내과 전문의가 치료 계획에서 완전한 재량을 가졌던 "실제 현실(real world)"에 어떻게 이용될 수 있었던 지의 보다 생생한 실험으로 느껴졌다.
통계적 평가
상기 연구의 목표들의 하나는 환자 치료를 결정하는 데 도움이 되고, 상기 MiCK 분의 이용을 반응 비율, 무재발 간격(relapse-free interval) 및 전체적인 생존과 상호 연관시키는 데 얼마나 자주 내과의들이 상기 MiCK 분석 결과들을 이용하였던 지를 확인하는 것이었다. 내과의들은 상기 분석 데이터가 돌아오기 전에 이들이 의도한 치료가 무엇이었던 지, 상기 분석이 보고된 후에 어떤 치료가 이용되었던 지 그리고 상기 분석이 환자에게 제공되는 최종 치료의 조제에 사용되었던 지를 기술하는 질문서를 고려하였다. 데이터는 분석을 위해 SAS 소프트웨어로 도입되었다. 샘플이 동일한 치료제의 다중 복용을 가졌을 경우, 가장 높은 KU 값을 갖는 농도가 상기 치료제로 지정되었다. 비모수 카플란-마이어 승법 극한(nonparametric Kaplan-Meier product limit) 방법들이 생존 분석 및 무재발 간격의 분석을 위해 이용되었다. 이러한 분석에 있어서, 로그 순위 검정(log rank test)이 중간값들을 비교하기 위해 생존 곡선들과 윌콕손 검정(Wilcoxon test)을 비교하는 데 이용되었다. 반응 비율들은 분할표들(contingency tables) 및 피셔의 정확성 검증(Fisher's exact test)을 이용하여 비교되었다.
조사 심사 위원회 승인(Investigational Review Board Approval)
조사자들은 워싱턴주 시애틀의 웨스턴(Western) IRB로부터 승인되고 모니터된 후에 이러한 시험을 수행하였다. 각 환자는 MiCK 분석들을 위한 종양 시편의 제출 이전에 서면으로 자발적으로 통지된 동의서를 가졌다. 임상 시험은 clinicaltrials.gov NCT00901264에 등록되었다.
결과들
환자 특성들은 표 3에 기재되어 있다. 평균 연령은 65세 이상이었고, 29명의 환자들은 여성이었다. 유방암(16), 비소세포 폐암(6), 비호지킨(non-Hodgkin) 림프종(4) 및 기타들을 포함하는 다양한 종양들이 연구되었다. 내과의들은 대부분 통상적으로 고식적 항암 화학 요법에 대해 고려되고 있었던 환자들을 시작하였다. 시작되었던 4명의 환자들만이 보조 항암 화학 요법에 대해 고려되고 있었다. 상기 MiCK 분석 후의 고식적 치료에 대한 사용이 계획된 치료의 중간 라인은 제8 라인 치료까지의 제1 라인 치료의 범위를 갖는 제2 라인이었다. 환자들에 대해 수반되는 중간 시간은 4.5개월이었다(내과의들이 치료들을 계획하기 위해 상기 MiCK 분석을 이용하였던 환자들에서의 5.6개월에 대하여 내과의들이 상기 MiCK 분석을 이용하지 않았던 환자들에서는 4.0개월).
MiCK 분석 결과들은 자주 내과의들에 의해 이용되었다(표 4). 64%의 환자들이 적어도 부분적으로 상기 MiCK 분석에 근거한 항암 화학 요법을 받았다. 18명(41%)은 상기 MiCK 분석만을 이용하였다. 10명의 환자들(23%)에서, 내과의들은 used MiCK 결과들을 이용하였지만, 또한 상기 분석에서 실험되지 않은 다른 치료제들을 가지는 정보, 또는 기관 기능 및 종양의 생물학적 특성들과 같은 개별적인 환자 특성들에 근거한 변형된 분석 결과들을 결합하였다. 이들 변화된 종양들의 생물학적 특징들은 종양 내과 전문의들에 의해 최종 치료 계획들을 발전시키는 데 고려되었다. 예를 들면, 유방암에 있어서, 호르몬 수용체 양성 환자들은 항암 화학 요법 이외에도 호르몬제들을 투여 받았으며, Her2 양성 환자들은 항암 화학 요법 이외에도 트라스투주맙(trastuzumab)을 투여 받았다. egfr-돌연변이(mutation) 양성인 비소세포 폐암의 환자들은 상기 약물 유발 아포프토시스 분석의 수행을 위한 고려 이전에 에를로트닙(erlotnib)을 투여 받았다. CD20 양성 비호지킨 림프종 환자들은 항암 화학 요법 이외에도 리툭시맙(rituximab)을 투여 받았다. 22명의 환자들(50%)에서, 항암 화학 요법의 변화는 상기 MiCK 분석 결과들의 이용에 근거한 결과였다.
환자들이 상기 분석의 수득에 동의하는 것을 서명하였더라도, 16명의 예들에서 내과의들은 환자 치료를 결정하기 위해 상기 분석을 이용하지 않았다. 1명의 예에서, 환자는 임상 시험을 받았다. 상기 분석 결과들 및 상기 분석에 기초한 제안된 치료를 권고 받은 후, 7명의 환자들이 다른 치료로 치료 받는 것을 선호하였다(대체로 상기 MiCK 분석에서 가장 잘 확인되는 치료의 독성으로 인해). 다른 8명의 환자들에서, 내과의는 문헌이나 내과의의 개인적인 경험에 기초한 다른 치료를 이용하는 것을 선호하였다.
유방암에 있어서, 실험되었던 환자들의 가장 큰 하위 집합인 환자들의 9/16(56%)가 상기 MiCK 분석에 기초하여 치료되었다. 3/9에 있어서, 상기 MiCK 분석은 다른 실험된 치료제들과 함께 사용되었고, 3/9에서 MiCK 결과들은 표적화된 생물 요법들(biotherapies)과 결합되었으며, 2/9에서 MiCK 결과들은 호르몬 치료와 결합되었고, 1/9에서 상기 MiCK 분석에서 활성인 치료제들만이 사용되었다.
항암 화학 요법, 제네릭 대 전유의 선택들에 대한 효과
16명의 환자들(36%)에서, 종양 내과 전문의들이 상기 MiCK 분석의 지식 전의 전유의 항암 화학 요법의 계획된 사용을 상기 분석 결과들을 검토한 후에는 제네릭 치료제들의 실제 사용으로 변경하였다. 3명(7%)의 환자들에 있어서, 내과의들이 제네릭 치료제들의 계획된 사용을 전유의 치료제들의 실제 사용으로 변경하였다. 9명의 환자들(20%)에서, 내과의들이 MiCK 분석 결과를 알기 이전의 결합된 치료의 이용에 비하여 상기 MiCK 분석 후에는 단일 치료제 치료를 이용하였다. 4명의 환자들(9%)에 있어서, 종양 내과 전문의들이 상기 MiCK 분석 결과를 알기 이전의 단일 치료제들의 계획된 사용에 비하여, MiCK 분석 결과들 후에는 결합된 치료제를 사용하였다.
내과의들이 상기 MiCK 분석을 이용하였을 때, 이들은 16명의 환자들에서 가장 높은 KU 값을 생성하였던 항암 화학 요법을 이용하였다. 내과의들은 23명의 환자들에서 보다 높은 정도의 아포프토시스(2KU 보다 큰)로 치료를 이용하였다.
환자 결과들에 대한 영향
고식적 항암 화학 요법을 받는 환자들에 있어서, 완전 플러스 부분 반응 비율들이 상기 MiCK 분석을 이용하거나 이용하지 않는 경우와 비교되었다(표 5). 내과의들이 상기 MiCK 분석의 결과들을 이용하였던 경우, 완전 플러스 부분 반응 비율은 44%였다. 이는 내과의들이 MiCK 분석을 이용하지 않을 경우(p＜0.02)에 단지 6.7% CR 플러스 PR 비율과 비교된다.
전체적인 생존이 상기 MiCK 분석 결과들을 이용하거나 이용하지 않는 경우와 비교되었다(도 2). 내과의들이 환자 치료의 결정을 위해 상기 MiCK 분석을 이용하였던 경우, 중간의 전체적인 생존은 내과의들이 MiCK 분석 결과들을 이용하지 않았던 경우(p＝0.02)에 단지 4.1개월에 비하여 10.1개월이었다.
내과의들이 치료를 결정하기 위해 상기 MiCK 분석을 이용하였던 환자들에서의 무재발 간격이 내과의들이 상기 MiCK 분석 결과들을 이용하지 않았던 환자들과 비교되었다(도 3). 상기 중간 무재발 간격은 내과의들이 상기 MiCK 분석들을 이용하지 않았던 환자들에서 4.0개월에 비하여 내과의들이 상기 MiCK 분석들을 이용하였단 환자들에서 8.6개월이었다(p＜0.01).
상기 MiCK 분석에 기초하여 선택된 항암 화학 요법에 대한 다른 치료제들의 첨가가 종양 내과 전문의들이 상기 MiCK 분석을 이용하였던 때에 관찰되는 이점들을 담당하였던 가능성을 배제하기 위하여, 본 발명자들은 종양 내과 전문의들이 상기 MiCK 분석만을 이용하였던 환자들의 결과들과 종양 내과 전문의들이 상기 MiCK 분석을 이용하지 않았던 환자들의 결과들을 비교하였다. 완전 및 부분 반응 비율들은 MiCK 분석의 이용이 없이 치료된 환자들(6.7%, p＝0.04)에 비하여 상기 MiCK 분석에 근거하여 치료된 환자들(43.8%)에서 보다 높았다. 전체적인 생존은 상기 MiCK 분석의 이용이 없이 치료된 환자들(중간값 4.1개월, p＝0.02)에 비해 상기 MiCK 분석에만 기초하여 치료된 환자들(중간값 10.1개월)이 보다 길었다. 상기 무재발 간격은 상기 MiCK 분석의 이용이 없이 치료된 환자들(중간값 4.0개월, p=0.03)에 비하여 상기 MiCK 분석에만 기초하여 치료된 환자들(중간값 8.0개월)이 보다 길었다. 이에 따라, 본 발명자들은 상기 MiCK 분석의 이용(및 다른 치료제들의 첨가 없이)이 관찰된 개선된 결과들과 연관이 있는 점으로 결론지었다.
논의
이러한 유용성 연구는 비무작위였으므로, 생체 검사의 72시간 이내에, 상기 약물 유발 아포프토시스 결과들 및 치료들이 생체 외에서 가장 우수하였던 실험실 해석, 그리고 테스트된 각각의 단일 치료제 또는 결합에 대한 아포프토시스의 실제 KU을 받아보았다.
결과들은 상기 MiCK 분석이 환자 치료들을 결정하기 위해 내과의들에 의해 자주 이용되었던 점을 입증한다. 항암 화학 요법 치료 계획을 설계하기 위한 종양 내과 전문의들에 의한 전향적인 생물학적 검증의 64% 비율의 이용은 임상적인 유용성의 증거인 것으로 간주되었다(내과의들은 환자 관리에 상기 결과들을 이용할 것이다).
이러한 연구에서의 결과들은 종양 내과 전문의들이 기꺼이 상기 분석의 결과들을 이용할 뿐만 아니라 이들이 그럴 때에 치료 결과들이 내과의들이 상기 분석을 이용하지 않는 때의 결과들 보가 우수할 수 있는 점을 나타낸다. 이들 환자들에서 개선의 크기는 통계적으로 중요하게 되기에 충분히 컸다.
개선된 결과들의 이러한 발견은 또한 덜 효과적인 치료들의 이용을 회피함으로서 치료의 비용을 감소시킬 수 있다. 내과의들이 자주 비용이 덜 드는 치료제들을 사용하였던 점의 관찰은 제네릭 치료제들이 적어도 전유의 치료제들만큼 유용할 수 있었을 때를 제시함에 의해 종양 내과 전문의들에게 중요할 수 있다.
이에 따라, 내과의들이 상기 MiCK 분석 결과들을 통지 받을 때, 이들은 환자 치료들을 계획하기 위해 상기 결과들을 자주 이용한다. 내과의들이 상기 결과들을 이용할 때, 환자 결과들이 보다 우수하게 나타난다.
실험예 6：재발성/전이성 유방암(CA)에서 생체 외의 항암 화학 요법(CT)-유발 아포프토시스(APOP)의 환자들：제네릭 다중 소스 치료제들(제네릭들)과 전유의 단일 소스 치료제들(전유들)의 비교
실험 배경
전이성 유방암의 치료는 제네릭들과 전유들 사이 그리고 항암 화학 요법들(콤보스(Combos))과 단일 제제 항암 화학 요법들 사이의 선택들을 수반한다. 이러한 실험은 제네릭 대 전유 및 콤보스(Combos) 대 단일 제제의 상대적인 생체 외의 항암 화학 요법 유발 아포프토시스를 결정하였다.
방법들
67명의 환자(Pt) 생체 검사들로부터의 정제된 유방암 세포들이 실험예 1－실험예 4에 기술한 미소배양 속동성(MiCK) 분석을 이용하여 항암 화학 요법으로 단기간의 배양에 놓여졌다. 아포프토시스는 48시간에 대해 매 5분마다 분석되었다. 아포프토시스는 아포프토시스의 속동성 단위(KU)로 정의되었다. 유의성 있는 아포프토시스는 ＞1.0KU이었다. 개별적인 분석들 사이의 유의성 있는 차이는 복제 분석들에 기초하여 ＞0.57KU이었다.
치료제들은 다음의 스킴(scheme)에 기초하여 제네릭(g) 또는 전유(p)로 분류되었다.
제네릭(Generic)＝5-플루오로우라실(fluorouracil), 카르보블라틴(carboblatin), 시스플라틴(cisplatin), 시톡산(cytoxan), 독소루비신(doxorubicin), 에토포시드(etoposide), 에피루비신(epirubicin), 이포스파미드(ifosfamide), 메토트렉세이트(methotrexate), 미톡산트론(mitoxantrone), 탁솔(taxol), 탁소테르(taxotere), 빈크리스틴(vincristine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈블라스틴(vinblastine).
전유(Proprietary)＝아브락산(abraxane), 독실(doxil), 에리불린(eribulin), 젬자르(gemzar), 익사베필론(ixabepilone), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 젤로다(xeloda).
결과들
43명의 환자들(pts)이 제네릭들 대 전유들의 비교를 위해 평가될 수 있었다. 제네릭들은 36/43의 Pts(84%)에서 APOP＞전유들의 경우이며, 6명의 Pts(14%)에서 APOP＝전유들의 경우를 생성하였다. 1명의 Pt(2%)에서 전유들은 APOP＞제네릭들의 경우를 생성하였다. 이들 결과들은 표 6 및 표 16에 예시된다. 또한, 표 7은 상기 유방암 시편들의 환자 특성들을 더 예시한다.
나타낸 등급들 내의 비교에 있어서, 에피루빈은 평균 APOP＞독소루비신을 가졌고(P＝0.01), 시스플라틴은 APOP＞카르보플라틴을 가졌으며(P＜0.01), 비노렐빈은 APOP＞빈크리스틴을 가졌고(P＝0.02), 도세탁셀은 APOP＞납-파클리탁셀을 가졌지만(P＝0.01), 도세탁셀 및 파클리탁셀의 APOP는 상이하였다(P＝0.85). 이들 및 다른 세부 비교들은 표 8－표 33에서 찾아볼 수 있다.
그러나, 개별적인 Pts에 있어서, 도세탁셀은 37%의 Pts에서 APOP＞파클리탁셀린(paclitaxelin)을 가졌던 반면, 파클리탁셀은 31%에서 도세탁셀 보다 우수하였다. 콤보스(Combos)에 대하여, 시클로포스파미드＋독소루비신은 25%에서 APOP＞단일 제제들을 생성하였던 반면, 단일 제제들은 67%에서 APOP＝ 또는 ＞시클로포스파미드 플러스 독소루비신을 가졌다. 시클로포스파미드 플러스 도세탁셀은 33%에서 APOP＞단일 제제들을 가졌지만, 단일 제제들은 66%에서 APOP＝ 또는 ＞시클로포스파미드 플러스 도세탁셀을 가졌다. 이들 및 다른 세부 비교들은 표 8－표 33에서 찾아볼 수 있다.
결론들
제네릭들의 APOP는 자주 전유들의 APOP와 동일하거나 우수하였다. 개별적인 환자들에서, 단일 제제들이 흔히 콤보스(Combos) 보다 높은 APOP를 생성하였다. 여기서 MiCK APOP 분석은 제네릭들 또는 단일 제제들이 전유들 또는 콤보스(Combos) 보다 높은 APOP를 생성하는 전이성 유방암(CA)이 있는 개개의 환자들(Pts)을 확인할 수 있다. 이들 차이들은 건강관리 비용에서 상당한 절감을 가져온다.
실험예 7：제네릭 다중 소스(제네릭) 항암 화학 요법(CT) 치료제들이 전유의 단일 소스(전유) 치료제들만큼 효과적인가? 재발성/전이성 유방 암종(유방 CA)과 비교하여 비소세포 폐암(NSCLC), 결장암(결장 CA)에서 생체 외의 CT-유발 아포프토시스( APOP)로부터의 증거
실험 배경
본 발명자들은 재발성이나 전이성 유방암이 있는 환자들(Pts)로부터의 암 세포들이 자주 전유들과 비교하여 제네릭들에서 훨씬 또는 보다 우수한 아포프토시스를 나타내는 점을 입증하였다(전술한 실험예 6). 본 발명자들은 이들 관찰들을 NSCLC 및 결장암이 있는 환자들에서 생체 외의 아포프토시스와 비교하였다.
방법들
환자 생체 검사들로부터의 정제된 종양 세포들이 실험예 1－실험예 4에 기술된 상기 미소배양 속동성(MiCK) 분석을 이용하여 단기 배양 내로 배치되었다. 아포프토시스는 48시간에 대해 매 오 분마다 분석되었다. 아포프토시스는 아포프토시스의 속동성 단위들(KU)로 정의되었다. 유의성이 있는 아포프토시스는 ＞1.0KU였고, 개개의 분석들 사이의 유의성이 있는 차이들은 반복 분석들에 기초하여 ＞0.57KU로 정의되었다. 유방 CA, 결장 CA 및 NSCLC로부터의 결과들이 비교되었다.
치료제들은 다음 스킴에 근거하여 제네릭(g) 또는 전유(p)로 분류되었다.
제네릭＝시톡산, 5-플루오로우라실, 시타라빈, 카르보플라틴, 카르보플라틴/탁솔, 카르보플라틴/탁소테르, 시스플라틴, 시스플라틴/탁솔, ㅣ스플라틴/탁소테르, 에피루비신/에토포시드, 에토포시드, 이다루비신, 이포스파미드, 이리노테칸, 멜팔란, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 토포테칸, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈.
전유＝5-플루오로우라실/이리노테칸/옥살리플라틴, 5-플루오로우라실/옥살리플라틴, 알림타, 알림타/탁솔, 알림타/카르보플라틴, 알림타/시스플라틴, 시스플라틴/젬자르, 이리노테칸/젤로다, 알림타/젬자르, 글리벡, 옥살리플라틴/젤로다, 소라페닙, 수니티닙, 타르세바, 젤로다, 아브락산, 젬자르, 옥살리플라틴.
결과들
NSCLC가 있는 41명의 환자들(pts), 결장 CA가 있는 8명의 Pts 및 유방 CA가 있는 67명의 Pts가 성공적으로 배양되었다. 제네릭들은 NSCLC가 있는 25/32의 Pts(78%), 결장 CA가 있는 4/7의 Pts(57%) 및 유방 CA가 있는 36/43의 Pts(84%)에서 전유들보다 우수한 APOP를 야기하였다. NSCLC가 있는 5명의 Pts(16%), 결장 CA가 있는 1명의 Pt(14%) 및 유방 CA가 있는 6명의 Pts(14%)에서 제네릭들이 생성한 APOP＝전유들. 전유들은 NSCLC가 있는 2명의 Pts(6%), 결장 CA가 있는 2명의 Pts(29%) 및 유방 CA가 있는 1명의 Pt(2%)에서 제네릭들보다 우수한 APOP를 생성하였다. 유의성 있는 APOP(1.0 보다 작은 KU)를 생성하는 치료제가 없는 NSCLC, 결장 CA 또는 유방 CA가 있는 0명의 Pts가 있었다. 전유들은 유방 CA에서 보다 결장 CA에서 나은 APOP를 생성하였다(p＜0.05). 이들 결과들은 표 6(모든 질병 시편들); 표 16(유방암 시편들); 표 34(폐암 시편들); 그리고 표 35(결장암 시편들)에서 찾아볼 수 있다. 실험된 조직 시편 유향들 사이의 통계적 유의성의 비교는 제네릭들 또는 전유 치료제들이 보다 효과적인 가와 관련하여 도 4－도 7에서 찾아볼 수 있다.
결론들
제네릭 치료제들은 NSCLC, 결장 CA 및 유방 CA가 있는 대부분의 Pts에서 전유의 치료제들과 동일하거나 우수한 생체 외의 APOP를 생성할 수 있다. 적어도 전유의 치료제들만큼 활성인 제네릭 치료제들의 빈도는 질병에 의해 변화되며, 결장 CA에 비해 유방 CA에서 보다 높았다. 그러나, 상기 MiCK APOP 분석은 전유의 치료제들의 사용을 요구할 수 있었던 개별적인 Pts을 확인할 수 있다. 이들 결론들은 이러한 생체 외의 결과들을 확인하기 위해 전향적인 임상 시험들을 정당화시킨다. 상기 APOP 분석에 기초한 제네릭 치료제들의 증가된 이용은 건강관리 비용을 조절하는 데 도움이 될 수 있다.
실험예 8：유방암, 결장암 및 비소세포 폐암에서 항암 화학 요법 유발 아포프토시스 분석의 이용에 의한 비용 절감
실험 배경
미합중국에서 항암 화학 요법 비용은 지나치게 높아지고 있다. 본 발명자들은 개선된 항암 화학 요법 유발 아포프토시스 분석(상기 미소배양 속동성, 또는 MiCK 분석)이 개발되었던 실험예 1－실험예 7의 진행에서 입증하였다. 항암 화학 요법 치료를 계획하는 데 상기 분석의 이용은 임상적인 결과들의 개선, 개선된 반응 비율, 재발까지의 보다 긴 시간 및 보다 긴 생존과 연관되는 것으로 나타났다(실험예 5). 앞서 제시된 실험들은 또한 상기 분석에서 제네릭 다중 소스 치료제들로부터의 상기 약물 유발 아포프토시스가 자주 전유의 단일 소스 치료제들로부터의 아포프토시스 보다 우수하거나 동등한 점을 나타냈다(실험예 5－실험예 7). 따라서, 이러한 실험은 유방, 결장 및 비소세포 폐암들이 있는 환자들을 치료함에 있어서 전유의 단일 소스 치료제들을 제네릭 다중 소스 치료제들로 대체하도록 상기 MiCK 분석을 이용함에 의해 가능한 비용 절감을 산정하기 위해 수행되었다. 본 발명자들은 하나의 치료제 후보 물질 대 다른 것의 활용으로부터 야기될 수 있는 금전적인 차이들을 나타내는 데 일반적인 용어인 금전적 결과들(monetary consequences)을 사용한다. 이들 금전적인 결과들은, 예를 들면, 선택된 치료제(흔히 제네릭)가 비교된 전유의 상대 보다 상대적으로 값이 쌀 경우에 환자나 건강관리 시스템에 유익할 수 있다. 상기 선택된 제네릭 치료제가 이의 전유의 상대 보다 값이 싼 경우에 있어서, 상기 금전적인 결과(예를 들면, 상기 제네릭과 전유 사이의 비용에서의 차이)를 비용 절감으로 호칭할 수 있다. 그러나, 상기 금전적 결과들은 보다 높은 KU 값을 갖는 치료제가 상대적으로 보다 많은 비용이 드는 치료제 후보 물질이 될 수 있기 때문에 비용 절감을 가져와야 하는 것은 아니다. 이러한 상황에 있어서, 상기 MiCK 분석에 기초하여 환자에 대해 사용되는 상기 치료제 후보 물질을 선택하는 금전적인 결과는 보다 비싼 치료제가 선택될 수 있었던 경우에 비하여 금전의 상대적인 절감을 가져올 수 있다. 상기 제네릭의 금전적 결과들의 용어들은 다음에 상술되는 Mean Drug Savings, Assay Adjusted Mean Drug Savings 그리고 Net Mean Drug Savings statistics 통계들을 활용함에 의해 더 설명될 수 있다.
방법들
Pt 생체 검사들로부터의 정제된 종양 세포들이 실험예 1－실험예 4에 기재된 상기 미소배양 속동성(MiCK) 분석을 이용하여 단기 배양 내로 배치되었다. 즉, 적어도 0.5㎤의 생존 가능한 종양 조직, 5 코어 니들 생체 검사들 또는 1000㎖의 악성 삼출물들을 가지는 살균된 종양 시편들이 얻어졌다. 수집의 24시간 내지 48시간 이내에, 상기 시편은 다져졌고, 0.25% 트립신 및 0.08% DNA 가수분해효소(DNase)로 1－2시간 동안 37℃에서 소화되었으며, 이후에 100마이크로미터 셀 스트레이너를 통해 여과되었다. 필요할 때, 생존 불능의 세포들은 밀도 구배 원심 분리에 의해 제거되었다. 상기 세포 서스펜션은 이후에 부착에 의해 대식 세포들을 제거하도록 조직 배양 플라스크 내에서 30분 동안 37℃에서 배양되었다. 상피 종양들에 대하여, 림프구들은 T 림프구들을 위한 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD2 항체 및 B 림프구들을 위한 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD19 항체로 30분 동안의 배양에 의해 제거되었다. 필요한 경우에 잔류하는 대식 세포들은 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD14 항체를 이용하여 제거되었다. 상기 최종 세포 서스펜션은 96-웰 또는 384-웰 하프 에어리어 플레이트, 웰 당 120마이크로리터 부분 표본 내로 배치되었다. 상기 플레이트는 37℃에서 하룻밤 동안 5% 이산화탄소 습도 조절된 분위기로 배양되었다. 5×104세포들 내지 1.5×105세포들이 완전한 웰-바닥 커버리지를 가져오도록 세포 부피에 따라 웰 마다 심어졌다. 급성기 세포주(DSMZ, 독일) 내의 인간 JURL-MK2 만성 백혈병이 환자 종양 세포들로 수행된 MiCK 분석들을 위한 양성 대조군으로 사용되었다. 페놀 레드가 없는 RPMI-1640 배지가 모든 배양들에 대해 사용되었다. 이는 10% 소태아 혈청, 100단위/㎖의 페니실린 및 100마이크로그램/㎖의 스트렙토마이신으로 보충되었다. 세포 계수들 및 생존성은 트리판 블루 염색 배제법에 의해 평가되었다. 오염되고 괴사성의 세포들의 정제 후, 각 종양 세포 제조물은 세포학적으로 악성 종양의 존재를 확인하기 위해 헤마톡실린(hematoxylin)/에오신(eosin) 염색된 시토스핀 제조물들을 이용하여 병리학자들에 의해 분석되었다. 충분한 수의 세포들이 이용 가능한 경우, 면역 세포 화학 착색들도 종양 표현형을 보다 특징짓도록 수행되었다. 평가될 수 있기 위해, 종양 시편들은 병리학 평가 및 트리판 블루 배제법에 의한 90% 생존성에 의해 적어도 90% 종양 세포 함량을 함유하였다.
하룻밤 동안의 배양 후, 항암 화학 요법 치료제들이 5마이크로리터 부분 표본들 내의 96-웰 플레이트의 웰들에 첨가되었다. 치료제들 또는 치료제 결합들의 수 및 실험된 농도들의 수는 상기 종양 시편으로부터 분리되었던 생존 가능한 악성 세포들의 수에 의존한다. 몰 농도로 결정된 상기 치료제 농도들은 충분한 세포들이 사용 가능할 경우에 원하는 혈액 수준 농도 플러스 또는 마이너스 1배 계열 희석으로서 제조자들에 의해 표시되는 것들이다. 치료제 첨가에 이어, 상기 플레이트는 30분 동안 37℃에서 5% 이산화탄소 습도 조절된 인큐베이터 내에서 배양되었다. 각 웰은 이후에 살균된 광물유와 중첩되었고, 상기 플레이트는 마이크로플레이트 분광 광도 판독기(바이오테크 인스트루먼트(BioTek instruments))의 인큐베이터 챔버 내로 배치되었다. 600나노미터에서의 광학 밀도가 판독되었고, 48시간의 주기에 대해 매 5분마다 기록되었다. 아포프토시스와 상호 연관된 광학 밀도 증가들은 전술한 형식으로 전유 소프트웨어 프로아포(ProApo)에 의해 아포프토시스의 속동성 단위(KU)로 전환되었다. 활성의 아포프토시스는 ＞1.0KU로 나타났다. 치료제가 생성하는＝1KU는 비활성이거나, 약물 유발 세포 독성의 다른 마커들(배양 내의 성장, 티미딘 흡수)을 갖는 이전의 KU의 실험실 상호 연관성에 기초하여 상기 치료제에 대해 내성이 있는 것으로 나타났다.
상기 연구의 마감일에 완료되었던 재발성 질병인 유방 암종, 결장 암종 또는 비소세포 폐 암종이 있는 환자로부터의 모든 분석들의 결과들이 분석되었다. 연구들은 전유의 단일 소스 치료제들 및 제네릭 다중 소스 치료제들 모두가 분석에 모두 실험되었을 경우에만 평가될 수 있었다. 치료제의 우수성은 아포프토시스 0.57KU 또는 상기 비교 치료제 보다 높은 것으로 정의되었다. 동등성은 제2 치료제의 0.57KU 이내의 하나의 치료제에 대한 아포프토시스로 정의되었다. 열등성은 하나의 치료제의 0.57단위들에 대한 아포프토시스 또는 제2 치료제 보다 낮은 것으로 정의되었다.
항암 화학 요법의 비용은 치료의 6사이클 동안 메디케어 지불을 이용하여 평가되었다(2011년 사사분기 지불 계획에 근거하였다). 항암 화학 요법 사이클은 3주 또는 4주의 치료(상기 치료제나 결합에 따라)로 구성되었다. 환자들은 사람의 평균적인 크기이기 때문에 1.8㎡의 표면 면적을 가지는 것으로 가정되었다. 이러한 측정은 상기 치료제의 복용량을 계산하는 데 이용되었다.
전유의 단일 소스 치료제들은 납-파클리탁셀(nab-paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 옥살리플라틴, 카피타빈(capcitabine), 익사베필론(ixabepilone), 에루빌린(erubilin), 리포조말 독소루비신(liposomal doxorubicin) 및 페메트렉세드(pemetrexed)였다.
제네릭 다중 소스 치료제들은 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 비노렐빈(vinorelbine) 및 빈블라스틴(vinblastine)이었다.
유방암에 대한 전유의 치료제들 또는 결합들은 납-파클리탁셀, 카피타빈 및 젬시타빈이었고, 결장암에 대해서는 5-플루오로우라실 플러스 류코보린(leucovorin) 플러스 옥살리플라틴이었으며, 비소세포 폐암에 대해서는 페메트렉세드 플러스 시스플라틴 및 젬시타빈 플러스 시스플라틴이었다.
유방암에 대한 제네릭 치료제들 또는 결합들은 비노렐빈, 도세탁셀 플러스 시클로포스파미드 및 에피루비신 플러스 시클로포스파미드였고, 결장암에 대해서는 5-플루오로우라실 플러스 류코보린 플러스 이리노테칸이었으며, 비소세포 폐암에 대해서는 카르보플라틴 플러스 파클리탁셀, 비노렐빈 또는 도세탁셀이었다.
각 치료제 또는 결합들의 6사이클 동안의 메디케어 배상(medicare reimbursement)이 계산되었고, 각 암에 대한 전유의 치료제들의 평균과 제네릭 치료제들을 위한 평균이 이후에 비교되었다.
평균 치료제 절감은 평균 전유의 치료제 비용 마이너스 평균 제네릭 치료제 비용의 차이로 정의되었다. 분석-조절된 평균 치료제 절감은 전유의 치료제들에 대해 우수하거나 동등한 제네릭 치료제의 빈도(상기 MiCK 분석에 의해 결정된 바와 같은)를 곱한 치료제 절감으로 정의되었다. 네트(net) 평균 치료제 절감은 상기 분석-조절된 평균 치료제 절감 마이너스 상기 MiCK 분석의 산정된 비용인 $5000으로 정의되었다. 비용 절감의 퍼센티지는 상기 네트 평균 치료제 절감을 평균 전유의 치료제 비용으로 나누어 정의되었다. 다음 식들은 이들 관계들을 예시한다.
평균 치료제 절감(Mean Drug Savings)＝평균 전유의 치료제 비용－평균 제네릭 치료제 비용
분석 조절된 평균 치료제 절감(Assay Adjusted Mean Drug Savings)＝(평균 전유의 치료제 비용－평균 제네릭 치료제 비용)×전유의 치료제에 대해 우수하거나 동등한 제네릭 치료제의 빈도
네트 평균 치료제 절감(Net Mean Drug Savings)＝(평균 전유의 치료제 비용－평균 제네릭 치료제 비용)×전유의 치료제에 대해 우수하거나 동등한 제네릭 치료제의 빈도－MiCK 분석의 비용
통계적 분석들
결정은 각 암에 대한 세 가지의 가장 폭넓게 사용된 치료 프로그램들로서 이루어졌다. 이후에, 각 치료에 대한 표준 평균 복용량뿐만 아니라 각 환자들을 위한 각 암에 대한 메디케어 허용 가능한 비용이 결정되었다. 이후에, MiCK 분석들이 수행되었고, 결과들은 다양한 암 유형들에 기초하여 가장 우수한 치료의 확인을 가능하게 하였다. 이들 MiCK 분석이 추론한 가장 우수한 치료 계획들은 이후에 통상적인 치료의 비용과 비교되었다. 상기 비교에 이어서, 결과들 및 상기 MiCK 분석 결과들에 기초한 선택된 가장 우수한 치료 계획들이 국가적으로 인정된 비용 컨설턴트에 의해 검토되었다.
결과들
평가될 수 있었던 결장 암종이 있는 7명의 환자들, 비소세포 폐 암종이 있는 32명의 환자들 및 유방 암종이 있는 43명의 환자들이 존재하였다(표 6 및 실험예 7에 제시된 바와 같이). 표는 상기 제네릭 다중 소스 치료제들이 상기 전유의 단일 소스 치료제들에 비해 결장암에서 71%, 유방암에서 98% 및 비소세포 폐암에서 94%정도로 동등하거나 우수한 점을 나타낸다. 전유의 치료제들은 결장암이 있는 환자들의 29%, 유방암이 있는 환자들의 2% 및 비소세포 폐암이 있는 환자들의 6%에서 보다 많은 약물 유발성 아포르토시스를 생성하였다.
치료제들에 대한 치료의 비용이 이후에 상기 방법들에서 기술된 바와 같이 모델화되었다. 상기 결과들은 치료제들만을 위한 치료의 여섯 달의 비용(항암 화학 요법 관리, 암 치유 치료제들, 종양 실험, 입원 또는 응급 치료를 포함하여)의 차이들이 표 36 및 표 37에 열거된다.
3가지 암들 모두에 있어서, 전유의 치료제들을 제네릭 치료제들로 대체함에 의해 실질적인 절감이 있었다.
상기 분석-조절된 평균 치료제 절감은 상기 암들의 각각에 대해 높게 남아 있었다(표 36). 환자 당으로 산정된 네트 절감은 $8,321로부터 $20,338까지 변화되었다. 바용 절감 퍼센티지는 42.8%로부터 54%까지 변화되었다. 본 발명의 방법들에 기초하여, 유방암 치료들은 43%의 절감을 입증할 수 있었고, 결장암 치료들은 54%의 절감을 입증할 수 있었으며, 비소세포 폐암 치료들은 47%의 절감을 입증할 수 있었다.
논의
이러한 연구는 본 발명의 실시예의 상기 약물 유발성 아포프토시스 분석의 이용이 실질적인 비용 절감을 가져올 수 있는 점을 나타낸다(표 36). 이는 상기 분석을 가지고 있지 않은 모든 내과의들이 전유의 치료제들 또는 결합들을 사용할 수 있는 점과 내과의가 상기 분석의 결과를 인지하고 있을 때에 상기 내과의가 상기 분석의 가이드를 따를 수 있고 전유의 치료제들 보다 우수하거나 동등할 경우에 제네릭 치료제들이나 결합들을 사용할 수 있으며, 상기 분석에서 우수하였던 경우에 전유의 치료제들이나 결합들을 사용할 수 있는 점을 가정한다.
이러한 연구는 모든 내과의들이 상기 약물 유발성 아포프토시스 분석에서 가장 우수하였던 치료제들을 사용할 수 있는 점을 추정한다. 이전의 실험예(실험예 5)에 있어서, 내과의들이 64%의 시간에서 약물 유발성 아포프토시스 분석으로부터 가장 우수한 결과들을 이용하였던 점이 발견되었다. 따라서, 상기 네트 비용 절감(표 36에 산정된)이 36%만큼 감소될 수 있는 점이 가능하다. 그러나, 실험예 5에서 진행되었던 이전의 연구와 같이, 상기 분석의 가이드를 따른 내과의들의 증가하는 수는 상기 약물 유발성 아포프토시스 분석으로부터의 결과들의 64%의 이용 비율이 최소한의 추정이 될 수 있는 점을 나타낸다.
상기 잠재적인 비용 절감은 또한 상기 분석에서 실험된 상기 항암 화학 요법 치료제들에 대해서만 인식되어야 한다. 보다 많은 전유의 치료제들이 특정한 질병들(예를 들면, 유방암)에 이용 가능하게 됨에 따라, 증가하는 퍼센티지의 환자들이 전유의 치료제들에 대해 보다 반응적이 될 수 있고, 네트 비용 절감이 이에 따라 덜 할 수 있는 점이 가능할 것이다. 또한 일부 전유의 치료제들이 제네릭이 될 수 있고(예를 들면, 결장암), 이에 따라 다른 비용의 감소와 상기 분석의 이용의 잠재적인 비용 절감 충격이 감소될 수 있는 점도 가능할 것이다.
그럼에도 불구하고, 이러한 연구는 의 상기 약물 유발성 아포프토시스 분석의 이용이 환자들 및 종양 학회에서 넓게 구현될 경우에 건강관리 계획들에 대해 매우 실질적인 비용 절감을 가져올 수 있는 점을 제시한다. 보다 중요하게는, 비용이 절감될 수 있을 뿐만 아니라 실험예 5에서 나타낸 바와 같이 내과의들이 환자 치료를 계획하는 데 여기에 개시된 MiCK 분석의 실시예를 이용할 때에 환자 결과들이 보다 우수하게 된다. MiCK 분석의 이용은, 본 발명의 실시예에 따르면, 통계적으로 충분한 보다 높은 완전 및 부분 반응 비율들, 재발까지의 보다 긴 시간 및 보다 긴 생존(실험예 5)과 관련되었다.
따라서, 여기에 개시된 MiCK 약물 유발성 아포프토시스 분석의 활용은 유방암, 결장암 및 폐암이 있는 각 환자들에 대한 우세한 치료의 확인을 가능하게 할 수 있다. 여기에 개시된 분석의 활용으로 선택된 치료는 보다 나은 결과와 보다 낮은 비용을 가져온다. 본 발명에 개시된 MiCK 분석은 건강관리 개선과 개인화된 치료에 중요한 수단이 될 것이다.
실험예 9：현미경 사진 실험
실험은 청구된 바와 같은 방법들에서의 현미경 사진(photomicroscopy)의 이용을 입증하기 위해 수행되었다. 상기 현미경 사진들(도 8 및 도 9)은 각기 하룻밤 동안의 배양 전 및 하룻밤 동안의 배양 후의 세포 분포와 세포들의 생존성을 나타낸다. 이에 따라, 현미경 사진들은 세포 생존성에 접근하도록 사용될 수 있고, 상기 분리/정제 프로세스의 최후의 단계로 여겨질 수 있거나, 상기 MiCK 분석의 개시로 여겨질 수 있다.
도 8은 하룻밤 동안의 배양 전의 플레이트의 하나의 웰 내의 세포들의 현미경 사진이다. 도 9는 15시간의 하룻밤 동안의 배양 후의 동일한 웰의 현미경 사진이다. 도 9의 세포들은 이들이 이제 상기 웰의 바닥에 부착되기 때문에 보다 타원형이고 약간 평탄한 것으로 나타난다. 도 9는 항암 치료제 후보 물질들이 이제 상기 웰에 첨가되도록 준비된 상기 방법의 시점에서 웰 내의 세포들의 상태를 나타낸다.
실험예 10：환자의 특정 암 세포 실험
실험은 잠재적인 항암 치료제 후보 물질이 특정한 환자에 대해 보다 효과적일 수 있는 지를 확인하기 위해 수행되었다. 상기 실험은 이에 따라 개시된 방법론 및 분석들을 개별화된 암 치료 프로토콜들을 생성하는 데 효과적인 수단으로서 입증한다.
상기 실험들은 55세의 여성으로부터의 지라 및 복부 종양 생체 검사 시편들로부터 수집된 신생물(neoplastic) 세포들에 대해 수행되었다. 상기 종양 시편들은 일려지지 않은 원발성(primary)이었다. 상기 실험은 37종의 잠재적인 항암 치료제들, 이들 치료제들의 결합들 및 다양한 농도들의 이들 치료제들의 효능을 시험하기 위해 본 발명에 따른 MiCK 분석의 이용으로 구성되었다.
상기 결과들에 근거할 경우, 시스플라틴이 이러한 환자에 가장 효능이 있는 단일의 치료제이다. 시스플라틴은 10KU들 보다 큰 KU값을 가졌다(표 38). 그러나, 단일 제제들로서 활용된 임의의 백금계 치료제들이 매우 효과적이었다. 비백금계 치료제들로서 수니티닙 또는 시톡산 또한 매우 효과적인 결과들을 야기하였고, 환자다 백금에 견딜 수 없을 경우에는 양호한 대안이 될 수 있었다.
상기 MiCK 분석에서 5.0KU 보다 큰 아포프토시스 판독들은 매우 민감한 것으로 간주되며, 양호한 임상적 반응과 연관된다. 모든 시약들 및 시약들의 결합이 생존 가능한 대조군 세포주에 대해 대조 실험되었고, 적절한 수준들의 아포프토시스를 유발하는 것이 발견되었다. 알킬화제들(alkylating agent)인 시클로포스파미드 및 이포스파미드는 이들의 활성 대사 작용들, 4HC 및 4HI에 각각에 대한 간 대사 변형(metabolic transformation)을 요구하며, 이에 따라 생체 외에서 직접 테스트될 수 없는 점에 유의하여야 한다. 상기 MiCK 분석을 위하여, 이들의 활성 대사 작용들, 4HC 및 4HI가 각기 이용되었다.
상기 실험은 또한 다양한 농도들의 37가지의 항암 치료제 후보 물질들을 테스트하였고, 이러한 데이터는 도 10에서 찾아볼 수 있다. 상기 테스트된 항암 치료제들의 일부가 농도에 따라 아포프토시스에 대해 이종의 반응을 가졌던 반면, 다른 치료제 후보 물질들은 변화하는 농도에 반응을 보이지 않았던 점을 관찰할 수 있다.
시편의 종양 유형에 의존하는 효소 활용
종양 유형 제1 선택 효소＋DNase 0.008% 다른 효소 가능성＋DNase 0.008%
방광(bladder) 콜라게나아제(collagenase) IV 300U/㎖
유방(breast) 콜라게나아제 IV 300U/㎖ 콜라게나아제 III 200U/㎖
자궁경부(cervix) 트립신 0.25%
결장(colon) 콜라게나아제 I 300U/㎖＋디스파아제(dispase) 1U/㎖ 트립신 0.25%
자궁내막(endometrial) 트립신 0.25% ---
신장(kidney) 콜라게나아제 IV 300U/㎖ ---
위(gastric) 트립신 0.25% ---
평활근육종(leiomyosarcoma) 트립신 0.25% 콜라게나아제 IV 300U/㎖
간(liver) 콜라게나아제 IV 300U/㎖
폐(lung) 콜라게나아제 IV 300U/㎖ ---
흑색종(melanoma) 콜라게나아제 IV 300U/㎖
난소(ovarian) 트립신 0.25% ---
췌장(pancreas) 콜라게나아제 IV 300U/㎖＋히알루로디나아제(hyaluronidase) 0.1U/㎖ ---
전립선(prostate) 콜라게나아제 I 300U/㎖ ---
연부조직 육종(soft tissue sarcoma) 트립신 0.25% ---
흉선(thymus) 콜라게나아제 I 300U/㎖ ---
최종 세포 서스펜션 도포 프로토콜
96웰 플레이트
코닝 # 3696 		384 클리어 플레이트
코닝 # 3701 		384 블랙 플레이트
그레이너 # 788091
예비 충진 배지 30㎕ 15㎕ 2.5㎕
세포 서스펜션 90㎕ 45㎕ 15㎕
약물 5㎕(25X) 2.5㎕(25X) 2.5㎕(8X)
오일 30㎕ 15㎕ 7㎕
환자 특성들
환자들의 수 44
연령(평균) 65.1년
성별 29 여성
종양 유형들
유방 16
비소세포 폐 6
비호지킨성 림프종 4
췌장 3
난소 2
피부 3
기타 10
수행 상태(ECOG 평균) 1.3
치료의 라인
보조제 4
제1 16
제2 9
제3 5
제4 1
제5 또는 그 이상 5
MiCK 분석 이용의 패턴들
내과의가 MiCK 분석을 이용함 28
분석 결과들만 이용함 18
분석 결과들 및 다른 데이터를 이용함 8
분석 플러스 다른 치료제를 이용함 9
조직 기능으로 인해 변형된 분석을 이용함 2
내과의가 MiCK 분석 결과들을 이용하지 않음 16
환자들이 치료제들의 사용을 선호하지 않음 7
환자들이 임상적 시도에 임함 1
내과의가 결과들만을 이용하지 않음 8
반응과 MiCK 분석 이용의 연관성
CR PR 안정 진행
내과의가 분석 결과들을 이용함 3 8 8 6
내과의가 분석 결과들을 이용하지 않음 0 1 3 11
MiCK 유도된 아포프토시스 분석에서 제네릭 다중 소스 치료제들과 전유의 단일 소스 치료제들의 비교
질병 분석들의 수 제네릭 치료제 아포프토시스가 전유의 치료제 보다 우수 제네릭 치료제 아포프토시스가 전유의 치료제와 동일 전유의 치료제 아포프토시스가 제네릭 치료제 보다 우수
결장 7 57% 14% 29%
유방 43 84% 14% 2%
비소세포 폐 32 78% 16% 6%
환자 특성들(n=72)
연령 56세(중간값)
종양 전이에 대한 분석 54% No
46% Yes
전이 병소들에 대한 분석 69% No
31% Yes
원발성 종양에 대한 분석 78% No
22% Yes
전이의 부위들 33% 림프절
18% 없음
16% 기타
15% 흉막 삼출(pleural effusion)
12% 간
6% 흉벽
(유방암 환자들로부터의 N＝67 조직 샘플들이 MiCK 분석으로 분석되었다. 환자 특성들은 다음에 나타낸다.)
다양한 치료제들에 대한 KU 요약 통계
치료제 N 평균 중간값 표준 편차 %＞1 %＞3
5FU 29 0.7 0.6 0.65 31% 0%
5FU/메토트렉세이트 10 1.1 1.0 0.91 40% 10%
아브락산 13 1.2 1.0 0.73 46% 0%
카르보 39 1.6 1.6 1.08 67% 13%
카르보/탁솔 13 3.3 3.1 1.83 92% 54%
카르보/탁소테르 13 2.6 2.4 1.55 85% 38%
시스플라틴 36 2.2 2.3 1.47 78% 22%
시톡산 39 2.8 2.6 2.07 85% 31%
시톡산/독소 13 3.5 3.2 1.85 92% 54%
시톡산/에피 11 3.2 3.4 1.43 100% 55%
시톡산/탁솔 10 2.6 2.7 1.62 80% 50%
시톡산/탁소테르 9 4.3 4.1 2.33 100% 67%
독실 14 1.1 1.1 0.63 64% 0%
독소 38 1.9 1.6 0.89 84% 11%
에피 54 2.5 2.1 1.31 94% 22%
에리불린 11 1.0 1.0 0.54 45% 0%
에토포시드 22 1.3 1.3 0.92 55% 5%
젬자르 40 1.0 0.8 0.91 43% 3%
이포스파미드 11 1.7 1.5 1.42 64% 27%
익사베필론 23 1.3 1.2 0.84 65% 4%
메토트렉세이트 30 0.9 0.9 0.60 33% 0%
미톡스 22 1.2 1.2 0.81 64% 0%
옥살리 11 1.9 1.8 1.10 82% 9%
탁솔 41 2.1 1.9 1.78 71% 15%
탁소테르 43 2.1 1.9 1.35 77% 26%
빈크리스틴 12 1.1 1.0 0.76 50% 0%
비노르 42 1.8 1.5 1.55 64% 14%
비노르/젤로다 10 2.1 1.6 1.69 80% 20.0%
Vnbl 10 1.8 1.5 1.08 80% 10.0%
젤로다 19 0.7 0.7 0.68 21% 0.0%
다음 표 9－표 15에 있어서, 두 치료제들을 비교하기 위해, 이들의 KU 값들이 쌍 t-검정 접근법(paired t-test approach)을 이용하여 환자 수준에 대해 분석되었다.
KU의 환자 쌍별 비교(pairwise comparisons)：에피루비신(Epirubicin) 대 독소루비신(doxorubicin) 대 미톡산트론(mitoxantrone)
치료제 비교 평균 차이(95% CI) 통계적 유의도
에피－독소(n＝34) 0.37(0.08 내지 0.66) 0.01
에피－미톡스(n＝21) 0.83(0.38 내지 1.28) ＜0.01
독소－미톡스(n＝18) 0.63(0.11 내지 1.15) 0.02
(이들 치료제들은 에피(Epi) 및 미톡스(Mitox) 사이에 가장 큰 차이를 가지며 각기 상이하게 나타난다.)
KU의 환자 쌍별 비교：시톡산(Cytoxan) 대 이포스파미드(ifosphamide)
치료제 비교 평균 차이(95% CI) 통계적 유의도
시톡산－이포스파미드(n＝11) 0.34(-0.07 내지 0.76) 0.10
(시톡산과 이포스파미드 사이에는 경계선 통계적 유의도가 존재한다.)
KU의 환자 쌍별 비교：카르보플라틴(Carboplatin) 대 시스틀라틴(cisplatin) 대 옥살리플라틴(oxaliplatin)
치료제 비교 평균 차이(95% CI) 통계적 유의도
시스플라틴-카르보(n＝7) 0.88(0.37 내지 1.39) ＜0.01
옥살-카르보(n＝11) 0.34(-0.14 내지 0.82) 0.15
시스플라틴-옥살(n＝10) 0.33(-0.07 내지 0.73) 0.09
(시스플라틴은 카르보보다 통계적으로 높다(p＜0.01). 옥살보다 통계적으로 높은 경계선이 존재한다(p＝0.09).)
KU의 환자 쌍별 비교：빈블라스틴(Vinblastine) 대 빈크리스틴(vincristine) 대 비노렐빈( vinorelbine )
치료제 비교 평균 차이(95% CI) 통계적 유의도
Vnbl-빈크리스틴(n＝7) 0.14(-0.26 내지 0.54) 0.43
비노르-빈크리스틴(n＝11) 0.63(0.10 내지 1.16) 0.02
비노르-Vnbl(n＝10) 0.14(-0.20 내지 0.49) 0.37
(통계적으로 중요한 차이는 비노렐빈이 빈크리스틴 보다 평균 상에서 높다는 점뿐이다(p＝0.02).)
KU 의 환자 쌍별 비교： 탁솔 ( Taxol ) 대 탁소테르 ( taxotere ) 대 아브락산( abraxane )
치료제 비교 평균 차이(95% CI) 통계적 유의도
탁소테르-탁솔(n＝35) 0.05(-0.54 내지 0.65) 0.85
탁소테르-아브락산(n＝12) 0.98(0.26 내지 1.69) 0.01
탁솔-아브락산(n＝12) 1.20(0.26 내지 2.14) 0.02
(탁솔 및 탁소테르 모두가 아브락산 보다 통계적으로 충분히 크다.)
KU의 환자 쌍별 비교：독실(Doxil) 대 독소루비신(doxorubicin)
치료제 비교 평균 차이(95% CI) 통계적 유의도
독소-독실(n＝9) 0.56(-0.07 내지 1.18) 0.08
(독실과 독소루비신의 차이는 통계적으로 충분한 경계선이다(p=0.08).)
KU의 환자 쌍별 비교：젤로다(Xeloda) 대 5FU
치료제 비교 평균 차이(95% CI) 통계적 유의도
젤로다-5FU(n＝13) 0.26(-0.26 내지 0.77) 0.30
(젤로다와 5FU 사이에 차이가 있는 것으로 결론을 내리기에는 불충분한 통계적 증거이 존재한다.)
단일 치료제를 위해, 얼마의 경우들에서 유방암 시편들에서 가장 우수한 제네릭이 가장 우수한 전유 보다 효과적인 가
조건 계수
0.57 이상으로 가장 우수한 제네릭＞가장 우수한 전유 및 가장 우수한 제네릭＞1.0 36/43(84%)
얼마나＝(+/- 0.57 이내) 6/43(14%)
0.57 이상으로 가장 우수한 전유＞가장 우수한 제네릭 및 가중 우수한 전유＞1.0 1/43(2%)
얼마였던 가 모든 KU＜1.0 0/67(0%)
시톡스(Cytox) 대 이포스(Ifos)의 비교
조건 계수
0.57 이상으로 시톡스＞이포스프 및 시톡스＞1 2/11(18%)
시톡스＝이포스프 +/- 0.57 및 모두＞1 6/11(55%)
이포스프＞시톡스＋0.57 0/11(0%)
시톡스 및 이포스프 모두＜1 3/11(27%)
카르보(Carbo) 대 시스플라트(Cisplat)의 비교
조건 계수
0.57 이상으로 카르보＞시스플라틴 및 카르보＞1 2/24(8%)
카르보＝시스플라틴 +/- 0.57 및 모두＞1 4/24(17%)
시스플라틴＞카르보＋0.57 14/24(58%)
시스플라틴 및 카르보 모두＜1 4/24(17%)
카르보(Carbo) 또는 시스플라트(Cisplat) 대 옥살리(Oxali)의 비교
조건 계수
0.57 이상으로 최대(카르보 또는 시스플라틴)＞옥살리 및 최대(카르보 또는 시스플라틴)＞1 4/11(36%)
최대(카르보 또는 시스플라틴)＝옥살리 +/- 0.57 및 모두＞1 4/11(36%)
옥살리＞최대(카르보 또는 시스플라틴)＋0.57 1/11(9%)
카르보와 시스플라틴 및 옥살리＜1 1/11(9%)
빈로엘 ( Vinroel )( Vinor ) 대 빈크리스틴 ( Vincristine )( Vcr ) 및 Vnbl 의 비교
조건 계수
0.57 이상으로 Vinor＞최대(Vcr 또는 Vnbl) 및 빈로엘＞1 4/14(29%)
Vinor＝최대(Vcr 또는 Vnbl) +/- 0.57 및 모두＞1 5/14(36%)
최대(Vinor 또는 Vnbl)＞Vinor＋0.57 0/14(0%)
Vcr과 Vnbl 및 Vinor＜1 2/14(14%)
아브락산(Abraxane) 대 탁솔(Taxol) 및 탁소테르(Taxotere)의 비교
조건 계수
0.57 이상으로 아브락산＞최대(탁솔, 탁소테르) 및 아브락산＞1 0/13(0%)
아브락산＝최대(탁솔, 탁소테르) +/- 0.57 및 모두＞1 2/13(15%)
최대(탁솔, 탁소테르)＞아브락산＋0.57 10/13(77%)
아브락산 및 탁솔과 탁소테르＜1 1/13(8%)
탁소테르(Taxotere) 대 탁솔(Taxol)의 비교
조건 계수
0.57 이상으로 탁소테르＞탁솔 및 탁소테르＞1 13/35(37%)
탁소테르＝탁솔 +/- 및 모두＞1 6/35(17%)
탁솔＞탁소테르＋0.57 11/35(31%)
탁솔 및 탁소테르＜1 5/35(14%)
독실(Doxil) 대 독소(Doxo)의 비교
조건 계수
0.57 이상으로 독실＞독소 및 독실＞1 0/9(0%)
독실＝독소 +/- 및 모두＞1 2/9(22%)
독소＞독실＋0.57 4/9(44%)
독소 및 독실＜1 2/9(22%)
젤로다(Xeloda) 대 5FU의 비교
조건 계수
0.57 이상으로 젤로다＞5FU 및 젤로다＞1 2/13(15%)
젤로다＝5FU +/- 및 모두＞1 0/13(0%)
5FU＞젤로다＋0.57 2/13(15%)
5FU 및 젤로다＜1 8/13(62%)
에피루비신(Epirubicin) 대 독소루비신(Doxorubicin)의 비교
조건 계수
0.57 이상으로 에피＞독소 및 에피＞1 6/34(18%)
에피＝독소 +/- 및 모두＞1 22/34(65%)
독소＞에피＋0.57 3/34(9%)
독소 및 에피＜1 1/34(3%)
치료제들의 결합들을 위해, 얼마의 경우들에서 5fu/메소(metho)＞5fu 그리고 메소＞1.0; 5fu/메소＝5fu 또는 메소; 5fu 또는 메소＞5fu/메소; 모두＜1.0이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 5fu/메소＞최대(5fu, 메소) 및 5fu/메소＞1 2/10(20%)
5fu/메소＝최대(5fu, 메소) +/- 0.57 및 모두＞1 2/10(20%)
최대(5fu, 메소)＞5fu/메소＋0.57 1/10(10%)
5fu/메소, 5fu 및 메소 모두＜1 4/10(40%)
치료제들의 결합들을 위해, 얼마의 경우들에서 카르보(carbo)/탁솔(taxol)＞카르보 및 탁솔 그리고＞1.0; c/t＝c 또는 t; c 또는 t＞c/t; 모두＜1.0이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 카르보/탁솔＞최대(카르보, 탁솔) 및 카르보/탁솔＞1 4/12(33%)
카르보/탁솔＝최대(카르보, 탁솔) +/- 0.57 및 모두＞1 6/12(50%)
최대(카르보, 탁솔)＞카르보/탁솔＋0.57 1/12(8%)
카르보, 탁솔, 카르보/탁솔 모두＜1 1/12(8%)
치료제들의 결합들을 위해, 얼마의 경우들에서 카르보(carbo)/탁소테르(taxotere)＞카르보 및 탁소테르 그리고＞1.0; c/탁소테르＝c 또는 탁소테르; c 또는 탁소테르＞c/탁소테르; 모두＜1.0이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 카르보/탁소테르＞최대(카르보, 탁소테르) 및 카르보/탁소테르＞1 2/13(15%)
카르보/탁소테르＝최대(카르보, 탁소테르) +/- 0.57 및 모두＞1 5/13(38%)
최대(카르보, 탁소테르)＞카르보/탁소테르＋0.57 5/13(38%)
카르보, 탁소테르, 카르보/탁소테르 모두＜1 1/13(8%)
치료제들의 결합들을 위해, 얼마의 경우들에서 시톡스(cytox)/독소(doxo)＞시톡스 및 독소 그리고 ＞1.0; 시톡스/독소＝시톡스 또는 독소; 시톡스 또는 독소＞시톡스/독소; 모두＜1.0이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 시톡스/독소＞최대(시톡스, 독소) 및 시톡스/독소＞1 3/12(25%)
시톡스/독소＝최대(시톡스, 독소) +/- 0.57 및 모두＞1 3/12(25%)
최대(시톡스, 독솔)＞시톡스/독솔＋0.57 5/12(42%)
시톡스, 독솔, 시톡스/독솔 모두＜1 1/12(8%)
치료제들의 결합들을 위해, 얼마의 경우들에서 시톡스(cytox)/에피(epi)＞시톡스 및 에피 그리고 ＞1.0; 시톡스/에피＝시톡스 또는 에피; 시톡스 또는 에피＞시톡스/에피; 모두＜1.0이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 시톡스/에피＞최대(시톡스, 에피) 및 시톡스/에피＞1 4/11(36%)
시톡스/에피＝최대(시톡스, 에피) +/- 0.57 및 모두＞1 3/11(27%)
최대(시톡스, 에피)＞시톡스/에피＋0.57 4/11(36%)
시톡스, 에피, 시톡스/에피 모두＜1 0/11(0%)
치료제들의 결합들을 위해, 얼마의 경우들에서 시톡스(cytox)/탁솔(taxol)＞시톡스 및 탁솔 그리고＞1.0; 시톡스/탁솔＝시톡스 또는 탁솔; 시톡스 또는 탁솔＞시톡스/탁솔; 모두＜1.0이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 시톡스/탁솔＞최대(시톡스, 탁솔) 및 시톡스/탁솔＞1 2/10(20%)
시톡스/탁솔＝최대(시톡스, 탁솔) +/- 0.57 및 모두＞1 2/10(20%)
최대(시톡스, 탁솔)＞시톡스/탁솔＋0.57 6/10(60%)
시톡스, 탁솔, 시톡스/탁솔 모두＜1 0/10(0%)
치료제들의 결합들을 위해, 얼마의 경우들에서 시톡스(cytox)/탁소테르(taxotere)＞시톡스 및 탁소테르 그리고 ＞1.0; 시톡스/탁소테르＝시톡스 또는 탁소테르; 시톡스 또는 탁소테르＞시톡스/탁소테르; 모두＜1.0이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 시톡스/탁소테르＞최대(시톡스, 탁소테르) 및 시톡스/탁소테르＞1 3/9(33%)
시톡스/탁소테르＝최대(시톡스, 탁소테르) +/- 0.57 및 모두＞1 2/9(22%)
최대(시톡스, 탁소테르)＞시톡스/탁소테르＋0.57 4/9(44%)
시톡스, 탁소테르, 시톡스/탁소테르 모두＜1 0/9(0%)
치료제들의 결합들을 위해, 얼마의 경우들에서 비노르(vinor)/젤로(xelo)＞비노르 및 젤로 그리고 ＞1.0; 비노르/젤로＝비노르 또는 젤로; 비노르 또는 젤로＞비노르/젤로; 모두＜1.0이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 비노르/젤로＞최대(비노르, 젤로) 및 비노르/젤로＞1 0/10(0%)
비노르/젤로＝최대(비노르, 젤로) +/- 0.57 및 모두＞1 4/10(40%)
최대(비노르, 젤로)＞비노르/젤로＋0.57 4/10(40%)
비노르, 젤로, 비노르/젤로 모두＜1 2/10(20%)
얼마의 경우들에서 폐암 시편들에서 가장 우수한 제네릭이 가장 우수한 전유 보다 효과적이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 가장 우수한 제네릭＞가장 우수한 전유 및 가장 우수한 제네릭＞1 25/32(78%)
얼마나＝(+/- 0.57 이내) 5/32(16%)
0.57 이상으로 가장 우수한 전유＞가장 우수한 제네릭 및 가장 우수한 전유＞1 2/32(6%)
얼마였던 가 모든 KU＜1.0 0/41(0%)
얼마의 경우들에서 결장암 시편들에서 가장 우수한 제네릭이 가장 우수한 전유 보다 효과적이었던 가
조건 계수
0.57 이상으로 가장 우수한 제네릭＞가장 우수한 전유 및 가장 우수한 제네릭＞1 4/7(57%)
얼마나＝(+/- 0.57 이내) 1/7(14%)
0.57 이상으로 가장 우수한 전유＞가장 우수한 제네릭 및 가장 우수한 전유＞1 2/7(29%)
얼마였던 가 모든 KU＜1.0 0/8(0%)
MiCK 약물 유발성 아포프토시스 분석을 기초로 한 제네릭 다중 소스 치료제 사용 대 전유의 단일 소스 치료제 사용으로부터의 치료제 비용 절감
질병 환자 당 치료제 절감(평균) 제네릭 치료제 우수성 또는 동등성의 환자들의 비율 환자 당 분석-조절된 치료제 절감(평균) 환자 당 네트(net) 치료제 절감(평균) 비용 절감 퍼센티지
결장 $35,668 71% $25,338 $20,338 54.0%
유방 $13,593 98% $13,321 $8,321 42.8%
비소세포 폐 $15,774 94% $14,827 $9,827 47.0%
MiCK 약물 유발성 아포프토시스 분석을 기초로 한 제네릭 다중 소스 치료제 사용 대 전유의 단일 소스 치료제 사용으로부터의 치료제 비용 절감
암 전유의 단일 소스 PMT/6 제네릭 다중 소스 PMT/6 평균 절감 %
MSD		 환자 당 절감
유방 NAB-PACLI $26704 VINOR $2242
GEMCIT $12609 EPI/CTX $1355
CAPECIT $18976 CTX/DOCET $13913
평균 $19430 $5837 $13593 98% $8321/PT
결장 FOLFOX $37670 FOLFIRI $1982 $35688 71% $20338/PT
NSCLC PEM/CIS $29217 CARBO/PACLI $806
GEM/CIS $12609 VINOR $1601
DOCET $13009
평균 $20913 $5138 $15774 94% $9827/PT
다양한 농도들에서 37가지의 실험된 항암 치료제 후보 물질들에 대한 암 세 소들의 아포프토시스 반응
실험된 치료제 최대 반응(KU) 반응 수준 실험된 치료제 최대 반응(KU) 반응 수준
시스플라틴 >10.0 민감 젬시타빈＋탁솔레르 2.4 중간보다 낮음
4HC(시톡산) 8.4 탁솔레르 2.3
수니피닙 7.9 메토트렉세이트＋빈블라스틴 2.2
옥살리플라틴 6.7 탁솔 1.6 낮음
카르보플라틴 6.0 테모졸로미드 1.5
멜팔란 5.3 글리벡(이마티닙) 1.5
비다자 4.3 중간 프로카르바진 1.3
닥티노마이신 4.0 빈블라스틴 1.2
벨카드 3.8 독실 1.2
소라페닙 3.8 블레오마이신 1.1
에피루비신 3.5 빈크리스틴 0.9 비민감
독소루비신 3.2 CCNU 0.8
4HI(이포스파미드)＋에피루비신 3.2 에토포시드 0.8
다노루비신 3.1 젬시타빈 0.8
빈크렐빈 3.1 메토트렉세이트 0.8
이리노테칸 2.6 중간보다 낮음 타르세바 0.7
4HI(이포스파미드) 2.6 알림타 0.6
4HI(이포스파미드)＋독소루비신＋다카르바진 2.5 다카르바진 0.6
5-플루오로우라실 0.3

Claims (26)

  1. 항암 치료제 후보 물질(anti-cancer drug candidate)의 상대적 아포프토시스(apoptosis) 유도 능력을 평가하는 방법에 있어서:
    a) 종양 시편으로부터 암 세포들을 수득하는 단계를 포함하고;
    b) 상기 시편을 다지고(mincing), 소화시키고 필터링하는 단계를 포함하며;
    c) 밀도 구배 원심 분리(density gradient centrifugation)에 의해 생존 불능의 세포들을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하고;
    d) 부착에 의해 대식 세포들(macrophages)을 제거하도록 세포 서스펜션을 배양시키는 단계를 포함하며;
    e) 관심의 대상인 세포들을 분리하도록 양성, 음성 및/또는 고갈(depletion) 분리를 수행하는 단계를 포함하고;
    f) 필요한 경우에 마그네틱 비드들(magnetic bead)에 콘주게이트된 CD14를 이용하여 임의의 잔류하는 대식 세포들을 제거하는 단계를 포함하며;
    g) 최종 서스펜션을 도포하는 단계를 포함하고;
    h) 상기 플레이트를 배양시키는 단계를 포함하며;
    i) 도포된 최종 서스펜션의 적어도 하나의 웰(well)을 적어도 하나의 제1 항암 치료제 후보 물질 또는 상기 제1 후보 물질과 다른 물질들의 혼합물들에 노출시키는 단계를 포함하고;
    j) 도포된 최종 서스펜션의 적어도 하나의 웰을 적어도 하나의 제2 항암 치료제 후보 물질 또는 상기 제2 후보 물질과 다른 물질들의 혼합물들에 노출시키는 단계를 포함하며;
    k) 상기 적어도 하나의 제1 및 제2 항암 치료제 후보 물질들에 노출된 웰들, 또는 적어도 하나의 제1 또는 적어도 하나의 제2 항암 치료제 후보 물질 및 다른 물질들의 혼합물을 함유하는 웰들의 광학 밀도를 측정하는 단계를 포함하고, 상기 광학 밀도를 측정하는 단계는 선택된 시간 동안 선택된 시간 간격들에서 순차적인 방식으로 일어나며;
    l) 상기 광학 밀도 및 시간 측정들로부터 상기 적어도 하나의 제1 및 제2 항암 치료제 후보 물질들에 대한 속동성 단위 값(kinetic units value)을 결정하는 단계를 포함하고;
    m) 각 치료제 후보 물질에 대한 상기 속동성 단위 값을,
    a) 상기 속동성 단위 값이 소정의 역치(threshold)보다 클 경우에 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 상기 항암 치료제 후보 물질의 능력; 및
    b) 상기 속동성 단위 값이 소정의 역치보다 작을 경우에 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 상기 항암 치료제 후보 물질의 불능과 상호 연관시키는 단계를 포함하며;
    n) 각 치료제 후보 물질에 대한 상기 결정된 속동성 단위 값을 비교하는 단계를 포함하고;
    o) 상기 단계 n)에서의 비교에 기초하여 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 보다 큰 상대적인 능력을 가지는 치료제 후보 물질을 결정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 제1 및 제2 항암 치료제 후보 물질들은 적어도 하나의 제네릭(generic) 치료제 후보 물질 및 하나의 전유의(proprietary) 치료제 후보 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    p) 상기 제네릭 또는 전유의 치료제 후보 물질의 선택으로부터 야기되는 금전적인 결과들(monetary consequences)을 판단하는 단계를 더 포함하며, 가장 높은 상대적인 속동성 단위 값을 갖는 상기 치료제 후보 물질이 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 금전적인 결과들은 보다 낮은 속동성 단위 값을 갖는 치료제 후보 물질에 근거하여 발생될 수 있었던 비용에 비해 보다 높은 속동성 단위 값을 갖는 선택된 치료제로 단일의 환자를 치료하는 것에 기초하여 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서,
    q) 상기 단계 p)로부터 판단되는 상기 금전적 결과들을 예상 고객층(target population)으로 추정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 예상 고객층은 미합중국으로부터의 전국적인 인구인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 3 항에 있어서, 상기 단계 p)의 금전적 결과들은,
    i) 상기 보다 높은 속동성 단위 값을 갖는 선택된 항암 치료제에 대한 및 상기 보다 낮은 속동성 단위 값을 갖는 치료제에 대한 메디케어 비용 지불 일정들(Medicare cost payment schedules)을 수득하는 단계를 포함하고;
    ii) 상기 보다 낮은 속동성 단위 값을 갖는 상기 치료제 후보 물질로 상기 환자를 치료하는 것에 대하여 상기 보다 높은 상대적인 속동성 단위 값을 갖는 상기 치료제 후보 물질로 상기 환자를 치료하는 것에 기초하여 단일의 환자에 대해 정확할 수 있는 상대적인 금전적 비용 절감 또는 상대적인 금전적 지출을 판단하는 단계를 포함하며, 상기 치료는 상기 선택된 항암 치료제 후보 물질로의 치료의 적어도 하나의 사이클을 구비하고;
    iii) 상기 ii)로부터의 상기 비용 절감 또는 상대적인 금전적 지출을 관심의 대상인 예상 고객층에 대하여 추정하는 단계를 포함하는 방법에 의해 판단되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 종양 시편은 고상의 종양 시편, 혈액 시편, 골수 시편, 또는 삼출물 유래 시편인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 제1 또는 제2 항암 치료제 후보 물질들의 적어도 하나는 상기 항암 치료제 후보 물질 및 적어도 하나의 추가적인 항암 치료제 후보 물질을 포함하는 결합인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 상기 플레이트의 각각의 웰은 다른 항암 치료제 후보 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 플레이트의 각각의 웰은 상기 항암 치료제 후보 물질의 다른 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 항암 치료제 후보 물질 농도는 0.01μM 내지 10,000μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1 항에 있어서, 상기 광학 밀도는 순차적으로 측정되고, 대략 48시간의 주기로 대략 매 5분마다 기록되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1 항에 있어서, 상기 광학 밀도는 550나노미터 내지 650나노미터의 파장에서 분광 광도계(spectrophotometer)로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항암 치료제 후보 물질들은, 아브락산(Abraxane), 알림타(Alimta), 암사크린(Amsacrine), 아스파라기나아제(Asparaginase), 벤다무스틴(Bendamustine), 블레오마이신(Bleomycin), 보수티닙(Bosutinib), 캘릭스(Caelyx)(독실(Doxil)), 카르보플라틴(Carboplatin), 카르무스틴(Carmustine), CCNU, 클로람부실(Chlorambucil), 시스플라틴(Cisplatin), 클라드리빈(Cladribine), 클로파라빈(Clofarabine), 시타라빈(Cytarabine), 시톡산(Cytoxan)(4HC), 다카르바진(Dacarbazine), 닥티노마이신(Dactinomycin), 다사티닙(Dasatinib), 다우노루비신(Daunorubicin), 데시타빈(Decitabine), 덱사메타손(Dexamethasone), 도세탁셀(Docetaxel), 독소루비신(Doxorubicin), 에피루비신(Epirubicin), 에리불린(Eribulin), 에를로티닙(Erlotinib), 에스트라무스틴(Estramustine), 에토포시드(Etoposide), 에베롤리무스(Everolimus), 플루다라빈(Fludarabine), 5-플루오로우라실(Fluorouracil), 겜시타빈(Gemcitabine), 글리벡(Gleevec)(이마티닙(imatinib)), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 이다루비신(Idarubicin), 이로스파미드(Ifosfamide)(4HI), 인터페론(Interferon)-2a, 이리노테칸(Irinotecan), 익사베필론(Ixabepilone), 멜팔란(Melphalan), 메캅토푸린(Mercaptopurine), 메토트렉세이트(Methotrexate), 미토마이신(Mitomycin), 미톡산트론(Mitoxantrone), 닐로티닙(Nilotinib), 니트로겐 무스타드(Nitrogen Mustard), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 펜토스타틴(Pentostatin), 프로카르바진(Procarbazine), 레고라페닙(Regorafenib), 소라페닙(Sorafenib), 스트렙토조신(Streptozocin), 수니티닙(Sunitinib), 테모졸로미드(Temozolomide), 템시롤리무스(Temsirolimus), 테니포시드(Teniposide), 탈리도미드(Thalidomide), 티오구아닌(Thioguanine), 토포테칸(Topotecan), 벨카드(Velcade), 비다자(Vidaza), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 비노렐빈(Vinorelbine), 보리노스타트(Vorinostat), 에베롤리무스(Everolimus), 라파티닙(Lapatinib), 레날리도미드(Lenalidomide), 라파마이신(Rapamycin) 그리고 보트리엔트(Votrient)(파조파닙(Pazopanib))로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 2 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항암 제네릭 치료제 후보 물질들은, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 독소루비신(doxorubicin), 에피루비신(epirubicin), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 이리노테칸(irinotecan), 토포테칸(topotecan), 비노렐빈(vinorelbine) 그리고 빈블라스틴(vinblastine)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 2 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 항암 전유의 치료제 후보 물질들은, 납-파클리탁셀(nab-paclitaxel), 젬시타빈(gemcitabine), 옥살리플라틴(oxaliplatin), 캅시타빈(capcitabine), 익사베필론(ixabepilone), 에루빌린(erubilin), 리포조말 독소루비신(liposomal doxorubicin) 그리고 페메트렉세드(pemetrexed)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. a) 종양 시편을 수득하는 단계;
    b) 상기 시편을 다지고, 소화시키고, 필터링하는 단계;
    c) 밀도 구배 원심 분리로 생존 불능의 세포들을 선택적으로 제거하는 단계;
    d) 부착에 의해 대식 세포들을 제거하도록 세포 서스펜션을 배양시키는 단계;
    e) 관심의 대상인 세포들을 분리하도록 양성, 음성 및/또는 고갈 분리를 수행하는 단계;
    f) 필요한 경우에 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD14 항체를 이용하여 임의의 잔류하는 대식 세포들을 제거하는 단계;
    g) 최종 서스펜션을 도포하는 단계; 및
    h) 상기 플레이트를 배양시키는 단계를 포함하는 종양 세포 분리 및 정제 방법.
  19. 종양 시편으로부터 유래되는 암 세포주에서 아포토시스를 유발하는 항암 치료제 후보 물질의 능력을 평가하는 방법에 있어서,
    a) 종양 시편을 수득하는 단계를 포함하고;
    b) 상기 시편을 다지고, 소화시키며, 필터링하는 단계를 포함하며;
    c) 밀도 구배 원심 분리로 생존 불능의 세포들을 선택적으로 제거하는 단계를 포함하고;
    d) 부착에 의해 대식 세포들을 제거하도록 세포 서스펜션을 배양시키는 단계를 포함하며;
    e) 관심의 대상인 세포들을 분리하도록 양성, 음성 및/또는 고갈 분리를 수행하는 단계를 포함하고;
    f) 필요한 경우에 마그네틱 비드들에 콘주게이트된 CD14 항체를 이용하여 임의의 잔류하는 대식 세포들을 제거하는 단계를 포함하며;
    g) 최종 서스펜션을 도포하는 단계를 포함하고;
    h) 상기 플레이트를 배양시키는 단계를 포함하며;
    i) 도포된 최종 서스펜션의 적어도 하나의 웰을 적어도 하나의 항암 치료제 후보 물질 또는 상기 후보 물질 및 다른 물질들의 혼합물들에 노출시키는 단계를 포함하고;
    j) 상기 적어도 하나의 항암 치료제 후보 물질들에 노출된 웰들, 또는 적어도 하나의 항암 치료제 후보 물질 및 다른 물질들의 혼합물을 함유하는 웰들의 광학 밀도를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 광학 밀도를 측정하는 단계는 선택된 시간 동안 선택된 시간 간격들에서 순차적인 방식으로 일어나고;
    k) 상기 광학 밀도 및 시간 측정들로부터 상기 적어도 하나의 항암 치료제 후보 물질에 대한 속동성 단위 값을 결정하는 단계를 포함하며;
    l) 각 치료제 후보 물질에 대한 속동성 단위 값을,
    a) 상기 속동성 단위 값이 소정의 역치보다 클 경우에 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 상기 항암 치료제 후보 물질의 능력; 및
    b) 상기 속동성 단위 값이 소정의 역치보다 작을 경우에 상기 암 세포들에 아포프토시스를 유도하는 상기 항암 치료제 후보 물질의 불능과 상호 연관시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 플레이트의 각각의 웰은 다른 항암 치료제 후보 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19 항에 있어서, 상기 플레이트의 각각의 웰은 상기 항암 치료제 후보 물질의 다른 농도를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19 항에 있어서, 상기 항암 치료제 후보 물질 농도는 0.01μM 내지 10,000μM인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19 항에 있어서, 상기 광학 밀도는 순차적으로 측정되고, 대략 48시간의 주기로 대략 매 5분마다 기록되는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 19 항에 있어서, 상기 광학 밀도는 550나노미터 내지 650나노미터의 파장에서 분광 광도계로 측정되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19 항에 있어서, 상기 종양 시편은 고상의 종양 시편, 혈액 시편, 골수 시편, 또는 삼출물 유래 시편인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 19 항에 있어서, 상기 항암 치료제 후보 물질들은, 아브락산, 알림타, 암사크린, 아스파라기나아제, 벤다무스틴, 블레오마이신, 보수티닙, 캘릭스(독실), 카르보플라틴, 카르무스틴, CCNU, 클로람부실, 시스플라틴, 클라드리빈, 클로파라빈, 시타라빈, 시톡산(4HC), 다카르바진, 닥티노마이신, 다사티닙, 다우노루비신, 데시타빈, 덱사메타손, 도세탁셀, 독소루비신, 에피루비신, 에리불린, 에를로티닙, 에스트라무스틴, 에토포시드, 에베롤리무스, 플루다라빈, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 글리벡(이마티닙), 하이드록시우레아, 이다루비신, 이로스파미드(4HI), 인터페론-2a, 이리노테칸, 익사베필론, 멜팔란, 메캅토푸린, 메토트렉세이트, 미토마이신, 미톡산트론, 닐로티닙, 니트로겐 무스타드, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 펜토스타틴, 프로카르바진, 레고라페닙, 소라페닙, 스트렙토조신, 수니티닙, 테모졸로미드, 템시롤리무스, 테니포시드, 탈리도미드, 티오구아닌, 토포테칸, 벨카드, 비다자, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 비노렐빈, 보리노스타트, 에베롤리무스, 라파티닙, 레날리도미드, 라파마이신 그리고 보트리엔트(파조파닙)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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