CN112384790A - 利用激光力细胞学的改进生物物理和生物化学细胞监测和定量 - Google Patents

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Abstract

本发明针对进行生物物理和生物化学细胞监测和定量的智能算法、方法、计算机实施方法，本发明通过使用基于流体力和光学力的测量，实现改进感染力试验的增强性能和客观分析，改进感染力试验包括中和试验和外源因子检测。

Description

利用激光力细胞学的改进生物物理和生物化学细胞监测和 定量
技术领域
本发明的实施例整体涉及利用光学力和/或流体力来测量细胞对不同刺激（differential stimuli）的响应，以及实现了对生物物理和生物化学细胞监测和定量的方法的智能算法（IA）；在某些实施例中，本发明中的方法由计算机实现。本发明描述的实施例包括实现改进感染力试验的增强性能和客观分析，改进感染力试验包括中和试验和外源因子检测（AAT）。所述方法使用基于光学力的测量值，例如激光力细胞学（LFC）。具体而言，本发明描述了自动扫描和分析多孔板的自动算法和感染度量计算，所述多孔板用于中和以及其他功能性试验。此外，使用悬浮细胞或嵌入基质的细胞来扩展可用于此类试验的感染模型以及监测、评估和定量外源因子（AA）样本和培养物的能力。
背景技术
目前，血清病毒中和试验是用于分析体内衍生免疫力抑制病毒感染和/或复制的能力的最高标准。中和试验用于确定血清衍生抗体在减少或阻断在培养物中的细胞中的病毒感染和/或后续复制的功效。基本上，用感染性病毒剂和体内衍生的血清抗体的组合对人类或动物细胞进行体外处理，以检查血清衍生抗体是否对体外细胞内的病毒剂的感染和/或复制具有特异性和有效性。这些类型的分析实验需要附加分析。蚀斑试验和蚀斑减少中和试验（PRNT）都测量每单位体积样本中感染性病毒颗粒的数量，后者还测量因中和血清或其他药剂引起的感染力单位的减少。该试验涉及将含有病毒的溶液置于平板中生长的附着细胞上，涂抹涂层（通常为琼脂糖）以防止病毒自由传播，然后等待3至15天，以使死亡或清除的细胞（蚀斑）的区域由于单一感染性病毒颗粒而形成。类似地，组织培养物感染量50（TCID50）是通过执行终点稀释试验而得到的特定体积中的感染性病毒浓度的量度。TCID50被定义为感染培养物中细胞的给定批次接种孔的50％所需的病毒稀释度。尽管这些方法已经使用了数十年，但在实验和操作员之间以可靠和可再现的结果执行上述方法方面仍面临着固有挑战。在分析悬浮液中的细胞、对大量样本的要求（用于稀释度计算）、分析的耗时和主观技术以及细胞操作导致的细胞死亡和/或感染参数更改等不良后果方面，这些试验也存在局限性。需要大量稀释度的一个原因是当前方法的有限动态范围和高可变性。
现有技术描述了使用光学密度和各种约束来确定中和效价，例如分析和绘制每个样本的最大光学密度，的方法和装置，（公开号为第2013/0084560的美国专利，该专利借引用并入本发明）。但公开号为第2013/0084560的美国专利仅使用了光学密度，没有使用微流体和/或光学力，也不包括使用通过自动实时网格搜索算法实现的附加智能，该算法计算哪些样本需要被读取/分析以确定实验的结果。美国专利第4,329,424号描述了另一个半自动系统，但这种方法使用光源，而不是光学力，而且不是全自动的。
此外，尽管美国专利第8,778,347号描述了使用由流式细胞术监测的灭活荧光标记病毒，以减少实验操作所需的安全预防措施，而欧洲专利第1140974号描述了使用假病毒报告基因，但是这两个参考文献都具有局限性，这是因为由于试验中使用的样本细胞或感染原的标记或修饰繁琐，必须要分析大量样本。由于细胞和感染物的修饰已被证明能够活化、分化或更改感染力和/或功能，因此需要的是无标记分析，以充当需要这种修饰来分析的传统方法的理想替代。
另外，尽管WO1989006705描述了使用蚀斑转移试验来检测逆转录酶病毒和测量中和抗体，但其中的启示将实验者局限于使用单层细胞类型。实际上，正如本领域技术人员所熟知，并非所有病毒都会感染形成单层的细胞。需要的是能够使用悬浮细胞或嵌入基质的细胞进行感染研究和分析的方法和设备，从而在病毒感染的实验中能够用更多种细胞类型。
现有技术（例如美国专利第6,778,263号）描述了校准物（例如，微珠或细胞）的使用，但这种启示因为仅描述了在时间延迟积分（TDI）检测器的情况下使用校准物，所以具有局限性。TDI检测器的功能性依赖于使固态检测器（如电荷耦合器件阵列）中光子感生电荷线与试样流动同步地位移，并使用校准物来提高系统的性能。另外，现有技术的校准微珠仅限于校准流量和对准TDI检测器，不用于校准分析信息，所述分析信息用于例如折射率（例如微珠/人工细胞的折射率比）的物理或化学信息的数据校正、归一化、定量或计算。缺乏的是校准物的启示或使用，所述校准物描述如光学力、光学扭矩、光动力学、有效折射率、尺寸、形状的测量值或相关测量值，其中校准物是基于聚合物、玻璃、生物制剂、脂质、囊泡或细胞（活的或固定的）的校准物。另外，还缺少对具有与所关注粒子相关的特性但不干扰所关注样本的数据收集的校准物的启示。
需要改进方法和设备以在多个识别方面（如生物物理和生物化学曲线）有效表征生物成分和系统。某些实施例中，此类方法和设备包括的智能算法和方法应适用于例如衍生自基于病毒的接种疫苗或药物发现试验的样本，使得能够在完整或耗尽的细胞分离株中检验细胞类型之间、个体群组之间或甚至试验之间的感染力参数偏差。其他样本处理可能包括血清抗体、抗病毒化合物、抗菌化合物、毒素、有毒的工业物质或化学品（TIMs/TICs）、寄生虫以及基因或细胞疗法产物（如CAR T细胞和溶瘤疫苗）的评估。还需要针对细菌的中和试验，该试验利用被设计成对细菌敏感的细胞（低反应阈值），该细胞包括用于借助基于多层面光学力的测量值来测量感染原的感染性的细胞系或初生细胞。理想情况下，此类方法和设备应能够通过分析生物制造液体（如条件培养基）或其他所关注样本（如从生物反应器或其他此类容器获得的样本）来确定感染力测量值，而该感染力测量值有助于外源因子检测。
发明内容
目前用于表征生物细胞和系统的可用程序和分析方法，如感染力试验（例如中和试验、TCID50和临床样品操作）需要大量稀释度、潜在有害的标记程序，并产生高度多变的结果，使得实验之间和实验中以及试验的比较有挑战性，下游的细胞应用受限。本发明克服了这些限制，提供了与生物物理和生物化学细胞监测和定量相关的新方法，包括使用基于光学力的技术（例如激光力细胞学（LFC））来实现未标记细胞样本的增强自动扫描的智能分析算法，其结果是对样本稀释度及最终样本试样的需求减少，以及分析所需的时间及相关成本减少，同时在分析过程中实现规范一致的细胞评价。此外，本发明实现了使用悬浮细胞或嵌入基质的细胞以用于分析，扩展用于中和或其他功能性试验的感染模型的动态范围，以及监测、评估和定量来自样本和培养物的外源因子的能力。此外，本发明描述的发明方法可由计算机实施，从而提高效率、可靠性和再现性。
背景技术激光力细胞学（LFC）的基本前提是，其利用微流体和光诱导压力的结合，对每个细胞进行光学测量，包括光学力或压力、尺寸、速度和其他参数。虽然LFC是一个优选实施例，但是根据本发明可以使用其他基于光学力的技术。将LFC应用于中和、TCID50以及其他试验的扫描和分析中以用于确定病毒效价和感染力（两者为同义词）以及确定浓度是通过测量细胞特征中的变化来进行的，这些变化指示的是与含有抗体和/或所关注的病毒的血清共同培养的细胞相对于仅用非免疫血清处理的细胞（对照或安慰剂）的细胞病变效应。此外，在无血清的情况下与病毒共培养的细胞可用于确定衍生自原代或细胞培养源的细胞感染率。在下文中，任何时候提到中和试验，应认为也提到了作为常规应用的TCID50或蚀斑试验。
本发明减少了与实验主观性、时间和成本要求相关的挑战，同时增强了关于读取和分析样本的客观易用性。在某些实施例中，这是通过使用智能算法（IA）扫描并自动和在算法上计算稀释度和/或效价确定和要求而实现的，这独立于人工计算，由计算机实施的过程实现。一种智能算法为涉及包括模糊逻辑方法的复杂的指令集，这些方法包含诸如感染力和感染度量（例如，低、中或高感染力范围）等可变结果。IA还可以包括人工智能（AI）概念，人工智能概念包括神经网络（NN）（反向传播或概率神经网络）或机器学习，以将校准数据应用于当前样本，为取样更好地预测最佳网格搜索模式。本文公开的这种新方法最终减少了每次实验所需的稀释度的量，从而节省了实验人员资源、时间和训练有素的人员对结果进行分析的需要，并且消除了目前定量中和试验效价所需要的报告基因、抗体或其他染色/标记机制的使用。
本发明利用光学力和/或流体力优化了对不同刺激的细胞响应的测量，并能够提供一致可靠的生物系统表征。
附图简要说明
图1是智能算法（IA）过程的示例，其选择顺序稀释度（100），计算细胞培养孔板上的TCID50/mL或中和百分比，并将结果定义为感染度量/mL “IM”（120）。此外，IA（100）通过定量测量细胞病变效应百分比（%CPE）和分析结果（140），实现稀释度和复制品之间的插值。
图2所示的图表详细说明了基于光学力的技术RadianceTM的实施例如何利用如图1所示的（100）来操作含有样本的培养板，以供应用至中和（200）和TCID50（220）试验。
图3所示的示意图演示了添加到细胞样本中的校准微珠的使用，该校准微珠可用作内部校准标准。
图4图示了RadianceTM用于生物反应器取样和分析，以进行外源因子检测（AAT）。
图5示出了使用RadianceTM进行AAT评估和监测的策略。
图6是CHO细胞中的病毒CPE和复制的汇总表。
图7定义了同时使用多种细胞类型进行AAT的LFC多重试验的可能性。
图8表示直接从大型工艺流程生物反应器中取样进行AAT的LFC分析。
图9图示了使用微型生物反应器进行AAT的LFC分析，该微型生物反应器运行掺有CM的悬浮细胞。
图10中的示意图图示了用于AAT的LFC巨噬细胞试验。
图11提供了本发明所采用的智能算法的发展概述。
图12提供了演示本发明所采用的智能算法的流程图（IM是感染度量，OLDR是最优线性动态范围）。
图13提供的图表展示了应用智能算法的可能情况：图13（A）为中间效价，图13（B）为高效价，图13（C）为低效价，图13（D）为低效价（稀释度过高），图13（E）为高效价（稀释度不足）。
图14提供了根据具有未知效价样本的已知病毒系统计算效价和创建校准曲线的概述。
图15提供了根据具有未知效价样本的未知（未熟知）病毒系统计算效价和创建校准曲线的概述。
图16提供的图表显示感染水疱性口炎病毒的vero细胞的感染度量与MOI的对比：图16.（A）中MOI是0.125，图16（B）中MOI是0.5，图16（C）中MOI是4。
图17在四个图表中提供了示例数据，四个图表展示了附着HEK 293细胞中腺病毒感染（Ad5）的各种测量值：图17（A）是尺寸对速度的散点分布图，图17（B）是显示速度频率的直方图，图17（C）是显示针对一定范围的MOI值的多变量感染度量的条形图，图17（D）是显示多变量感染度量与以PFU / mL表示的病毒效价之间关系的散点分布图。
图18提供了Radiance™数据的K-means聚类分析。
图19提供了计算绝对效价/感染力的示意图。
图20提供了三张图表：图20（A）为效价（对数尺度）、图20（B）为效价（线性尺度），图20（C）为感染度量。
图21提供了展示感染力和绝对效价结果的图表。
图22提供了使用ANN的病毒的LFC识别。
图23提供了用于评估细胞响应的总结步骤示意图，细胞响应可作为针对安慰剂患者的疾病检测或疫苗功效的生物标记物。
图24提供了用于评估细胞响应的总结步骤示意图，细胞响应可作为针对患者受试者的疾病检测或疫苗功效的生物标记物。
具体实施方式
参考具有各种特征的特定实施例描述了本发明。对于本领域技术人员来说，显而易见的是，在不脱离本发明的范围或精神的情况下，可以在本发明的实践中进行各种修改和变动。本领域技术人员将认识到，可能基于给定应用或设计的要求和规范单独或以任何组合使用这些特征。本领域技术人员将认识到，本发明实施例的系统和设备可与本发明的任意方法一起使用，且本发明的任何方法可使用本发明的任意系统和设备来执行。包含各种特征的实施例也可以由这些各种特征组成或基本上由这些不同特征组成。思考本发明的说明书和实践后，本发明的其他实施例对于本领域技术人员来说是将是显而易见的。所提供的对本发明的描述在性质上仅仅是示例性的，因此不偏离本发明本质的变动意在包括在本发明范围之内。
在详细解释本发明的至少一个实施方式之前，应理解，本发明不限于其在下文描述中阐述的或在以下附图中示出的部件结构和配置详情中的应用。本发明能够具有其他实施例，或能够以多种方式实践或实施。另外，应当理解，本发明中运用的措词和术语仅作说明，不作限制。
除非另有定义，否则本发明使用的所有技术和科学术语的含义为与该技术和方法所涉领域技术人员通常理解或使用的含义相同。
本发明提及的文本和参考文献以全文并入本发明，包括于2018年03月20日提交的、第62/645,652号美国临时专利申请。
一个实施例提供了使用光学力和/或流体力测量细胞对不同刺激的响应的方法，其中该方法包括接收入选的初始样本，入选的初始样本包含用各种已知水平的刺激物或分析物处理的生物细胞，对该样本进行基于光学力的测量，基于一个或多个基于光学力或流体力的参数来开发响应度量（RM）以描述细胞对刺激物的响应。在某些实施例中，本发明所公开的方法可以由计算机实施。
如图1所示，设计智能算法（100）用于读取（检测）、分析和预测细胞变化，例如但不限于多孔板（96孔是优选实施例，但在下文中可将“孔板”理解为任意孔板，包括但不限于含有任何数量的孔、或图案或容器的孔板（例如见图4））中所含样本的细胞病变效应（CPE）（例如针对病毒、细菌或毒素效应的%CPE。或者，包括但不限于有效折射率或尺寸归一化速度的任意LFC测量参数可用于代替%CPE来描述细胞变化）。在一个实施例中，算法软件在开始孔位置启动对细胞变化（即%CPE）的仪器分析和检测。在各方面，该开始位置可由用户根据经验或其它预先编程的归位坐标来选择。在实施例中，该算法将在随后基于观测数据、数据趋势和/或先前加载到软件中的实验布局自动选择具有或更高或更低稀释度的孔。具体而言，根据用户输入或现有知识，从中等稀释度或未经处理的对照开始取样。根据初始样本的定量结果选择下一个待分析样本。更具体地说，对于感染力测量，可参考%CPE。因此，如果%CPE高于目标感染力值（例如，50%），则下一个分析的样本将是含有更高的稀释因子的样本（例如，分析物如病毒或中和剂的浓度更低，）。移动间隔的大小取决于测量值的量级。例如，接近最大值（100%）的CPE值可能需要降低两到三个稀释度，而接近期望值（50%）的CPE值只需要降低一（1）个稀释度。相反，如果初始测量值低于目标值，则下一个测量的样本将有较小的稀释因子（分析物浓度更高），且间隔的量级将再次基于测量值的大小。以类似的方式选择随后取样的稀释度，直到识别了目标稀释度或分析了（部分或全部的）板。此后，取样相同稀释度的复制品，直到可以确定感染力的准确测量值。如果对预期的感染力水平或分析物的现有认识或理解有限，可从中间开始取样，并根据测量结果以自动方式继续，直到识别了目标感染力为止。这可最终减少准确测量样本感染力所需的稀释度和/或复制品的数量。因此，与传统中和试验所需的数量相比，本发明提供的新方法减少了所需样本稀释度的数量，同时借助智能算法的应用以及通过诸如激光力细胞学（LFC）的基于光学力的技术提供的更大动态范围，从而缩短了孔板分析所需的时间。在实施例中，所使用的基于光学力的技术包括激光力细胞学（LFC），然而任何其他基于光学力的技术可用于如本文所述的发明，其他基于光学力的技术包括但不限于光色谱法、交叉型光色谱法、激光分离、正交激光分离、光镊、光学捕获、全息光学捕获、光学操作，和激光辐射压力。
在替代实施例中，IA（100）可设置为自动搜索某些条件，包括各种时间点、稀释度或在一个或多个取样时间点的试剂变动。相应地，IA（100）可监测最低稀释度，推断并预测浓度和取样要求，并使用光学力测量值（即LFC）计算下一次分析的估计值，并实现感染度量/mL（“IM”）（120）的计算。如本发明所用，术语感染度量（“IM”）或响应量度（“RM”）是指考虑以下特定参数或值：细胞计数、速度（包括飞行时间中的速度和位置的变化）、光学力、尺寸、形状、纵横比、离心率、可变形性、定向、旋转（频率和位置）、折射率、体积、粗糙度、细胞复杂性、基于对比度的图像测量（例如，空间频率、时间或空间的强度变动）、三维细胞图像或切片、激光散射、荧光、拉曼（Raman）或其他光谱测量，以及反映样本中细胞变化或病毒/细菌感染力的水平的针对细胞或群体进行的任何组合或其他测量。在实施例中，例如Radiance™（LumaCyte™（夏洛茨维尔，弗吉尼亚州，美国）提供的激光力细胞学仪器）的设备用于进行基于光学力的测量，然而能够进行光学力测量的其他设备和方法（包括LFC）适合与本发明联合使用，这对本领域技术人员来说是显而易见的。（为清楚起见，感染度量（IM）和响应量度（RM）可根据测量的类型互换使用。）
图1中标记为（120）的一个IA实施例是通过测量各种感染力水平的数个样本来开发的，用以确定所测的RadianceTM 特定参数在感染时如何变化。如图1所示，当在每单元基础上测量这些参数时，LFC仪器（“RadianceTM”）关联软件为每个样本自动计算（120）。（120）可等同于传统的TCID50/mL、pfu/mL、感染复数（MOI）或其他已知感染值，但也含有关于细胞群的额外定量信息。每细胞多参数的分析产生的数据可以检测到细胞群体中更敏感的变化或细胞群体之间的差异，以及病毒株感染率。另一种选择是，还可将（120）应用于细胞系和病毒株，经归一化以使感染模型与来自接种或未接种疫苗的样本的血清之间的变异性和/或相似性关联，在该样本中可以检查血液中药物水平或疫苗诱导的抗体水平对细胞的影响。此外，可以在针对趋势和细胞群对比的各种研究中间或跨越这些研究来进一步比较来自细胞的细菌或病毒感染的结果。
可以通过调整（100）来从分析孔推断数据，以做出使用%CPE（140）定量测量的稀释度和复制值之间的插值，来确定间质性对数或指数数据点，以便进行与观测现象直接相关的高准确度和敏感性分析。这种预测算法确定可以告知用户所需的稀释度或复制值策略，以便将来的实验和样品操作。
图11、12和13就用于测量感染力的示例IA的详情提供了更多细节。尽管本实施例描述了基于Radiance测量值的感染性病毒效价（感染力）的计算，但该算法可采用类似方式应用于其他系统。图11列出了该特定实施例的假设和目标。具体而言，假设包括已经识别基于Radiance测量值的感染度量，已知对于病毒/细胞组合，对照（未感染）和感染度量的最大值，以及已知校准曲线的拟合类型。IA的目标是获得一个或多个RIM值，使感染性病毒效价或感染力的准确度、精确度和信噪比最大化。应有一系列的RIM值来确保这一点，这些值的计算基于用于创建校准曲线的先前数据。该范围是针对校准曲线的被称为最佳线性动态范围（OLDR），且可按每个病毒/细胞系对其进行调整。另外，有可能在OLDR内测量多个值，然后这些值全部用于计算作为结果的感染性病毒效价或感染力。
图12显示了描述示例算法的流程图。第一步是测量样本，第一个样本通常在稀释度值范围的中间。如果RIM值在OLDR之外，则取样不同的孔，如果IM过低，则移动到较高的病毒（分析物）浓度，如果IM过高，则移动到较低的病毒（分析物）浓度。一旦IM值在OLDR内，则进行检查以确认样本是否确实在OLDR内。其原因如图13所示，图13显示的几张示例图表显示了IM随着病毒（分析物）浓度变化的变动。在某些情况下（如A.中间效价所示），IM值针对高浓度分析物保持稳定，在这种情况下，混淆单个测量值是否真正在OLDR中的可能性较小。在其他情况下（如B.高效价所示），在OLDR之外且极高浓度下，IM值可能与真正在OLDR内的值相同甚至更小。因此，作为图12中示例算法的部分，必须进行检查，以确保值在OLDR内。检查的第一部分是看是否可以使用样本的其他特性和测量值（不一定是IM的部分）来确定样本是否确实在OLDR内。这可能基于与系统的生物学相关的在先知识以及在LFC系统中可能进行的其他测量。如果有其他度量可用来确认OLDR，那么算法将根据该测试的结果继续运行。如果其他度量确认了OLDR，那么测量完成，可以计算效价（感染力）。如果其他度量不能确认OLDR，则针对下一个最高病毒（分析物）的浓度测量IM。如果没有其他度量可用于确认OLDR，则执行相同的步骤。基于较高病毒浓度的IM，算法相应地继续运行。如果IM按基于对校准曲线的先前了解而改变预期的量，则确认该值确实在OLDR中，并且测量完成。如果不是，那么该值在OLDR之外，且该值可能过高，所以下一个测量的样本的病毒浓度要低3个梯度。
图13显示了附加情况，其中描述了随着病毒（分析物）浓度变化而发生的IM变化潜在趋势或情况。除了已经描述的两种情况，图13C显示了病毒的低初始浓度，因此取样体积下的较少的值在OLDR内。而图13D显示了初始浓度过低以至于所有测得的稀释度都在OLDR之外。最后，图13E图示了初始浓度过高以至于所有值也都在OLDR之外。
图2中的示意图图示了用于本发明的背景和优选实施例的先前受专利保护的激光分析和分选技术（“RadianceTM”），该技术借引用并入本发明，其中样本衍生自中和试验并通过LFC（200）分析，中和试验含有多种患者血清病毒稀释液以及所选择的细胞。中和试验中，血清和病毒在孔板中孵育一段时间，然后与细胞结合，并进行随后孵育。孵育期后，通过RadianceTM分析样本，以确定包括（120）计算值的感染力值。传统的中和试验为了试验性能而具有使用附着细胞的固有要求。当病毒感染在悬浮液中时需要生长和感染（生理需要）的许多哺乳动物和昆虫细胞系，这可限制该模型用于中和试验研究。RadianceTM不需要平板孔板或附着细胞即可使用该技术处理和测量样本，从而能实现分析用于中和及其他感染力试验的悬浮细胞。悬浮细胞（160）的使用还潜在允许了随时间推移对同一孔进行更统一的感染和取样（例如，周期性取样）。在另一个实施例中，可以在取样之前将细胞悬浮在藻酸盐，明胶或其他类似的半固态悬浮液中，以便在延长的孵育时间内减少对组织培养板表面的附着和/或提供更能代表体内状况的物理环境（180）。悬浮液基质的潜在使用还能使稀释细胞与来自其他细胞的潜在干扰接触信号相对隔离地被感染，并且还使感染模型的生理相关性比现有技术目前所体现的生理相关性更准确。此外，RadianceTM和IA（100）允许计算病毒或其他病原体的中和百分比。在一个实施例中，RadianceTM和IA（100）可用于在TCID50或蚀斑试验（220）中自动分析和评分CPE或蚀斑形成，以及用于AAT，借此定期对受感染细胞取样以检测细菌、病毒或其他病原体的存在。在这种情况下，病毒或其他分析物不会与中和血清一起孵育，而是直接与细胞结合。
对于由病毒、细菌、原生动物或真菌感染、细胞分化、坏死、凋亡、衰老、成熟、恶性肿瘤（无论是否为癌组织、细胞、物质循环）、外泌体、抗体、蛋白质或小分子引起的变化，可使用LFC测量任意类型细胞或粒子的细胞变化。动物或植物系统中的细胞可以表现为岗哨细胞，因为它们的响应和变化是可以用LFC检测到的。细胞或其他生物粒子的生物物理、生物化学或其他特性中的变化可因如上文所述的各种外部或内部变化或损伤而发生变化。LFC检测和测量这些细微变化的能力（响应量度（Response Metric，RM））使其成为针对动物、植物、原生动物或真菌系统中微粒的生物标记物发现识别工具。这些生物标记物对于检测与疾病或生物过程相关的新细胞状态或变化的细胞状态非常重要。图23和24提供了这些概念的示例，其中人类患者患有疾病或接受治疗（例如但不限于化学、疫苗、细胞或基因疗法），且其血细胞（无论分离与否的红细胞、白细胞、血小板）、外泌体、或其他细胞或生物成分响应疾病或治疗（对于接受治疗的患者）而发生变化。LFC可以检测到这些变化，从而为未来监测形成生物标记物的基础。
如图3所示，可使用一种或多种类型和/或尺寸的内部校准物（微珠或粒子）（240），以增加实验样本表现一致的置信度。同步校准可通过监测整个板分析过程中的系统性能来提高效价性能，减少样本之间的误差和标准偏差，以便能够根据实验参数拒绝或接受数据，和/或归一化数据来确保实验间和/或实验中的一致性（无论是固定，冻干或人工）。在某些实施例中，可以在每行开始时使用校准物，或在板上使用一次校准物，这取决于样本的性质和期望的所需校准水平。本发明描述了诸如光学力、光学扭矩、光动力学、有效折射率、尺寸、形状的测量，或单独的或与细胞混合的校准物的相关测量，其中校准物是基于聚合物、玻璃、金属、合金、生物、脂质、囊泡或细胞（活的或固定的）的校准物。校准物具有与所关注粒子相关的特性但又不干扰所关注样本的数据收集。校准物可以单独使用，可以与所关注样本混合使用，也可以与不同类型的校准物混合使用，或者三者的任意组合。上述光学力和其他测量可用于校准、验证或提高系统性能，以及归一化或比较不同系统之间的数据。
一个实施例提供了基于细胞对各种浓度处理的响应生成校准曲线，然后使用这种曲线预测未知水平样本的特性的方法。这种方法包括以下步骤：添加处理和孵育样本细胞；通过基于光学力的测量值分析具有细胞的复数个样本，以及处理的已知范围来确定响应量度；基于稀释度趋势确定最佳响应量度和时间；以及使用生成数据来预测未来样本。
图14和图15显示了产生代表性校准曲线所需步骤的两个实施例。图14描述了根据具有未知效价的已知或熟知病毒样本计算效价和创建校准曲线的过程。熟知意味着计算效价的IM和孵育时间都已经根据先前实验确定下来了。在这种情况下，制作未知病毒原液的稀释液，并在孵育指定时间段之前将其添加到细胞中。然后采集细胞并用Radiance™ 或者能够进行基于光学力的测量的类似仪器分析采集的细胞。然后根据图19中描述的绝对效价/感染力算法计算效价（感染力）。一旦计算出效价，也可以通过使用确定的效价值来计算每个稀释度下的病毒浓度，以此开发校准曲线。然后该校准曲线可用于测量未来未知样本。
图15描述了根据具有未知效价样本的未知或未熟知病毒系统计算效价和创建校准曲线的过程。在这种情况下，病毒和细胞系是已知的，但IM和孵育时间是未知的。因此，必须进行实验来确定感染后的孵育时间以及用哪些LFC参数来计算感染度量。生成这些度量的方法有几种，如图15-18所示，尽管总体目标（与使用哪些参数计算IM无关）是开发与尽可能广的病毒浓度范围内的感染性病毒效价密切关联的参数（或一组参数）。图16图示了一个示例，其显示了LFC参数中的一个（尺寸归一化速度）的直方图，以及其如何随病毒添加量（MOI）而变化。在这种情况下，Vero细胞被水疱性口炎病毒（VSV）感染。如图所示，尺寸归一化速度随着MOI的增加而增加，在第一个直方图中的MOI 0.125至最后一个直方图中的MOI4.0之间变化。尺寸归一化速度加上速度的标准偏差，用于开发与MOI以及进一步与病毒浓度紧密关联的IM。图17显示了另一个病毒系统的数据，人类腺病毒5（Ad5）感染人类胚肾（HEK 293）细胞。它还图示了开发IM、偏最小二乘（PLS）分析的另一种技术。在这种情况下，为了开发多变量IM，可以向PLS计算添加所需的任意个参数。PLS模型的输入可以是宽群体统计数据，例如LFC仪器测量的任何参数的平均值、标准偏差或中位数，但也可以是更复杂的输入，例如特定参数（例如速度）的群体直方图。如图18所示，该直方图的区间（bin）可根据区间（bin）之间的标准距离来简单定义，也可根据如K-means聚类的聚类算法对其调整。在K-means聚类的情况下，可以定义区间（bin）的数量以及使用的参数。此外，一般而言，可以使用全部或部分群体来定义群体直方图。
图19描述了一种在已知感染度量和孵育时间的情况下计算未知样本效价（感染力）的特定方法。如图15所示，细胞被稀释度不同的病毒感染，然后当在指定的感染后孵育期之后分析每个样本时，计算每个样本的感染度量。病毒超过一定浓度时，基本上所有的细胞都会在第一轮感染中被感染。尽管已经开发了多种分布来描述病毒感染，但经常使用的一个具体的示例是泊松分布（Poisson distribution）。一般来说，感染度量将有高于给定病毒浓度的最大值或稳定水平。因此，在分析未知样本时，第一步是识别最大感染度量，以及感染度量何时开始降低到该最大值以下，这应该会根据病毒感染的假设分布以已知方式发生。通过了解这种分布以及细胞数量和添加的病毒体积，可以添加病毒的感染单位数量。一旦确定了最大感染度量的点，在所示的具体示例中，其在MOI 4发生，下一步是减去未感染对照细胞的基线感染度量。假设100%的细胞在最大感染点被感染，这允许通过线性缩放感染度量来计算在较低病毒浓度下感染的细胞百分比。下一步是根据感染时的细胞数量、各稀释度下未感染细胞的百分比、泊松分布（Poisson distribution）（尽管可以使用其他分布）和在该稀释度下添加的病毒体积，计算各稀释度下按感染单位/mL添加的病毒量。这种关系的方程是：
Figure 373791DEST_PATH_IMAGE001
其中P（0） 是未感染细胞的部分，n是感染时的细胞数，v是添加的原始病毒原液的体积（mL）。基于泊松分布（Poisson distribution），假设：
Figure 25352DEST_PATH_IMAGE002
作为下一步的部分，确定对于计算来说位于最佳范围内的稀释度。一般来说，在0.5%到40%感染率之间。一旦确定了这些稀释度，可根据OLDR中2-3稀释度的平均效价计算总效价（感染单位/mL）。
图20和图21显示的具体数据显示了稀释度和效价之间的关系。图20显示了稀释度和效价在线性和对数尺度上的相关性，以及针对此特定数据集的MOI和感染度量之间的关系。图21显示了基于此计算，根据5个独立实验预测的绝对效价/感染力。已知效价和预测效价之间的平均差为0.096 log10。
基于光学力测量的感染力分析也可以在诸如RadianceTM等设备上以多种程式进行。样本外壳的形式包括但不限于各种孔板数量或尺寸结构（平或U形）的孔板（例如6孔、12孔、24孔、48孔或96孔板）；用于细胞培养、流动或悬浮的带孔、空间、凹槽或其他凸起或凹陷特征的图案表面；孔板或微流体结构上、在其中或独立于其的一个或多个细胞的液滴；可容纳较大体积样本的其他容器，如培养皿、烧瓶、烧杯、生物反应器或试管。改变样本制备程式的能力使用户能够利用任意数量的多个实验设计，包括一个制剂中分析的不同样本大小、剂量/稀释度和/或样本量级。
如本领域技术人员所知，在诸如疫苗、细胞和基因治疗产品等生物产品的制造方面，一个重要的问题是在无意中引入外源因子（内源性或外源性）。使用基于光学力的测量值，例如使用LFC检测生物反应器条件培养基或生物制造中使用的其他流体中的外源因子（AA）而获得的测量值，是本发明所述新方法的一个重要能力。本发明的方法能够进行关键性质量评估，并防止细菌、病毒或其他复制/活的污染物危害药物的生产。使用LFC的先进AAT的最终目的是阻止药物产品包括可能导致患者潜在感染的成分。使用LFC测量生物制造中病毒感染力的整个过程如图4所示，其中来自生物反应器或其他制造过程的条件培养基（CM）与悬浮培养或附着培养中生长的细胞混合，然后进行孵育，孵育时间段短于现有方法中的14天或FDA规定的更长时间。使用空白样本作为对照，监测相同的细胞。作为对试验的部分优化，可对细胞暴露在条件培养基中的时间量进行调整。
在一个实施例中，使用LFC来监测发现AA时的第一道防线是将CHO或用于生物生产的另一细胞系直接用作可使用LFC对其进行测量的响应性细胞。虽然并不是所有的病毒都会在CHO细胞（和其他生产细胞系）中引起细胞病变效应，但许多病毒会在CHO细胞（和其他生产细胞系）中引起细胞病变效应，而这构成了在生产过程中实时监测CHO细胞变化的基础。用LFC测量的变量偏差可作为AA潜在污染的指标。这显示在图5中，图5给出了使用RadianceTM/LFC进行AAT的总体策略。生产中使用的CHO细胞由取样系统持续监测，该取样系统移出细胞并将其引入RadianceTM进行LFC分析，以测量其固有特性的变化，以作为监测发现AA的一种方法。如果存在AA，CPE可能是可见的，这与用于监测蛋白质生成的LFC测量变量中的任何变化不同。与在线分析相反，也可以从生物反应器移出样本，并使用LFC在RadianceTM中单独操作。可移出条件培养基（CM），将条件培养基与有浓度或无浓度的细胞一起孵育（例如，离心分离以浓缩潜在的AA）。经过一段孵育期或整孵育期期间，可以监测细胞来发现AA的迹象。RadianceTM/LFC可以分选潜在感染的细胞，并收集这些细胞以使用其他方法进行分析，上述其他方法包括光谱法（荧光法、拉曼或其他）、聚合酶链反应（PCR）、下一代测序法（NGS）、质谱法（MS）、细胞计量术（流式、荧光法、质谱法或图像法）或其他方法。
对于那些不引起CHO细胞病变效应的病毒，可使用其他细胞系来检测。图6显示了病毒的部分列表，并根据细胞病变效应和复制对它们进行了分类。这表明四个细胞系可以很好地涵盖潜在病毒：Vero细胞、幼仓鼠肾细胞（BHK）、MRC-5细胞和人肾成纤维细胞（324K）。该小组不限于这四个细胞系，可使用其他现有细胞系，还可使用针对特定易感性而修饰的新开发细胞系。
在另一实施例中，本发明所述的方法可用于基于数据的特定模式对病毒或其它AA进行分类。对此有几种方法，包括人工神经网络（ANN）、模式识别或其他预测分析方法。图22显示了使用LFC数据的具体数据示例。在此，使用ANN，借助大约17个LFC参数作为输入，将测试样本分类为三种潜在病毒之一。
在某些实施例中，为了加速分析，可同时操作具有条件培养基或另一个分析物的体外岗哨细胞系与多个细胞系。在某些实施例中，岗哨细胞是对所监测或检测的状况（病毒、细菌、支原体、感染或其他AA）易感的细胞，可以使用LFC来测量岗哨细胞的响应。图7显示了在每个孔或生物取样系统中使用多个体外岗哨细胞系的多重试验。通过参数空间或使用其他标记、荧光、可视亮场显微识别或其他方法在RadianceTM/LFC中区分细胞的能力允许一起孵育细胞和同时操作细胞，这将大大提高工作量。细胞被设计为在RadianceTM/LFC中具有不同的参数，这样它们就不会相互混淆，可以用于多重试验。通过将细胞修饰为具有不同特性来实现多重的方法包括但不限于：基于荧光的绿色荧光蛋白（GFP）、红色荧光蛋白（RFP）、黄色荧光蛋白（YFP）和并入巨噬细胞系或其他细胞系中的其他基因修饰，以便确定哪一个报告了AA引起的细胞病变或其他效应。也可以通过（以下各项仅作示例）染色剂、染料、抗体共轭微珠标记物、亲和力结合的微珠或粒子、纳米颗粒（Au、Ag、Pt、玻璃、金刚石、聚合物或其他物质）对使用LFC分析的细胞进行标记。纳米颗粒可具有不同形状（球形、四面体、二十面体、杆状或立方形等）和尺寸，以实现两个目标：1）进入细胞的方式多样，以及2）改变可使用LFC测量的光学力。
在某些实施例中，纳米颗粒可与细胞一起孵育，且对于细胞类型而言吸收将照常发生，或者替代的，纳米颗粒地吸收可由化学或物理方式（例如由电穿孔或由脂质体促进）来增强，以提高颗粒吸收百分比。细胞将与纳米颗粒和待测试病毒一起孵育，病毒吸收至细胞的差异加大将导致使用LFC测量的光学力的差异变大，从而提高病毒检测灵敏度。在替代实施例中，纳米颗粒可先病毒一起孵育，再暴露于细胞。
在另一替代实施例中，吞噬特定数量微珠的巨噬细胞在LFC中具有不同特性，但仍会报告AA的存在。此外，只能分析细胞的特定部分，例如细胞核、线粒体或其他细胞器。这不仅可以用来提高AA的性能，也可以用于提高包括感染力的其他基于细胞的试验的性能。
在各方面中，细胞可在基因上被设计为具有不同的病毒、细菌、真菌或其它AA易感性，以用作体外岗哨细胞，在一个实施例中，在与RadianceTM/LFC一起使用的小组中允许采用定制的方式进行AA检测。向细胞系中并入或从细胞系移出某些基因可能会使细胞系更易感染特定种类的病毒、细菌或其他AA，从而提供能对病原体类型选择的快速检测。这与可能使用LFC的广泛病毒识别结合，将允许对病毒、细菌或其他类型AA的更好识别。
如图8所示，本发明所述的新方法通过使用LFC/RadianceTM（810）立即进行分析，展示了AAT可直接发生在从生产生物反应器（800）移出的细胞上。因为AA在生产细胞系（CHO或其它）中不生成CPE或其他效应，所以可在微型分析生物反应器（910）中使用其他悬浮细胞系，以刺激与生产生物反应器中存在的任何AA的生长和感染。
如图9所示，在微型生物反应器（910）中生长的细胞系用例如RadianceTM （920）进行后续取样，这些细胞系可用于测试CM，来发现AA。CM的样本从大型工艺流程生物反应器（900）泵入微型生物反应器，然后可使用LFC技术（920）（例如RadianceTM）对其定期取样，以查明是否存在外源因子。如果需要，可以在生产过程中的不同时间点使用多个生物反应器进行取样。微型生物反应器在某些方面将具有光学窗口，用于对细胞系进行光谱分析，来发现感染迹象，这可用于提供对病毒感染或支原体、或朊病毒、或细菌、真菌或原生动物感染的辨识。
图10显示了巨噬细胞（吞噬外来物质的白细胞，外来物质包括病毒、细菌、营养孢子和几乎任何其他物质）在该示例中作为体外岗哨细胞，用于检测CM中存在的AA。巨噬细胞以可通过LFC检测到的独特方式对外来物质的存在作出响应，巨噬细胞还可吞噬外来物质（病毒、病毒包涵体、细菌孢子或营养细胞、外泌体，或任何其他生物物质），因此当巨噬细胞吞噬外来物质时，其通过在膜内浓缩AA，来增加折射率。这有提高LFC对AA的响应的作用，并使巨噬细胞成为LFC的方便且可检测的容器或载体，以便LFC对预浓缩的AA进行分选并将其输送到其他技术进行进一步分析。在这种应用中，排除生物生产细胞（CHO或其他细胞），使其不被巨噬细胞吞噬，避免影响试验结果，是很重要的。尽管推测CHO细胞2通常不会被吞噬，因为它们与巨噬细胞的大小相同或比巨噬细胞更大3。可供选择的其他巨噬细胞活化（已知的活化剂，如板结合物（plate binding）、板组合物（plate composition）、培养基添加剂、添加生物分子（包括脂多糖（LPS）、细菌或病毒蛋白等））可用于选择性地控制吞噬活性或表型状态，包括基因或蛋白质表达的变化。
通过使用LFC/RadianceTM测量的许多参数，包括尺寸、速度（与光学力有关）、尺寸归一化速度、细胞体积、有效折射率、偏心率、可变形性、细胞粒度、旋转、定向、光学复杂性、膜灰度或使用LFC/RadianceTM测量的其他参数，可以实现病毒、细菌或其他生物体检测的特异性。这代表了使用多变量参数空间（包括图像）来定义用于AAT筛选的病毒或其他生物体的类别。与光学光谱的耦合将提供额外的特异性，包括拉曼、荧光、化学发光、圆二色性或其他方法。
本领域技术人员将认识到，可能基于给定应用或设计的要求和规范单独或以任何组合使用这些特征或忽略这些特征。当一个实施例用到“包含”某些特征时，应当理解，该实施例能够可供替代地“由”或“基本上由”任意一个或多个特征“组成”。思考本发明的说明书和实践后，本发明的其他实施例对于本领域技术人员来说是将是显而易见的。
特别注意，在本说明书中提供一个范围的值的情况下，该范围的上限和下限之间的每个值也被具体公开。这些较小范围的上限和下限也可以独立地包括或排除在范围内。单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代，除非上下文另有明确规定。说明书和示例旨在被视为示范性说明书和示例，且不偏离本发明本质的变化在本发明的范围之内。此外，本发明中引用的所有参考文献均借引用单独地全文并入于此，因为这些参考文献的引用旨在提供有效方法来补充本发明的使能公开，并提供详细说明本领域普通技术水平的背景。

Claims (78)

1.一种使用光学力和/或流体力测量细胞对不同刺激的响应的方法，所述方法包含：
接收选择的初始样本，所述样本包含用各种已知水平的刺激物或分析物处理的生物细胞，
对所述样本进行基于光学力的测量，
基于一个或多个基于光学力或流体力的参数来开发描述细胞对所述刺激物的响应的响应量度（RM）。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述响应量度用于测量额外未知样本的响应。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含基于有在可接受目标值范围内的RM，分析所述样本的稀释度直至确定感染力的准确测量值。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，测量的所述样本为细胞核、线粒体或其他亚细胞成分或组分。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光学力和流体力基于激光力细胞学。
6.权利要求1所述的方法，其特征在于，还包含：
比较初始样本的响应量度和目标值，
基于第一样本及管控预期或已知响应的算法的结果选择第二样本，
比较所述第二样本的响应量度和目标值，
以类似方式选择后续样本，直至识别出与目标响应量度或其他的定义端点匹配的样本。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基于光学力的测量利用激光力细胞学来评估参数，所述参数包含：线性速度、尺寸、周长、尺寸（面积、直径、体积等）、每个样本的捕获细胞数量、每个样本的光束射出细胞数量、聚集体数量（基于尺寸和/或形状或其他参数）、碎片大小的粒子数量（基于尺寸和/或形状或其他参数）、归一化速度、最小x位置、光学保持时间、光学捕获时间、光学力、光学扭矩、定向、光动力学和流体动力学、有效折射率、偏心率、短轴、长轴、可变形性、偏心可变形性、短轴和长轴可变形性、延伸因子、紧凑因子、圆度因子、包括灰度特征的图像、全图像、图像成分或图像衍生参数、形态特性或其他激光力细胞学衍生参数。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物细胞包含植物细胞（藻类细胞或其他）、原核细胞（细菌）、真核细胞、酵母、真菌、霉菌细胞、红细胞、神经元、卵细胞（卵子）、精细胞、白细胞、嗜碱性粒细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、血小板、囊泡、外泌体、基质细胞、如球状体的多细胞结构、间充质细胞和诱导多能干细胞（iPSC）。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物包含病毒。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物包含细菌。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物是病毒和含有抗体的中和血清（中和试验）。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物是细菌和含有抗体的中和血清。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物是毒素和血清中能（或不能）中和所述毒素的抗体。
14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述分析物是病毒和抗病毒化合物或物质。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞存在于单细胞层、悬浮液中或嵌入基质中。
16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞通过藻酸盐、明胶或其他相似的半固态悬浮液悬浮。
17.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞从正在进行的过程中取样并直接分析，无需进一步孵育。
18.根据权利要求1所述方法，其特征在于，还包含校准物。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述校准物包含微珠、粒子、生物制剂、脂质、囊泡、活细胞或固着细胞。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，所述微珠或粒子包含有机物质、聚合物、金属、合金、玻璃、蓝宝石或金刚石。
21.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述校准物的形状为球形或非球形，尺寸为从纳米到毫米。
22.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，所述校准物与一个或多个样本混合，并同时分析。
23.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，根据细胞的亮场图像分析、荧光测量值或一个或多个基于光学力的测量值，可以将所述校准物与细胞样本区分开来。
24.一种基于细胞对各种浓度处理的响应生成校准曲线，然后使用所述校准曲线预测未知水平样本的方法：
添加处理和孵育样本细胞，
通过流体和/或基于光学力的测量值分析具有细胞以及已知处理范围的复数个样本来确定响应量度，
基于稀释度趋势确定最佳响应量度和时间，
使用生成的数据预测未来样本。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述基于光学力的测量使用激光力细胞学。
26.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，测量的所述样本为细胞核、线粒体或其他亚细胞成分或组分。
27.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述刺激为病毒感染，所述浓度为病毒效价。
28.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，可选地包含附加分析，所述附加分析包括单变量度量、总群体直方图数据、子群体直方图数据、K-means聚类，或以创建多变量度量的PLS、PCA、神经网络或其他多变量或机器学习算法。
29.一种基于生物分子的生产或其他正在进行的生物过程中的细胞变化生成校准曲线然后使用校准曲线来预测未来过程的结果的方法，所述校准曲线将细胞响应与产物或所关注细胞特性相关联：
添加处理和孵育样本细胞，
通过基于光学力的测量值分析具有细胞和已知产物浓度范围的复数个样本来确定响应量度，
基于稀释度趋势确定最佳响应量度，
使用生成的数据预测未来样本。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述基于光学力的测量使用激光力细胞学。
31.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，测量的所述样本为细胞核、线粒体或其他亚细胞成分或组分。
32.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述产物为基于病毒的产物，如疫苗、溶瘤病毒、蛋白质、核酸或病毒载体。
33.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述产物为非病毒生成的蛋白质、核酸、聚合物或脂质。
34.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述细胞特性为繁殖力、活性或生成目标分子的能力。
35.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述细胞特性为分化状态、杀死特定细胞类型的能力、活化另一种细胞类型的能力，或改变另一种细胞类型的生物化学状态的能力，所述特定细胞类型如肿瘤。
36.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，可选地包含附加分析，所述附加分析包括单变量度量、总群体直方图数据、子群体直方图数据、K-means聚类，或以创建多变量度量的PLS、PCA、神经网络或其他多变量或机器学习算法。
37.一种计算绝对效价/感染力的方法，包含：
通过基于光学力的测量值分析具有细胞和已知病毒原液的稀释度范围的复数个样本来确定感染度量；
识别显示最大感染度量的样本；
将最大感染度量设置为100%感染；
根据该稀释度下感染时的细胞数量、未感染细胞的百分比、描述感染的数学分布和添加的病毒原液体积，计算每个稀释度下添加的病毒量（感染单位/mL）；以及
仅使用在指定范围内的稀释度，预测未知样本的总效价。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述基于光学力的测量使用激光力细胞学。
39.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，测量的所述样本为细胞核、线粒体或其他亚细胞成分或组分。
40.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，描述感染的所述分布为泊松分布、贝叶斯分布或其他数学分布。
41.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，还包含在从具有未知效价样本的未知病毒系统计算效价和创建校准曲线时，确定感染后的孵育时间以及用于生成感染度量的激光力细胞学参数。
42.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，还包含如微珠或粒子的校准物，所述校准物用于提高对仪器运行一致性的置信度。
43.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，直方图、散点图和/或多变量数据全部或部分用作感染度量或更复杂感染度量的组成部分。
44.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，K-means聚类用于生成感染度量。
45.一种检测外源因子的存在的方法，包含使用基于光学力的测量，所述方法包含：
直接从生物反应器或其他容器中取样细胞，无需额外孵育，
对细胞群进行基于光学力的测量，
基于测量的细胞响应和描述正常操作条件下的过程的先前数据集的组合，检测外源因子。
46.一种检测外源因子的存在的方法，包含使用基于光学力的测量，所述方法包含：
混合测试样本和在悬浮培养或附着培养中生长的细胞，并进行孵育；以及
通过激光力细胞学检测测试样本培养基中的外源因子。
47.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，空白细胞样本用作对照，用来与测试样本进行比较。
48.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述条件培养基获自生物反应器或其他制造过程。
49.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，作为对试验的部分优化，可对细胞暴露在所述条件培养基中的时间量进行调整。
50.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述细胞是中国仓鼠卵巢（CHO）、幼仓鼠肾（BHK）或其他相关细胞或其变体。
51.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述细胞包括但不限于Vero、HEK-293、MDCK、EB66、AGE1、WI-38、MRC-5、MARC 145、CRFK、A549、HL60、U937、SK-MEL-28、HCC2429、HEp-2或其他相关细胞或其变体。
52.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述细胞是HeLa细胞。
53.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，通过添加、改变或移出遗传物质或改变细胞的生物或物理状态，对所述细胞进行化学或基因修饰以使其易于广泛或特异性地感染病毒。
54.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，通过添加、改变或移出遗传物质或改变细胞的生物或物理状态，对所述细胞进行化学或基因修饰以使其易于广泛或特异性地感染细菌。
55.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，通过添加、改变或移出遗传物质或改变细胞的生物或物理状态，对所述细胞进行化学或基因修改以使其易于广泛或特异性地感染病毒，并具有使用LFC进行测量的良好特性。
56.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，通过添加、改变或移出遗传物质或改变细胞的生物或物理状态，对所述细胞进行化学或基因修改，使所述细胞对毒素或特定分子或分子种类敏感。
57.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，所述细胞是巨噬细胞。
58.根据权利要求57所述的方法，其特征在于，用化学制品或生物化学制品处理所述巨噬细胞，以影响其吞噬活性或细胞响应。
59.根据权利要求48所述的方法，其特征在于，还包含分选和收集所关注细胞，供进一步分析。
60.根据权利要求59所述的方法，其特征在于，进一步分析包括拉曼光谱法、荧光光谱法、质谱法、聚合酶链反应、单细胞测序法、下一代测序法，以及流式、荧光、质谱或图像细胞计量术。
61.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，还包含根据基于光学力的测量数据分类所述外源因子，来确定所述外源因子的身份。
62.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，所述外源因子包含病毒、细菌、细胞内细菌、支原体、真菌、原生动物、寄生虫或小分子。
63.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，还包含分类所述因子的步骤，所述步骤包含使用人工神经网络、模式识别和预测分析工具。
64.根据权利要求63所述的方法，其特征在于，所述人工神经网络使用多个激光力细胞学参数来分类所述外源因子。
65.根据权利要求64所述的方法，其特征在于，所述多激光力细胞学参数包含：线性速度、尺寸、周长、尺寸（面积、直径、体积等）、每个样本的捕获细胞数量、每个样本的光束射出细胞数量、聚集体数量（基于尺寸和/或形状或其他参数）、碎片大小的粒子数量（基于尺寸和/或形状或其他参数）、归一化速度、最小x位置、光学保持时间、光学捕获时间、光学力、光学扭矩、定向、光动力学和流体动力学、有效折射率、偏心率、短轴、长轴、可变形性、偏心可变形性、短轴和长轴可变形性、延伸因子、紧凑因子、圆度因子、包括灰度特征的图像、全图像、图像成分或图像衍生参数、形态特性或其他激光力细胞学衍生参数。
66.根据权利要求46所述的方法，其特征在于，可同时分析所述多个细胞系以加速分析。
67.一种使用基于光学力的测量的外源因子检测方法，包含：
在微型生物反应器中培养细胞系；
从大型工艺流程生物反应器向微型生物反应器泵送条件培养基的样本；以及
通过使用基于光学力的测量检测条件培养基中的外源因子。
68.根据权利要求67所述的方法，其特征在于，所述细胞系可以是悬浮细胞系，来刺激与大型工艺流程生物反应器中存在的任何外源因子的生长和感染。
69.一种使细胞响应与生物状态关联的方法，包含：
从患者或其他生物来源接收细胞；
对来自所述患者的细胞进行基于光学力的测量；
输出基于光学力的测量的数据，其中来自被分析细胞的数据与比较数据一起用于指示生物状态。
70.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述比较数据来自不同情况下的同一患者，所述不同情况如疾病或治疗和/或时间点。
71.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述比较数据来自一个或多个不同患者。
72.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述生物状态包括感染诊断，和/或病原体的识别。
73.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述生物状态包括疗效评估，所述疗效包括疫苗或抗体功效。
74.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述生物状态包括免疫或药物抗性评估。
75.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述生物状态包括癌症、细胞转移潜能评估。
76.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，随着时间的推移从同一患者收集样本，以建立正常细胞特征的基线。
77.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述生物状态包括采用细胞或基因疗法的治疗。
78.根据权利要求69所述的方法，其特征在于，所述激光力细胞学包含参数评估，所述参数包括：线性速度、尺寸、周长、尺寸（面积、直径、体积等）、每个样本的捕获细胞数量、每个样本的光束射出细胞数量、聚集体数量（基于尺寸和/或形状或其他参数）、碎片大小的粒子数量（基于尺寸和/或形状或其他参数）、归一化速度、最小x位置、光学保持时间、光学捕获时间、光学力、光学扭矩、定向、光动力学和流体动力学、有效折射率、偏心率、短轴、长轴、可变形性、偏心可变形性、短轴和长轴可变形性、延伸因子、紧凑因子、圆度因子、包括灰度特征的图像、全图像、图像成分或图像衍生参数、形态特性或其他激光力细胞学衍生参数。
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