KR20200135822A - 레이저력 사이톨로지를 사용한 고급 생물리적 및 생화학적 세포 모니터링 및 정량화 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유체력 및 광학력-기반 측정을 사용하는 중화 어세이 및 외래성 인자 시험을 포함한 고급 감염도 어세이의 증강된 성능 및 객관적 분석을 가능하게 하는 생물리적 및 생화학적 세포 모니터링 및 정량화를 위한 지능형 알고리즘, 방법론 및 컴퓨터-구현 방법론에 관한 것이다.
Description
본 개시의 실시형태는 일반적으로 생물리적 및 생화학적 세포 모니터링 및 정량화를 위한 방법론을 생성시키는 지능형 알고리즘(IA)을 비롯하여, 광학력 및/또는 유체력을 이용하는 차동 자극에 대한 세포 반응의 측정에 관한 것이고; 일정 실시형태에서, 본 명세서의 방법론은 컴퓨터-구현된다. 본 명세서에 기술된 실시형태는 중화 어세이 및 외래성 인자 시험(AAT)을 포함한 고급 감염도 어세이의 증강된 성능 및 객관적 분석의 가능성을 포함한다. 기술된 바와 같은 방법은 광학력-기반 측정, 예컨대 레이저력 사이톨로지(LFC: laser force cytology)를 사용한다. 구체적으로, 본 개시는 중화 및 다른 기능적 어세이를 위한 다중-웰 플레이트의 자동 스캔 및 분석을 위한 자동화 알고리즘 및 감염 메트릭 계산을 설명한다. 추가로, 외래성 인자(AA) 샘플 및 배양을 모니터링, 평가, 및 정량화하는 능력을 비롯하여 이러한 어세이에 이용할 수 있는 감염 모델을 확장시키기 위해서 현탁 또는 매트릭스-포매된 세포의 사용이 가능하다.
현재, 혈청 바이러스 중화 어세이는 바이러스 감염 및/또는 복제를 억제하는 생체내-유래 면역력의 능력의 분석을 위한 최적 표준이다. 중화 어세이는 배양되는 세포에서 바이러스 감염 및/또는 후속 복제를 감소시키거나 또는 차단시키는 혈청-유래 항체의 효능을 결정하는데 사용된다. 기본적으로, 인간 또는 동물 세포는 혈청-유래 항체가 시험관내 세포 내에서 바이러스원의 감염 및/또는 복제에 대해 특이적이고 효과적인지 여부를 조사하기 위해서 감염성 바이러스원 및 생체내-유래 혈청 항체의 조합으로 시험관내에서 처리된다. 추가 분석이 이들 유형의 분석적 실험에 필요하다. 플라크 어세이 및 플라크 감소 중화 시험(PRNT) 둘 모두는 샘플의 단위 부피 당 감염성 바이러스 입자의 수를 측정하고, 후자는 또한 중화 혈청 또는 다른 인자의 결과로서 감염성 유닛의 감소를 측정한다. 그 어세이는 플레이트에서 성장하는 부착성 세포 상에 바이러스 함유 용액을 배치하는 단계, 바이러스의 자유로운 확산을 방지하기 위해 오버레이(전형적으로 아가로스)를 도포하는 단계 및 이어서 단일 감염성 바이러스 입자의 결과로서 사멸 또는 투명 세포 영역(플라크)이 발생되도록 3 내지 15일 동안 대기하는 단계를 포함한다. 유사하게, 조직 배양 감염 용량 50(TCID50)은 종결점 희석 어세이를 수행하여 비체적 중 감염성 바이러스의 농도를 측정한 것이다. TCID50 은 배양된 세포의 접종된 웰의 소정 뱃치의 50%를 감염시키는데 필요한 바이러스의 희석물로서 정의된다. 이들 방법이 수십여년간 사용되어 왔지만, 실험 간 및 작업자 간 결과의 신뢰성 및 재현성으로 그들을 수행하는데는 고유한 도전이 존재한다. 또한 현탁 세포의 분석, 많은 수의 샘플(희석 계산용)에 대한 요구, 분석을 위한 시간 소모적이고 주관적인 기술 및 세포 조작으로 인한 감염 매개변수의 변경 및/또는 세포 사멸과 같은 바람직하지 않은 결과와 관련하여 어세이의 한계가 존재한다. 많은 수의 희석이 필요한 이유 중 하나는 현재 방법론의 제한적인 동적 범위 및 현재 방법론의 높은 가변성이다.
종래 기술은 각 샘플의 최대 광학 밀도의 분석 및 플로팅과 같은 중화 역가를 결정하기 위한 다양한 농도 및 광학 밀도를 사용하는 방법 및 장비를 기술한다 (참조로 본 명세서에 편입되는 미국 공개 특허 출원 번호 제2013/0084560호). 그러나 미국 공개 특허 출원 제2013/0084560호는 오직 광학 밀도만을 사용하고 미세유체력 및/또는 광학력을 이용하지 않고, 실험의 결과를 결정하기 위해 어떤 샘플을 판독/분석해야하는가를 계산하기 위해 자동 실시간-그리드 검색 알고리즘을 이용하는 추가의 지능의 사용을 도입하지도 않는다. 다른 반자동 시스템이 미국 특허 제4,329,424호에 기술되어 있지만 이러한 방법론은 광학력이 아닌 광원을 이용하며 완전히 자동화되지 않는다.
추가로, 미국 특허 제8,778,347호가 실험 조작에 필요한 안전 예방책을 줄이기 위해서 유세포측정을 통해 모니터링되는 불활성화된 형광-표지 바이러스의 사용을 기술하고 있고, 유럽 특허 제1140974호는 슈도비리온 리포터 유전자의 사용을 기술하는데, 양쪽 참조 문헌은 어세이에서 사용되는 샘플 세포 또는 감염원의 성가신 태그화 또는 변형으로 인해 대량의 샘플을 분석해야만 한다는 점에서 제한적이다. 세포 및 감염원의 변형이 감염도 및/또는 기능을 활성화시키거나, 분화시키거나, 또는 변경시킨다는 것이 확인되었으므로, 분석을 위해 이러한 변형을 요구하는 전통적인 방법에 대한 이상적인 대안으로서 필요한 것은 무-표지 분석이다.
더 나아가서, WO1989006705가 레트로바이러스를 검출하고 중화 항체를 측정하기 위한 플라크 전달 어세이의 사용을 기술하고 있지만, 여기서의 교시는 실험자가 오직 단층 세포 유형만을 사용하도록 제한한다. 실제로, 통상의 기술자에게 충분히 공지된 바와 같이, 모든 바이러스가 단층을 형성하는 세포를 감염시키는 것은 아니다. 감염 연구 및 분석을 위해 현탁 또는 매트릭스-포매 세포의 사용을 가능하게 하여서 바이러스 감염에 대한 실험에서 더 많은 다양한 세포 유형이 사용될 수 있게 하는 방법 및 장치가 필요하다.
미국 특허 제6,778,263호와 같은 종래 기술은 보정 개체(예를 들어, 비드 또는 세포)의 사용을 기술하지만, 이러한 교시는 그들이 시간-지연-통합(TDI) 검출기에서만 보정 개체의 사용을 기술한다는 점에서 제한적이다. TDI 검출기의 기능성은 표본 흐름과의 동기화로 고체-상태 검출기(예컨대 전하-결합 장치 어레이)에서의 광자-유도 전하선의 이동에 의존하고, 보정 개체는 이 시스템의 성능을 증강시키는데 사용된다. 뿐만 아니라, 종래 기술의 보정 비드는 흐름을 보정하고 TDI 검출기를 정렬시키는 데 국한되고, 그 뿐만 아니라, 또한 굴절률(예를 들어 비드/인공 세포의 굴절률의 비율)과 같은 물리적 또는 화학적 정보의 데이터 교정, 정규화, 정량화, 또는 계산을 위한 분석 정보를 보정하는데는 사용되지 않는다. 측정 예컨대 광학력, 광학 토크, 광학 역학, 유효 굴절률, 크기, 형상, 또는 관련 측정을 기술하는 보정 개체의 사용 또는 교시가 결여되어 있고, 여기서 상기 개체는 중합체, 유리, 생물제, 지질, 소포체 또는 (생 또는 고정) 기반 세포이다. 뿐만 아니라, 또한 관심 입자와 관련되지만, 관심 샘플에 대한 데이터 수집을 방해하지 않는 성질을 갖는 보정 개체의 교시가 결여되어 있다.
생물리적 및 생화학적 프로파일과 같은 수많은 식별 양상과 관련하여 생물적 성분 및 시스템을 효율적으로 특징규명하기 위해 개선된 방법 및 장치가 필요한 것이다. 일정 실시형태에서, 이러한 방법 및 장치는 세포 유형 간, 대상체 그룹 간 또는 심지어 시험 간에, 감염도 매개변수 편차에 대해 전체 또는 격감된 세포 단리주를 조사할 수 있게 하는 바이러스-기반 백신접종 또는 약물 발굴 시험으로부터 유래된 것과 같은 샘플에 대해 적용가능한 지능형 알고리즘 및 방법론을 포함해야 한다. 다른 샘플 처리는 혈청 항체, 항바이러스 화합물, 항박테리아 화합물, 독소, 독성 산업 물질 또는 화학물 (TIMs/TICs), 기생충, 및 유전자 또는 세포 요법 산물 예컨대 CAR T-세포 및 종양용해성 백신의 평가를 포함할 수 있다. 또한 필요한 것은 다면적 광학력-기반 측정법을 사용하여 감염원의 감염도를 측정하는 데 사용되는 세포주 또는 초대 세포를 포함하여 박테리아에 대해 민감하도록 디자인된(저반응 한계치) 세포를 이용하는 박테리아에 대한 중화 어세이이다. 이러한 방법 및 장치는 이상적으로 바이오제조 액체 예컨대 조건화 배지 또는 다른 관심 샘플 예컨대 생물반응기 또는 다른 이러한 용기로부터 수득된 것들의 분석을 통해 외래성 인자 시험에 유용한 감염도 측정의 결정을 가능하게 해야 한다.
생물적 세포 및 시스템의 특징규명을 위해 현재 이용가능한 절차 및 분석 방법론 예컨대 감염도 어세이(예를 들어, 중화 어세이, TCID50 및 임상 샘플 조작)는 광범위한 희석, 잠재적으로 유해한 태그화 절차를 요구하고 매우 가변적인 결과를 산출하여 실험 간 및 실험 내 및 시험 간 비교(inter- and intra-experimental and trial comparisons)를 어렵게 만들고 후속 세포 적용을 제한한다. 본 발명은 샘플 희석, 및 궁극적으로 샘플 표본에 대한 요건을 감소시킬뿐만 아니라, 분석 동안 세포의 정규화 및 일관된 평가를 가능하게 하면서 분석에 요구되는 시간과 관련 비용을 감소시키게 되는 광학력-기반 기술(예컨대 레이저력 사이톨로지(LFC))를 사용하여 비태그화 세포 샘플의 증강된 자동화 스캐닝을 위한 지능적 분석 알고리즘을 포함하는 생물리적 및 생화학적 세포 모니터링 및 정량화와 관련된 신규 방법을 제공함으로써 이러한 한계를 극복한다. 또한, 본 개시는 분석을 위해 현탁 또는 매트릭스-포매된 세포의 사용을 가능하게 하여서, 중화 또는 다른 기능적 어세이에 대한 감염 모델의 동적 범위를 비롯하여, 샘플 및 배양물로부터 외래성 인자를 모니터링, 평가 및 정량화하는 능력을 확장시킨다. 추가로, 본 명세서에 기술된 본 발명의 방법은 컴퓨터 구현될 수 있어서 효율성, 신뢰성 및 재현성을 개선시킬 수 있다.
배경 기술, 레이저력 사이톨로지(LFC)의 기본 전제는 세포 당 기준으로 광학력 또는 압력, 크기, 속도 및 다른 매개변수를 포함하여 광학 측정을 수행하기 위해 미세유체역학 및 광-유도 압력의 조합을 활용하는 것이다. LFC가 바람직한 일 실시형태이지만, 다른 광학력-기반 기술이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 중화, TCID50, 및 바이러스 역가 및 감염도(이 둘은 서로 동의어임)의 결정을 위한 다른 어세이 및 농도 결정의 스캐닝 및 분석에 LFC의 적용은 비면역화된 혈청 단독(대조군 또는 위약)으로 처리된 세포와 비교하여 관심 바이러스 및/또는 항체를 함유하는 혈청과 공배양된 세포의 세포변성 효과를 의미하는 세포의 특징 변화를 측정하여 수행된다. 추가로, 혈청 부재 하에서 바이러스와 공배양된 세포는 초대 또는 세포 배양 공급원으로부터 유래된 세포의 감염율을 결정하는 데 사용될 수 있다. 이하에서, 중화 어세이에 대한 임의의 참조는 또한 통상의 적용으로서 TCID50 또는 플라크 어세이에 대한 참조를 포함하는 것으로 간주될 것이다.
본 발명은 샘플의 판독 및 분석과 관련된 객관적 사용 용이성을 증강시키면서 실험적 주관성, 시간 및 비용 요건과 연관된 도전을 감소시킨다. 이것은 인간 계산과 독립적으로, 희석 및/또는 역가 결정 및 요건을 스캔하고 자동으로 알고리즘으로 계산하기 위해 지능형 알고리즘(IA)를 사용하여 가능하게 되고 일정 실시형태에서, 컴퓨터-구현 과정에 의해 가능하게 된다. 지능형 알고리즘은 감염도 및 감염 메트릭스(예를 들어, 저, 중, 또는 고 감염도 범위)와 같은 가변적 결과를 포괄하는 퍼지 논리 방법을 포함하는 복잡한 명령어 세트를 포함하는 것이다. IA는 또한 샘플링에 대한 최적 그리드 검색 패턴을 더욱 잘 예측하기 위해서 현재 샘플에 보정 데이터를 적용하기 위한 신경망(NN) (역전파 또는 확률적 NN) 또는 기계 학습을 포함하는 인공 지능(AI) 개념을 포함할 수 있다. 본 명세서에 개시된 이러한 새로운 방법론은 궁극적으로 실험 당 필요한 희석수를 감소시켜서, 현재 중화 어세이 역가의 정량화에 필요한, 실험 자원, 시간 및 고도로 숙련된 개인에 의한 분석 결과에 대한 필요성을 절감할 뿐만 아니라, 리포터 유전자, 항체, 또는 다른 염색/표지화 기전의 사용을 없애준다.
본 발명은 광학력 및/또는 유체력을 사용하는 차등적 반응에 대한 세포 반응의 측정을 최적화하고, 생물적 시스템의 일관적이고 신뢰할만한 특징규명의 전달을 가능하게 한다.
도 1은 순차적 희석을 선택하고 세포 배양 웰 플레이트에서 TCID50/mL 또는 중화 백분율을 계산하고 그 결과를 감염 메트릭/mL "IM"으로 정의(120)하기 위한 지능형 알고리즘(IA) 과정 (100)의 예이다. 추가로, IA (100)는 세포의 세포변성 효과 백분율(%CPE)의 정량적 측정 및 결과의 분석을 사용하여 희석물 및 복제물 간 내삽을 가능하게 한다 (140).
도 2는 중화 (200) 및 TCID50 (220) 어세이에 대한 적용을 위해서, 광학력-기반 기술, Radiance™의 실시형태가 도 1의 이러한 개시에 기술된 바와 같이 (100)을 이용하는 샘플-함유 배양 플레이트를 어떻게 조작하는가를 기술하는 도표를 도시한다.
도 3은 내부 보정 표준으로서 사용될 수 있는 세포 샘플에 첨가되는 보정 비드의 사용을 입증하는 개략도이다.
도 4는 생물반응기 샘플링 및 외래성 인자 시험(AAT)의 분석을 위한 Radiance™ 의 용도를 도시한다.
도 5는 Radiance™ 를 사용한 AAT 평가 및 모니터링의 전략을 예시한다.
도 6은 CHO 세포에서 바이러스 CPE 및 복제의 요약표이다.
도 7은 AAT를 위해 동시에 다수의 세포 유형을 사용하는 LFC 다중복합 어세이에 대한 잠재성을 정의한다.
도 8은 대량 공정 생물반응기로부터 직접적으로 샘플링에 의한 AAT에 대한 LFC 분석을 나타낸다.
도 9는 CM이 섞인 현탁 세포를 제공하는 미니-생물반응기를 사용한 AAT에 대한 LFC 분석의 도면이다.
도 10은 AAT에 대한 LFC 마크로파지 어세이를 예시하는 개략도이다.
도 11은 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 지능형 알고리즘의 개발을 설명하는 요약을 제공한다.
도 12는 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 지능형 알고리즘을 입증하는 흐름도를 제공한다 (IM은 감염 메트릭(Infection Metric)이고, OLDR은 최적 선형 동적 범위(Optimal Linear Dynamic Range)이다).
도 13은 지능형 알고리즘이 적용되는 잠재적인 사례를 입증하는 그래프를 제공한다: 도 13(A) 중간 역가, 도 13(B) 고역가, 도 13(C) 저역가, 도 13(D) 저역가 (과희석), 및 도 13(E) 고역가 (불충분 희석).
도 14는 미지 역가의 샘플과 기지 바이러스 시스템으로부터 역가를 계산하고 보정 그래프를 생성하는 것에 대한 요약을 제공한다.
도 15 는 미지 역가의 샘플과 미지 (또는 충분히 이해되지 않음) 바이러스 시스템으로부터 역가를 계산하고 보정 그래프를 생성하는 것에 대한 요약을 제공한다.
도 16은 수포성 구내염 바이러스가 감염된 vero 세포에 대한 감염 메트릭 대 MOI를 도시한 그래프를 제공한다: 도 16 (A) MOI 0.125, 도 16(B) MOI 0.5, 및 도 16(C) MOI 4.
도 17은 부착성 HEK293 세포에서 아데노바이러스 감염(Ad5)의 다양한 측정을 입증하는 4개 그래프의 예시적인 데이터를 제공한다: 도 17(A) 크기 대 속도의 산포도. 도17(B) 속도 주파수를 도시하는 히스토그램. 도17(C) MOI 값의 범위에 대한 다변량 감염 메트릭을 도시한 막대 그래프, 및 도17(D) PFU/mL로 바이러스 역가와 다변량 감염 메트릭의 상관성을 보여주는 산포도.
도 18은 Radiance™ 데이터의 K-평균 클러스터링 분석을 제공한다.
도 19는 절대 역가/감염도를 계산하기 위한 개략도를 제공한다.
도 20은 도 20(A) 역가 (log 스케일), 도 20(B) 역가 (선 스케일), 및 도20(C) 감염 메트릭의 그래프를 제공한다.
도 21은 감염도 및 절대 역가 결과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 22는 ANN을 사용한 바이러스의 LFC 동정을 제공한다.
도 23은 위약 환자의 경우에서 백신 효능 또는 질환 검출에 대한 생물지표로서 세포 반응을 평가하기 위한 단계들을 요약한 개략도를 제공한다.
도 24는 환자 대상체의 경우에 백신 효능 또는 질환 검출에 대한 생물지표로서 세포 반응을 평가하기 위한 단계들을 요약한 개략도를 제공한다.
도 2는 중화 (200) 및 TCID50 (220) 어세이에 대한 적용을 위해서, 광학력-기반 기술, Radiance™의 실시형태가 도 1의 이러한 개시에 기술된 바와 같이 (100)을 이용하는 샘플-함유 배양 플레이트를 어떻게 조작하는가를 기술하는 도표를 도시한다.
도 3은 내부 보정 표준으로서 사용될 수 있는 세포 샘플에 첨가되는 보정 비드의 사용을 입증하는 개략도이다.
도 4는 생물반응기 샘플링 및 외래성 인자 시험(AAT)의 분석을 위한 Radiance™ 의 용도를 도시한다.
도 5는 Radiance™ 를 사용한 AAT 평가 및 모니터링의 전략을 예시한다.
도 6은 CHO 세포에서 바이러스 CPE 및 복제의 요약표이다.
도 7은 AAT를 위해 동시에 다수의 세포 유형을 사용하는 LFC 다중복합 어세이에 대한 잠재성을 정의한다.
도 8은 대량 공정 생물반응기로부터 직접적으로 샘플링에 의한 AAT에 대한 LFC 분석을 나타낸다.
도 9는 CM이 섞인 현탁 세포를 제공하는 미니-생물반응기를 사용한 AAT에 대한 LFC 분석의 도면이다.
도 10은 AAT에 대한 LFC 마크로파지 어세이를 예시하는 개략도이다.
도 11은 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 지능형 알고리즘의 개발을 설명하는 요약을 제공한다.
도 12는 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 지능형 알고리즘을 입증하는 흐름도를 제공한다 (IM은 감염 메트릭(Infection Metric)이고, OLDR은 최적 선형 동적 범위(Optimal Linear Dynamic Range)이다).
도 13은 지능형 알고리즘이 적용되는 잠재적인 사례를 입증하는 그래프를 제공한다: 도 13(A) 중간 역가, 도 13(B) 고역가, 도 13(C) 저역가, 도 13(D) 저역가 (과희석), 및 도 13(E) 고역가 (불충분 희석).
도 14는 미지 역가의 샘플과 기지 바이러스 시스템으로부터 역가를 계산하고 보정 그래프를 생성하는 것에 대한 요약을 제공한다.
도 15 는 미지 역가의 샘플과 미지 (또는 충분히 이해되지 않음) 바이러스 시스템으로부터 역가를 계산하고 보정 그래프를 생성하는 것에 대한 요약을 제공한다.
도 16은 수포성 구내염 바이러스가 감염된 vero 세포에 대한 감염 메트릭 대 MOI를 도시한 그래프를 제공한다: 도 16 (A) MOI 0.125, 도 16(B) MOI 0.5, 및 도 16(C) MOI 4.
도 17은 부착성 HEK293 세포에서 아데노바이러스 감염(Ad5)의 다양한 측정을 입증하는 4개 그래프의 예시적인 데이터를 제공한다: 도 17(A) 크기 대 속도의 산포도. 도17(B) 속도 주파수를 도시하는 히스토그램. 도17(C) MOI 값의 범위에 대한 다변량 감염 메트릭을 도시한 막대 그래프, 및 도17(D) PFU/mL로 바이러스 역가와 다변량 감염 메트릭의 상관성을 보여주는 산포도.
도 18은 Radiance™ 데이터의 K-평균 클러스터링 분석을 제공한다.
도 19는 절대 역가/감염도를 계산하기 위한 개략도를 제공한다.
도 20은 도 20(A) 역가 (log 스케일), 도 20(B) 역가 (선 스케일), 및 도20(C) 감염 메트릭의 그래프를 제공한다.
도 21은 감염도 및 절대 역가 결과를 입증하는 그래프를 제공한다.
도 22는 ANN을 사용한 바이러스의 LFC 동정을 제공한다.
도 23은 위약 환자의 경우에서 백신 효능 또는 질환 검출에 대한 생물지표로서 세포 반응을 평가하기 위한 단계들을 요약한 개략도를 제공한다.
도 24는 환자 대상체의 경우에 백신 효능 또는 질환 검출에 대한 생물지표로서 세포 반응을 평가하기 위한 단계들을 요약한 개략도를 제공한다.
본 발명은 다양한 특성을 갖는 특정 실시형태를 참조하여 설명된다. 본 발명의 범주 또는 정신을 벗어나지 않고 본 발명의 실시에서 다양한 변형 및 변이가 만들어질 수 있다는 것은 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 통상의 기술자는 이들 특성이 소정 디자인 또는 응용분야의 요건 및 사양을 기반으로 임의의 조합으로 또는 단일하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 통상의 기술자는 본 발명의 실시형태의 시스템 및 장치가 임의의 본 발명의 방법과 함께 사용될 수 있고 본 발명의 임의 방법은 본 발명의 임의 시스템 및 장치를 사용하여 수행될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 다양한 특성을 포함하는 실시형태는 또한 그러한 다양한 특성으로 이루어질 수 있거나 또는 그로 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 실시 및 명세서를 고려하여 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 제공되는 본 발명의 설명은 사실상 단지 예시이며, 따라서, 본 발명의 본질을 벗어나지 않는 변형은 본 발명의 범주 내에 포함되는 것이다.
본 발명의 적어도 하나의 실시형태를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명이 하기 설명에 기재되거나 또는 도면에 예시된 구성요소의 구성 및 배열의 상세 설명에 이의 적용을 제한하는 것이 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시형태를 할 수 있거나 또는 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에서 적용되는 어법 및 전문용어는 설명의 목적을 위한 것이며 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 기술 및 방법론이 포괄되는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하거나 또는 사용되는 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 언급된 텍스트 및 참조 문헌은 2018년 3월 20일 출원된 미국 가출원 제62/645,652호를 포함하여, 그들 전문이 편입된다.
일 실시형태에서, 광학력 및/또는 유체력을 사용하여 차동 자극에 대한 세포 반응을 측정하기 위한 방법을 제공하고, 이러한 방법은 다양한 기지 수준의 자극 또는 피분석물로 처리된 생물적 세포를 포함하는 초기 샘플의 선택물을 수용하는 단계, 샘플에 대해 광학력-기반 측정을 수행하는 단계, 하나 이상의 광학력 또는 유체력-기반 매개변수를 기반으로 자극에 대한 세포 반응을 설명하도록 반응 메트릭(RM)을 개발하는 단계를 포함한다. 일정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 방법은 컴퓨터-구현될 수 있다.
도 1에 예시된 바와 같이, 지능형 알고리즘(100)은 다수-웰 플레이트 (96-웰이 바람직한 실시형태지만, 이하에서 "웰 플레이트"는 제한없이 임의 개수의 웰, 또는 패턴(들), 또는 용기를 함유하는 웰 플레이트를 포함한 임의의 웰 플레이트를 의미하는 것으로 이해할 수 있음 (예를 들어, 도 4 참조))에 함유된 샘플의 세포 변화, 예컨대, 제한없이, 세포변성 효과(CPE) (예를 들어, 바이러스, 박테리아, 또는 독소 효과에 대한 % CPE. 대안적으로, 제한없이 유효 굴절률 또는 크기 정규화된 속도를 포함하는 임의의 LFC 측정된 매개변수가 %CPE 대신 세포 변화를 설명하는데 사용될 수 있음)를 판독 (검출), 분석 및 예측하기 위해 사용되도록 디자인된다. 일 실시형태에서, 알고리즘 소프트웨어는 출발 웰 위치에서, 세포 변화, 즉 %CPE의 기기 분석 및 검출을 개시한다. 양상에서, 이러한 출발 위치는 사용자가 경험 또는 다른 사전-프로그램된 호밍(homing) 좌표를 기반으로 선택할 수 있다. 실시형태에서, 알고리즘은 이어서 관찰된 데이터, 데이터 추세, 및/또는 이전에 소프트웨어 로딩된 실험 레이아웃을 기반으로 더 높거나 더 낮은 희석의 웰을 자동으로 선택하게 된다. 구체적으로, 샘플링은 사용자 입력 또는 이전 지식을 기반으로 중간 희석 또는 미처리 대조군에서 시작된다. 분석하려는 다음 샘플은 초기 샘플의 정량적 결과를 기반으로 선택된다. 보다 구체적으로, 감염도 측정의 경우에, 이것은 %CPE를 의미할 수 있다. 따라서, %CPE가 표적 감염도 값 (예를 들어, 50%)보다 높으면, 분석되는 다음 샘플은 더 큰 희석 배율을 함유하는 것이 될 것이다 (예를 들어, 바이러스 또는 중화제와 같은 피분석물의 보다 낮은 농도). 이동되는 간격 크기는 측정 규모에 따라 좌우된다. 예를 들어, 최대치 (100%) 근처의 CPE 값은 2 내지 3 희석을 더 낮추는 것을 보장할 수 있는 한편, 바람직한 값 (50%)에 가까운 CPE 값은 오직 하나 (1) 희석을 더 낮추는 것이 요구될 것이다. 반대로, 초기 측정이 표적값에 비해 낮으면, 측정되는 다음 샘플은 더 작은 희석 배율 (더 높은 농도의 피분석물)이게 될 것이고, 간격의 규모는 다시 측정 규모에 기반하게 된다. 샘플링된 후속 희석물은 표적 희석(들)이 확인되거나 또는 (전체 또는 부분) 플레이트가 분석될 때까지 유사한 방식으로 선택된다. 이후에, 동일 희석의 복제물은 감염도의 정확한 측정이 결정될 수 있을 때까지 샘플링된다. 예상되는 감염도 또는 피분석물 수준의 제한된 사전 지식 또는 이해가 존재하면, 샘플링은 표적 감염도가 확인될 때까지 측정을 기반으로 중간에서 시작될 수 있고 자동 방식으로 진행될 수 있다. 이것은 궁극적으로 샘플의 감염도를 정확하게 측정하는데 요구되는 희석물 및/또는 복제물의 수를 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 제공하는 신규 방법론은 전통적인 중화 어세이가 요구하는 수와 비교하여, 필요한 샘플 희석물의 수를 감소시키고, 또한 지능형 알고리즘의 적용 및 레이저력 사이톨로지(LFC)와 같은 광학력-기반 기술의 사용에 의해 제공된 더 큰 동적 범위를 통해 웰 플레이트 분석에 필요한 시간을 감소시킨다. 일 실시형태에서, 광학력-기반 기술은 레이저력 사이톨로지(LFC)를 포함하지만, 임의의 다른 광학력-기반 기술은 제한없이 광학 크로마토그래피, 교차형 광학 크로마토그래피, 레이저 분리, 직교 레이저 분리, 광학 집게, 광학 트래핑, 홀로그램 광학 트래핑, 광학 조작, 및 레이저 방사 압력을 포함하여, 본 명세서에 기술된 바와 같이 본 발명과 함께 사용될 수 있다.
대안적인 실시형태에서, IA(100)는 다양한 시점, 희석, 또는 하나 이상의 샘플링 시점에 시약 변동성을 포함하여, 일정 조건에 대해 자동으로 검색하도록 설정될 수 있다. 따라서, IA(100)는 최저 희석을 모니터링할 수 있고 농도 및 샘플링 요건을 외삽 및 예측할 수 있으며, 광학력-측정(즉, LFC)을 사용하여 다음 분석에 대한 추정을 계산하고 감염 메트릭/mL ("IM") (120)의 계산을 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 감염 메트릭 ("IM") 또는 반응 메트릭 ("RM")은 세포 개수, 속도 (비행 시간 동안 속도 및 위치의 변화 포함), 광학력, 크기, 형상, 종횡비, 편심성, 변형성, 배향, 회전 (주파수 및 위치), 굴절률, 부피, 거칠기, 세포 복잡성, 대비 기반 이미지 측정 (예를 들어, 공간 주파수, 시간 또는 공간의 강도 변동), 3-D 세포 이미지 또는 슬라이스, 레이저 산란, 형광, 라만 또는 다른 분광 측정 및 이의 임의 조합 또는 세포 변화도 또는 샘플 중 바이러스/박테리아 감염도를 반영하는 세포 또는 개체군에 대해 이루어지는 다른 측정을 고려하는 특정 매개변수 또는 값을 의미한다. 일 실시형태에서, Radiance™ (LumaCyte™ (Charlottesville, Virginia, USA)에서 입수가능한 레이저력 사이톨로지 기기)와 같은 장치는 광학력-기반 측정을 수행하는데 사용되지만, 통상의 기술자에게 자명한 바와 같이, LFC를 포함하는 광학력 측정을 할 수 있는 다른 장치 및 방법이 본 발명과 함께 사용하는데 적합할 것이다. (명확함을 위해서 감염 메트릭(IM) 및 반응 메트릭(RM)은 측정이 수행되는 유형에 따라서 상호교환적으로 사용될 수 있음.)
도 1에서 (120)으로 라벨링되는, 하나의 IA 실시형태는 측정된 Radiance™ 특정 매개변수가 감염시 어떻게 변화되는가를 결정하기 위해서 다양한 수준의 감염도로 다수의 샘플을 측정하여 개발된다. 도 1에 표시된 바와 같이, LFC 기기 ("Radiance™")-연관 소프트웨어는 이들 매개변수가 세포당 기반으로 측정될 때 각 샘플에 대해 (120)을 자동으로 계산한다. (120)은 전통적인 TCID50/mL, pfu/mL, 감염 다중도(MOI) 또는 다른 기지의 감염값에 해당될 수 있고 또한 세포 개체군에 대한 추가의 정량적 정보를 함유한다. 세포-당 다수-매개변수 분석은 세포 개체군 및 바이러스 균주 감염도 비율 간 훨씬 더 민감한 이동 또는 편차를 검출할 수 있는 데이터를 산출한다. 다양한 세포주 및 바이러스 균주에 대한 (120)의 적용은 또한 대안적으로, 혈중 약물 또는 백신-유도 항체의 수준이 세포에 대한 효과로서 조사될 수 있는 백신접종 또는 백신 미접종 샘플 유래 혈청 및 감염 모델 간 유사성 및 또는 상관 분산에 대해 정규화될 수 있다. 게다가, 세포의 박테리아 또는 바이러스 감염에 의한 결과는 추세 및 세포 개체군 비교를 위해 다양한 연구들 전반 및 연구들 간에 추가로 비교될 수 있다.
%CPE의 정량적 측정(140)을 사용한 희석물 및 복제물 간 내삽은 관찰된 현상과 직접적으로 상관있는 고도로 정확하고 민감한 분석을 위한 인터스티셜 로그(interstitial log) 또는 지수 데이터점을 결정하기 위해 분석되는 웰로부터 데이터를 외삽하기 위해 (100)을 조정하여 만들어질 수 있다. 이러한 예측 알고리즘 결정은 향후 실험 및 샘플 조작을 위한 바람직한 희석 또는 복제 전략을 사용자에게 알릴 수 있다.
도 11, 12, 및 13은 감염도를 측정하기 위해서 실시예 IA의 상세 설명에 관한 추가 상세 사항을 제공한다. 이러한 실시형태는 Radiance 측정을 기반으로 감염성 바이러스 역가 (감염도)의 계산을 기술하지만, 알고리즘은 유사한 방식으로 다른 시스템에 적용될 수 있다. 도 11은 이러한 특정 실시형태에 대한 전제(Assumption) 및 목표를 열거한다. 구체적으로, 전제는 Radiance 측정 기반 감염 메트릭이 확인되어지고, 감염 메트릭에 대한 대조군 (미감염) 및 최대 값이 바이러스/세포 조합에 대하여 알려져 있고, 보정 그래프에 대한 적합화 유형이 알려져 있다는 것을 포함한다. IA의 목표는 감염성 바이러스 역가 또는 감염도에 대한 정확도, 정밀도, 및 신호 대 노이즈 비율을 최대화하는 RIM의 값 또는 값들을 수득하는 것이다. 이를 보장하는 RIM에 대한 값들의 범위가 있어야 하고 이는 보정 그래프를 생성시키기 위해 사용된 이전 데이터를 기반으로 계산된다. 상기 범위는 보정 그래프에 대한 최적 선형 동적 범위(OLDR)를 말하고 바이러스/세포주 당 기반으로 조정될 수 있다. 또한, 다수의 값이 상기 OLDR 내에서 측정되고 이어서 모두가 최종 감염성 바이러스 역가 또는 감염도를 계산하는 데 사용되는 것이 가능할 수 있다.
도 12는 예시적인 알고리즘을 설명하는 흐름도를 도시한다. 제1 단계는 샘플을 측정하는 것이고, 첫번째는 일반적으로 희석값의 중간 범위 내에 존재한다. RIM의 값이 OLDR 밖에 있으면, 상이한 웰을 샘플링하고, IM이 너무 낮으면 더 높은 농도의 바이러스 (피분석물)로 이동하고, IM이 너무 높으면 더 낮은 농도의 바이러스 (피분석물)로 이동한다. IM의 값이 OLDR 내에 있다면, 샘플이 진짜로 OLDR 내에 있는지 여부를 확인하기 위해 검토가 이루어진다. 이에 대한 이유는 도 13에 예시되어 있는데, 바이러스 (피분석물)의 농도가 변화되면서 IM의 변동을 보여주는 몇몇 예시적인 그래프를 도시한다. 일부 경우 (A. 중간 역가로 도시)에서, 고농도의 피분석물에 대한 IM 평탄역의 값, 이 경우에 단일 측정값이 실제로 OLDR 내에 있는지 여부에 관해서 혼동될 가능성은 덜할 것이다. 다른 경우 (B. 고역가로 도시)에서, OLDR 밖에 있는 매우 고농도에서의 IM에 대한 값은 실제로 OLDR 내에 있는 값과 동일할 수 있거나 또는 심지어 그 값 미만일 수 있다. 따라서, 값이 OLDR 내에 있다는 것을 보장하기 위해서 도 12의 예시적인 알고리즘의 일부로서 검토가 이루어져야만 한다. 검토의 제1 부분은 반드시 IM의 일부일 필요는 없는 샘플의 다른 특징 및 측정이 샘플이 진짜로 OLDR 내에 있는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있는지 여부를 확인하는 것이다. 이것은 잠재적으로 LFC 시스템에서 만들어진 다른 측정을 비롯하여 시스템의 생물학과 관련된 이전 지식을 기반으로 할 수 있다. 다른 메트릭스가 OLDR을 확인하는데 이용가능하다면, 알고리즘은 그 시험의 결과에 따라서 진행된다. 다른 메트릭스가 OLDR을 확인한다면, 측정은 완료되고 역가 (감염도)를 계산할 수 있다. 다른 메트릭스가 OLDR을 확인할 수 없으면, IM은 다음 최고 농도의 바이러스 (피분석물)에 대해 측정된다. OLDR을 확인하기 위해서 이용가능한 다른 메트릭스가 존재하지 않는다면 동일한 단계가 수행된다. 더 높은 바이러스 농도의 IM을 기반으로, 알고리즘이 그에 따라 진행된다. 보정 그래프의 이전 지식을 기반으로 기대량만큼 IM이 변화하면, 그 값은 진짜로 OLDR 내인 것으로 확인되고 측정은 완료된다. 그렇지 않으면 값은 OLDR 밖이고 아마도 너무 높아서, 측정되는 다음 샘플은 바이러스 농도가 3단계 더 아래이다.
추가 경우는 바이러스 (피분석물) 농도의 변화에 따른 IM에서의 변동의 가능한 추세 또는 경우를 설명하는 도 13에 도시된다. 이미 설명된 2개 경우 이외에도, 13C는 샘플링된 부피에서 더 적은 값이 OLDR 내에 존재하도록 하는 바이러스의 낮은 초기 농도를 도시하는 반면, 13D는 초기 농도가 너무 낮아서 측정된 모든 희석물이 OLDR 밖에 있다는 것을 보여준다. 마지막으로, 13E는 초기 농도가 너무 높아서 모든 값이 역시 OLDR 밖에 존재한다는 것을 예시한다.
도 2의 개략도는 샘플이 다수 환자 혈청-바이러스 희석물 및 선택 세포를 함유하는 중화 어세이로부터 유래되고 LFC (200)로 분석된 배경 및 바람직한 실시형태 적용을 위해, 참조로 본 명세서에 편입된 이전에 특허받은 레이저 분석 및 분류 기술 ("Radiance™")을 예시한다. 중화 어세이의 경우, 혈청 및 바이러스는 세포와의 조합 및 후속 인큐베이션 이전의 소정 기간 동안 웰 플레이트에서 인큐베이션된다. 인큐베이션 기간 이후에, 샘플은 (120)의 계산을 포함하는 감염도 값을 결정하기 위해서 Radiance™ 에 의해 분석된다. 전통적인 중화 어세이는 본질적으로 어세이 성능을 위해 부착성 세포의 사용을 요구한다. 바이러스는 성장 및 감염에 현탁 (생리적 요구) 중인 것을 요구하는 많은 포유동물 및 곤충 세포주를 감염시키므로, 이는 중화 어세이 연구에서 사용되는 모델을 제한할 수 있다. Radiance™ 는 샘플을 처리하고 측정하기 위한 기술에 편평 웰 플레이트 또는 부착 세포를 요구하지 않아서 중화 및 다른 감염도 어세이에 대해 현탁 세포의 분석을 가능하게 한다. 현탁 세포의 사용 (160)은 시간 경과에 따라 잠재적으로 동일 웰의 보다 균일한 감염 및 샘플링 (예를 들어, 주기적 샘플링)을 더욱 가능하게 한다. 다른 실시형태에서, 세포는 연장된 인큐베이션 시간 동안 조직 배양 플레이트 표면과의 부착성을 감소시키고/시키거나 생체내 조건을 보다 대표하는 물리적 환경을 제공하기 위해 샘플링 이전에 알기네이트, 젤라틴 또는 다른 유사한 반고형 현탁액에 현탁될 수 있다 (180). 현탁 매트릭스의 잠재적 사용은 또한 희석 세포를 다른 세포로부터의 잠재적 간섭 접촉 신호로부터 상대적으로 고립되어 감염될 수 있게 하고 현재 종래 기술에 의해 구현되는 것에 비해서 감염 모델에 대해 보다 정확한 생리적 관련성을 가능하게 한다. 게다가, Radiance™ 및 IA (100)는 바이러스 또는 다른 병원체에 대한 중화율을 계산할 수 있게 허용한다. 일 실시형태에서, Radiance™ 및 IA (100)는 AAT 뿐만 아니라 TICD50으로 CPE 또는 플라크 형성 또는 플라크 어세이 (220)를 자동으로 분석하고 채점하는데 이용될 수 있어서 감염된 세포는 박테리아, 바이러스 또는 다른 병원체의 존재를 검출하기 위해서 주기적으로 샘플링된다. 이러한 경우에, 바이러스 또는 다른 피분석물은 중화 혈청과 인규베이션되지 않으며 그 대신에 세포와 직접 배합되게 된다.
세포 변화의 측정은 바이러스, 박테리아, 원충, 또는 진균 감염, 세포 분화, 괴사, 아폽토시스, 노화, 성숙화, 악성 종양 (암성 조직, 세포, 순환 또는 비순환 물질), 엑소솜, 항체, 단백질, 또는 소형 분자로 인한 임의 유형의 세포 또는 입자의 변화에 대해서 LFC를 사용하여 가능하다. 동물 또는 식물 시스템 내에서 세포는 그들이 LFC를 사용해 검출가능한 방식으로 반응하고 변화한다는 점에서 센티넬 (sentinel) 세포로서 행동할 수 있다. 세포 또는 다른 생물적 입자의 생물리학적, 생화학적 또는 다른 성질의 변화는 상기 기술된 것과 같은 다양한 외부 또는 내부 변화 또는 손상으로 인해 변화될 수 있다. 이러한 미세한 변화를 검출하고 측정하는 LFC의 능력 (반응 메트릭 (RM))은 동물, 식물, 원충, 또는 진균 시스템에서 미립자에 대한, 생물지표 발굴 및 동정을 위한 도구일 수 있다는 것이다. 이들 생물지표는 질환 또는 생물적 과정과 관련된 새롭거나 또는 변화된 세포 상태를 검출하는데 중요하다. 도 23 및 24는 이들 개념의 예를 제공하고 여기서 인간 환자는 질환을 갖고 있거나 또는 치료 (예를 들어 제한없이 화학물, 백신, 세포 또는 유전자 요법)를 받고, 그 및 질환 또는 치료 (치료 환자의 경우)에 대응하여 그들 혈액 세포 (분리 또는 미분리된, 적혈 세포, 백혈 세포, 혈소판), 엑소솜, 또는 다른 세포 또는 생물적 성분이 변화한다. LFC는 이들 변화를 검출할 수 있고, 그 다음으로 향후 모니터링을 위한 생물지표의 기초를 형성할 수 있다.
내부 보정 개체 (비드 또는 입자) (240)의 하나 이상의 유형 및/또는 크기의 사용은 도 3에서 처럼, 실험 샘플이 일관적인 방식으로 거동한다는 신뢰를 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 동시 보정은 플레이트 분석 전반에서 시스템 성능을 모니터링하여 증가된 역가 측정 성능을 가져올 수 있고/있거나, 샘플 간 오류 및 표준 편차를 감소시킬 수 있고/있거나, 실험 매개변수에 따라서 데이터를 거부 또는 수락할 수 있고/있거나 실험 간 및/또는 실험 내 일관성 (고정, 동결-건조 또는 인공이건 간에)을 보장하도록 정규화될 수 있다. 보정 개체는 일정 실시형태에서, 샘플의 성질, 및 필요한 바람직한 보정 수준에 따라서, 플레이트 상에서 모든 열의 시작 시에, 또는 1회만 사용될 수 있다. 본 발명은 측정 예컨대 광학력, 광학 토크, 광학 역학, 유효 굴절률, 크기, 형상, 또는 단독으로 또는 세포와 혼합하여 보정 개체의 관련 측정을 설명하고, 여기서 상기 개체는 중합체, 유리, 금속제, 합금, 생물제, 지질, 소포체 또는 (생 또는 고정) 기반 세포이다. 보정 개체는 관심 입자와 관련되지만, 관심 샘플 상에서 데이터 수집을 방해하지 않는 성질을 가져야 한다. 보정 개체는 단독으로, 관심 샘플과 혼합하여, 상이한 유형의 보정 개체와 혼합하여, 또는 3개의 임의 조합으로 사용될 수 있다. 상기 기술된 바와 같은 광학력 및 다른 측정은 시스템의 성능을 보정, 검증, 또는 증강시킬 뿐만 아니라, 상이한 시스템에 걸쳐 데이터를 정규화 또는 비교하는 데 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 다양한 농도의 처리제(treatments)에 대한 세포 반응을 기반으로 보정 그래프를 생성시킨 후 이러한 그래프를 사용하여 미지 수준의 샘플의 특징을 예측하기 위한 방법들이 제공된다. 이러한 방법은 처리제를 첨가하는 단계 및 샘플 세포를 인큐베이션시키는 단계, 반응 메트릭을 결정하기 위해서 세포 및 기지 범위의 처리제를 갖는 복수의 샘플을 광학력-기반 측정에 의해 분석하는 단계, 희석에 따른 추세를 기반으로 최적 반응 메트릭 및 시간을 결정하는 단계, 및 생성된 데이터를 사용하여 향후 샘플을 예측하는 단계를 포함한다.
대표적인 보정 그래프를 생성시키는 데 필요한 단계의 2개 실시형태가 도 14 및 15에 도시된다. 도 14는 미지 역가의 샘플과 기지 또는 충분히 이해된 바이러스 샘플로부터 역가를 계산하고 보정 그래프를 생성시키는 과정을 기술한다. 충분히 이해된다는 것은 역가를 계산하기 위한 IM 및 인큐베이션 시간이 이전 실험을 기반으로 확립되었다는 것을 의미한다. 이러한 경우에, 미지 바이러스 스톡의 희석물을 만들고, 이를 시간의 지정된 기간 동안의 인큐베이션 전에 세포에 첨가한다. 이어서, 세포를 회수하고 Radiance™ 또는 광학력 기반 측정을 할 수 있는 유사한 기기를 사용해 분석한다. 이어서, 역가 (감염도)는 도 19에 기술된 절대 역가/감염도 알고리즘을 기반으로 계산된다. 역가가 계산되면, 또한 보정 그래프가 각각의 희석물에서의 바이러스 농도를 계산하기 위해 결정된 역가 값을 사용해 개발될 수 있다. 이어서 이러한 보정 그래프는 향후 미지 샘플의 측정에 사용될 수 있다.
도 15는 미지 역가의 샘플과 미지 또는 충분히 이해되지 않은 바이러스 시스템으로부터 역가를 계산하고 보정 그래프를 생성시키는 과정을 기술한다. 이러한 경우에, 바이러스 및 세포주는 알려져 있지만, IM 및 인큐베이션 시간은 알려져 있지 않다. 따라서, 감염 후 인큐베이션 시간을 비롯하여, 어떠한 LFC 매개변수를 사용하여 감염 메트릭을 계산하는가를 결정하기 위해서 실험이 수행되어야 한다. 도 15-18에 기술된 바와 같이, 이들 메트릭스를 생성시키기 위한 몇몇 방식이 존재하지만, 전체 목표는, IM을 계산하는데 어떠한 매개변수가 사용되는가와 무관하게, 가능한 광범위한 바이러스 농도에 걸쳐 감염성 바이러스 역가와 충분히 상관있는 매개변수 (또는 매개변수의 세트)를 개발하는 것이다. 이의 예는 도 16에 예시되어 있는데, LFC 매개변수 중 하나, 크기 정규화된 속도, 및 첨가된 바이러스의 양 (MOI)에 따라 어떻게 변화되는가의 히스토그램을 도시한다. 이러한 경우에, Vero 세포를 수포성 구내염 바이러스 (VSV)로 감염시켰다. 도시된 바와 같이, 크기 정규화된 속도는 첫번째 히스토그램에서의 MOI 0.125에서 마지막 히스토그램에서의 MOI 4.0까지의 범위로, MOI가 증가함에 따라, 증가된다. 속도의 표준 편차와 결합된, 크기 정규화된 속도는 MOI 및 그에 따른 바이러스 농도와 강력하게 상관있는 IM을 개발하는 데 사용되었다. 도 17은 인간 배아 신장 (HEK 293) 세포를 감염시키는, 다른 바이러스 시스템, 인간 아데노바이러스 5 (Ad5)로부터의 데이터를 도시한다. 또한 IM을 개발하기 위한 다른 기술, 부분 최소 제곱 (PLS) 분석을 예시한다. 이러한 경우에, 필요한 만큼 많은 매개변수가 다변량 IM을 개발하기 위해서 PLS 계산에 추가될 수 있다. PLS 모델에 대한 입력은 모집단 전체 통계학, 예컨대 LFC 기기에 의해 측정되는 임의 매개변수에 대한 평균, 표준 편차, 또는 중앙값일 수 있을 뿐만 아니라, 또한 보다 복잡한 입력, 예컨대 속도와 같은 특정 매개변수에 대한 모집단 히스토그램일 수 있다. 이러한 히스토그램의 빈은 빈 사이의 표준 거리를 기반으로 단순히 정의될 수 있거나, 또는 도 18에 도시된 바와 같은, K-평균 클러스터링과 같은 클러스터링 알고리즘을 기반으로 조정될 수 있다. K-평균 클러스터링의 경우에, 빈의 개수를 비롯하여 사용되는 매개변수가 정의될 수 있다. 또한, 일반적으로, 전체 모집단 또는 오직 이의 일부분이 모집단 히스토그램을 정의하는데 사용될 수 있다.
도 19는 감염 메트릭 및 인큐베이션 시간이 이미 알려져 있는 경우에 미지 샘플의 역가 (감염도)를 계산하는 일 특정 방법을 기술한다. 도 15에 기술된 바와 같이, 세포는 바이러스의 상이한 희석물로 감염되고 이어서 감염 메트릭은 지정된 감염후 인큐베이션 기간 이후에 분석되어서 각 샘플에 대해 계산된다. 바이러스의 일정 농도 초과에서, 본질적으로 모든 세포는 첫번째 라운드의 감염 동안 감염되어야 한다. 다수의 분산이 바이러스 감염을 설명하기 위해 개발되었지만, 자주 사용되는 하나의 특정예는 푸아송 (Poisson) 분산이다. 일반적으로, 감염 메트릭은 제공된 바이러스 농도 초과의 평탄역 또는 최대값을 가질 것이다. 따라서, 미지 샘플의 분석 시에 제1 단계는 최대 감염 메트릭을 비롯하여 또한 바이러스 감염에 대해 추정된 분포를 기반으로 기지 방식으로 발생되어야 하는, 그 최대값 미만으로 감염 메트릭이 감소되기 시작할 때를 확인하는 것이다. 이러한 분포와 첨가되는 바이러스의 부피 및 세포의 수를 이해함으로써, 바이러스의 감염성 유닛의 수가 추가될 수 있다. 최대 감염 메트릭의 지점이 결정되면, 이것이 MOI 4에서 일어남을 보여주는 특정한 예에서, 다음 단계는 감염되지 않은 대조군 세포의 기본 감염 메트릭을 차감하는 것이다. 세포의 100%는 직선 방식으로 감염 메트릭을 스케일링하여 보다 낮은 바이러스 농도에서 감염된 세포의 백분율의 계산을 허용하는, 최대 감염 지점으로서 감염된다고 가정된다. 다음 단계는 감염 시점에 세포의 수, 각 희석에서 미감염된 세포의 백분율, (다른 분포가 사용될 수도 있지만) 푸아송 분포, 및 그 희석에서 첨가된 바이러스의 부피를 기반으로, 각 희석에서 감염성 유닛/mL로 첨가되는 바이러스의 양을 계산하는 것이다. 이 관계에 대한 방정식은 다음과 같다:
여기서 P(0)는 미감염된 세포의 분율이고, n은 감염 시 세포의 수이며, v는 첨가되는 본래 바이러스 스톡의 부피 (mL)이다. 푸아송 분포를 기반으로, 다음의 식을 가정한다:
다음 단계의 일부로서, 계산을 위한 최적 범위 내에 속하는 희석물을 결정한다. 일반적으로, 이것은 0.5% 내지 40% 감염이다. 이들 희석물을 결정하면, 전체 역가 (감염성 유닛/mL)는 OLDR 내 2-3 희석물로부터의 평균 역가를 기반으로 계산될 수 있다.
희석과 역가 사이의 관계를 보여주는 구체적인 데이터는 도 20 및 21에 도시되어 있다. 도 20은 선 및 로그 스케일 둘 모두 상에서 희석 및 역가 간 상관성을 비롯하여 이러한 특정 데이터 세트에 대한 감염 메트릭 및 MOI 간 관계를 보여준다. 도 21은 이러한 계산을 기반으로 5회 독립 실험으로부터 예측된 절대 역가/감염도를 보여준다. 기지 및 예측 역가 간 평균 편차는 0.096log10 이다.
광학력-측정 기반의 감염도 분석이 또한 Radiance™과 같은 장치 상의 다수 포맷으로 가능하다. 샘플 수용의 형태는 제한없이 6, 12, 24, 48, 또는 96 웰 플레이트와 같은 다양한 웰 플레이트 수 또는 크기 구성 (평면 또는 U-바닥)의 웰 플레이트, 웰, 공간, 홈, 또는 세포 배양을 위한 다른 융기형 또는 톱니형 피처를 갖는 패턴화 표면, 흐름 또는 현탁, 웰 플레이트 또는 미세유체 구조 위, 그 내부 또는 그와 독립적인 하나 또는 다수 세포의 액적, 다른 용기 예컨대 배양 디쉬, 플라스크, 비이커, 생물반응기 또는 대량 부피의 샘플을 수용할 수 있는 튜브를 포함한다. 샘플 제조의 포맷을 변경시키는 능력은 사용자가 다양한 샘플 크기, 용량/희석물 및/또는 1회 제조 시 분석되는 샘플의 규모를 포함하여, 임의 수의 다수 실험 디자인을 이용할 수 있게 한다.
통상의 기술자에게 공지된 바와 같이, 백신 및 세포 및 유전자 요법 제품과 같은 생물적 제품의 제조와 연관된 심각한 우려 중 하나는 (내생성 또는 외생성) 외래성 인자의 우연한 유입이다. 생물반응기 조건 배지 또는 바이오제조에서 사용되는 다른 유체에서 외래성 인자 (AA)를 검출하기 위해 LFC를 사용해 수득되는 것과 같은, 광학력-기반 측정의 사용은 본 명세서에 기술된 신규 방법론의 중요한 능력이다. 본 발명의 방법은 약물 물질의 생산을 위태롭게 하는 박테리아, 바이러스, 또는 다른 복제/생존 오염원의 예방 및 품질 핵심 평가를 가능하게 한다. LFC를 사용하는 고급 AAT의 궁극적인 목표는 환자의 잠재적 감염을 초래할 수 있는 약물 생성물 중 가능한 내포를 차단하는 것이다. 바이오제조에서 바이러스 감염도의 측정을 위한 LFC의 사용의 전체 과정은 도 4에 도시되어 있는데 여기서 생물반응기 또는 다른 제조 과정으로부터의 조건 배지 (CM)는 현탁 또는 부착 배양으로 성장된 세포와 혼합되고 현재 FDA 지침 하에서 14일 이상이 걸리는 현재의 방법에 비해 더 짧은 기간 동안 인큐베이션된다. 대조군으로서 블랭크 샘플을 사용해 동일한 세포를 모니터링한다. 세포가 조건화 배지에 노출되는 시간량은 어세이 최적화의 일부로서 조정될 수 있다.
일 실시형태에서, AA에 대한 모니터링을 위해 LFC를 사용할 때 1차 방어선은 LFC를 사용해 측정할 수 있는 반응성 세포로서 직접적으로 생물생성에 사용되는 다른 세포주 또는 CHO의 사용이다. 모든 바이러스가 CHO 세포 (및 다른 생산 세포주)에서 세포변성 효과를 초래하지 않지만, 많은 것들이 그러하고, 이것이 생산 동안 CHO 세포에서 변화의 실시간 모니터링을 위한 근간을 형성한다. LFC를 사용해 측정된 변수의 편차는 AA에 의한 잠재적 오염의 지표로서 사용될 수 있다. 이는 도 5에 도시되어 있으며 여기서 Radiance™ /LFC를 사용한 AAT를 위한 전반적인 전략이 제공된다. 생산에 사용되는 CHO 세포는 세포를 제거하고 AA에 대해 모니터링하기 위한 방식으로서 그들 고유 성질의 변화를 측정하기 위한 LFC 분석용 Radiance™에 그들을 도입시키는 샘플링 시스템을 통해 일정하게 모니터링된다. CPE는 AA가 존재하면 가시화될 수 있고 이것은 단백질 생산을 모니터링하기 위해 사용되는 LFC 측정 변수에서의 임의 변화와 상이하다. 샘플은 또한 생물반응기로부터 제거될 수 있고 온-라인 분석과 반대로 LFC를 사용하는 Radiance™ 에서 개별적으로 작업될 수 있다. 조건 배지 (CM)는 농축 (예를 들어, 잠재적 AA를 농축하기 위한 원심분리) 존재 또는 부재로 세포로부터 제거되어 세포와 인큐베이션될 수 있다. 인큐베이션 기간 이후 또는 인큐베이션 기간 전체에서, 세포는 AA의 징후에 대해 모니터링될 수 있다. Radiance™ /LFC는 잠재적으로 감염된 세포를 분류해 낼 수 있고 그들을 분광분석 (형광, 라만 등), 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 차세대 시퀀싱 (NGS), 질량 분광분석 (MS), 세포측정 (유세포, 형광, 질량, 또는 이미지) 또는 다른 방법을 포함한 다른 방법을 사용하는 분석을 위해 수집할 수 있다.
CHO 세포에서 세포변성 효과를 초래하지 않는 바이러스의 경우에, 다른 세포주가 검출에 사용될 수 있다. 도 6은 바이러스의 부분 목록을 도시하고 그들을 세포변성 효과 및 복제에 따라 분류한다. 이것은 4종의 세포주: Vero 세포, 베이비 햄스터 신장 세포 (BHK), MRC-5 세포, 및 인간 신장 섬유아세포 (324K) 세포가 잠재적 바이러스의 적절한 커버리지를 제공할 수 있다는 것을 의미한다. 패널은 이들 4종 세포주에 국한되지 않으며 다른 현존 세포주뿐만 아니라 특정 감수성을 위해 변형된 새롭게 개발된 세포주도 역시 사용될 수 있다.
추가 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 데이터의 특정 패턴을 기반으로 바이러스 또는 다른 AA를 분류할 수 있다. 인공 신경망 (ANN), 패턴 인식, 또는 다른 예측 분석 방법을 포함하여, 몇몇 방법들이 이를 위해 사용될 수 있다. LFC 데이터를 사용하는 이의 구체적인 데이터 예는 도 22에 도시되어 있다. 여기서, ANN은 입력으로서 대략 17 LFC 매개변수를 사용하여 3종의 잠재적 바이러스 중 하나로서 시험 샘플을 분류하는데 사용된다.
일정 실시형태에서, 분석을 가속화시키기 위해서, 다수 세포주가 조건 배지 (CM) 또는 다른 피분석물과 함께 시험관내 센티넬 세포주로 동시에 사용될 수 있다. 일정 실시형태에서, 센티넬 세포는 모니터링 또는 검출되는 조건 (바이러스, 박테리아, 마이코플라스마, 감염, 또는 다른 AA)에 감수성인 세포이고 그들 반응은 LFC를 사용해 측정될 수 있다. 도 7은 각각의 웰 또는 바이오샘플링 시스템에서 다수의 시험관내 센티넬 세포주를 사용한 다중복합 어세이를 도시한다. 매개변수 공간에 의하거나 또는 다른 태그, 형광성, 시각 명시야 현미경 확인, 또는 다른 수단을 사용하는 Radiance™/LFC에서 세포를 구별하는 능력은 세포를 함께 인큐베이션시킬 수 있게 하여 처리량을 상당히 증가시키게 되고 동시에 수행될 수 있다. 세포는 Radiance™ /LFC에서 상이한 매개변수를 갖도록 조작되어서 그들은 서로 혼동되지 않을 것이고 어세이를 다중복합화시키는데 사용될 수 있다. 상이한 성질을 갖도록 세포를 변형시켜서 다중복합화하기 위한 방법은 제한없이 형광 기반 - 녹색 형광 단백질 (GFP), 적색 형광 단백질 (RFP), 노란색 형광 단백질 (YFP) 및 마크로파지 세포주 또는 다른 세포주에 도입되어서 어떤 것이 AA로 인한 세포변성 또는 다른 효과의 존재를 보고하는가를 결정할 수 있는 다른 유전자 변형을 포함한다. LFC를 사용해 분석된 세포는 또한 단지 예로서, 착색제, 염료, 항체 접합 비드 표지, 친화성 결합 비드 또는 분자, 나노입자 (Au, Ag, Pt, 유리, 다이아몬드, 중합체, 또는 다른 재료)로 표지될 수 있다. 나노입자는 2가지 목적: 1) 세포로의 다양한 진입, 및 2) LFC를 사용해 측정가능한 광학력의 변화를 수행하기 위해 상이한 형상 (구형, 사면체, 20면체, 막대 또는 큐브 형태 등) 및 크기를 가질 수 있다.
일정 실시형태에서, 나노입자는 세포와 인큐베이션될 수 있고 세포 유형에 따라 정상적으로 흡수가 일어나게 되거나 또는 대안적으로 나노입자 흡수는 나노입자 흡수율을 증강시키기 위해 화학적으로 또는 물리적으로 (예컨대 전기천공에 의하거나 또는 리포솜으로 촉진) 증가될 수 있다. 세포는 나노입자 및 시험하려는 바이러스와 인큐베이션되고 세포로의 바이러스 흡수의 증가된 편차는 LFC를 사용해 측정된 광학력의 더 큰 편차를 초래하게 되어서, 바이러스 검출 감도를 개선시킨다. 대안적인 실시형태에서, 나노입자는 세포에 노출 전에 바이러스와 인큐베이션될 수 있다.
추가의 대안적인 실시형태에서, 명시된 수의 비드를 빨아들이는 마크로파지는 LFC에서 상이한 성질을 가지게 되지만 AA의 존재를 여전히 보고하게 된다. 추가로, 세포의 오직 특정 부분, 예컨대 핵, 미토콘드리아 또는 다른 세포 소기관이 분석될 수 있다. 이것을 사용하여 AA뿐만 아니라 감염도를 포함한 다른 세포-기반 어세이의 성능을 증강시킬 수 있다.
측면들에서, 세포는 시험관내 센티넬 세포로서 사용을 위해서 상이한 바이러스, 박테리아, 진균 또는 다른 AA 감수성을 갖도록 유전자 조작될 수 있고, 일 실시형태에서, Radiance™ /LFC와 사용되는 패널에서는 AA 검출을 위해 고안된 접근을 가능하게 한다. 세포주 내로 또는 그로부터 일정 유전자를 도입시키거나 또는 제거하는 것은 세포주를 특정한 부류의 바이러스, 박테리아, 또는 다른 AA에 의한 감염에 더 관대하게 만들 수 있어서, 병원체 유형의 선택성에 따라 신속한 검출을 제공할 수 있다. LFC를 사용해 가능한 광범위 바이러스 동정과 조합되어 이것은 바이러스, 박테리아, 또는 다른 유형의 AA의 보다 양호한 동정을 가능하게 할 것이다.
본 명세서에 기술된 신규 방법은 도 8에 도시된 바와 같이 즉시 LFC/ Radiance™ (810)를 사용하는 분석을 통해 생산용(production) 생물반응기 (800)로부터 제거된 세포에 대해 AAT를 직접적으로 발생시킬 수 있다는 것을 입증한다. 생산 세포주 (CHO 등)에서 CPE 또는 다른 효과를 일으키지 않는 AA의 경우에, 추가적인 현탁 세포주가 미니 분석 생물반응기 (910)에서 사용되어 생산용 생물반응기에 존재하는 임의 AA와의 성장 및 감염을 자극시킬 수 있다.
예를 들어 Radiance™ (920)을 사용한 후속 샘플링을 위한 미니 생물반응기 (910)에서 성장된 세포주는 도 9에 도시된 바와 같이, AA에 대해 CM을 시험하기 위해 사용될 수 있다. CM의 샘플은 외래성 인자가 존재하는가를 확인하기 위해서 대형 공정 생물반응기 (900)로부터 미니 생물반응기로 펌핑되고, 이어서 주기적으로 LFC 기술 (920) (예를 들어, Radiance™)을 사용해 샘플링될 수 있다. 필요하다면 생산 공정의 상이한 시점에서 샘플링을 위해 다수의 생물반응기가 사용될 수 있다. 측면들에서, 미니 생물반응기(들)는 바이러스 감염 또는 마이코플라즈마, 또는 프라이온, 또는 박테리아, 진균, 또는 원충 감염의 동정을 제공하는데 사용될 수 있는 감염의 징후에 대한 세포주의 분광 분석을 위한 광학창을 가진다.
도 10은 CM에 존재하는 AA의 검출을 위해서, 이러한 예에서 시험관내 센티넬 세포로서, 마크로파지 세포 (바이러스, 박테리아, 영양 포자, 및 거의 모든 다른 물질을 포함한 외래 물질을 빨아들이는 백혈 세포)의 용도를 도시한다. 마크로파지는 LFC를 통해 검출가능한 고유한 방식으로 외래 물질의 존재에 반응하고 또한 외래 물질 (바이러스, 바이러스 내포체, 박테리아 포자 또는 영앙 세포, 엑소솜, 또는 임의의 다른 생물적 물질)을 빨아들일 수 있어서 그들이 그들을 빨아들이면서 그들 막 내부에 AA를 농축시킴으로써 그들 굴절률을 증가시킨다. 이것은 AA에 대한 LFC 반응을 증가시키고 또한 마크로파지를 추가 분석을 위해 다른 기술로 사전 농축된 AA를 분류 및 전달하기 위해 LFC에 대한 편리하고 검출가능한 용기 또는 비히클로 만들도록 한다. 이러한 적용분야에서 바이오제조 세포 (CHO 등)을 배제시켜 그들이 어세이 결과에 영향을 미치는, 마크로파지에 의해 흡입되지 않는 것이 중요할 것이다. 추측이지만 CHO 세포2 는 일반적으로 그들이 마크로파지3 와 동일한 크기이거나 또는 더 크므로 흡입되지 않을 것이다. 대안적인 마크로파지 활성화 (기지의 활성인자 예컨대 플레이트 결합, 플레이트 조성, 배지 첨가제, 특히 리포폴리사카라이드 (LPS), 박테리아 또는 바이러스 단백질을 포함한 생물분자의 첨가)는 유전자 또는 단백질 발현의 변화를 포함하는, 표현형 상태 또는 식균 활성을 선택적으로 제어하는 데 사용될 수 있다.
바이러스, 박테리아, 또는 다른 유기체 검출의 특이성은 크기, 속도 (광학력 관련), 크기 정규화된 속도, 세포 부피, 유효 굴절률, 편심율, 변형성, 세포 입상도, 회전, 배향, 광학 복잡성, 막 그레이스케일, 또는 LFC/ Radiance™를 사용해 측정된 다른 매개변수를 포함하여, LFC/ Radiance™ 가 측정하는 많은 매개변수의 사용을 통해서, 가능하게 된다. 이것은 AAT 스크리닝 목적을 위해 바이러스 또는 다른 유기체의 부류를 정의하기 위한 이미지를 포함하여 다변량 매개변수 공간의 사용을 의미한다. 광학 분광분석과의 결합은 라만, 형광도, 화학발광도, 원형 이색성, 또는 다른 방법을 포함하여, 추가 특이성을 제공할 것이다.
통상의 기술자는 소정 적용 또는 디자인의 요건 및 사양을 기반으로 개시된 특성을 단일하게, 임의 조합으로, 또는 생략하여 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 실시형태가 일정 특성을 "포함한다"고 언급될 때, 그 실시형태는 대안적으로 임의의 하나 이상의 특성"으로 이루어지거나 또는 그로 "본질적으로 이루어진다"는 것을 이해해야 한다. 본 발명의 다른 실시형태는 본 발명의 명세서 및 실시를 고려하여 통상의 기술자에게 자명할 것이다.
값의 범위가 본 명세서에서 제공되는 경우에, 그 범위의 상한치와 하한치 사이의 각각의 값이 또한 특별히 개시되는 것으로 특히 유의한다. 이들 보다 작은 범위의 상한치 및 하한치도 역시 독립적으로 그 범위에 포함되거나 또는 배제될 수 있다. "일", "하나", 및 "그"의 단수형은 문맥에서 달리 명확하게 명시하지 않으면 복수의 지시 대상을 포함한다. 명세서 및 예는 본질적으로 예시로서 간주되고 본 발명의 본질을 벗어나지 않는 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 또한, 본 개시에서 인용되는 모든 참조 문헌은 각각 개별적으로 그들 전문이 참조로 편입되고 이와 같이 통상의 기술자의 수준을 상술하는 배경을 제공할 뿐만 아니라 본 발명의 가능한 개시를 보충하는 효율적인 방식을 제공하기 위한 것이다.
참조 문헌
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3. Krombach, F., et al., Cell size of alveolar macrophages: an interspecies comparison. Environ Health Perspect, 1997. 105(Suppl 5): p. 1261-3.
Claims (78)
- 광학력 및/또는 유체력을 사용하여 차동 자극에 대한 세포 반응을 측정하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
다양한 기지 수준의 자극 또는 피분석물로 처리된 생물적 세포를 포함하는 초기 샘플의 선택물을 수용하는 단계,
상기 샘플에 대해 광학력-기반 측정을 수행하는 단계,
하나 이상의 광학력 또는 유체력-기반 매개변수를 기반으로 상기 자극에 대한 세포 반응을 기술하는 반응 메트릭 (RM)을 개발하는 단계
를 포함하는 것인, 방법. - 제1항에 있어서, 상기 반응 메트릭은 추가의 미지 샘플의 상기 반응을 측정하는 데 사용되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 허용가능한 표적 값 범위 내에 속하는 RM을 갖는 것을 기반으로, 감염도의 정확한 측정이 결정될 때까지 상기 샘플의 희석물을 분석하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 측정되는 상기 샘플은 세포 핵, 미토콘드리아, 또는 다른 세포하 성분 또는 분획인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 광학력 및 유체력은 레이저력 사이톨로지를 기반으로 하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서,
표적 값에 대해 초기 샘플의 상기 반응 메트릭을 비교하는 단계,
첫번째의 결과, 및 예측 또는 기지 반응을 통제하는 알고리즘을 기반으로 제2 샘플을 선택하는 단계,
표적 값에 대해 상기 제2 샘플의 상기 반응 메트릭을 비교하는 단계,
표적 반응 메트릭 또는 다른 정의된 종결점에 부응하는 샘플이 확인될 때까지 유사한 방식으로 후속 샘플을 선택하는 단계
를 더 포함하는 것인 방법. - 제5항에 있어서, 상기 광학력-기반 측정은 직선 속도, 크기, 주변 길이(perimeter), 크기 (영역, 직경, 부피 등), 샘플 당 트래핑된 세포의 수, 샘플 당 빔 방사된 세포의 수, 응집체의 수 (크기 및/또는 형상 또는 다른 매개변수 기반), 파편-크기 입자의 수 (크기 및/또는 형상 또는 다른 매개변수 기반), 정규화된 속도, 최소 x 위치, 광학 체류 시간, 광학 트래핑 시간, 광학력, 광학 토크, 배향, 광학 및 유체 역학, 유효 굴절률, 편심성, 단축, 장축, 변형성, 편심성 변형성, 단축 및 장축 변형성, 신장 인자, 조밀도 인자, 순환성 인자, 그레이스케일 피처 포함 이미지, 전체 이미지, 이미지 요소(components) 또는 이미지 파생 매개변수, 모폴로지 특징, 또는 다른 레이저력 사이톨로지 파생 매개변수를 포함하는 매개변수를 평가하기 위해서 레이저력 사이톨로지를 이용하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 생물적 세포는 식물 세포 (조류 세포 등), 원핵생물 세포 (박테리아), 진핵생물 세포, 효모, 진균, 곰팡이 세포, 적혈 세포, 뉴런, 난세포 (난자), 정자, 백혈 세포, 호염기구, 호중구, 호산구, 단핵구, 림프구, 마크로파지, 혈소판, 소포체, 엑소솜, 기질 세포, 다세포 구조물 예컨대 스페로이드, 간엽 세포, 및 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 피분석물은 바이러스를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 피분석물은 박테리아를 포함하는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 피분석물은 바이러스 및 항체 함유 중화 혈청 (중화 어세이)인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 피분석물은 박테리아 및 항체 함유 중화 혈청인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 피분석물은 독소 및 독소를 중화할 수 있는 (또는 없는) 혈청 중 항체인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 피분석물은 바이러스 및 항바이러스 화합물 또는 물질인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 단층 또는 현탁액에 존재하거나 또는 매트릭스 포매되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 알기네이트, 젤라틴, 또는 다른 유사한 반고체 현탁액에 의해 현탁되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 진행중인 공정으로부터 샘플링되어서 추가 인큐베이션없이 직접 분석되는 것인 방법.
- 제1항에 있어서, 보정 개체를 더 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 보정 개체는 비드, 입자, 생물제, 지질, 소포체, 생존 세포, 또는 고정 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제19항에 있어서, 비드 또는 입자는 유기 물질, 중합체, 금속, 합금, 유리, 사파이어 또는 다이아몬드를 포함하는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 보정 개체는 나노미터 내지 밀리미터 크기의 구형 또는 비구형 형상인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 보정 개체는 하나 이상의 샘플과 혼합되어 동시에 분석되는 것인 방법.
- 제18항에 있어서, 상기 보정 개체는 상기 세포의 명시야 이미지 분석, 형광 측정, 또는 하나 이상의 광학력-기반 측정을 기반으로 세포 샘플로부터 구별될 수 있는 것인 방법.
- 다양한 농도의 처리제에 대한 세포 반응을 기반으로 보정 그래프를 생성시키고, 이어서 이를 이용하여 미지 수준의 샘플을 예측하기 위한 방법으로서,
처리제를 첨가하고 샘플 세포를 인큐베이션시키는 단계,
세포, 및 기지 범위의 처리제를 갖는 복수의 샘플을 유체력 및/또는 광학력-기반 측정에 의해 분석하여 반응 메트릭을 결정하는 단계,
희석 추세를 기반으로 최적 반응 메트릭 및 시간을 결정하는 단계,
생성된 데이터를 사용하여 향후 샘플을 예측하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제24항에 있어서, 상기 광학력-기반 측정은 레이저력 사이톨로지를 이용하는 것인 방법.
- 제24항에 있어서, 측정되는 상기 샘플은 세포 핵, 미토콘드리아, 또는 다른 세포하 성분 또는 분획인 방법.
- 제24항에 있어서, 자극은 바이러스 감염이고 농도는 바이러스 역가인 방법.
- 제24항에 있어서, 단변량 메트릭스, 전체 모집단 히스토그램 데이터, 서브세트 모집단 히스토그램 데이터, K-평균 클러스터링, 또는 PLS, PCA, 신경망 또는 다른 다변량 또는 다변량 메트릭 생성을 위한 기계 학습 알고리즘을 포함하는 추가 분석을 경우에 따라 포함하는 것인 방법.
- 세포 반응과 관심 생성물 또는 세포 속성의 상관관계를 보여주는 생물적 분자의 생성 또는 다른 진행중인 생물공정 동안 세포 변화를 기반으로 보정 그래프를 생성시키고 이어서 상기 보정을 사용하여 향후 과정의 결과를 예측하기 위한 방법으로서,
처리제를 첨가하고 샘플 세포를 인큐베이션시키는 단계,
세포 및 기지 범위의 생성물 농도를 갖는 복수의 샘플을 광학력-기반 측정에 의해 분석하여 반응 메트릭을 결정하는 단계,
희석 추세를 기반으로 최적 반응 메트릭를 결정하는 단계,
생성된 데이터를 사용하여 향후 샘플을 예측하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제29항에 있어서, 상기 광학력-기반 측정은 레이저력 사이톨로지를 이용하는 것인 방법.
- 제29항에 이어서, 측정되는 상기 샘플은 세포 핵, 미토콘드리아, 또는 다른 세포하 성분 또는 분획인 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 생성물은 바이러스 기반 생성물 예컨대 백신, 종양용해성 바이러스, 단백질, 핵산 또는 바이러스 벡터인 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 생성물은 비바이러스 생성 단백질, 핵산, 중합체 또는 지질인 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 세포 속성은 생산능, 생존능, 또는 표적 분자 생산 능력인 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 세포 속성은 분화 상태, 특정 세포 유형 예컨대 종양 사멸 능력, 다른 세포 유형을 활성화시키는 능력, 또는 다른 세포 유형의 생화학적 상태를 변화시키는 능력인 방법.
- 제29항에 있어서, 단변량 메트릭스, 전체 모집단 히스토그램 데이터, 서브세트 모집단 히스토그램 데이터, K-평균 클러스터링, 또는 PLS, PCA, 신경망 또는 다른 다변량 또는 다변량 메트릭 생성을 위한 기계 학습 알고리즘을 포함하는 추가 분석을 경우에 따라 포함하는 것인 방법.
- 절대 역가/감염도를 계산하기 위한 방법으로서,
세포 및 바이러스 스톡의 기지 범위의 희석물을 갖는 복수의 샘플을 광학력-기반 측정에 의해, 분석하여 감염 메트릭을 결정하는 단계;
최대 감염 메트릭을 입증하는 샘플을 확인하는 단계;
상기 최대 감염 메트릭을 100% 감염으로 설정하는 단계;
감염시 세포의 수, 미감염된 세포의 백분율, 감염을 설명하는 수학적 분포, 및 희석시 첨가된 바이러스 스톡의 부피를 기반으로 각 희석물에 첨가된 바이러스의 양 (감염성 유닛/mL)을 계산하는 단계; 및
명시된 범위 내에 속하는 상기 희석물만을 사용하여, 미지 샘플의 전체 역가를 예측하는 단계
를 포함하는 것인, 방법. - 제37항에 있어서, 상기 광학력-기반 측정은 레이저력 사이톨로지를 이용하는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 측정된 상기 세포는 세포 핵, 미토콘드리아, 또는 다른 세포하 성분 또는 분획인 방법.
- 제37항에 있어서, 감염을 설명하는 분포는 푸아송 (Poisson), 베이지안 (Bayesian), 또는 다른 수학적 분포인 방법.
- 제37항에 있어서, 미지 역가의 샘플과 미지 바이러스 시스템으로부터 역가를 계산하고 보정 그래프를 생성시킬 때 상기 감염 메트릭을 생성시키는 데 사용되는 감염 후 인큐베이션 시간 및 레이저력 사이톨로지 매개변수 둘 모두를 결정하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 계측이 일관된 방식으로 거동된다는 신뢰를 증가시키는 데 사용하는 보정 개체 예컨대 비드 또는 입자를 더 포함하는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, 히스토그램, 산포도, 및/또는 다변량 데이터는 상기 감염 메트릭 또는 보다 복잡한 감염 메트릭의 요소로서 그 전체 또는 일부에서 사용되는 것인 방법.
- 제37항에 있어서, K-평균 클러스터링은 상기 감염 메트릭을 생성시키는데 사용되는 것인 방법.
- 광학력-기반 측정의 사용을 포함하는 외래성 인자의 존재를 검출하기 위한 방법으로서,
임의의 추가 인큐베이션없이 생물반응기 또는 다른 용기로부터 직접적으로 세포를 샘플링하는 단계,
세포의 개체군에 대해 광학력-기반 측정을 하는 단계,
정상 작동 조건 하의 과정을 설명하는 이전 데이터 세트 및 상기 측정된 세포 반응의 조합을 기반으로 외래성 인자를 검출하는 단계
를 포함하는 것인, 방법. - 광학력-기반 측정의 사용을 포함하는 외래성 인자의 존재를 검출하기 위한 방법으로서,
현탁 또는 부착 배양으로 성장하는 세포와 시험 샘플을 혼합하고 인큐베이션시키는 단계; 및
레이저력 사이톨로지를 통해서 시험 샘플 배지에서 외래성 인자를 검출하는 단계
를 포함하는 것인, 방법. - 제46항에 있어서, 블랭크 세포 샘플은 상기 시험 샘플과 비교하기 위한 대조군으로서 사용되는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 조건 배지는 생물반응기, 또는 다른 제조 공정으로부터 수득되는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 세포가 조건 배지에 노출되는 시간량은 어세이 최적화의 일부로서 조정될 수 있는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO), 베이비 햄스터 신장 (BHK), 또는 다른 관련 세포 또는 이의 변이체인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 세포는 제한없이 Vero, HEK-293, MDCK, EB66, AGE1, WI-38, MRC-5, MARC 145, CRFK, A549, HL60, U937, SK-MEL-28, HCC2429, HEp-2, 또는 다른 관련 세포 또는 이의 변이체를 포함하는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 세포는 HeLa 세포인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 세포는 유전 물질을 첨가, 변화 또는 제거시키거나 또는 상기 세포의 생물적 또는 물리적 상태를 변화시켜서 광범위하게 또는 특이적으로 바이러스 감염에 대해 감수성이도록 화학적으로 또는 유전자적으로 변형되는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 세포는 유전 물질을 첨가, 변화 또는 제거시키거나, 또는 상기 세포의 생물적 또는 물리적 상태를 변화시켜서 광범위하게 또는 특이적으로 박테리아 감염에 대해 감수성이도록 화학적으로 또는 유전자적으로 변형되는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 세포는 유전 물질을 첨가, 변화 또는 제거시키거나 또는 상기 세포의 생물적 또는 물리적 상태를 변화시켜서 광범위하게 또는 특이적으로 바이러스 감염에 감수성이도록 화학적으로 또는 유전자적으로 변형되고 LFC를 사용한 측정에 양호한 특징을 갖는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 세포는 유전 물질을 첨가, 변화 또는 제거시키거나 또는 상기 세포의 생물적 또는 물리적 상태를 변화시켜서 독소 또는 특이적 분자 또는 분자 부류에 대해 감수성이도록 화학적으로 또는 유전자적으로 변형되는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 세포는 마크로파지 세포인 방법.
- 제57항에 있어서, 상기 마크로파지 세포는 이의 식균 활성 또는 세포 반응에 영향을 미치는 화학물 또는 생화학물로 처리되는 것인 방법.
- 제48항에 있어서, 추가 분석을 위해 관심 세포를 분류 및 수집하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제59항에 있어서, 추가 분석은 라만 (Raman) 분광법, 형광 분광법, 질량 분광법, 중합효소 연쇄 반응, 단일 세포 시퀀싱, 차세대 시퀀싱, 흐름, 형광, 질량, 또는 이미지 세포측정을 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 외래성 인자의 정체를 결정하기 위해서 광학력-기반 측정을 기반으로 상기 외래성 인자를 분류하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 외래성 인자는 바이러스, 박테리아, 세포내 박테리아, 마이코플라스마, 진균, 원충, 기생충, 또는 소형 분자를 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 인공 신경망, 패턴 인식 및 예측 분석 도구의 사용을 포함하여 상기 인자(agent)를 분류하는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
- 제63항에 있어서, 상기 인공 신경망은 상기 외래성 인자를 분류하기 위해서 다수의 레이저력 사이톨로지 매개변수를 사용하는 것인 방법.
- 제64항에 있어서, 상기 다수의 레이저력 사이톨로지 매개변수는 직선 속도, 크기, 주변길이, 크기 (영역, 직경, 부피 등), 샘플 당 트래핑된 세포의 수, 샘플 당 빔 방사된 세포의 수, 응집체의 수 (크기 및/또는 형상 또는 다른 매개변수를 기반으로), 파편-크기 입자의 수 (크기 및/또는 형상 또는 다른 매개변수를 기반으로), 정규화된 속도, 최소 x 위치, 광학 체류 시간, 광학 트래핑 시간, 광학력, 광학 토크, 배향, 광학 및 유체 역학, 유효 굴절률, 편심성, 단축, 장축, 변형성, 편심성 변형성, 단축 및 장축 변형성, 신장 인자, 조밀도 인자, 순환성 인자, 그레이스케일 피처 포함 이미지, 전체 이미지, 이미지 요소 또는 이미지 파생 매개변수, 모폴로지 특징, 또는 다른 레이저력 사이톨로지 파생 매개변수를 포함하는 것인 방법.
- 제46항에 있어서, 다수의 세포주는 분석을 가속화하기 위해서 동시에 분석될 수 있는 것인 방법.
- 광학력-기반 측정을 사용하여 외래성 인자를 시험하기 위한 방법으로서,
미니 생물반응기에서 세포주를 성장시키는 단계;
조건 배지의 샘플을 대형 공정 생물반응기로부터 상기 미니 생물반응기로 펌핑하는 단계; 및
광학력-기반 측정을 이용하여 조건 배지에서 외래성 인자를 검출하는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제67항에 있어서, 상기 세포주는 대형 공정 생물반응기에 존재하는 임의 외래성 인자에 의한 성장 및 감염을 촉진하기 위한 현탁 세포주일 수 있는 것인 방법.
- 세포 반응을 생물적 상태와 상관시키기 위한 방법으로서,
환자 또는 다른 생물적 공급원으로부터 세포를 수용하는 단계;
상기 환자로부터의 세포에 대해 광학력-기반 측정을 수행하는 단계;
광학력-기반 측정 데이터를 출력하는 단계로서, 분석된 세포로부터의 상기 데이터는 생물적 상태를 지시하기 위해서 비교 데이터와 함께 사용되는 단계
를 포함하는 것인, 방법. - 제69항에 있어서, 상기 비교 데이터는 상이한 조건 예컨대 질환 또는 치료 및/또는 시점 하의 동일 환자로부터 유래되는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 비교 데이터는 상이한 환자 또는 환자들로부터 유래되는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 생물적 상태는 감염의 진단, 및/또는 병원체의 동정을 포함하는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 생물적 상태는 백신 또는 항체 효능을 포함하여, 치료 효능의 평가를 포함하는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 생물적 상태는 면역력 또는 약물 내성의 평가를 포함하는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 생물적 상태는 암, 세포의 전이 잠재성의 평가를 포함하는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 샘플은 정상 세포 특징의 기준점을 확립하기 위해서 동일 환자로부터 시간 경과에 따라 수집되는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 상기 생물적 상태는 세포 또는 유전자 요법에 의한 치료를 포함하는 것인 방법.
- 제69항에 있어서, 레이저력 사이톨로지는 직선 속도, 크기, 주변길이, 크기 (영역, 직경, 부피 등), 샘플 당 트래핑된 세포의 수, 샘플 당 빔 방사된 세포의 수, 응집체의 수 (크기 및/또는 형상 또는 다른 매개변수를 기반), 파편-크기 입자의 수 (크기 및/또는 형상 또는 다른 매개변수를 기반), 정규화된 속도, 최소 x 위치, 광학 체류 시간, 광학 트래핑 시간, 광학력, 광학 토크, 배향, 광학 및 유체 역학, 유효 굴절률, 편심성, 단축, 장축, 변형성, 편심성 변형성, 단축 및 장축 변형성, 신장 인자, 조밀도 인자, 순환성 인자, 그레이스케일 피처 포함 이미지, 전체 이미지, 이미지 요소 또는 이미지 파생 매개변수, 모폴로지 특징, 또는 다른 레이저력 사이톨로지 파생 매개변수를 포함하는 매개변수의 평가를 포함하는 것인 방법.
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