CN108795868A - 一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了属于生物医学技术领域的一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株。本发明利用不同浓度的西妥昔单抗处理人结直肠癌细胞株NCI‑H508，以50％细胞能够存活的药物浓度作为初始浓度长期处理细胞，直至NCI‑H508细胞能在此浓度下正常生长，通过逐渐加量法继续长期处理NCI‑H508细胞，历时6个月，最终获得了能在西妥昔单抗处理下快速生长的人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI‑H508/C225。本发明可用于分析人结直肠癌细胞西妥昔单抗耐药后的形态学及生物学表型的变化；研究结直肠癌对西妥昔单抗耐药的分子机制和逆转耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物；发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等，具有较高的科研和生产应用价值。

Description

一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株及其应用
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株。
背景技术
结直肠癌(CRC)，是消化系统常见的恶性肿瘤之一，其发病率居我国消化系统恶性肿瘤的第1位。近年来，随着饮食习惯及生活方式的改变，CRC的发病率呈逐年上升趋势，且5年生存率低、预后较差。多数结直肠癌患者发现时已处于晚期，失去手术时机。
药物治疗是晚期结直肠癌患者的主要治疗手段，但治疗过程中患者经常出现耐药现象，成为化学治疗的瓶颈。因此，研究结直肠癌细胞耐药机制及其预防或逆转结直肠癌耐药的发生，对于提高化学药物治疗效果十分必要；建立肿瘤耐药细胞株对于研究肿瘤耐药机制、肿瘤细胞耐药性逆转、开发及评价新药等具有重要的应用价值。
肿瘤靶向治疗药物由于治疗药物的效率高、靶向性较好、毒性低，在缓解患者病情、控制肿瘤的发展和改善患者生活质量方面有更广阔的发展前景。西妥昔单抗是第一个获准上市的靶向作用于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)的IgG单克隆抗体。西妥昔单抗与肿瘤细胞表面的EGF R特异性结合后阻断受体的二聚化、酪氨酸激酶的磷酸化以及信号传导，通过 EGFR下游信号通路传递凋亡信号到胞核内，发挥抑制细胞增殖、促进细胞凋亡的作用，并抑制肿瘤细胞DNA的修复，发挥抗肿瘤作用。2004年美国食品药品监督局批准EGFR-TKI类药物西妥昔单抗(Cetuximab)用于表皮生长因子受体过度表达的转移性直肠癌的治疗。目前尚缺乏对西妥昔单抗耐药的结直肠癌细胞株，肿瘤耐药细胞株的构建方法也亟需改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株 NCI-H508/C225，其保藏编号为CCTCC NO：C201878，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2018年4月26 日。
上述的一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株，按照如下步骤获得：
步骤一，取人结直肠癌细胞株NCI-H508细胞复苏后置于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37℃，5％的CO2培养箱中培养；
步骤二，取步骤一所述的生长至对数生长期的NCI-H508细胞种于96孔培养皿中，分别加入0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、 100μg/L的西妥昔单抗，72小时后，通过CCK-8法检测细胞活力，计算细胞生长抑制率，得到西妥昔单抗对NCI-H508细胞株的半数抑制浓度(IC50)为 10μg/ml；
步骤三，使用10μg/ml的西妥昔单抗长期刺激NCI-H508细胞，刺激72h后用不含西妥昔单抗的RPMI 1640完全培养液培养96h，待NCI-H508细胞能在 10μg/ml西妥昔单抗处理下正常生长后，增加西妥昔单抗的浓度至20μg/ml，重复上述过程直至西妥昔单抗浓度加至160ug/ml，计算耐药株的IC50，以确定耐药株对西妥昔单抗的耐药程度，获得人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株。
本发明的主要技术方案是利用不同浓度的西妥昔单抗处理人结直肠癌细胞株NCI-H508，以50％细胞能够存活的药物浓度作为初始浓度长期处理细胞，直至NCI-H508细胞能在此浓度下正常生长，通过逐渐加量法继续长期处理NCI-H508细胞，历时6个月，最终获得了能在西妥昔单抗处理下快速生长的人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225。
本发明通过形态学观察、生长曲线测定、稳定性测定、DNA突变检测，评价人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225的生物学特性，成功建立 NCI-H508/C225耐药株。
本发明还提供了人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225在筛选抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225在研究化疗耐药机制中的应用。
有益效果：本发明可用于分析人结直肠癌细胞西妥昔单抗耐药后的形态学及生物学表型的变化；研究结直肠癌对西妥昔单抗耐药的分子机制和逆转耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物；发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等，具有较高的科研和生产应用价值。
附图说明
图1为光学显微镜下人结直肠癌西妥昔单抗敏感细胞株NCI-H508细胞形态图。
图2为光学显微镜下人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225细胞形态图。
图3为不同浓度西妥昔单抗处理72小时后，NCI-H508和耐药细胞 NCI-H508/C225细胞活力图。
图4为不同浓度西妥昔单抗处理72小时后，NCI-H508和撤药8周后NCI-H508/C225细胞活力图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
实施例所用的人结直肠癌细胞NCI-H508购置美国全球生物资源中心；实施例所用的西妥昔单抗为市售的德国默克公司的5mg/ml规格的产品。
实施例1
1.人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225的诱导建立验证
①取NCI-H508细胞复苏后置于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，于 37℃，5％的CO2培养箱中培养；为找寻最适宜西妥昔单抗刺激浓度，取对数生长期的所述NCI-H508细胞种于96孔培养皿中，分别加入0.1μg/ml、0.5μg/ml、 1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/L的西妥昔单抗，72小时后，通过 CCK-8法检测细胞活力，计算细胞生长抑制率，得到西妥昔单抗对NCI-H508细胞株的半数抑制浓度(IC50)。
②使用上述检测出的IC50值约10μg/ml长期刺激NCI-H508细胞，每次刺激 72h后换上不含有西妥昔单抗的RPMI 1640完全培养液培养96h。待NCI-H508 细胞能在10μg/ml西妥昔单抗处理下正常生长后，增加西妥昔单抗的浓度至 20μg/ml，重复此过程直至西妥昔单抗浓度加至160ug/ml，计算耐药株的IC50，以确定耐药株对西妥昔单抗的耐药程度。历时6个月左右最终获得能在西妥昔单抗处理下正常生长的人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225。
将上述细胞与NCI-H508对照细胞接种96孔板(每孔5000个细胞)，24小时后加入不同浓度的西妥昔单抗(1、5、10、20、50、100、200μg/ml)，于72小时吸弃培养基，每孔各加100μL无血清培养液和10μL CCK8工作液共计110μL的混合物，在培养箱中培养1-2小时后，放入酶标仪以450nm波长检测，读出每孔的OD值并计算平均值，计算细胞活力即OD值平均值/对照组OD值，以西妥昔单抗浓度为横坐标、细胞活力为纵坐标，绘制成药物抑制曲线图(图3)，计算耐药株的耐药指数，即耐药细胞IC50/敏感细胞IC50。
2.人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株NCI-H508/C225的形态学观察
①倒置相差显微镜观察活细胞形态：分别取对数生长期的NCI-H508对照细胞和NCI-H508/C225耐药细胞，PBS清洗换液后，在倒置显微镜(200X)下观察活细胞形态。通过光镜可以观察到NCI-H508贴壁生长，呈地图状生长，相近细胞间排列较紧密，细胞颜色深(图1)；NCI-H508/C225细胞变细，变长，细胞间排列较松散，有明显间隙，细胞颜色淡(图2)。
3.NCI-H508/C225稳定性的鉴定
将NCI-H508/C225耐药株进行撤除西妥昔单抗8周后，正常换液、传代，与 NCI-H508对照细胞接种96孔板(每孔5000个细胞)，24小时后加入不同浓度的西妥昔单抗(1、5、10、20、50、100、200μg/ml)，于72小时吸弃培养基，按上述CCK8法计算细胞活力，以西妥昔单抗浓度为横坐标、细胞活力为纵坐标，绘制成药物抑制曲线图(图4)，计算撤药8周后耐药株的耐药指数，结果显示耐药指数稍有所下降，但仍维持较强的耐药性，说明此耐药株的耐药性可以稳定存在，不受传代换液影响，适合进一步分子生物学实验。
4.NCI-H508和NCI-H508/C225进行DNA突变检测
将上述细胞与NCI-H508对照细胞使用DNA提取试剂盒提取DNA，在DNA 浓度检测后，使用Iontorrent ampliSeq试剂盒2.0、IonXpress barcode试剂盒、Ion AmpliSeqColon and Lung Cancer Panel v2进行建库。文库定量后，用Iontorrent Onetouch模板试剂盒扩增文库混合物，并根据方案在Iontorrent Onetouch系统上富集。最后，使用Iontorrent PGM系统，用Iontorrent PGM测序试剂盒进行测序。根据参考基因组hg19分析突变位点。突变频率的阈值为1％。整体深度中值覆盖范围>1000X。扩增子的测序范围大于1000，均一性>90％。结果显示NCI-H508 和NCI-H508/C225突变位点一致，在耐药株构建过程中，西妥昔单抗常见耐药基因KRAS并未发生突变，DNA水平上未发生继发性耐药突变(表1)。
表1NCI-H508和NCI-H508/C225DNA突变高通量测序
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (5)

1.一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株，其特征在于，其保藏编号为CCTCC NO：C201878。
2.根据权利要求1所述一种人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株，其特征在于，按照如下步骤获得：
步骤一，取人结直肠癌细胞株NCI-H508细胞复苏后置于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，于37℃，5％的CO2培养箱中培养；
步骤二，取步骤一所述的生长至对数生长期的NCI-H508细胞种于96孔培养皿中，分别加入0.1μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/L的西妥昔单抗，72小时后，通过CCK-8法检测细胞活力，计算细胞生长抑制率，得到西妥昔单抗对NCI-H508细胞株的半数抑制浓度为10μg/ml；
步骤三，使用10μg/ml的西妥昔单抗长期刺激NCI-H508细胞，刺激72h后用不含西妥昔单抗的RPMI 1640完全培养液培养96h，待NCI-H508细胞能在10μg/ml西妥昔单抗处理下正常生长后，增加西妥昔单抗的浓度至20μg/ml，重复上述过程直至西妥昔单抗浓度加至160ug/ml，计算耐药株的半数抑制浓度，以确定耐药株对西妥昔单抗的耐药程度，获得人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株。
3.权利要求1所述的人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。
4.权利要求1所述的人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株在制备抗肿瘤药物中的应用。
5.权利要求1所述的人结直肠癌西妥昔单抗耐药细胞株在研究化疗耐药机制中的应用。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109260470A (zh) * 2018-09-17 2019-01-25 上海景峰制药有限公司 自然杀伤性t细胞联合西妥昔单抗在制备治疗抗肿瘤药物中的应用
CN113337471A (zh) * 2021-04-02 2021-09-03 清华-伯克利深圳学院筹备办公室 5-氟尿嘧啶耐药的结直肠腺癌上皮细胞及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KIMIO YONESAKA等: "Activation of ERBB2 Signaling Causes Resistance to the EGFR-Directed Therapeutic Antibody Cetuximab", 《，SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE》 *
徐宗斌: "人结直肠癌耐药细胞株HCT-8/L-OHP的构建及HOXB8过表达的探讨"", 《福建医科大学学报》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109260470A (zh) * 2018-09-17 2019-01-25 上海景峰制药有限公司 自然杀伤性t细胞联合西妥昔单抗在制备治疗抗肿瘤药物中的应用
CN109260470B (zh) * 2018-09-17 2022-03-22 上海景峰制药有限公司 自然杀伤性t细胞联合西妥昔单抗在制备治疗抗肿瘤药物中的应用
CN113337471A (zh) * 2021-04-02 2021-09-03 清华-伯克利深圳学院筹备办公室 5-氟尿嘧啶耐药的结直肠腺癌上皮细胞及其应用

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