CN109402176A - 从血红细胞分离的细胞外囊泡和其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用源自血红细胞(RBC)的细胞外囊泡(EV)进行RNA递送的方法。该方法包括血红细胞细胞外囊泡的提纯和电穿孔，并将RNA导入细胞外囊泡，同时将载有RNA的细胞外囊泡应用于靶细胞。该方法还包括使用载有RNA的细胞外囊泡治疗癌症。
Description
序列清单
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技术领域
本发明涉及分子生物学和基因组编辑领域，更具体地涉及通过细胞外囊泡(EV)将遗传物质转移到受体细胞。
背景技术
包括反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide,ASO)、小干扰RNA(siRNA)、合成mRNA和基因组编辑RNA-蛋白质复合物的RNA治疗剂是用于以高特异性和高灵活性靶向人类基因组的新兴治疗方式。ASO和siRNA已作为敲低基因的工具已被广泛地用于生物医学研究中。它们能将任何感兴趣基因沉默从而在靶向疾病重要基因方面具有巨大潜力。可以使用各种化学修饰或缀合来保持ASO和siRNA稳定并增强其结合特异性。用于RNA转染的常用方法包括核转染(nucleofection)、脂质转染(lipofection)和电穿孔(electroporation)，其仅适用于体外递送。病毒转导和纳米颗粒通常用于体内递送RNA和DNA，然而，这些方法通常效率低、具有免疫原性和有毒。
科学最新突破之一是基因组编辑的新技术——定期聚集间隔短回文重复(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)方法，其能够对基因组DNA进行稳健和精确的修饰，以广泛地用于多种研究和医学中。CRISPR是纠正癌症遗传异常的理想工具，因为该系统可以设计为直接靶向基因组DNA。CRISPR系统涉及两个主要组分：Cas9酶和指导(gRNA)。gRNA含有用于DNA结合的靶向序列和用于Cas9结合的支架序列。Cas9核酸酶通常用于“敲除”靶基因，因此它可用于删除或抑制对癌症起始或发展必不可少的致癌基因。与ASO和siRNA类似，CRISPR系统在靶向任何感兴趣的基因方面提供了高灵活性，因此可以基于个体患者的基因突变设计潜在的基于CRISPR的疗法。CRISPR系统的一个优点是其完全消除疾病基因表达的能力，这些疾病基因只能通过使用ASO或siRNA的RNA干扰方法部分抑制。此外，可以使用多种gRNA同时抑制或激活多种基因，从而提高治疗效率并降低可能由靶基因中的新突变引起的抗性。CRISPR技术的应用已经从针对不同疾病的工作台快速发展到临床。CRISPR介导的T细胞修饰用于癌症治疗的临床试验已在中国和美国开始。许多其他基于CRISPR的疗法正在开发中。然而，这些疗法中的大多数依赖于靶细胞的体外修饰或使用可靶向极少数细胞类型(例如肝细胞)的病毒或纳米颗粒的CRISPR系统全身递送。
急性髓性白血病(AML)是最具攻击性的血癌类型，每年影响近352,000人，5年存活率为1.5％。急性髓性白血病的特征在于外周血(PB)和骨髓(BM)中成髓细胞的增加。30-40％的急性髓性白血病患者(大多数在60岁以下)对化疗和造血干细胞移植反应良好。然而，老年患者的反应率要低得多，因为他们无法忍受化疗的毒性。此外，由于耐药性，几乎所有患者在一定时间后复发。因此，需要新的治疗策略来提高反应率、降低毒性和对抗药物抗性。基因组学的最新进展提供了对急性髓性白血病遗传和表观遗传异常的更好理解，并提出了新的特异性治疗靶点。RNA干扰和基因组编辑方法逐步成为针对这些异常的新方法。然而，已证明向急性髓性白血病细胞递送RNA的基因治疗具有难度，尤其是对于体内治疗。常见的基因治疗递送载体如腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)和脂质纳米颗粒(LNP)在急性髓性白血病模型中大多无效或有毒。
因此，需要提高递送效率并降低癌症基因疗法的毒性。
发明内容
在本发明的一个方面，提供了一种向靶细胞递送RNA的方法，包括以下步骤：a)从血红细胞(RBC)中提纯细胞外囊泡(EV)；b)使用电穿孔使RNA进入所述细胞外囊泡以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及c)将载有RNA的细胞外囊泡应用于靶细胞。
使用来自血红细胞的细胞外囊泡(包括微泡(microvesicles)和外泌体(exosomes))的优点是血红细胞是最丰富的血细胞，因此可以从任何血库中可获得的血红细胞单位中获得和纯化大量细胞外囊泡。优选地，血红细胞衍生自人类。与合成转染试剂不同，它们是无毒的。血红细胞细胞外囊泡(RBC EV)不含有癌细胞或干细胞的细胞外囊泡中通常含有的致癌DNA/RNA或生长因子，因此血红细胞细胞外囊泡不会对受体细胞产生任何转化风险。
在一个实施例中，血红细胞衍生自哺乳动物，优选为人，并经离子载体处理，具体地是经钙离子载体处理。使用蔗糖缓冲(sucrose cushion)超速离心纯化细胞外囊泡。术语“蔗糖缓冲”是指在离心过程中自身建立的蔗糖梯度。在一个实施例中，通过使用约40％至约70％、约50％至约60％或约60％的蔗糖溶液制备蔗糖梯度。
在另一个实施例中，电穿孔的细胞外囊泡包含反义寡核苷酸(ASO)、mRNA、短链RNA或质粒。优选地，短链RNA包括gRNA。优选地，反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：1或由SEQ IDNO：1组成。
在进一步的实施例中，靶细胞包含癌细胞，或者是癌细胞。在另一个实施例中，靶细胞包括白血病细胞，具体地是急性髓性白血病(AML)细胞、乳腺癌细胞，或急性髓性白血病细胞和乳腺癌细胞的组合。
在另一个实施例中，如上所述，利用电穿孔使拮抗miR-125b的反义寡核苷酸进入细胞外囊泡以敲除靶细胞中的miR-125b。优选地，拮抗miR-125b的反义寡核苷酸包含SEQID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。
在另一个实施例中，抑制了靶细胞的生长。在另一个实施例中，利用电穿孔导入诸如葡聚糖的小分子化合物进入细胞外囊泡。
在另一个实施例中，该方法包括向靶细胞施用载有RNA的细胞外囊泡，其调节凋亡相关的基因表达，从而诱导靶细胞中的细胞凋亡。
本发明也涉及如上所述的细胞外囊泡在制备向靶细胞递送RNA的药物的用途。具体地，靶细胞和RNA如上所述。
在本发明的第二方面，提供了一种向靶细胞递送反义寡核苷酸以抑制基因表达的方法，包括以下步骤：a)从血红细胞中提纯细胞外囊泡；b)利用电穿孔使RNA进入所述细胞外囊泡以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及c)将载有RNA的细胞外囊泡应用于所述靶细胞。
在一个实施例中，利用电穿孔使Cas9 mRNA和gRNA进入细胞外囊泡。在一个实施例中，利用电穿孔使能转录Cas9 mRNA和gRNA的质粒进入细胞外囊泡。
在一个实施例中，如上所述，血红细胞衍生自哺乳动物，优选为人，并经离子载体处理，特别是经钙离子载体处理。
在一个实施例中，RNA是拮抗miR-125b的反义寡核苷酸，以抑制靶细胞中的致癌miR-125b。优选地，拮抗miR-125b的反义寡核苷酸包含SEQ ID NO：1或由SEQ ID NO：1组成。
在另一个实施例中，靶细胞包含癌细胞或是癌细胞。在另一个实施例中，靶细胞包含白血病细胞，特别是急性髓性白血病细胞、乳腺癌细胞，或急性髓性白血病细胞和乳腺癌细胞的组合。
可理解的是，本发明也涉及如上所述的细胞外囊泡在制备向靶细胞递送反义寡核苷酸以抑制基因表达的药物的用途。具体地，反义寡核苷酸、靶细胞和RNA如上所述。
在本发明的第三方面，提供了用于CRISPR基因组编辑系统的将RNA递送至靶细胞的方法，包括以下步骤：a)从血红细胞中提纯细胞外囊泡，其中血红细胞优选地衍生自人类并使用离子载体，具体地是经钙离子载体处理的；b)利用电穿孔使RNA(可以是Cas9 mRNA和/或gRNA)进入所述细胞外囊泡以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及c)将载有RNA的细胞外囊泡应用于靶细胞。CRISPR是一种能够对基因组DNA进行稳健和精确修饰的方法，可广泛地用于多种研究和医学中。该系统可以设计为直接靶向基因组DNA。
在一个实施例中，利用电穿孔使Cas9 mRNA和gRNA进入细胞外囊泡。优选地，Cas9mRNA包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成。此外，gRNA是包含SEQ ID NO：3或由SEQ IDNO：3组成的eGFP gRNA。
在另一个实施例中，利用电穿孔使Cas9和gRNA质粒进入细胞外囊泡。在另一个实施例中，靶细胞包含癌细胞或是癌细胞。
在进一步的实施例中，靶细胞包含白血病细胞或是白血病细胞。在一个具体实施例中，靶细胞包括白血病细胞，特别是急性髓性白血病细胞、乳腺癌细胞，或急性髓性白血病细胞和乳腺癌细胞的组合。
在本发明的第四方面，提供了通过将RNA递送至靶细胞来治疗癌症的方法，包括以下步骤：a)从血红细胞中提纯细胞外囊泡，其血红细胞优选衍生自哺乳动物，特别是人类，使用离子载体特别是钙离子载体处理；b)利用电穿孔使RNA进入EV以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及c)将载有RNA的细胞外囊泡应用于靶细胞，从而抑制靶细胞的生长，其中靶细胞包含癌细胞。
另一方面，本发明提供了细胞外囊泡在制备治疗癌症的药物中的用途，其特征在于，所述细胞外囊泡从血红细胞中提纯出。
在一个实施例中，利用电穿孔使RNA进入所述细胞外囊泡以形成载有RNA的细胞外囊泡。
优选地，所述RNA包括反义寡核苷酸、mRNA或短链RNA。优选地，短链RNA包括gRNA。
在一个实施例中，癌症包括白血病、乳腺癌，或白血病和乳腺癌的组合。在另一个实施例中，癌症包含急性髓性白血病。
附图说明
图1a是显示从人血红细胞(RBC)收集细胞外囊泡(EVs)的过程的示意图。图1b是显示血红细胞细胞外囊泡(RBC EV)的浓度和大小分布的图示。图1c显示了经由蛋白质印迹分析在细胞裂解物和细胞外囊泡中ALIX、TSG101和血红蛋白A的表达。
图2a是细胞外囊泡电穿孔的示意图。图2b显示了使用电穿孔的细胞外囊泡(E-EV)或未电穿孔的细胞外囊泡(UE-EV)培养的珠子的AF647荧光和前向散射(FSC)的FACS分析获得的结果。
图3a是细胞外囊泡摄取测定的示意图。图3b显示了经由蛋白质印迹分析的HBA相对于GAPDH的表达。图3c显示了(经由FACS分析)白血病MOLM13细胞摄取血红细胞细胞外囊泡。
图4a是葡聚糖(Dextran)递送的示意图。图4b显示血红细胞细胞外囊泡(经由FACS分析)将葡聚糖递送至白血病MOLM13细胞。
图5a是反义寡核苷酸(ASO)递送的示意图。图5b显示了从FACS分析获得的结果，其中MOLM13细胞未经处理或与FAM ASO或与电穿孔细胞外囊泡(E-EV)或与未电穿孔的细胞外囊泡(UE-EV)一起培养。图5c是显示图5b的结果的曲线图。图5d是显示处理后FAM阳性细胞的平均百分比的图。具体地，结果显示血红细胞细胞外囊泡向白血病MOLM13细胞递送反义寡核苷酸。
图6a显示了在MOLM13细胞中AF647荧光的FACS分析获得的结果，其未经处理，单独与葡聚糖AF647(Dex-647)，与Dex-647和未电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与载有Dex-647的LipofectaminTM 3000(Lipo3000)，与载有Dex-647干扰素或与Dex-647电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)一起培养24小时。图6b显示了从MOLM13细胞中FAM荧光的FACS分析获得的结果，其未经处理，单独与FAM-ASO，与FAM-ASO和未电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与载有FAM-ASO的Lipo3000，与载有FAM-ASO的干扰素或与FAM-ASO电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(E-EV)处理24小时。
图7a显示处理后MOLM13细胞的细胞死亡/存活率百分比，其单独与葡聚糖AF647(Dex-647)，与Dex-647和未电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与载有Dex-647LipofectaminTM 3000(Lipo3000)，与载有Dex-647的干扰素或与Dex-647电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)一起培养24小时。图7b显示了处理后MOLM13细胞的细胞死亡/存活率的百分比，其单独与FAM-ASO，与FAM-ASO和未电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与载有FAM-ASO的Lipo3000，与载有FAM-ASO的干扰素或与FAM-ASO电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)处理24小时。
图8a是miR-125b ASO递送的示意图。图8b显示处理后MOLM13细胞中miR-125b的表达，其与非电穿孔血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与有阴性对照(NC)-ASO电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)或抗miR-125b ASO(125b-ASO)电穿孔血红细胞细胞外囊泡处理72小时。图8c显示处理后MOLM13细胞中miR-125a的表达，与用非电穿孔血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与阴性对照(NC)-ASO电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)或抗miR-125b ASO(125b-ASO)电穿孔血红细胞细胞外囊泡处理72小时。图8d显示了BAK1相对于GAPDH在MOLM13细胞中的表达，所述MOLM13细胞用与图8b和8c中相同的方法处理。图8e显示了未处理或用UE-EV或如所示的ASO电穿孔细胞外囊泡处理的MOLM13细胞的数量。
图9a是miR-125b ASO递送的示意图。图9b显示用非电穿孔血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)处理后CA1a细胞中miR-125b的表达，与阴性对照(NC)-ASO电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)或抗miR-125b ASO(125b-ASO)电穿孔血红细胞细胞外囊泡处理72小时。图9c显示用非电穿孔血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)处理后CA1a细胞中miR-125a的表达，与阴性对照(NC)-ASO电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)或抗miR-125b ASO(125b-ASO)电穿孔血红细胞细胞外囊泡处理72小时。图9d显示了如上所述的处理后CA1a细胞的结晶紫染色结果。
图10a是Cas9 mRNA递送的示意图。图10b显示用未电穿孔的细胞外囊泡或用5、10或20μg Cas9 mRNA电穿孔的细胞外囊泡处理后MOLM13细胞中Cas9 mRNA的水平，在处理24小时后通过qRT-PCR测定。图10c显示了如上所述的处理后MOLM13细胞的代表性图像。图10d显示了如图10c所示的HA-Cas9蛋白染色阳性的MOLM13细胞的平均百分比。
图11a是RNA递送的示意图。图11b显示了用未经电穿孔的细胞外囊泡或用Cas9和gRNA电穿孔的细胞外囊泡处理后NOMO1-GFP细胞中GFP的FACS分析获得的结果。
图12a是质粒递送的示意图。图12b显示了未处理的293T-eGFP细胞中的GFP的FACS分析结果，或如图所示与未电穿孔的细胞外囊泡(UE-EV)或质粒电穿孔的细胞外囊泡(E-EV)一起培养。图12c显示了由图12b的结果制备的图示。
图13a是体内细胞外囊泡摄取测定的示意图。图13b显示右侧带有未处理肿瘤的裸鼠的荧光图像和左侧注射PKH26标记的(红色)细胞外囊泡的裸鼠的肿瘤荧光图像。图13c显示了处理后72小时肿瘤的体外荧光图像。图13d显示注射PKH26标记的细胞外囊泡后24-72小时肿瘤中荧光信号的总辐射效率(光子/秒)。
具体实施方式
本发明涉及分子生物学和基因组编辑领域。更具体地，通过细胞外囊泡(EV)将遗传物质转移至受体细胞以及从血红细胞中纯化或分离细胞外囊泡或外泌体(exosomes)的方法。
细胞将分别称为内体和质膜来源的不同类型的膜囊泡(称为外泌体和微泡)释放到细胞外环境中。这些细胞外囊泡通过作为膜和细胞溶质蛋白质，脂质和RNA细胞之间转移的载体，其代表细胞间通信的重要模式。
许多细胞类型分泌的细胞外囊泡含有能够改变其他细胞表型的RNA。细胞外囊泡不仅包含RNA，还包含稳定RNA并促进靶细胞中RNA功能的蛋白质。
细胞外囊泡介导的RNA递送是一个有吸引力的平台，因为细胞外囊泡的天然生物相容性是克服大部分体内递送的障碍的解决方案。细胞外囊泡通常是无毒的且无免疫原性的。它们容易被许多细胞类型吸收，但它们确实具有一些抗吞噬细胞标记物，如CD47，它们可以帮助它们逃避网状内皮系统巨噬细胞的吞噬作用。此外，细胞外囊泡能够通过内皮细胞间连接很好地渗透，甚至穿过血脑屏障，因此它们是多功能的药物载体。具有临床价值的是，细胞外囊泡的递送不受由肿瘤细胞经常表现出的P-糖蛋白过表达引起的多药物抗性机制的阻碍，以消除许多化合物。
对于治疗性递送，许多研究小组已经尝试从癌细胞系和干细胞产生细胞外囊泡，由于需要各种补充剂的大规模细胞培养，所述细胞外囊泡细胞非常昂贵。此外，来自癌症和干细胞的细胞外囊泡可能含有促进癌症生长的致癌蛋白或生长因子。来自血浆和血细胞的细胞外囊泡对于癌症疗法更安全。血红细胞细胞外囊泡不含有癌细胞或干细胞的细胞外囊泡中通常含有的致癌DNA/RNA或生长因子，因此，血红细胞细胞外囊泡不会对受体细胞产生任何转化风险。与合成转染试剂不同，血红细胞细胞外囊泡也是无毒的。Wahlgren等人最近的一篇文章描述了用于分离血浆外泌体、衍生自多泡体的小细胞外囊泡，以及用siRNA对这些外泌体进行电穿孔的方案。他们证明载有siRNA的外泌体被单核细胞和淋巴细胞吸收，导致靶基因的显着敲低。该方法可能适用于癌症治疗，然而，血浆外泌体通常非常不均一，因为它们来源于循环中的不同细胞类型，并且来自血浆的外泌体的产量低。另一方面，血红细胞是均质的，因为来自每个个体的血红细胞是相同的。
在本发明中，选择RNA以通过结合miRNA或编辑靶基因组DNA来抑制靶基因的表达。此外，提供了一种用于从血红细胞(RBC)提纯细胞外囊泡和在细胞外囊泡中掺入RNA用于针对癌症(包括急性髓性白血病和乳腺癌)的基因疗法的新方法。
实施例
通过参考以下实施例描述本发明，这些实施例是以举例说明的方式提供的，并不意图以任何方式限制本发明。
实施例1
材料和方法
通过红十字会从香港健康捐赠者处获得血液样本，并获得知情同意书。通过离心将血红细胞与血浆和白细胞分离，并用10mM钙离子载体(Sigma)处理过夜。通过多次离心步骤优化细胞外囊泡的纯化，包括使用60％蔗糖缓冲(100,000xg的超速离心)去除蛋白质污染，产生均匀的细胞外囊泡群，平均直径为～140nm。从～300ml血液中分离的每个血红细胞单位平均产生7.1mg细胞外囊泡。如由蛋白质印迹分析所示，这些细胞外囊泡富含细胞外囊泡标记物、ALIX和TSG101。它们还含有血红蛋白A，其是来自血红细胞的主要蛋白质。
图1a：从离子载体处理的人血红细胞收集培养物上清液，并进行多步离心以除去死细胞和碎片。通过用60％蔗糖缓冲超速离心纯化细胞外囊泡，并通过超速离心(100,000xg)用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤。图1b：通过Nanosight纳米颗粒分析仪测量血红细胞细胞外囊泡的浓度和大小分布。图1c：相对于细胞裂解物中的GAPDH和从血红细胞纯化的细胞外囊泡的ALIX，TSG101(细胞外囊泡标记物)和血红蛋白A(血红细胞标记物)的蛋白质印迹分析。
随后，使用基因脉冲发生X细胞电穿孔仪(BioRad)在不同电压下测试使用与Alexa647(AF647，Thermo Fisher Scientific)缀合的葡聚糖来对血红细胞细胞外囊泡进行优化的电穿孔方案。将电穿孔的细胞外囊泡添加到乳胶珠中并使用流式细胞术分析AF647。发现250V是最佳电压，其导致93.6％的AF647阳性细胞外囊泡结合珠。
图2a：细胞外囊泡电穿孔的示意图：将50μg血红细胞细胞外囊泡与4μg Alexa647(AF647)标记的葡聚糖混合，并在50至250V的不同电压下电穿孔。将细胞外囊泡与乳胶珠培养过夜，并通过荧光激活细胞分选(FACS)分析。图2b：用电穿孔的细胞外囊泡(E-EV)或未电穿孔的细胞外囊泡(UE-EV)培养的珠子的AF647荧光和前向散射(FSC)的FACS分析。在门上方指示AF647阳性珠子的百分比。
为了测量急性髓性白血病(AML)细胞对细胞外囊泡的摄取，血红细胞衍生的细胞外囊泡用称为TR(Thermo Fisher)的荧光膜染料标记。使用蔗糖缓冲充分洗涤标记的细胞外囊泡，模拟电穿孔并加入到AML MOLM13细胞中。与细胞外囊泡培育24小时后，MOML13细胞的蛋白质印迹分析显示血红蛋白A(HBA)蛋白的明显摄取，其在未处理的细胞中不存在。重要的是，如FACS分析所示，用血红细胞细胞外囊泡治疗不影响急性髓性白血病细胞的活力。在与氟硼二吡咯标记的细胞外囊泡培养后，MOLM13细胞变为100％氟硼二吡咯阳性，表明所有细胞都摄取了荧光血红细胞细胞外囊泡。电穿孔增加了MOLM13细胞对HBA的摄取，但没有增加氟硼二吡咯的摄取。
图3a：细胞外囊泡摄取测定的示意图：用氟硼二吡咯TR(红色荧光染料)标记50μg血红细胞细胞外囊泡，洗涤两次，在250V下进行电穿孔，并与MOLM13细胞一起培养24小时。图3b：血红蛋白A(HBA)相对于GAPDH的蛋白质印迹分析；图3c：活细胞的FACS分析，基于大小散射(SSC)和前向散射(FSC)的门控，以及未经处理或与电穿孔细胞外囊泡(E-EV)或未电穿孔的细胞外囊泡培养的MOLM13细胞中的氟硼二吡咯荧光(UE-EV)。
用葡聚糖AF647在电穿孔的情况下进一步测试不同量的EV，发现最佳递送的情况是75μg细胞外囊泡能导致AF647的68.6％阳性细胞。因此，75μg细胞外囊泡用于后续实验。
图4a：葡聚糖递送的示意图：将50-100μg血红细胞细胞外囊泡与4μg葡聚糖AF647混合并在250V电穿孔。将电穿孔的细胞外囊泡与MOLM13细胞一起培养24小时。图4b：未经处理或用50-100μg葡聚糖AF647电穿孔细胞外囊泡(E-EV)或100μg未电穿孔(UE-EV)培养的MOLM13细胞中葡聚糖AF647荧光的FACS分析。
用FAM(绿色荧光)标记的乱序RNA寡核苷酸(Shanghai GenePharma)开始测试RNA的递送，其大约为7kDa，其通常用作阴性对照反义寡核苷酸(ASO)。用FAM ASO电穿孔血红细胞细胞外囊泡并与MOLM13细胞一起培养。24小时后，观察到MOLM13细胞摄取～70％的FAMASO。在另一种急性髓性白血病细胞系NOMO-1细胞中观察到类似的摄取(数据未显示)。
图5a：ASO递送的示意图：75μg血红细胞细胞外囊泡用400pmole FAM荧光标记的乱序ASO(～7kDa)电穿孔，并与MOLM13细胞一起培养24小时。图5b-5d：未经处理或与FAM ASO或电穿孔细胞外囊泡(E-EV)或与未电穿孔的细胞外囊泡(UE-EV)一起培养的MOLM13细胞中的FAM荧光的FACS分析。如图5d所示，从3个独立实验计算FAM阳性细胞的+SEM的平均百分比。
然后将血红细胞细胞外囊泡递送的葡聚糖AF647和FAM ASO与两种商业化的脂质转染试剂LipofectamineTM 3000(Thermo Fisher Scientific)和干扰素TM(Polyplus转染)进行比较，所述脂质转染试剂通常用于转染哺乳动物细胞中的核酸。与先前的实验一致，血红细胞细胞外囊泡将葡聚糖AF647和FAM ASO递送至～75％的MOLM13细胞。在MOML13细胞中，LipofectamineTM 3000仅达到了葡聚糖AF647和FAM ASO的3％和55％的递送，而干扰素仅达到了2.7％和38.7％的葡聚糖AF647和FAM ASO的递送。使用LipofectamineTM 3000和干扰素观察到的不良递送并不令人意外，因为制造商将包括急性髓性白血病细胞的血细胞称为“难以转染”的细胞类型。因此，血红细胞细胞外囊泡达到的75％的递送效率是一个很大的改进。
图6a：未经处理的MOLM13细胞中AF647荧光的FACS分析，仅与4μg葡聚糖AF647(Dex-647)，与Dex-647和未电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与载有Dex-647LipofectaminTM3000(Lipo3000)，与载有Dex-647的干扰素或与Dex-647电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)一起培养24小时。图6b：未经处理的MOLM13细胞中的FAM荧光的FACS分析，其与单独的2minimole FAM-ASO，与FAM-ASO和未电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与载有FAM-ASO的Lipo3000，与载有FAM-ASO的干扰素或与FAM-ASO电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(E-EV)一起培养24小时。
此外，血红细胞细胞外囊泡对细胞没有毒性，相反，使用LipofectamineTM 3000和干扰素进行转染导致细胞死亡增加约20-30％。
基于碘化丙啶(PI)染色和FACS分析确定细胞死亡百分比，如图7a所示：未处理的MOLM13细胞，仅与4μg葡聚糖AF647(Dex-647)，与Dex-647和未电穿孔血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与载有Dex-647的LipofectaminTM 3000(Lipo3000)，与载有Dex-647的干扰素或与Dex-647电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)一起培养24小时；图7b：未处理的MOLM13细胞，仅与2minimole的FAM-ASO，与FAM-ASO和未电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与载有FAM-ASO的Lipo3000，与载有FAM-ASO的干扰素或与FAM-ASO电穿孔血红细胞细胞外囊泡(E-EV)一起培养24小时。从三个独立实验计算平均细胞死亡和SEM。单向Anova试验：**P<0.05；**P<0.01。
进一步测试了血红细胞细胞外囊泡在急性髓性白血病细胞中递送拮抗致癌miR-125b的ASO的治疗潜力。miR-125b在不同类型的癌症中上调，包括急性髓性白血病和其他白血病。已经显示miR-125b通过调节p53网络中的多个基因来抑制细胞凋亡。miR-125b还在人和小鼠模型中促进造血干细胞和白血病细胞的增殖。使用电穿孔将包含SEQ ID NO：1序列的抗miR-125b ASO(Shanghai Gene Pharma)装载到血红细胞细胞外囊泡中，并用这些细胞外囊泡处理MOLM13细胞。72小时后，发现miR-125b的水平以剂量依赖性方式被抑制80-95％。由于与miR-125b的序列相似性，miR-125a(miR-125b的同源物)也被抑制50-80％。miR-125的抑制导致BAK1的显着增加，BAK1是调节细胞凋亡的miR-125a/b的靶标。在培养3-4天后，用miR-125b ASO负载的细胞外囊泡处理也显着抑制MOLM13细胞的生长。因此，在血红细胞细胞外囊泡中使用ASO抑制miR-125b可代表急性髓性白血病治疗的新方法。
如本文所述，miR-125b优选包含SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：4组成，miR-125a优选包含SEQ ID NO：5或由SEQ ID NO：5组成。特别地，miR-125b由SEQ ID NO：4组成，miR-125a由SEQ ID NO：5组成。
图8a：miR-125b ASO递送的示意图：25-100μg血红细胞细胞外囊泡用2μmole抗miR-125b ASO电穿孔并与MOLM13细胞一起培养。该实施方案中的抗miR-125b ASO由SEQ IDNO：1组成。图8b-c：miR-125b和miR-125a相对于U6b snRNA在未经处理的MOLM13细胞中的表达，与100ug未电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与阴性对照(NC)-ASO电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(E-EVs)或抗miR-125b ASO(125b-ASO)电穿孔的血红细胞细胞外囊泡一起培养持续72小时，通过Taqman qRT-PCR测定，以平均值和SEM表示。图8d：与图8b中相同的处理的MOLM13细胞中BAKI相对于GAPDH的表达。图8e：未处理或用UE-细胞外囊泡或如所示的ASO电穿孔细胞外囊泡处理的MOLM13细胞的数量。单向Anova试验：**P<0.01；***P<0.001。
类似地，测试血红细胞细胞外囊泡将miR-125b ASO递送至乳腺癌MCF10aCA1a(CA1a)细胞。发明人观察到用载有miR-125b ASO的细胞外囊泡处理的CA1a细胞中，80-90％的miR-125a和miR-125b被敲低。因此，miR-125s的敲低抑制了CA1a细胞的增殖。
图9a：miR-125b ASO递送的示意图：25-50μg血红细胞细胞外囊泡用2μmole抗miR-125b ASO电穿孔，并与CA1a细胞一起培养。图9b-c：未经处理的CA1a细胞中miR-125b和miR-125a相对于U6b snRNA的表达，与未经电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(UE-EV)，与阴性对照(NC)-ASO电穿孔的血红细胞细胞外囊泡(E-EV)或抗miR-125b ASO(125b-ASO)电穿孔的血红细胞细胞外囊泡一起培养持续72小时，通过Taqman qRT-PCR测定，以平均值和SEM表示。图9d：未处理的CA1a细胞的结晶紫染色，或如所示用UE-EV或ASO电穿孔的细胞外囊泡处理的CA1a细胞的结晶紫染色。条形图表示在结晶紫染色的孔中计数的平均细胞数(n＝3)。单向Anova试验：**P<0.01。
为了测试使用血红细胞细胞外囊泡的CRISPR递送的可行性，使用针对葡聚糖和ASO优化的方案将合成的SpCas9 mRNA(Trilink)电穿孔到血红细胞细胞外囊泡中。结果，在使用qRT-PCR与电穿孔的细胞外囊泡培养24小时后，在MOLM 13细胞中检测到大量的Cas9mRNA。此外，使用HA标签的免疫染色，在处理后48小时，在～50％MOLM13细胞的细胞核(与核染色重叠)中发现了Cas9蛋白。这表明血红细胞细胞外囊泡可用于递送CRISPR Cas9系统。
图10a：Cas9 mRNA递送的示意图：用Cas9 mRNA电穿孔血红细胞细胞外囊泡，并与MOLM13细胞一起培养24或48小时。图10b：未处理的MOLM13细胞中Cas9 mRNA相对于GAPDHmRNA的水平，与未电穿孔的细胞外囊泡或用5、10或20μg Cas9 mRNA电穿孔的细胞外囊泡一起培养，通过qRT-PCR在治疗24小时后测定。值表示为平均值SEM(n＝3)。图10c：MOLM13细胞的代表性图像，其未经处理，或与未电穿孔的细胞外囊泡或与10μg Cas9mRNA电穿孔的细胞外囊泡培养48小时。对细胞进行HA-Cas9蛋白(绿色)和核DNA(Hoechst，蓝色)的染色。图10d：如(c)中所示的HA-Cas9蛋白染色阳性的MOLM13细胞的平均百分比。
随后，发明人将血红细胞细胞外囊泡中的Cas9 mRNA与抗eGFP gRNA一起递送至用eGFP标记的急性髓性白血病细胞NOMO1。一周后，发明人观察到在32.9％NOMOl细胞中完全敲除了eGFP。因此，血红细胞细胞外囊泡递送的RNA能够执行eGFP的CRISPR敲除。如本文所述，Cas9 mRNA优选包含SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：2组成，eGFP gRNA优选包含SEQ IDNO：3或由SEQ ID NO：3组成。特别地，Cas9 mRNA由SEQ ID NO：2组成，eGFP gRNA由SEQ IDNO：3组成。
图11a：RNA递送的示意图：用Cas9 mRNA和抗GFP gRNA电穿孔血红细胞细胞外囊泡，并与NOMO1-GFP细胞一起培养7天。图11b：未处理的NOMO1-GFP细胞中的GFP的FACS分析，与未电穿孔的细胞外囊泡或用Cas9和gRNA电穿孔的细胞外囊泡培养。GFP阴性细胞的百分比显示在门上方。
此外，还测试了通过血红细胞细胞外囊泡递送质粒。用两种质粒电穿孔血红细胞细胞外囊泡，一种表达SpCas9，一种表达针对eGFP的gRNA。将电穿孔的细胞外囊泡与均匀表达eGFP的人胚肾HEK-293T细胞一起培养。96小时后，发现细胞外囊泡处理产生13.8％的GFP阴性细胞，而未处理群体中GFP阴性为3.52％。用电穿孔的细胞外囊泡处理显示GFP阴性细胞的明显峰值，其表明通过递送Cas9和gRNA质粒同源敲除eGFP。因此，血红细胞细胞外囊泡不仅能够提供RNA，还能够提供用于基因组编辑的质粒DNA。此外，该递送适用于HEK-293T固体癌细胞。
图12a：质粒递送的示意图：用Cas9质粒和eGFP gRNA质粒电穿孔血红细胞细胞外囊泡，并与表达293T细胞的eGFP培养96小时。图12b-12c对未处理的293T-eGFP细胞中的GFP进行FACS分析，或者如所示与未电穿孔的细胞外囊泡(UE-EV)或质粒电穿孔的细胞外囊泡(E-EV)培养。GFP阴性细胞用图12b中的百分比和图12c中的箭头表示。
图13a：体内细胞外囊泡摄取测定的示意图。图13b：右侧带有未处理肿瘤的裸鼠的荧光图像和左侧带有PKH26标记的(红色)细胞外囊泡的肿瘤的裸鼠的荧光图像。图13c：处理后72小时肿瘤的体外荧光图像。图13d：注射PKH26标记的细胞外囊泡后24-72小时内肿瘤中荧光信号的总辐射效率(光子/秒)。为了确定血红细胞细胞外囊泡是否被体内肿瘤细胞摄取，将CA1a细胞植入小鼠中，在两侧的侧腹(图13a)。肿瘤大小约为7mm。然后肿瘤内注射100μg的PKH26标记的细胞外囊泡。每天进行荧光实时成像3天(72小时)。拍摄携带未处理肿瘤和注射PKH26标记的(红色)细胞外囊泡的肿瘤的裸鼠图像(图13b)。参考图13c，其显示了处理后72小时肿瘤的体外荧光图像，并证明PKH26标记的细胞外囊泡被肿瘤细胞摄取。如图13d所示，在注射PKH26标记的细胞外囊泡后24至72小时，肿瘤中荧光信号的总辐射效率(光子/秒)逐渐降低。
本领域技术人员将理解，在不脱离广泛描述的本发明的精神或范围的情况下，可以对具体实施方案中所示的本发明进行多种变化和/或修改。因此，本发明的实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制性的。
本领域技术人员还将理解，本发明还可以包括对该方法进行的进一步的其他修改，其不影响该方法的整体功能。
除非另有说明，否则对本文包含的现有技术的任何引用不应视为承认该信息是公知常识。应理解，如果本文提及任何现有技术信息，则此类参考不构成承认该信息形成本领域，任何其他国家的公知常识的一部分。
SEQUENCE LISTING
<110> 香港城市大学
<120> 从血红细胞分离的细胞外囊泡和其用途
<130> I53049LLO
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ucacaaguua gggucucagg ga 22
<210> 2
<211> 4107
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
auggauaaga aauacucaau aggcuuagau aucggcacaa auagcgucgg augggcggug 60
aucacugaug aauauaaggu uccgucuaaa aaguucaagg uucugggaaa uacagaccgc 120
cacaguauca aaaaaaaucu uauaggggcu cuuuuauuug acaguggaga gacagcggaa 180
gcgacucguc ucaaacggac agcucguaga agguauacac gucggaagaa ucguauuugu 240
uaucuacagg agauuuuuuc aaaugagaug gcgaaaguag augauaguuu cuuucaucga 300
cuugaagagu cuuuuuuggu ggaagaagac aagaagcaug aacgucaucc uauuuuugga 360
aauauaguag augaaguugc uuaucaugag aaauauccaa cuaucuauca ucugcgaaaa 420
aaauugguag auucuacuga uaaagcggau uugcgcuuaa ucuauuuggc cuuagcgcau 480
augauuaagu uucgugguca uuuuuugauu gagggagauu uaaauccuga uaauagugau 540
guggacaaac uauuuaucca guugguacaa accuacaauc aauuauuuga agaaaacccu 600
auuaacgcaa guggaguaga ugcuaaagcg auucuuucug cacgauugag uaaaucaaga 660
cgauuagaaa aucucauugc ucagcucccc ggugagaaga aaaauggcuu auuugggaau 720
cucauugcuu ugucauuggg uuugaccccu aauuuuaaau caaauuuuga uuuggcagaa 780
gaugcuaaau uacagcuuuc aaaagauacu uacgaugaug auuuagauaa uuuauuggcg 840
caaauuggag aucaauaugc ugauuuguuu uuggcagcua agaauuuauc agaugcuauu 900
uuacuuucag auauccuaag aguaaauacu gaaauaacua aggcuccccu aucagcuuca 960
augauuaaac gcuacgauga acaucaucaa gacuugacuc uuuuaaaagc uuuaguucga 1020
caacaacuuc cagaaaagua uaaagaaauc uuuuuugauc aaucaaaaaa cggauaugca 1080
gguuauauug augggggagc uagccaagaa gaauuuuaua aauuuaucaa accaauuuua 1140
gaaaaaaugg augguacuga ggaauuauug gugaaacuaa aucgugaaga uuugcugcgc 1200
aagcaacgga ccuuugacaa cggcucuauu ccccaucaaa uucacuuggg ugagcugcau 1260
gcuauuuuga gaagacaaga agacuuuuau ccauuuuuaa aagacaaucg ugagaagauu 1320
gaaaaaaucu ugacuuuucg aauuccuuau uauguugguc cauuggcgcg uggcaauagu 1380
cguuuugcau ggaugacucg gaagucugaa gaaacaauua ccccauggaa uuuugaagaa 1440
guugucgaua aaggugcuuc agcucaauca uuuauugaac gcaugacaaa cuuugauaaa 1500
aaucuuccaa augaaaaagu acuaccaaaa cauaguuugc uuuaugagua uuuuacgguu 1560
uauaacgaau ugacaaaggu caaauauguu acugaaggaa ugcgaaaacc agcauuucuu 1620
ucaggugaac agaagaaagc cauuguugau uuacucuuca aaacaaaucg aaaaguaacc 1680
guuaagcaau uaaaagaaga uuauuucaaa aaaauagaau guuuugauag uguugaaauu 1740
ucaggaguug aagauagauu uaaugcuuca uuagguaccu accaugauuu gcuaaaaauu 1800
auuaaagaua aagauuuuuu ggauaaugaa gaaaaugaag auaucuuaga ggauauuguu 1860
uuaacauuga ccuuauuuga agauagggag augauugagg aaagacuuaa aacauaugcu 1920
caccucuuug augauaaggu gaugaaacag cuuaaacguc gccguuauac ugguugggga 1980
cguuugucuc gaaaauugau uaaugguauu agggauaagc aaucuggcaa aacaauauua 2040
gauuuuuuga aaucagaugg uuuugccaau cgcaauuuua ugcagcugau ccaugaugau 2100
aguuugacau uuaaagaaga cauucaaaaa gcacaagugu cuggacaagg cgauaguuua 2160
caugaacaua uugcaaauuu agcugguagc ccugcuauua aaaaagguau uuuacagacu 2220
guaaaaguug uugaugaauu ggucaaagua auggggcggc auaagccaga aaauaucguu 2280
auugaaaugg cacgugaaaa ucagacaacu caaaagggcc agaaaaauuc gcgagagcgu 2340
augaaacgaa ucgaagaagg uaucaaagaa uuaggaaguc agauucuuaa agagcauccu 2400
guugaaaaua cucaauugca aaaugaaaag cucuaucucu auuaucucca aaauggaaga 2460
gacauguaug uggaccaaga auuagauauu aaucguuuaa gugauuauga ugucgaucac 2520
auuguuccac aaaguuuccu uaaagacgau ucaauagaca auaaggucuu aacgcguucu 2580
gauaaaaauc gugguaaauc ggauaacguu ccaagugaag aaguagucaa aaagaugaaa 2640
aacuauugga gacaacuucu aaacgccaag uuaaucacuc aacguaaguu ugauaauuua 2700
acgaaagcug aacguggagg uuugagugaa cuugauaaag cugguuuuau caaacgccaa 2760
uugguugaaa cucgccaaau cacuaagcau guggcacaaa uuuuggauag ucgcaugaau 2820
acuaaauacg augaaaauga uaaacuuauu cgagagguua aagugauuac cuuaaaaucu 2880
aaauuaguuu cugacuuccg aaaagauuuc caauucuaua aaguacguga gauuaacaau 2940
uaccaucaug cccaugaugc guaucuaaau gccgucguug gaacugcuuu gauuaagaaa 3000
uauccaaaac uugaaucgga guuugucuau ggugauuaua aaguuuauga uguucguaaa 3060
augauugcua agucugagca agaaauaggc aaagcaaccg caaaauauuu cuuuuacucu 3120
aauaucauga acuucuucaa aacagaaauu acacuugcaa auggagagau ucgcaaacgc 3180
ccucuaaucg aaacuaaugg ggaaacugga gaaauugucu gggauaaagg gcgagauuuu 3240
gccacagugc gcaaaguauu guccaugccc caagucaaua uugucaagaa aacagaagua 3300
cagacaggcg gauucuccaa ggagucaauu uuaccaaaaa gaaauucgga caagcuuauu 3360
gcucguaaaa aagacuggga uccaaaaaaa uauggugguu uugauagucc aacgguagcu 3420
uauucagucc uagugguugc uaagguggaa aaagggaaau cgaagaaguu aaaauccguu 3480
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uuuuuagaag cuaaaggaua uaaggaaguu aaaaaagacu uaaucauuaa acuaccuaaa 3600
uauagucuuu uugaguuaga aaacggucgu aaacggaugc uggcuagugc cggagaauua 3660
caaaaaggaa augagcuggc ucugccaagc aaauauguga auuuuuuaua uuuagcuagu 3720
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cagcauaagc auuauuuaga ugagauuauu gagcaaauca gugaauuuuc uaagcguguu 3840
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ccaauacgug aacaagcaga aaauauuauu cauuuauuua cguugacgaa ucuuggagcu 3960
cccgcugcuu uuaaauauuu ugauacaaca auugaucgua aacgauauac gucuacaaaa 4020
gaaguuuuag augccacucu uauccaucaa uccaucacug gucuuuauga aacacgcauu 4080
gauuugaguc agcuaggagg ugacuga 4107
<210> 3
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gggcacgggc agcuugccgg 20
<210> 4
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<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
ucccugagac ccuaacuugu ga 22
<210> 5
<211> 24
<212> RNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
ucccugagac ccuuuaaccu guga 24
Claims (24)
1.一种用于向靶细胞递送RNA的方法，包括：
a)从血红细胞提纯细胞外囊泡；
b)利用电穿孔使RNA进入细胞外囊泡，以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及
c)将所述载有RNA的细胞外囊泡应用于所述靶细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述血红细胞衍生自人类并经钙离子载体处理。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述细胞外囊泡通过使用蔗糖缓冲超速离心以从处理过的血红细胞中纯化。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RNA包括反义寡核苷酸、mRNA或短链RNA。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞包括癌症细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞包括急性髓性白血病细胞、乳腺癌细胞，或急性髓性白血病细胞和乳腺癌细胞的组合。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，利用电穿孔使拮抗miR-125b的反义寡核苷酸进入细胞外囊泡。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述靶细胞的生长受到抑制。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用电穿孔导入小分子化合物进入细胞外囊泡中。
10.如权利要求1所述的方法，包括向所述靶细胞施用载有RNA的细胞外囊泡，其调节凋亡相关的基因表达，从而在所述靶细胞中诱导细胞凋亡。
11.一种向靶细胞递送反义寡核苷酸以抑制基因表达的方法，其特征在于，所述方法包括：
a)从血红细胞中提纯细胞外囊泡；
b)利用电穿孔刺激细胞外囊泡，使RNA进入细胞外囊泡以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及
c)将所述载有RNA的细胞外囊泡应用于所述靶细胞。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述血红细胞衍生自人类并经钙离子载体处理。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述RNA是拮抗miR-125b的反义寡核苷酸，以抑制所述靶细胞中的致癌miR-125b。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是急性髓性白血病细胞、乳腺癌细胞，或急性髓性白血病细胞和乳腺癌细胞的组合。
15.一种用于CRISPR基因组编辑系统的将RNA递送至靶细胞的方法，包括：
a)从血红细胞中提纯细胞外囊泡；
b)使用RNA进行所述细胞外囊泡的电穿孔所述以形成载有RNA的细胞外囊泡；以及
c)将所述载有RNA的细胞外囊泡应用于所述靶细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，利用电穿孔使Cas9 mRNA和gRNA进入细胞外囊泡。
17.如权利要求15所述的方法，其特征在于，利用电穿孔使能转录Cas9 mRNA和gRNA的质粒进入细胞外囊泡。
18.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是癌症细胞。
19.如权利要求15所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是白血病细胞。
20.细胞外囊泡在制备治疗癌症的药物中的用途，其特征在于，所述细胞外囊泡从血红细胞中提纯出。
21.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述利用电穿孔使RNA进入细胞外囊泡以形成载有RNA的细胞外囊泡。
22.如权利要求21所述的用途，其特征在于，所述RNA包括反义寡核苷酸、mRNA或短链RNA。
23.如权利要求20所述的用途，其特征在于，所述癌症包括白血病、乳腺癌，或白血病和乳腺癌的组合。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述癌症包括急性髓性白血病。
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