CN115717142B - silncRNA16及其治疗铂类耐药肿瘤中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种silncRNA16以及以silncRNA16制备的Nano‑silncRNA16纳米靶向药物，该silncRNA16及Nano‑silncRNA16纳米靶向药物可以用于逆转肿瘤铂类化疗耐药。其中本发明所提供的silncRNA16可特异性结合并抑制lncRNA16的表达。本发明所提供的Nano‑silncRNA16纳米药物在耐药NSCLC中富集、并将silncRNA16高效递送至肿瘤细胞内，实现精准靶向lncRNA16，进而促进线粒体ROS生成，从而逆转肿瘤铂类化疗耐药。

Description

silncRNA16及其治疗铂类耐药肿瘤中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种新型的纳米靶向药物及其用途，具体涉及一种silncRNA16、纳米靶向药物在治疗铂类耐药肿瘤中的用途。

背景技术

肺癌是人类发病率和死亡率第一的恶性肿瘤，严重危害人类生命健康。临床研究表明，以铂类为基础的一线全身治疗进行3-4周期后，1/3-3/4的非小细胞肺癌(NSCLC)患者会产生明显耐药，且没有有效的二线药物。

研究显示，化疗耐药的原因涉及多个方面，最新研究显示活性氧(ROS)生成减少和清除增加是促进化疗耐药的重要原因。据报道，耐药癌细胞中ROS清除能力增加，抗氧化酶的活性增强，使耐药癌细胞中ROS浓度显著降低，避免细胞凋亡，加剧了肿瘤耐药。显然，细胞保护性抗氧化已成为有效抗肿瘤治疗的障碍。缺乏有效的治疗靶点、体内干预效果差、高效成熟的递送材料缺乏是克服化疗耐药的主要障碍，确定调节ROS浓度的新靶点，开发有效克服铂类耐药的新方法是临床的迫切需要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种silncRNA16，该silncRNA16可特异性结合并抑制lncRNA16，从而实现对由于肿瘤细胞中ROS浓度降低引起的耐药肿瘤的治疗。

本发明的另一目的在于提供一种纳米靶向药物。

本发明的第三个目的在于提供上述silncRNA16或纳米靶向药物的用途。

为了实现上述目的，本发明提供一种silncRNA16，该silncRNA16的正义链序列如Seq ID No.1所示：5’-CUCUAGGUACUACUAACCATT-3’；该silncRNA16的反义链序列如Seq IDNo.2所示：5’-UGGUUAGUAGUACCUAGAGTT-3’。

如上所述地，进一步在所述silncRNA16的正义链的5’端、反义链的5’端、反义链的3’端其中之一的位置进行荧光修饰-化学修饰的联合修饰；或在所述silncRNA16的正义链的5’端、反义链的5’端、反义链的3’端中的任意两个位置分别进行荧光修饰和化学修饰。

如上所述地，当进行荧光修饰-化学修饰的联合修饰时，化学修饰直接与silncRNA16的正义链的5’端、反义链的5’端或反义链的3’端连接。

如上所述地，所述荧光修饰使用的荧光染料为FAM、VIC、JOE、TET、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED460、FITC、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7或cy7.5；所述化学修饰为胆固醇修饰、甲基化修饰、氟代修饰、氯代修饰中的一种或多种的联合修饰。

如上所述地，所述silncRNA16特异性结合并抑制lncRNA16表达。

本发明还提供一种纳米靶向药物，由上述的silncRNA16与药学上可接受的载体和/或辅料组成。

如上所述地，所述的药学上可接受的载体为N-乙酰半乳糖胺分子、脂质体、纳米凝胶、纳米棒、胶束、纳米微球、碳纳米管、树形分子或外泌体。

本发明还提供上述silncRNA16或纳米靶向药物在制备逆转肿瘤铂类化疗耐药的药物中的用途。

如上所述地，该肿瘤为肺肿瘤。

本发明还提供一种药物组合物，由上述silncRNA16或纳米靶向药物，和铂类药物组成。

优选地，所述铂类药物为顺铂、卡铂或奈达铂。

如上所述地，上述silncRNA16或纳米靶向药物按照5mg/kg的用量皮下给药，然后第二日将铂类药物按照0.5mg/kg的用量腹腔注射给药。

本发明所提供的silncRNA16能够沉默顺铂耐药A549细胞(以下简称为A549/DDP细胞)中lncRNA16的表达的同时，促进细胞ROS产生，提高顺铂耐药的非小细胞肺癌(NSCLC)对顺铂的敏感性。

本发明通过向铂类耐药的机体给药治疗的silncRNA16或纳米靶向药物Nano-silncRNA16，实现逆转肿瘤铂类耐药。本发明通过RT-qPCR分析NSCLC患者血浆lncRNA16含量与铂类药物化疗响应的相关性，发现lncRNA16在铂类不响应NSCLC患者血浆中高表达，且耐药后lncRNA16含量较治疗前显著升高。通过siRNA下调lncRNA16的表达，促进ROS浓度上调，从而抑制A549/DDP细胞的生长，说明lncRNA16是顺铂耐药过程中潜在的关键靶点，通过N-乙酰半乳糖胺(GalNAC)递送silncRNA16在体内有效抑制lncRNA16，从而恢复耐顺铂NSCLC对顺铂的敏感性。

本发明的有益效果在于：

本发明提供一种silncRNA16或纳米靶向药物，该silncRNA16或纳米靶向药物在耐药NSCLC中富集、并将silncRNA16高效递送至A549/DDP细胞内，实现精准靶向lncRNA16，促进线粒体ROS生成，在体内体外实现逆转耐药NSCLC对顺铂耐药的效果。

附图说明

图1A为NSCLC化疗响应组和不响应组的患者血浆lncRNA16含量在铂类治疗前的统计图。

图1B为NSCLC化疗响应组和不响应组的患者血浆lncRNA16含量在铂类治疗后的统计图。

图1C为NSCLC化疗响应组和不响应组的患者血浆lncRNA16在铂类治疗前后的表达对比统计图。

图2为顺铂敏感株A549和顺铂耐药株A549/DDP中lncRNA16的比较。

图3A为通过流式细胞术比较顺铂敏感株A549和顺铂耐药株A549/DDP中ROS浓度的差异。

图3B通过流式细胞术比较顺铂敏感株A549和顺铂耐药株A549/DDP中ROS浓度差异的统计图。

图4为pGPU6/Neo的质粒图谱。

图5为顺铂耐药株A549/DDP中lncRNA16敲低后的ROS变化图。

图6为不同序列silncRNA16对A549/DDP细胞中lncRNA16的沉默效率统计图。

图7A为克隆形成检测不同序列silncRNA16对A549/DDP细胞的生长抑制作用。

图7B为克隆形成检测不同序列silncRNA16对A549/DDP细胞的生长抑制作用的统计图。

图8为A549/DDP细胞对化学修饰的cy3-silncRNA16#2的摄取照片图。

图9为给药15分钟-12小时后在裸鼠重要脏器及肿瘤中cy3-silncRNA16#2的富集。

图10A为裸鼠接受治疗期间体重的变化折线图。

图10B为cy3-silncRNA16#2在体内对耐药NSCLC的生长抑制作用肿瘤图示。

图10C为cy3-silncRNA16#2在体内对耐药NSCLC的生长抑制作用肿瘤重量统计图。

图10D为cy3-silncRNA16#2治疗对裸鼠肝肾结构的影响。

图11A为Nano-silncRNA16纳米粒的透射电镜图示。

图11B为Nano-silncRNA16纳米粒的粒径分布。

图11C为通过质谱技术检测Nano-silncRNA16纳米粒的分子量。

图12为A549/DDP细胞对Nano-silncRNA16纳米药物的摄取照片图。

图13为silncRNA16与Nano-silncRNA16对lncRNA16敲低效率的比较。

图14A为给药0.5小时、2小时后，Nano-silncRNA16纳米药物与silncRNA16在裸鼠重要脏器及肿瘤中的富集比较图示。

图14B为给药0.5小时、2小时后，Nano-silncRNA16纳米药物与silncRNA16在裸鼠重要脏器及肿瘤中的富集比较的统计图示。

图15A为Nano-silncRNA16纳米药物联合顺铂对耐药NSCLC的生长抑制作用肿瘤图。

图15B为Nano-silncRNA16纳米药物联合顺铂对耐药NSCLC的生长抑制作用肿瘤重量统计图。

图16A为Nano-silncRNA16纳米药物联合顺铂对裸鼠体重的影响折线图。

图16B为Nano-silncRNA16纳米药物联合顺铂对裸鼠心脾肺肾肝结构的影响图示。

图17A至图17G显示为Nano-silncRNA16纳米药物联合顺铂对裸鼠肝功能的影响，主要包括对肝中总蛋白、白蛋白、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸转氨酶、碱性磷酸酶、γ-谷氨酰转移酶、直接胆红素的影响。

图18A至图18C显示为Nano-silncRNA16纳米药物联合顺铂对裸鼠肾功能的影响，其中包括对肌酐、尿素、尿酸的影响。

图19A至图19B为Nano-silncRNA16纳米药物联合顺铂对裸鼠心肌酶的影响，其中包括对乳酸脱氢酶、肌酸激酶的影响。

具体实施方式

下面将对本发明的实施例进行详细、完善的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)长度超过200个碱基对，缺乏蛋白质编码功能。虽然在调节健康组织中的蛋白质翻译中发挥重要作用，但LncRNAs表达/功能的失调被认为是某些癌症的重要原因。LncRNA既可以作为癌基因，也可以作为肿瘤抑制因子。发明人在此基础上筛选鉴定了一系列LncRNA，其中，LncRNA16是小核仁RNA宿主基因1(SNHG1)反义链的一段长为240bp的转录本。SNHG1在肿瘤中普遍高表达，发挥促癌作用，促进肿瘤细胞的增殖和肿瘤进展。经鉴定LncRNA16在肺癌具有差异化表达，与临床上广泛用作肺癌评估的指标CEA，CA199，CA125，NSE，CYFRA21-1，SCC相比，lncRNA16具有更高的阳性率，高达64.29％，表明LncRNA16是肺癌早期诊断的有效指标。

在下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。

材料：

1.人源非小细胞肺癌细胞系A549、A549/DDP为商业化细胞系，购买自青旗(上海)生物技术发展有限公司。

2.shlncRNA16质粒委托苏州吉玛基因股份有限公司制备，所用载体为pGPU6/Neo。

3.SPF级BALB/c裸鼠，4周龄、雌性，购买自北京维通利华实验动物技术有限公司。

4.顺铂冻干粉购买自Selleck公司，产品编号S1166。

5.DMEM培养基购买自北京索莱宝科技有限公司，产品编号11995；FBS购买自依科赛生物科技(太仓)有限公司，产品编号FSP500；青链霉素混合液(100×)购买自北京索莱宝科技有限公司，产品编号P1400；500mL DMEM培养基中加入5mL青链霉素混合液(100×)、50mL FBS即为DMEM完全培养基。

6.Opti-MEM^TM减血清培养基购买自赛默飞世尔科技，产品编号31985070。

7.转染试剂Lipofectamine 2000Reagent(Lipofectamine 2000)购买自赛默飞世尔科技，产品编号11668030。

8.BIOG cfRNA Easy Kit购买自常州百代生物科技股份有限公司，产品编号51028。

9.PrimeScript^TMRT Reagent Kit with gDNA Eraser购买自宝日医生物技术(北京)有限公司，产品编号RR047Q。

10.TB

Premix Ex Taq^TMII(Tli RNaseH Plus)购买自宝日医生物技术(北京)有限公司，产品编号RR820L。

11.MitoSOX^TMRed线粒体超氧化物指示剂购买自赛默飞世尔科技，产品编号M36008。

12.GP-transfect-Mate转染液购买自上海吉玛制药技术有限公司，产品编号G04008。

13.BD EDTA一次性真空采血管购买自北京优尼康生物科技有限公司，产品编号367525。

14.0.25％胰蛋白酶溶液购买自武汉普诺赛生命科技有限公司，产品编号PB180227。

15.血球计数板购买自杭州晓柚生物科技有限公司，产品编号02-671-5。

16.Hoechst 33342购买自碧云天生物技术有限公司，产品编号C1025。

17.基质胶购买自北京索莱宝科技有限公司，产品编号356234。

实施例1：lncRNA16在铂类治疗前后的含量变化

1.患者标本收集

(1)纳入标准：

a)确诊为NSCLC且需要行辅助化疗的患者；

b)在a)的基础上，化疗方案统一，以铂类为主或铂类联用其他药物。铂类为顺铂、卡铂或奈达铂中的一种，联用的其他药物为培美曲塞、吉西他滨、紫杉醇脂质体、白蛋白紫杉醇中的一种。

由于临床患者的标准化疗没有单用铂类的方案，一般都联用上述其他药物，以下实验仅测试铂的耐药问题。

(2)标本收集：

a)辅助化疗前的静脉血标本，用以评估初始lncRNA16含量。

b)辅助化疗2-4个周期的静脉血标本，用以评估治疗后lncRNA16含量。

(3)疗效评价：参照实体肿瘤疗效评价标准RECIST对疗效进行评价，按照疗效对患者进行分组分析。

(4)分离血浆：采集8mL静脉血于BD EDTA一次性真空采血管中，采集过程由护士完成。将采血管置于离心机中，4℃，400g离心20分钟，血液分为两层，上层即为血浆，将血浆吸出存放于2mL EP管中。

2.血浆总RNA提取

使用BIOG cfRNA Easy Kit提取血浆总RNA，实施步骤按照说明书进行，其中所用吸附柱、洗涤液A、洗涤液B、RNA carrier、裂解液、消化液、洗脱液均包含在BIOG cfRNAEasy Kit中。

具体步骤如下：

(1)自行准备：无水乙醇、无RNA酶1.5mL离心管。

(2)取出洗涤液，按以下操作：

a)洗涤液A工作液配置：21mL洗涤液A中加入9mL无水乙醇。

b)洗涤液B工作液配置：9mL洗涤液B中加入21mL无水乙醇。

c)配置好的洗涤液A、B工作液如出现沉淀，可在37℃溶解，摇匀后使用。

(3)取无RNA酶的1.5mL离心管，加入200μL血浆，4μL RNA carrier混合均匀，随后加入300μL裂解液及20μL消化液，震荡10秒，充分混匀，56℃水浴10分钟至完全裂解。

(4)加入1000μL无水乙醇，轻轻颠倒混匀，如有半透明悬浮物，不影响RNA的提取及后续实验。

(5)将吸附柱放入收集管内，将760μL上述溶液转入吸附柱内，静置2分钟，12000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液。

(6)将剩余760μL溶液转移至吸附柱内，重复步骤(5)。

(7)将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液A工作液至吸附柱内，12000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液。

(8)将吸附柱放回收集管内，加500μL洗涤液B工作液至吸附柱内，12000rpm 4℃离心1分钟，弃收集管内废液。

(9)将吸附柱放回收集管内，12000rpm 4℃离心2分钟，弃收集管内废液。

(10)取出吸附柱，放入新的无RNA酶的1.5mL离心管内，加入30-50μL洗脱液，静置3分钟，12000rpm 4℃离心2分钟，所得RNA溶液即为总RNA。

3.逆转录

使用PrimeScript^TMRT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒进行逆转录，按照说明书进行操作，具体步骤如下：

(1)去除基因组DNA反应：按照如下表1于冰上配置反应混合液I，为了保证反应液配置的准确性，先按反应数+2的量配置，然后分装到每个反应管中，最后加入步骤2所得的总RNA样品。

表1：反应混合液I

试剂	使用量
		5xgDNA Eraser Buffer	2.0μL
gDNA Eraser	1.0μL
		Total RNA	*
RNase Free dH2O	Up to 10μL

上述混合液于42℃反应2分钟。Total RNA中*即为总RNA，20μL反转录反应体系中，最多使用1μg的总RNA。

(2)反转录反应：为了保证反应液配置的准确性，先按反应数+2的量配置如下表2的反应混合液II，然后分装10μL到每个反应管中，再与步骤(1)的反应混合液I按照表3制成反应体系，轻柔混匀后立即进行反转录反应得到cDNA。

表2：反应混合液II

表3：反应体系

试剂	使用量
		步骤(1)的反应混合液I	10.0μL
Master Mix	10.0μL
		Total	20.0μL

反转录程序为：37℃15分钟，随后85℃5秒，最后4℃保存cDNA。

4.定量聚合酶链反应(qPCR)

(1)设计lncRNA16引物：lncRNA16正向引物序列如：Seq ID No.3所示：5’-GATGACAGTCTGCCTCTATCTTAC-3’；lncRNA16反向引物序列如：Seq ID No.4所示：5’-CTTTGAGCCAAGCAGGTTATTG-3’。该lncRNA16的正向引物和反向引物委托广州天一辉远基因科技有限公司合成。

(2)使用试剂盒TB

Premix Ex Taq^TMII按照如下表4成分于冰上配置PCR反应混合液。

表4：PCR反应混合液

试剂	使用量
		TB Green Primix Ex Taq II	10μL
PCR Forwad Primer(10μM)	0.8μL
		PCR Reverse Primer(10μM)	0.8μL
ROX Reference Dye II(50X)	0.4μL
		步骤3制备的cDNA	2μL
RNase Free dH2O	6μL
		Total	20μL

PCR反应在Applied Biosystems 7500系统上进行。程序设置如下：Stage 1：预变性(Reps 1；95℃30秒)；Stage 2：PCR反应(Reps 40；95℃5秒，60℃34秒)；Stage 3：溶解曲线分析(Reps 1；95℃15秒，65℃60秒，95℃15秒)。

5.数据收集及处理

参照上述纳入标准，共收集NSCLC患者静脉血16例，按照疗效评价对其分组，其中化疗响应的患者4例(设为响应组)，化疗不响应的患者12例(设为不响应组)。

化疗响应表示化疗对该患者有效，根据实体肿瘤疗效评价标准RECIST进行评估，包括完全缓解和部分缓解。完全缓解的定义：所有可见病灶完全消失并至少维持4周以上。部分缓解定义：肿瘤病灶的最大径及其最大垂径的乘积减少50％以上，维持4周以上。

化疗不响应表示化疗对该患者无效，包括疾病稳定和病变进展。疾病稳定定义：病情无明显变化至少4周，估计肿瘤大小减少不足50％或是增大不到25％。疾病进展：有新病变出现，或原有病变估计增大25％或超过25％。

通过RT-qPCR比较lncRNA16在响应组和不响应组患者治疗前后的变化，结果如图1A至图1C所示。其中，图1A为响应组和不响应组的患者血浆lncRNA16在铂类治疗前的含量，从图1A可以看出治疗前化疗不响应的患者血浆lncRNA16的含量更高，是化疗响应患者的4.931倍；图1B为响应组和不响应组的患者血浆lncRNA16在铂类治疗后的含量，从图1B可以看出化疗不响应的患者血浆中lncRNA16含量是响应患者的约91.3倍；图1C为治疗前后的lncRNA16含量的比较，可见化疗不响应的患者血浆lncRNA16的含量在治疗后有更显著的升高，升高了115.8倍，而化疗响应的患者lncRNA16降低了1.431倍。因此，lncRNA16在铂类不响应NSCLC患者血浆中高表达，且耐药后lncRNA16含量较治疗前显著升高，表明lncRNA16是预测化疗响应的潜在标志物。

实施例2：顺铂敏感株A549细胞和顺铂耐药株A549/DDP细胞中lncRNA16的比较

1.细胞铺板

(1)分别取对数生长期的A549及A549/DDP细胞，各加入1mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化1分钟后加入1mL DMEM完全培养基中和，吹散细胞，采用血球计数板计算细胞浓度，将细胞以2×10⁶个/孔加入到六孔板中，随后加入DMEM完全培养基至2mL进行培养。

(2)待A549细胞或A549/DDP细胞的细胞密度达到90％左右时，弃去细胞上清，使用PBS缓冲液将细胞洗2次，准备提取总RNA。

2.提取总RNA

每孔加入1mL Trizol，冰上静置15分钟后转移至1.5mL无RNA酶的EP管。随后每管加入200μL氯仿，震荡混匀后冰上静置10分钟，12000g 4℃离心15分钟。收集上清转移至新的1.5mL无RNA酶的EP管，1:1加入异丙醇，-20℃静置30分钟后12000g 4℃离心10分钟。弃上清，加入冰上预冷的DEPC水稀释的75％的乙醇，轻轻上下混匀，12000g 4℃离心10分钟。弃上清，EP管室温干燥5-10分钟，加入20μL DEPC水于55-60℃溶解即获得总RNA。使用ThermoScientific NanoDrop分光光度计测总RNA浓度。

3.RT-qPCR

实验步骤和引物参照实施例1中步骤3-4。

4.数据收集及处理

通过RT-qPCR检测A549、A549/DDP中lncRNA16的表达量，结果如图2所示。从图2可以看出：lncRNA16在A549/DDP中的表达显著高于A549细胞，综合实施例1中的结论可知，lncRNA16促进铂类耐药且其表达量高低与患者铂类药物化疗响应相关。

实施例3：顺铂敏感株A549和顺铂耐药株A549/DDP中ROS浓度的比较以及在A549/DDP中敲低lncRNA16后的ROS变化

(一)比较A549和A549/DDP中ROS浓度，步骤如下：

1.细胞铺板

(1)取对数生长期的A549及A549/DDP细胞，加入1mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化1分钟后加入1mL DMEM完全培养基中和，吹散细胞，采用血球计数板计算细胞浓度，将细胞以2×10⁶个/孔加入到六孔板中，随后加入DMEM完全培养基至2mL进行培养。

(2)待细胞密度达到90％左右时，弃去细胞上清，使用PBS缓冲液将细胞洗2次，准备对细胞中ROS进行标记。

2.细胞ROS标记

使用PBS缓冲液将MitoSOX^TMRed线粒体超氧化物指示剂稀释至浓度为5μM配制成Mito-SOX工作液，在6孔板中每个含细胞的孔中加入100μL的Mito-SOX工作液进行细胞染色10分钟，随后去除Mito-SOX工作液，将细胞用PBS缓冲液冲洗2遍。其中MitoSOX^TMRed线粒体超氧化物指示剂与ROS结合可产生荧光。

3.细胞ROS上机检测

通过BD Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences，USA)进行检测A549、A549/DDP中ROS的浓度，流式结果如图3A所示，A549/DDP中的ROS浓度显著低于A549细胞。图3B为该实验的统计学分析结果，表明A549/DDP中ROS浓度低于A549细胞，且这种差异极其显著，表明lncRNA16可以抑制ROS生成。

(二)shlncRNA16质粒的构建

设计shlncRNA16序列用于敲低lncRNA16，并设计shlncRNA16#NC序列作为阴性对照，shlncRNA16#NC序列不会对lncRNA16的表达产生干扰。

shlncRNA16序列设计两条：shlncRNA16#1和shlncRNA16#2用于比较敲低lncRNA16的效率。

shlncRNA16#1序列的正义链如Seq ID No.5所示；5’-GGTGAATACAGGTATTCCTGA-3’；反义链如Seq ID No.6所示：5’-CCACTTATGTCCATAAGGACT-3’。

shlncRNA16#2序列的正义链如Seq ID No.7所示；5’-GCTCAAAGGGCCAGCACCTTC-3’；反义链如Seq ID No.8所示；5’-CGAGTTTCCCGGTCGTGGAAG-3’。

shlncRNA16#NC序列的正义链如Seq ID No.9所示；5’-CCGGCAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTGTTTTTG-3’；反义链如Seq ID No.10所示；5’-AATTCAAAAACAACAAGATGAAGAGCACCAACTCGAGTTGGTGCTCTTCATCTTGTTG-3’。

委托苏州吉玛基因股份有限公司构建表达上述shlncRNA16#1序列、shlncRNA16#2序列或shlncRNA16#NC序列的shRNA质粒。构建策略为(5’-3’)：按照顺序设计插入序列：BbsⅠ酶切位点-正义链序列-9nt loop接头序列(序列为：TTCAAGAGA)-反义链序列-RNA聚合酶III终止子(序列为：TTTTTT)-BamHⅠ酶切位点。将如图4所示的pGPU6/Neo空载体用BbsⅠ和BamHⅠ双酶切，用T4 DNA连接酶将插入序列插入到双酶切后的pGPU6/Neo空载体中，构成重组质粒。采用常规技术将重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5α，使用抗生素Neomycin进行筛选，扩增、纯化，分别得到shlncRNA16#NC质粒、shlncRNA16#1质粒或shlncRNA16#2质粒。

(三)在A549/DDP中敲低lncRNA16后的ROS检测步骤如下：

1.细胞铺板

取对数生长期的A549/DDP细胞，加入1mL 0.25％胰蛋白酶溶液消化1分钟后加入1mL DMEM完全培养基中和，吹散细胞，采用血球计数板计算细胞浓度，将细胞以2×10⁶个/孔接种于共聚焦小皿中，随后加入DMEM完全培养基至1mL进行培养。待细胞密度约为40％-50％时，将细胞用PBS缓冲液清洗2遍，随后进行细胞转染。

2.细胞转染

加入1.5mL Opti-MEM^TM减血清培养基于六孔板每个孔中。以下为六孔板的一个孔所需转染液的配置：取一个1.5mL无RNA酶的EP管，将2μgshlncRNA16#NC质粒用250μL Opti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟；另取一个1.5mL无RNA酶的EP管将5μL Lipofectamine2000用250μL Opti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟，随后将两管混合成转染溶液，放置20分钟，最后将转染溶液全部加入六孔板的一个孔中，在二氧化碳恒温培养箱中孵育6小时后，将转染溶液更换成DMEM完全培养基，继续培养24小时。shlncRNA16#1质粒和shlncRNA16#2质粒的转染方法与shlncRNA16#NC质粒转染方法一致。

3.细胞ROS标记

使用PBS缓冲液将MitoSOX^TMRed线粒体超氧化物指示剂稀释至浓度为5μM配制成Mito-SOX工作液，在6孔板中每个含细胞的孔中加入100μL的Mito-SOX工作液进行细胞染色10分钟。其中MitoSOX^TMRed线粒体超氧化物指示剂与ROS结合可产生荧光。

4.细胞核染色

ROS标记结束后，去除Mito-SOX工作液，将细胞用PBS缓冲液冲洗2遍，随后将Hoechst 33342用PBS缓冲液稀释10000倍，此时得到Hoechst 33342工作液。将250μLHoechst 33342工作液加入至细胞中，37℃孵育30分钟，用PBS缓冲液洗3遍，最后加入1mLPBS缓冲液。

5.细胞ROS检测

通过激光共聚焦显微镜检测ROS浓度。

通过激光共聚焦显微镜检测激发光波长为510nm的荧光强度以评估A549/DDP细胞内lncRNA16被敲低后ROS浓度的变化，结果如图5所示。Mito-SOX的荧光围绕在细胞核周围，荧光越强代表ROS浓度越高，此外Hoechst33342显示了细胞核的形态为圆形，Merged图为同时显示ROS浓度与细胞核的荧光，从图5可以看出，lncRNA16被敲低后细胞中Mito-SOX的荧光强度增强，表明ROS浓度有显著上升，因此说明抑制lncRNA16的表达促进ROS浓度的增加。

实施例4：比较不同序列silncRNA16对A549/DDP细胞中lncRNA16的沉默效率及对细胞增殖抑制作用。

1.siRNA序列设计及合成

silncRNA16#NC的正义链序列如Seq ID No.11所示：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′；反义链序列如Seq ID No.12所示：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。

silncRNA16#1的正义链序列如Seq ID No.13所示：5′-CUUCAGAGCUGAGAGCUUUTT-3′；反义链序列如Seq ID No.14所示：5′-AAAGCUCUCAGCUCUGAAGTT-3′。

silncRNA16#2的正义链如Seq ID No.1所示：5′-CUCUAGGUACUACUAACCATT-3′；反义链如Seq ID No.2所示：5′-UGGUUAGUAGUACCUAGAGTT-3′。

将双链silncRNA16#NC、silncRNA16#1、silncRNA16#2委托苏州吉玛基因股份有限公司合成。

2.细胞铺板

取对数生长期的A549/DDP细胞，采用PBS缓冲液清洗后加入0.25％胰蛋白酶溶液1mL，消化1分钟后加入1mL DMEM完全培养基中和，吹散细胞，采用细胞计数板计算细胞浓度，将细胞以2×10⁶个/孔加入到六孔板中进行培养。

3.细胞转染

待细胞密度达40％-50％时，吸弃培养液，使用PBS缓冲液将细胞洗2遍后加入1.5mL Opti-MEM^TM减血清培养基于六孔板的每个孔中。以下为六孔板的一个孔所需转染液的配置：取1个1.5mL无RNA酶的EP管，将100pmol silncRNA16#NC/silncRNA16#1/silncRNA16#2用250μL Opti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟；另取一个1.5mL无RNA酶的EP管将5μL Lipofectamine 2000用250μL Opti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟，随后将两管混合成转染溶液，放置20分钟，最后将转染溶液全部加入六孔板的一个孔中，在二氧化碳恒温培养箱中孵育6h后，将转染溶液更换成DMEM完全培养基，继续培养24小时。

4.总RNA提取及RT-qPCR

将转染了silncRNA16#NC或silncRNA16#1或silncRNA16#2的细胞按照实施例2步骤2-3进行总RNA提取及RT-qPCR。统计转染后A549/DDP细胞中lncRNA16表达量下降程度，如图6所示。从图6可以看出，与转染了silncRNA16#NC的A549/DDP细胞相比，转染silncRNA16#1的A549/DDP细胞中silncRNA16#1对lncRNA16表达量的敲低效率为40％；与转染了silncRNA16#NC的A549/DDP细胞相比，转染silncRNA16#2的A549/DDP细胞中silncRNA16#2对lncRNA16表达量的敲低效率为60％。

5.克隆形成实验

(1)对数生长期的A549/DDP细胞，采用PBS缓冲液清洗后加入0.25％胰蛋白酶溶液1mL，消化1分钟后加入1mL DMEM完全培养基中和，吹散细胞，采用细胞计数板计算细胞浓度，将细胞以1×10³个/孔加入到六孔板中进行培养。

(2)铺板次日按照步骤2分别转染siRNA，七日后重复转染一次。

(3)14天后移除培养基，使用1％的结晶紫染液对细胞染色15分钟，自来水冲洗风干后计数超过50个细胞的克隆，结果如图7A所示和图7B所示。

其中，图7A显示检测silncRNA16#1或silncRNA16#2对A549/DDP细胞的生长抑制作用，图7B显示克隆形成检测silncRNA16#1或silncRNA16#2对A549/DDP细胞的生长抑制作用的统计图。从图7A可以看出，silncRNA16#1对A549/DDP细胞的克隆生长无抑制作用，silncRNA16#2对A549/DDP细胞的克隆生长有抑制作用。从图7B可以看出，silncRNA16#2对克隆增殖的抑制效果不显著，silncRNA16#2对克隆增殖的抑制效果极其显著。从图7A和图7B可以看出，silncRNA16#2对克隆增殖的抑制效果较好。

从图6、图7A和图7B可以看出，silncRNA16#2具有更好的lncRNA16敲低效率和更优的肿瘤增殖抑制效果，因此选择该silncRNA16#2进行后续实验，也可称之为silncRNA16。

实施例5检测A549/DDP细胞对cy3-silncRNA16#2的摄取。

对silncRNA16#2进行修饰，可以在其正义链的5’端、反义链的5’端、反义链的3’端其中之一的位置进行荧光修饰-化学修饰的联合修饰；或在所述silncRNA16的正义链的5’端、反义链的5’端、反义链的3’端中的任意两个位置分别进行荧光修饰和化学修饰。

例如：a.在silncRNA16#2的正义链5’端进行化学修饰，反义链3’端进行荧光修饰；

b.在silncRNA16#2的正义链5’端进行荧光修饰，反义链3’端进行化学修饰；

c.在silncRNA16#2的正义链5’端进行化学修饰，反义链5’端进行化学修饰；

d.在silncRNA16#2的正义链5’端进行荧光修饰，反义链5’端进行化学修饰；

e.用荧光-化学联合修饰，且化学修饰连接silncRNA16#2正义链的5’端、反义链的5’端、反义链的3’端中的一处。

以上仅为举例，还可以为符合修饰规则的其他情况，后续以第一种情况为例。

其中的荧光修饰使用的荧光染料为FAM、VIC、JOE、TET、TAMRA、ROX、Texas Red、LCRED460、FITC、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7或cy7.5；后续以其中的cy3荧光染料为例。

其中的化学修饰为胆固醇修饰、甲基化修饰、氟代修饰、氯代修饰中的一种或多种的联合修饰，后续以胆固醇修饰为例。

1.制备进行修饰的silncRNA16#2

胆固醇修饰的siRNA可以延长其在体内的循环时间，增强siRNA的透膜能力，促进细胞摄取。因此silncRNA16#2、silncRNA16#NC的正义链5’端与胆固醇分子通过共价连接，为标示silncRNA16#2、silncRNA16#NC在细胞和组织中的分布，silncRNA16#2、silncRNA16#NC的反义链3’端与cy3荧光分子通过共价连接。上述修饰委托苏州吉玛基因股份有限公司在合成siRNA时同时完成胆固醇、cy3共轭物的修饰，所用方法为本领域中的标准方法。得到的修饰胆固醇和cy3共轭物的silncRNA16#2命名为cy3-silncRNA16#2，修饰胆固醇和cy3共轭物的silncRNA16#NC命名为cy3-silncRNA16#NC(由于后续转染后通过显微镜可直接观察到cy3，因此以cy3命名)。

2.细胞铺板

对数生长期的A549/DDP细胞，采用PBS缓冲液清洗后加入0.25％胰蛋白酶溶液1mL，消化1分钟后加入1mL DMEM完全培养基中和，吹散细胞，采用细胞计数板计算细胞浓度，将细胞以2×10⁶个接种于共聚焦小皿中。待细胞密度约为40％-50％时，进行细胞转染。

3.细胞转染

使用PBS缓冲液将细胞洗2遍后加入0.5mL Opti-MEM^TM减血清培养基于共聚焦小皿中。以下为一个共聚焦小皿所需转染液的配置：取1个1.5mL无RNA酶的EP管，将50pmol cy3-silncRNA16#2用125μL Opti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟；另取一个1.5mL无RNA酶的EP管将2.5μL Lipofectamine 2000用125μL Opti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟，随后将两管混合成转染溶液，放置20分钟，最后将转染溶液全部加入一个共聚焦小皿中，在二氧化碳恒温培养箱中孵育6小时后，将转染溶液更换成DMEM完全培养基。

4.细胞核染色

将Hoechst 33342工作液与细胞于37℃孵育30分钟，去除Hoechst 33342工作液，用PBS缓冲液洗3遍，加入1mL PBS缓冲液。

5.镜下观察

通过激光共聚焦显微镜检测激发光波长为543nm的荧光以评估细胞对cy3-silncRNA16#2的摄取。

6.数据收集及处理

通过激光共聚焦显微镜检测A549/DDP对cy3-silncRNA16#2的摄取。如图8所示，Hoechst 33342工作液染色显示了细胞核的形态为圆形，此外可见cy3荧光环绕细胞核周围，Merged图为同时显示细胞核与cy3-silncRNA16#2的荧光，可知A549/DDP顺利摄取了cy3-silncRNA16#2。

实施例6检测cy3-silncRNA16#2在裸鼠重要脏器及肿瘤中的富集

1.皮下移植瘤构建以及分组

(1)皮下移植瘤构建

准备4周大小的BALB/c雌性裸鼠20只，将对数生长期的A549/DDP细胞消化并离心收集细胞。用PBS缓冲液清洗细胞2次并用PBS缓冲液重悬A549/DDP细胞，使用血球计数板计数细胞并将细胞密度调整为1×10⁶个/50μL。将50μL含1×10⁶个A549/DDP细胞的PBS悬液与基质胶按照体积比1：1混合，随后注入裸鼠右肋皮下部位。

(2)裸鼠分组及治疗

当肿瘤达到大小约60mm³，将裸鼠随机分为4个处理组：PBS(腹腔注射)组，顺铂(腹腔注射，5mg/kg)组，cy3-silncRNA16#NC(皮下注射，0.5mg/kg)+顺铂(腹腔注射，5mg/kg)组，cy3-silncRNA16#2(皮下注射，0.5mg/kg)+顺铂(腹腔注射，5mg/kg)组。联合用药组在分组当天给cy3-silncRNA16#NC或cy3-silncRNA16#2处理，在次日给药顺铂；单独用药组在分组次日给PBS或顺铂处理，此后每隔三天进行一个周期治疗，一共4个周期。

2.检测cy3-silncRNA16#2在裸鼠重要脏器及肿瘤中的富集

为了检测cy3-silncRNA16#2在肿瘤和脏器(心脾肺肾肝)中的富集情况，皮下给予cy3-silncRNA16#2，在给定时间(15分钟-12小时)对裸鼠进行予安乐死处理，将心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤组织取出，通过荧光成像仪观察给药15分钟到12小时后cy3-silncRNA16#2在裸鼠各器官和肿瘤组织的蓄积。

3.数据收集及处理

荧光成像仪观察给药15分钟到12小时后cy3-silncRNA16#2在裸鼠各器官和肿瘤组织的蓄积。如图9所示，可见cy3荧光主要在肿瘤、肝、肾中富集，表明cy3-silncRNA16#2能够在体内顺利被肿瘤摄取。

实施例7检测cy3-silncRNA16#2在体内对耐药NSCLC的生长抑制作用及毒性评估

1.裸鼠体重监测

药物治疗可能会产生一些副作用，如临床上化疗的患者可能有脱发、呕吐、体重减轻、骨髓抑制、肝肾毒性等等，若没有体重下降表明该药物或药物组合没有产生体重降低的副作用。在裸鼠实验中，体重是治疗整个过程中最方便监测且不会对裸鼠造成不良反应的指标，没有造成体重下降表明该药物组合基本没有毒性，不会引起治疗副作用。

监测实施例6中从治疗开始至4个周期治疗结束后各组裸鼠的体重，并通过GraphPad Prism 8.0软件作体重生长折线图，如图10A所示。从图10A可以看出，cy3-silncRNA16#2与顺铂的联合没有造成裸鼠的体重下降。

2.裸鼠肿瘤称重

所有治疗结束后取出裸鼠肿瘤，进行称重，按照分组有序摆放并进行拍照，如图10B所示，然后对肿瘤进行统计，结果如图10C所示。从图10B和图10C可以看出，cy3-silncRNA16#2与顺铂的联合显著抑制肿瘤生长，cy3-silncRNA16#2与顺铂的联合对抑制肿瘤生长具有显著的统计学意义，表明cy3-silncRNA16#2与顺铂的联合抑制肿瘤生长的效果极其显著。

3.H&E染色

所有治疗结束后取出裸鼠肝肾，进行H&E染色分析其结构有无异常。

(1)石蜡切片脱蜡

按照以下顺序进行脱蜡：二甲苯去蜡二次，各8分钟；无水乙醇二次、95％乙醇、80％乙醇、70％乙醇各2分钟，自来水冲洗，蒸馏水洗。

(2)染色

步骤如下：苏木精然也染15分钟，自来水洗片刻，盐酸酒精分化(1-2次浸水)，流水冲洗片刻，温水或碳酸锂饱和水溶液显蓝1分钟，流水冲洗3分钟，伊红液染5分钟。

(3)脱水透明封固

步骤如下：95％乙醇、无水乙醇(各二次，1-2分钟)，二甲苯二次，1分钟，滴加中性树胶后用盖玻片封片，结果如9D所示。

从图10D可以看出，细胞核被苏木精染为蓝色，细胞质被伊红染为红色。H&E染色结果显示cy3-silncRNA16#2与顺铂的联合不会造成裸鼠肝肾结构异常。

从上述结果可以看出，cy3-silncRNA16#2显著增强了耐顺铂NSCLC对顺铂的敏感性，抑制肿瘤生长，且没有系统毒性。

实施例8Nano-silncRNA16的表征。

1.Nano-silncRNA16的合成

将silncRNA16#2的正义链3'末端通过磷酸酯键与三个N-乙酰半乳糖胺(GalNAC)分子共价缀合，得到silncRNA16#2分子与GalNAC分子的摩尔比为1:3的silncRNA16#2缀合物。

GalNAC缀合分子的结构式如式I所示。

以连接GalNAC缀合分子的固相载体起始循环，将GalNAC缀合分子通过共价连接的方式缀合在silncRNA16#2正义链的3'末端。切割与脱保护：将GalNAC-silncRNA16#2的正义链、silncRNA16#2反义链(反义链不带GalNAC)分别加入25％浓氨水中，55℃反应16小时，以完成核酸链认固相载体上的切割，并脱除碱基上的保护基团和磷酸上的保护基团。将氨水上清吸出后，真空浓缩至干。纯化与脱盐：利用制备型离子色谱纯化柱(Source 15Q)，通过NaBr的梯度洗脱，完成核酸的纯化。采用反相色谱纯化柱进行脱盐。退火：将正义链与反义链以等摩尔比混合，加热至95℃，室温冷却后，使它们通过氢键形成双链结构。将制备的复合物于-20℃冷冻3-6小时后冷冻干燥20-26小时得到带有GalNAC缀合分子的silncRNA16#2冻干粉，制成纳米靶向药物，将其命名为Nano-silncRNA16，备用。

Nano-silncRNA16结构如式II所示。

采用同样方法制备Nano-silncRNA16#NC冻干粉。

上述Nano-silncRNA16、Nano-silncRNA16#NC制备委托苏州吉玛基因股份有限公司制备成冻干粉。

3.Nano-silncRNA16在电镜下的形状及粒径分布。

将Nano-silncRNA16冻干粉用PBS缓冲液配置成20μM的浓度，随后用PBS缓冲液稀释1000倍于透射电镜下观察Nano-silncRNA颗粒形状，如图11A所示。从图11A可以看出，Nano-silncRNA16纳米颗粒呈球形。通过使用Image J软件测量至少200个粒子分析粒径大小，结果如图11B所示。从图11B可以看出，Nano-silncRNA16纳米颗粒主要分布在15-35nm范围内。

4.Nano-silncRNA16的分子量检测。

通过质谱技术检测Nano-silncRNA16的分子量，结果如图11C所示，从图11C可以看出，Nano-silncRNA16的分子量大小为7337.075，误差为-0.053％，在±0.01％内，提示Nano-silncRNA16构建成功。

实施例9检测A549/DDP细胞对Nano-silncRNA16的摄取

1.细胞铺板

对数生长期的A549/DDP细胞，采用PBS缓冲液清洗后加入0.25％胰蛋白酶溶液1mL，消化1分钟后加入1mL DMEM完全培养基中和，吹散细胞，采用细胞计数板计算细胞浓度，将细胞以2×10⁶个接种于共聚焦小皿中。待细胞密度约为40％-50％时，进行细胞转染。

2.细胞转染

使用PBS缓冲液将细胞洗2遍后加入0.5mL Opti-MEM^TM减血清培养基于共聚焦小皿中。以下为一个共聚焦小皿所需转染液的配置：取1个1.5mL无RNA酶的EP管，将50pmolNano-silncRNA16用125μL Opti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟；另取一个1.5mL无RNA酶的EP管将2.5μL GP-transfect-Mate转染液用125μL Opti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟，随后将两管混合成转染溶液，放置20分钟，最后将转染溶液全部加入一个共聚焦小皿中，在二氧化碳恒温培养箱中孵育6小时后，将转染溶液更换成DMEM完全培养基。

3.细胞核染色

将Hoechst 33342工作液与细胞于37℃孵育30分钟，去除Hoechst 33342工作液，用PBS缓冲液洗3遍，加入1mL PBS缓冲液。

4.镜下观察

通过激光共聚焦显微镜检测激发光波长为543nm的荧光以评估细胞对Nano-silncRNA16的摄取，结果如图12所示。Hoechst 33342工作液染色显示了细胞核的形态为圆形，此外可见cy3荧光环绕细胞核周围，Merged图为同时显示细胞核与Nano-silncRNA16的荧光。从图12可以看出cy3荧光环绕细胞核周围，可知A549/DDP顺利摄取了Nano-silncRNA16。

实施例10比较silncRNA16与Nano-silncRNA16对lncRNA16敲低效率

1.细胞铺板

取对数生长期的A549/DDP细胞，采用PBS缓冲液清洗后加入0.25％胰蛋白酶溶液1mL，消化1分钟后加入1mL DMEM完全培养基中和，吹散细胞，采用细胞计数板计算细胞浓度，将细胞以2×10⁶个/孔加入到六孔板中进行培养。

2.细胞转染

待细胞密度达40％-50％时，吸弃培养液，加入PBS缓冲液将细胞洗2遍后加入1.5mL Opti-MEM^TM减血清培养基于六孔板的每个孔中。以下为六孔板的一个孔所需转染液的配置：取一个1.5mL无RNA酶的EP管，将100pmol silncRNA16或Nano-silncRNA16用250μLOpti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟，另取一个1.5mL无RNA酶的EP管将5μLLipofectamine 2000用250μL Opti-MEM^TM减血清培养基稀释放置5分钟，随后将两管混合成转染溶液，放置20分钟，最后将转染溶液全部加入六孔板的一个孔中，在二氧化碳恒温培养箱中孵育6小时后，将转染溶液更换成DMEM完全培养基，继续培养24小时。

4.RNA提取及RT-qPCR

本部分实验过程及引物参照实施例2步骤2-3进行。

通过RT-qPCR比较silncRNA16与Nano-silncRNA16对lncRNA16的敲低效率，如图13所示。从图13可以看出，Nano-silncRNA16更能显著敲低A549/DDP细胞中lncRNA16的表达量。

实施例11比较silncRNA16与Nano-silncRNA16在裸鼠重要脏器及肿瘤中的富集

1.皮下移植瘤构建以及分组

(1)皮下移植瘤构建

准备4周大小的BALB/c雌性裸鼠40只，将对数生长期的A549/DDP细胞消化并离心收集细胞。用PBS缓冲液清洗细胞2次并用PBS缓冲液重悬A549/DDP细胞，使用血球计数板计数细胞并将细胞密度调整为1×10⁶个/50μL。将50μL含1×10⁶个A549/DDP细胞的PBS悬液与基质胶按照体积比1：1混合，随后注入裸鼠右肋皮下部位。

(2)裸鼠分组及治疗

当肿瘤达到大小约200-300mm³，将裸鼠随机分为5个处理组：PBS(腹腔注射)组，顺铂(腹腔注射，5mg/kg)组，silncRNA16#NC(皮下注射，0.5mg/kg)+顺铂(腹腔注射，5mg/kg)组，silncRNA16(皮下注射，0.5mg/kg)+顺铂(腹腔注射，5mg/kg)组，Nano-silncRNA16(皮下注射，0.5mg/kg)+顺铂(腹腔注射，5mg/kg)组。在分组当天给silncRNA16#NC或silncRNA16或Nano-silncRNA16处理，联合用药组在次日给顺铂；单独用药组在分组次日给予PBS或顺铂处理。治疗初始时间为第0天，每隔三天进行一个周期治疗，一共6个周期。

2.比较silncRNA16与Nano-silncRNA16在裸鼠重要脏器及肿瘤中的富集

为了比较silncRNA16与Nano-silncRNA16在肿瘤和脏器(心脾肺肾肝)中的富集情况，皮下分别给予比较silncRNA16和Nano-silncRNA16处理，在给定时间对裸鼠进行予安乐死处理，将心、肝、脾、肺、肾以及肿瘤组织取出，通过荧光成像仪比较给药0.5小时、2小时后silncRNA16与Nano-silncRNA16在裸鼠重要脏器及肿瘤中的富集差异。

3.数据收集及处理

通过荧光成像仪比较silncRNA16与Nano-silncRNA16给药0.5小时、2小时后silncRNA16与Nano-silncRNA16在裸鼠重要脏器及肿瘤中的富集差异。如图14A所示，可见荧光主要在肿瘤、肝肾中富集，表明silncRNA16与Nano-silncRNA16均能在体内顺利被肿瘤摄取。如图14B所示，通过使用利用GraphPad Prism 8.0软件分析平均荧光强度，我们发现给药0.5小时时silncRNA16与Nano-silncRNA16在肿瘤中富集程度相当，给药2小时后发现Nano-silncRNA16在肿瘤中的富集显著强于silncRNA16。

实施例12比较silncRNA16与Nano-silncRNA16在体内对耐药NSCLC的生长抑制作用。

所有治疗结束后取出裸鼠肿瘤，进行称重，按照分组有序摆放并进行拍照。通过使用利用GraphPad Prism 8.0软件分析每组裸鼠肿瘤重量差异，结果如图15A和图15B所示。从图15A可以看出，Nano-silncRNA16对裸鼠肿瘤的生长抑制作用更优于silncRNA16，显著降低顺铂的耐药性。如图15B所示为各组肿瘤重量的分析，显示Nano-silncRNA16联合顺铂组肿瘤重量最低，抑制肿瘤生长效果更强。

实施例13检测Nano-silncRNA16联合顺铂对裸鼠体重及脏器结构的影响。

1.裸鼠体重监测

监测从治疗开始至4个周期治疗结束后裸鼠的体重，并通过GraphPad作体重生长折线图，结果如图16A所示。从图16A可以看出，Nano-silncRNA16联合顺铂没有造成裸鼠的体重下降。

2.H&E染色

所有治疗结束后取出裸鼠心脾肺肾肝，进行H&E染色分析其结构有无异常。实验步骤参照实施例7步骤3。结果如图16B所示。从图16B可以看出，Nano-silncRNA16联合顺铂不会造成裸鼠重要脏器结构异常。

从上述结果可以看出，Nano-silncRNA16显著增强了耐顺铂NSCLC对顺铂的敏感性，抑制肿瘤生长，且没有系统毒性。

实施例14Nano-silncRNA16联合顺铂对裸鼠肝功能的影响

1.裸鼠眼静脉取血

准备1％的肝素钠溶液，加入30μL于1.5mL EP管中。左手将裸鼠固定，右手手持镊子，拔除裸鼠眼球，迅速将血挤入上述EP管中，盖好置于冰上。

2.分离血浆

将步骤1中获得的血于4℃，400g离心20分钟，血液分为两层，上层即为血浆，将血浆吸出存放于2mL EP管中备用。

3.肝功能指标检测

将上述获得的血浆用去离子水稀释50倍，通过ELISA检测总蛋白(如图17A所示)、白蛋白(如图17B所示)、丙氨酸氨基转移酶(如图17C所示)、天冬氨酸转氨酶(如图17D所示)、碱性磷酸酶(如图17E所示)、γ-谷氨酰转移酶(如图17F所示)、直接胆红素(如图17G所示)。从图17A至图17G可以看出，仅丙氨酸氨基转移酶(图17C)、直接胆红素(图17G)在silncRNA16联合顺铂组与其他组有差异，在Nano-silncRNA16联合顺铂组无异常，表明Nano-silncRNA16联合顺铂不造成肝损伤。可以表明Nano-silncRNA16联合顺铂更优于silncRNA16联合顺铂。

实施例15Nano-silncRNA16联合顺铂对裸鼠肾功能的影响

1.裸鼠眼静脉取血及分离血浆

参照实施例14步骤1-2。

2.肾功能指标检测

将上述获得的血浆用去离子水稀释50倍，通过ELISA检测肌酐(如图18A所示)、尿素(如图18B所示)、尿酸(如图18C所示)。从图18A至图18C可以看出，肌酐、尿素、尿酸在Nano-silncRNA16联合顺铂组无异常，表明Nano-silncRNA16联合顺铂不造成肾功能损伤。

实施例16Nano-silncRNA16联合顺铂对裸鼠心肌酶的影响

1.裸鼠眼静脉取血及分离血浆

参照实施例14步骤1-2。

2.肾功能指标检测

将上述获得的血浆用去离子水稀释50倍，通过ELISA检测乳酸脱氢酶(如图19A所示)、肌酸激酶(如图19B所示)。从图19A和图19B可以看出，乳酸脱氢酶、肌酸激酶在Nano-silncRNA16联合顺铂组无异常，而肌酸激酶如图19B所示在silncRNA16联合顺铂组与其他组有差异，表明Nano-silncRNA16联合顺铂不造成肾损伤，更优于silncRNA16联合顺铂。

从实施例10至实施例16可以看出，Nano-silncRNA16在肿瘤中的富集显著强于silncRNA16，正因为Nano-silncRNA16在肿瘤中的高富集，使得因为Nano-silncRNA16进入肿瘤细胞中增多，对lncRNA16的敲低效率更强，最终导致Nano-silncRNA16联合顺铂对肿瘤生长的抑制效果最强，其抑制效果显著强于silncRNA16联合顺铂。且Nano-silncRNA16联合顺铂没有造成裸鼠体重下降，不损伤肝肾功能和心肌功能，说明Nano-silncRNA16联合顺铂的效果最优，且不具有系统毒性。

从上述实施例中可以看出，本发明所提供的silncRNA16通过特异性结合lncRNA16并抑制其表达，促进ROS上调，从而抑制A549/DDP细胞的生长。通过GalNAC递送silncRNA16在体内有效抑制lncRNA16，从而恢复耐顺铂NSCLC对顺铂的敏感性。

上述实施例中采用GalNAC缀合分子制备Nano-silncRNA16，也可以采用脂质体、纳米凝胶、纳米棒、胶束、纳米微球、碳纳米管、树形分子或外泌体作为载体制备Nano-silncRNA16，以促进silncRNA16被细胞的摄取。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京肿瘤医院(北京大学肿瘤医院)

<120> silncRNA16、纳米靶向药物及其治疗铂类耐药肿瘤中的用途

<130> DOME

<160> 14

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cucuagguac uacuaaccat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ugguuaguag uaccuagagt t 21

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gatgacagtc tgcctctatc ttac 24

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctttgagcca agcaggttat tg 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtgaataca ggtattcctg a 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccacttatgt ccataaggac t 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gctcaaaggg ccagcacctt c 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cgagtttccc ggtcgtggaa g 21

<210> 9

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccggcaacaa gatgaagagc accaactcga gttggtgctc ttcatcttgt tgtttttg 58

<210> 10

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aattcaaaaa caacaagatg aagagcacca actcgagttg gtgctcttca tcttgttg 58

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

uucuccgaac gugucacgut t 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

acgugacacg uucggagaat t 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cuucagagcu gagagcuuut t 21

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

aaagcucuca gcucugaagt t 21

Claims (11)

1.一种silncRNA16，其特征在于，该silncRNA16的正义链序列如Seq ID No.1所示：5’-CUCUAGGUACUACUAACCATT-3’；该silncRNA16的反义链序列如Seq ID No.2所示：5’-UGGUUAGUAGUACCUAGAGTT-3’。

2.如权利要求1所述的silncRNA16，其特征在于，进一步在所述silncRNA16的正义链的5’端、反义链的5’端、反义链的3’端其中之一的位置进行荧光修饰-化学修饰的联合修饰；或在所述silncRNA16的正义链的5’端、反义链的5’端、反义链的3’端中的任意两个位置分别进行荧光修饰和化学修饰。

3.如权利要求2所述的silncRNA16，其特征在于，当进行荧光修饰-化学修饰的联合修饰时，化学修饰直接与silncRNA16的正义链的5’端、反义链的5’端或反义链的3’端连接。

4.如权利要求2或3所述的silncRNA16，其特征在于，所述荧光修饰使用的荧光染料为FAM、VIC、JOE、TET、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED460、FITC、cy3、cy3.5、cy5、cy5.5、cy7或cy7.5；所述化学修饰为胆固醇修饰、甲基化修饰、氟代修饰、氯代修饰中的一种或多种的联合修饰。

5.如权利要求1至3任一项所述的silncRNA16，其特征在于，所述silncRNA16特异性结合并抑制lncRNA16表达。

6.一种纳米靶向药物，其特征在于，由如权利要求1至5任一项所述的silncRNA16与药学上可接受的载体和/或辅料组成。

7.如权利要求6所述的纳米靶向药物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体为N-乙酰半乳糖胺分子、脂质体、纳米凝胶、纳米棒、胶束、纳米微球、碳纳米管、树形分子或外泌体。

8.如权利要求1至3任一项所述silncRNA16或如权利要求6或7所述的纳米靶向药物在制备逆转肿瘤铂类化疗耐药的药物中的用途，所述肿瘤为肺部肿瘤。

9.一种药物组合物，其特征在于，由如权利要求1至5任一项所述的silncRNA16或如权利要求6或7所述的纳米靶向药物，和铂类药物组成。

10.如权利要求9所述的药物组合物，其特征在于，所述铂类药物为顺铂、卡铂或奈达铂。

11.如权利要求9或10所述的药物组合物，其特征在于，使用时先将如权利要求1至3任一项所述的silncRNA16或如权利要求6或7所述的纳米靶向药物按照5 mg/kg的用量皮下给药，然后第二日将铂类药物按照0.5 mg/kg的用量腹腔注射给药。

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