CN105561344B - 一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法 - Google Patents

一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种RNAi技术联合小剂量5‑氨基酮戊酸（ALA）诱导肿瘤细胞原卟啉IX（PpIX）积聚的方法，是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi基因沉默技术抑制亚铁螯合酶（FECH）的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞。本发明还提供了上述RNAi所用的三个双链siRNA片段，对FECH具有很高的沉默效率。利用本发明的方法和双链siRNA片段，可在只使用小剂量外源性ALA的情况下，即可获得大量的PpIX并使其积聚在肿瘤细胞，实现肿瘤病灶的标示，尤其是对于早期肿瘤的标示，具有显著的意义。

Description

一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的 方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。更具体地，涉及一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法。
背景技术
癌症已成为威胁人类健康和生命的一大杀手，而癌症的发现往往都已处于中晚期，约75％的患者就诊时肿瘤已到进展期，肿瘤已发生转移。而早期癌症病灶的发现对癌症的治疗具有至关重要的意义，但是目前大部分癌症均缺乏早期症状及有效的诊断方法。
肿瘤选择性积聚原卟啉IX(Pp1X)已被证实伴随于成瘤过程的早期，可发生在有或无外源性5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid，ALA)诱导的情况下。研究发现，亚铁螯合酶(FECH)可催化二价铁嵌入原卟啉IX(PpIX)生成血红素，而很多类型肿瘤的亚铁螯合酶(FECH)活力较正常细胞为低，所以将PpIX转化为血红素减少，从而导致肿瘤组织中PpIX增多，在此基础上，使用合适波长及能量的光源激发肿瘤内部蓄积的PpIX后，比较不同组织部位的PpIX荧光含量及分布差异，就可发现早期微小癌灶。
目前，国内外一直采用大剂量外源性5-氨基酮戊酸(5-Aminolevulinic acid，ALA)的方式来增加肿瘤细胞内PpIX的合成量，以便标示肿瘤病灶。而因为部分肿瘤的FECH活性并未明显降低，故能够将外源性ALA诱导产生的细胞内源性PpIX转化为血红素，从而使PpIX迅速流失，因此该方式往往只能产生低浓度的肿瘤PpIX，必须使用更大剂量的ALA，才能产生足够的Pp1X在肿瘤组织积聚。采用大剂量使用5-氨基酮戊酸(ALA)的方式，不仅存在上述的缺陷，而且大剂量的ALA用量还极易产生严重的全身尤其神经毒副作用。
发明人前期研究利用RNAi技术阻断FECH基因的表达，在此基础上辅小剂量的外源性ALA，通过增加合成、减少去路的双重效能的方式以提高肿瘤细胞原卟啉IX积聚浓度，从而改善了单用大剂量外源性ALA的模式难收集较高浓度的PpIX的方法上的不足。但是，在利用RNAi技术阻断FECH表达的效能方面，目前所使用单段siRNA的方法仍有很大的改进空间，虽然理论上使用单段siRNA可达到很高的基因敲减率，但是以我们多年的实际操作经验及实验结果分析可知，实际工作中该方法一般只能达到约60～65％范围水平的基因敲减率，因此，在此基础上辅以小剂量外源性ALA标示肿瘤病灶的效果不甚理想，尤其是针对早期病灶的标示。
因提高RNAi技术阻断FECH表达的效能是提高肿瘤细胞PpIX积聚浓度的最关键的环节，因此，探索更有效地提高对肿瘤细胞FECH基因的敲减率的方法，已成为此技术领域中的一项重大挑战。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有RNAi技术结合小剂量外源性ALA标示肿瘤病灶技术的缺陷和不足，提供一种更有效的RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法，该方法利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶(FECH)的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞，达到使用小剂量外源性ALA即可有效标示肿瘤病灶的目的，提高肿瘤的检出率。
本发明的目的是提供一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法。
本发明另一目的是提供上述方法中所使用的RNAi干扰序列及其在肿瘤诊断方面的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法，是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞；其中，所述利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH表达所用的双链siRNA的反义链的核苷酸序列与靶基因部分或全部互补，双链siRNA的正义链与反义链部分或全部互补。
进一步地，所述沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达是利用双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一个或三者联用；所述740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的反义链的核苷酸序列分别与SEQ ID NO.1所示序列的740、1072、3389位开始的一段核苷酸序列互补；该段互补的核苷酸序列由18～29个连续的核苷酸组成。
优选地，所述该段互补的核苷酸序列由19～25个连续的核苷酸组成。
更优选地，所述该段互补的核苷酸序列由19～23个连续的核苷酸组成。
最优选地，所述该段互补的核苷酸序列由19个连续的核苷酸组成。
另外，优选地，所述双链siRNA片段的两条链的3’端含有二核苷酸，而且这二核苷酸最好是uu。
具体地，作为一种优选的实施方案，所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～7所示。即如下所示：
(1)双链740FECH-siRNA
正义链740FECH-S1(如SEQ ID NO.2所示)：
5'GCAGCUUAAAUGCCAUUUAUU 3'(第二条链)；
反义链740FECH-AS1(如SEQ ID NO.3所示)：
3'UUCGUCGAAUUUACGGUAAAU 5'(第一条链，与SEQ ID NO.1所示序列的740～758位核苷酸互补)。(SEQ ID NO.1所示序列的740～758位核苷酸：gcagcttaaatgccattta)。
(2)双链1072FECH-siRNA
正义链1072FECH-S2(如SEQ ID NO.4所示)：
5'GGUCCUCAAACAGACGAAUUU 3'(第二条链)；
反义链1072FECH-AS2(如SEQ ID NO.5所示)：
3'UUCCAGGAGUUUGUCUGCUUA 5'(第一条链，与SEQ ID NO.1所示序列的1072～1090位核苷酸互补)。(SEQ ID NO.1所示序列的1072～1090位核苷酸：ggtcctcaaacagacgaat)。
(3)双链3389FECH-siRNA
正义链3389FECH-S3(如SEQ ID NO.6所示)：
5'CAGGCAAAGAGGAAUUUAUUU 3'(第二条链)；
反义链3389FECH-AS4(如SEQ ID NO.7所示)：
3'UUGUCCGUUUCUCCUUAAAUA 5'(第一条链，与与SEQ ID NO.1所示序列的3389～3407位核苷酸互补)。(SEQ ID NO.1所示序列的3389～3407位核苷酸：caggcaaagaggaatttat)。
另外，进一步地，上述的添加小剂量ALA是指本发明所述之体外细胞实验中低于或等于0.1mM的ALA浓度，或本发明所述之动物实验中低于或等于1毫克/公斤体重的ALA浓度。
另外，根据所述的内容，一种干扰抑制亚铁螯合酶FECH表达的双链siRNA也在本发明的保护范围之内，所述双链siRNA为双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一个或三者的组合；所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～7所示。
而且，上述双链siRNA在制备肿瘤诊断试剂方面的应用也应在本发明的保护范围之内。这种核酸分子可以单独使用或与其它物质结合使用时可作为药物和/或诊断试剂。例如，这项发明的核酸分子可能包含给药的运输载体，包括脂质体，载体和稀释剂及它们的盐和/或这种载体是药学中被接受的某种剂型。
上述双链siRNA还可用于制备药物组合物，这个组合含有一个或多个本发明的核酸分子，即所述的双链siRNA，核酸分子位于一个可接受的载体中，如稳定剂，缓冲剂等类似物质。
上述的药物组合物也可以制造成口服的片剂，胶囊或酏剂，直肠给药的栓剂，可注射给药的无菌溶液，悬浮液，和其它已知的复合体。
另外，上述运输载体，即运输该核酸分子(双链siRNA)的载体最好是表达载体，并且最好能提供特异性的或靶向的运输方式。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种有效诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法，并且只需使用小剂量的外源性ALA，具体方法是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达，从而使得大量的PpIX积聚在肿瘤细胞。
同时，本发明提供了上述RNAi所用的双链siRNA片段，即740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA，对FECH具有很高的沉默效率，利用其沉默处理的同时，添加小剂量外源性ALA，即可快速、有效地使得PpIX大量积聚在肿瘤细胞，可实现肿瘤病灶的标示，尤其是对于早期肿瘤的标示，具有显著的意义。
附图说明
图1为荧光定量PCR检测FECH基因表达水平的结果。
图2为Western blot转膜时的叠放顺序。
图3为Western blot结果。
图4为荧光定量光谱仪检测转染siRNA和/或加ALA处理后的MDA-MB-435细胞内的PpIX浓度。
图5为显微荧光定量检测0.1mM ALA处理后MDA-MB-435细胞内的PpIX的积聚情况。
图6为显微荧光定量检测50nM 3389-FECH-siRNA处理后MDA-MB-435细胞内的PpIX的积聚情况。
图7为显微荧光定量检测50nM 3389-FECH-siRNA处理MDA-MB-435细胞后，再加上0.1mM剂量的ALA细胞内的PpIX的积聚情况。
图8为显微荧光定量检测50nM 3389-FECH-siRNA处理MDA-MB-435细胞后，再加上1mM剂量的ALA,细胞内的PpIX的积聚情况。
图9为激光共聚焦显微镜检查肿瘤细胞内积聚的PpIX荧光。
图10为动物实验的肿瘤组织所产生的PpIX红色荧光观察结果。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
以下实施例中所用细胞株为人乳腺癌细胞株MDA-MB-435。
所用培养基：DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、0.25％胰酶-EDTA(Trypsin-EDTA)、磷酸缓冲液(PBS)、青链霉素双抗溶液(Penicillin-Streptomycin)均购自Gibco公司。
所用试剂：阳离子脂质体转染试剂盒(Transmessenger kit，Qiagen公司)、阴性对照siRNA(negative control siRNA，Qiagen)、Trizol(Invitrogen公司)、RTMaster Mix kit(TaKaRa)、Premix EX TaqTM II kit(TaKaRa)、基因表达试剂盒(美国应用生物系统公司)、增强型BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天)、抗体Anti-FECH(Santa Cruz)、抗体anti-GAPDH(Santa Cruz)、30％甲叉双丙烯酰胺(30％Acrylamide/Bis Solution，Bio-rad)、TEMED(Bio-rad)、细胞裂解液(Bio-rad)、磷酸酶抑制剂(Bio-rad)。
所用仪器：水套式CO2培养箱(Forma II Water Jacketed CO2Incubator，Thermo)、激光共聚焦显微镜、倒置显微镜、Spectra Max M2多功能酶标仪、ABI Prism 7000型荧光定量PCR仪等均为市购。
另外，以下实施例中所用的统计学方法：采用spss 15.0统计软件进行统计学处理，实验结果(均数±标准差)表示。应用组间t检验，p<0.05有统计学意义，纵坐标每个值代表三次独立实验平均值。
实施例1FECH-siRNA的设计
以NCBI网站上的序列NM_000140.2(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)为根据，设计了3个双链siRNA片段，分别为740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～7所示：
1、双链740FECH-siRNA
(1)740FECH-S1(如SEQ ID NO.2所示)：
5'GCAGCUUAAAUGCCAUUUAUU 3'(正义链，第二条链)；
(2)740FECH-AS1(如SEQ ID NO.3所示)：
3'UUCGUCGAAUUUACGGUAAAU 5'(反义链，第一条链，与SEQ ID NO.1所示序列的740～758位核苷酸互补)。
(SEQ ID NO.1所示序列的740～758位核苷酸：gcagcttaaatgccattta)。
2、双链1072FECH-siRNA
(1)1072FECH-S2(如SEQ ID NO.4所示)：
5'GGUCCUCAAACAGACGAAUUU 3'(正义链，第二条链)；
(2)1072FECH-AS2(如SEQ ID NO.5所示)：
3'UUCCAGGAGUUUGUCUGCUUA 5'(反义链，第一条链，与SEQ ID NO.1所示序列的1072～1090位核苷酸互补)。
(SEQ ID NO.1所示序列的1072～1090位核苷酸：ggtcctcaaacagacgaat)。
3、双链3389FECH-siRNA
(1)3389FECH-S3(如SEQ ID NO.6所示)：
5'CAGGCAAAGAGGAAUUUAUUU 3'(正义链，第二条链)；
(2)3389FECH-AS4(如SEQ ID NO.7所示)：
3'UUGUCCGUUUCUCCUUAAAUA 5'(反义链，第一条链，与与SEQ ID NO.1所示序列的3389～3407位核苷酸互补)。
(SEQ ID NO.1所示序列的3389～3407位核苷酸：caggcaaagaggaatttat)。
实施例2FECH-siRNA处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞后亚铁螯合酶基因的mRNA表达水平
1、细胞培养
(1)人乳腺癌细胞株MDA-MB-435培养液条件为90％DMEM培养基+10％FBS+1％双抗(青霉素100IU/ml+链霉素100μg/ml)，于恒温细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养。
(2)待细胞生长至85％左右时用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化传代培养。取对数生长期的细胞用阳离子脂质体转染试剂盒(Transmessenger kit)进行转染。
2、细胞转染
(1)细胞分组，实验共设6组，分别为：
1)只加转染剂处理组(阴性对照组)；
2)单用0.1mM ALA组；
3)50nM PCTsiRNA+0.1mM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs；
4)50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
5)50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
6)50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。
(2)细胞转染siRNA及加ALA处理
1)将对数生长期的MDA-MB-435单细胞悬液按2×105/孔接种至6孔板，用含双链霉素Penicillin-Streptomycin的完全培养基培养24小时。
2)24h后待细胞融合度达到60％进行转染，用转染试剂盒内的buffer将各组siRNA浓度稀释至0.1ug/μL。按表1所示进行操作：
表1
3)将以上各组分用移液枪吹打三次混匀，室温(15℃～25℃)，静置5min。
4)向以上6组的管中各加入转染剂(Transmessenger)8.8μL。
5)用移液枪吹打五次混匀，室温(15℃～25℃)，静置10min。
6)从细胞培养箱取出六孔板，去掉旧的培养基，用PBS洗两次。
7)每孔加500μL DMEM培养基(不含血清不含双抗)，然后相应每孔直接加入以上混合液100μL，使得每孔总体积为600μL，混合摇匀。
8)在正常培养情况下孵育12h。
9)孵育12h后，去除旧的培养基每孔直接加入2ml DMEM完全培养基。
10)接种48h后进行二次转染，去除旧的培养基后，操作同上。
11)100mM ALA的配制：精确称取16.76mg的ALA，溶于1ml PBS。
12)接种72h后，去除旧的培养基，用PBS洗两次，每次2ml。之后加入1ml无血清无双抗的DMEM培养基，相应组加0.1mM ALA，即从100mM ALA吸取1μL，加入ALA后，轻轻摇匀。
13)ALA作用4个小时，进行定量PCR。
3、荧光定量PCR
(1)分别利用FECH基因(FECH-1、FECH-2、FECH-3)引物和GAPDH引物，进行荧光定量PCR。
上述引物的序列如下，均由invitrogen公司合成。其核苷酸序列如下所示：
FECH基因引物：
上游引物：atggaggtggaagtcaggtg
下游引物：gtcatgaggtctcggtccaa
内参基因GAPDH引物：
上游引物：agcctcaagatcatcagc
下游引物：gagtccttccacgatacc
(2)从转染的细胞中提取总RNA
转染72h后，细胞融合度达到90％，按照下面实验步骤提取细胞的总RNA：
1)预冷Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇；
2)吸掉细胞培养基，用预冷的PBS洗2次，加1ml Trizol，反复吹打，然后转移至无RNA酶的1.5ml的EP管中，室温静置5min；
3)加200μL氯仿，上下用力颠倒15s，室温静置3min；
4)离心12000rpm，4℃，15min；
5)吸取上清液至新的1.5ml的EP管中，加异丙醇500μL，上下轻柔颠倒15s，室温静置10min；
6)离心12000rpm，4℃，10min；
7)去掉上清液，加入1ml的无水乙醇轻柔漂洗沉淀；
8)离心7500rpm，4℃，5min；
9)去掉液体，加入1ml的80％乙醇轻柔漂洗沉淀；
10)7500rpm，4℃，5min；
11)去掉上清液，干燥RNA 5min；
12)加入15μL的0.1％DEPC灭菌水溶解。
(3)总RNA逆转录为cDNA
1)总RNA浓度的测定：将各个样品稀释50倍，用UV板分别测定每个样品在260nm和280nm的吸亮度，选择OD260/OD280的比值为1.7至2.2之间的样品进行下一步实验；根据以下公式计算总RNA的浓度：总RNA(μg/μl)＝40×OD260×50/1000。
2)各样品取500ng的总RNA按照Takara的逆转录试剂盒RT MasterMix的说明书，用随机引物进行逆转录成cDNA，于-20℃保存。
(4)PCR扩增人FECH基因
1)将逆转录后的cDNA稀释3倍后，各取1μl的cDNA稀释液进行PCR扩增；实验重复3次。
2)扩增体系如下：
其中，上下游引物混合液的终浓度为10μM。
在0.2ml PCR管中加入下列组分后，充分混匀。
3)扩增条件如下：95℃30s，40循环(95℃5s、61℃30s)。
(5)Taqman荧光定量PCR按基因表达试剂盒说明操作。
4、实验结果
荧光定量PCR检测FECH基因表达水平的结果如附图1所示。图中，从左至右依次为：
(1)NCT：只加转染剂处理组(阴性对照组)；
(2)ALA：单用0.1mM ALA组；
(3)PCTsiRNA：50nM PCTsiRNA+0.1mM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs；
(4)740siRNA：50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
(5)1072siRNA：50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
(6)3389siRNA：50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。
结果显示：PCTsiRNA+0.1mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、50nM1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组，在抑制FECH mRNA表达方面的作用，分别和只加转染剂处理组及单用0.1mM ALA组比较，均有统计学的明显差异(P<0.01)，说明PCTsiRNA+0.1mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、50nM1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组、及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组敲减FECH mRNA表达的作用明显高于只加转染剂处理组及单用0.1mM ALA这两组。而且，PCTsiRNA组敲减FECHmRNA表达的作用明显高于740siRNA、1072siRNA和3389siRNA这三组。
实施例3FECH-siRNA处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞后亚铁螯合酶基因的蛋白表达水平
1、本实施例用Western blotting法检测实施例2中各组细胞FECH蛋白表达水平，方法如下：
(1)提取总蛋白：收集二次转染后的MDA-MB-435细胞，按照以下方法提取细胞总蛋白(整个过程在冰上进行)：
1)去除培养液，用预冷的PBS洗2次。
2)每孔加入加100μl含PMSF的裂解液，用刮刀来回滑动，使裂解液和细胞充分接触。
3)充分裂解后，将细胞裂解液移至500μl的离心管，4℃，12000g离心10分钟，取上清移至新的离心管。
4)用考马斯亮蓝法测定总蛋白的浓度。
2、Western blot：按照以下步骤进行western blot：
1)制10％的SDS-PAGE凝胶：先加10％分离胶，用去离子水密封胶顶部，然后凝固20分钟；倒掉水，用滤纸吸干，然后加5％的浓缩胶，迅速插入加样梳，再用浓缩胶液将气泡排除，再凝固30分钟即可。
2)SDS-PAGE电泳：各样品总蛋白上样量为90μg。
3)转膜：将滤纸、海绵垫、放置于电转液中，浸泡30-60min，同时准备与大小与凝胶相同的PVDF膜(蛋白分子量大于100kD用0.45μm的PVDF膜，小于100kD的则用0.2μm的PVDF膜)，在甲醇中提前浸泡20s，使PVDF膜半透明，然后用ddH2O洗2次，然后放置于转移液中泡30min，或更久。SDS-PAGE完成后，取下分离胶，将分离胶，PVDF膜以及两层滤纸按顺序放好，放到放好海绵的黑白板上。(即：从黑色负极端依次从下至上为：海绵垫/滤纸/胶/PVDF膜/滤纸/海绵垫。)
使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置，设定转膜电流为300mA，转膜时间为90分钟。电转时要释放很多热量，所以槽内要放入专用的冰盒，整个电泳槽置于盛有冰的盆中，叠放顺序如图2所示。
4)封闭：转膜完成后，立即将PVDF膜用TBS洗涤2次，5min/次；膜吸干后放入封闭液中，在摇床上缓慢摇动,室温封闭90min。封闭结束后，用TBST洗3次，10min/次。
5)一抗孵育：用TBST配制anti-FECH抗体(稀释比为1：300)和anti-GAPDH抗体(稀释比为1：1000)，将膜放入其中，在摇床上缓慢摇动孵育(常温1h→4℃过夜→常温1h)。孵育结束后，用TBST洗3次，10min/次。
6)二抗孵育：用TBST配制相应的二抗(稀释比为1：3000)，将膜放入其中，在摇床上缓慢摇动孵育(常温2h)。孵育结束后，用TBST洗3次，10min/次。
7)ECL显影：ECL Western Blotting Substrate reagent试剂盒，A液和B液按1：1混合两种分光底物，均匀铺在膜上，作用1分钟。用凝胶成像系统ChemiDoc XRS拍照。
2、Western Blot结果如附图3所示。图3中，从左至右依次为：
(1)NCT：只加转染剂处理组(阴性对照组)；
(2)ALA：单用0.1mM ALA组；
(3)740siRNA：50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
(4)1072siRNA：50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
(5)3389siRNA：50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
(6)PCTsiRNA：50nM PCTsiRNA+0.1mM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs。
结果显示：PCTsiRNA+0.1mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、50nM1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组,分别和只加转染剂处理组及单用0.1mM ALA组比较,对FECH基因在蛋白水平的抑制作用明显增加,均有统计学的明显差异(P<0.01).说明PCTsiRNA+0.1mM ALA组、50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、50nM1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组、及50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组对FECH基因在蛋白水平的抑制作用远强于只加转染剂处理组及单用0.1mM ALA组。而且，PCTsiRNA组对FECH基因在蛋白水平的抑制作用远强于740siRNA、1072siRNA和3389siRNA这三组。
实施例4用FECH-siRNA处理人乳腺癌细胞株MDA-MB-435细胞后在细胞内检测到的PpIX浓度
1、细胞培养，同实施例2。
2、细胞转染
(1)细胞分组
同实施例2，实验共设6组，分别为：
1)只加转染剂处理组(阴性对照组)；
2)单用0.1mM ALA组；
3)50nMPCTsiRNA+0.1mM ALA组：是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs；
4)50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
5)50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
6)50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。
(2)细胞转染siRNA及加ALA处理，同实施例2，不同之处仅在于在最后ALA作用4个小时后，是作相关定量检测(而不是定量PCR)。
3、荧光定量光谱仪检测
荧光定量光谱仪检测转染siRNA和/或加ALA处理后的MDA-MB-435细胞内的PpIX浓度，结果如附图4所示。图4中，从左至右依次为：
(1)只加转染剂处理组(阴性对照组)；
(2)单用0.1mM ALA组；
(3)50nMPCTsiRNA+0.1mM ALA组：
是740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的混合siRNAs；
(4)50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
(5)50nM 1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组；
(6)50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA组。
结果显示，用0.1mM的ALA处理后不能诱导明显的PpIX在肿瘤细胞内积聚，但如果用50nM 3389-FECH-siRNA+0.1mM ALA处理MDA-MB-435细胞，在肿瘤细胞内积聚的PpIX浓度比单用ALA处理组要高出近50倍。而且，其他两组(50nM 740FECH-siRNA+0.1mM ALA组、50nM1072FECH-siRNA+0.1mM ALA组)也都显著高于单用ALA处理组。
因此，分别利用本发明所提供的三个双链siRNA和小剂量ALA联用，均可大幅提高肿瘤细胞内积聚的PpIX浓度，而且三个双链siRNA联用效果更好。
4、显微荧光定量检测
分别利用0.1mM ALA、50nM 3389FECH-siRNA(单用siRNA阻断FECH表达)的处理、50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA(siRNA阻断FECH表达+ALA)的处理，以及50nM 3389FECH-siRNA+1mM ALA(siRNA阻断FECH表达+ALA)的处理，显微荧光定量检测处理后MDA-MB-435细胞内的PpIX的积聚情况。
结果如附图5～8所示。
(1)阴性对照组(单用0.1mM ALA)的显微荧光定量检查的结果如附图5所示：X轴代表背景杂散光，y轴代表PpIX荧光。scatter plots图显示代表PpIX荧光强度的荧光斑点峰值很低，只有约25个PpIX计量单位/每毫秒。
(2)如图6所示，用50nM 3389-FECH-siRNA处理MDA-MB-435细胞后，代表PpIX荧光强度的荧光斑点峰值高达250个PpIX计量单位/每毫秒。
检查的结果表明：单用siRNA阻断肿瘤细胞亚铁螯合酶的表达就可以导致PpIX在肿瘤细胞内积聚，产生有诊断性价值的PpIX红色荧光。
(3)如图7所示,联用50nM 3389FECH-siRNA+0.1mM ALA处理MDA-MB-435细胞后,可以在肿瘤细胞内检测到PpIX荧光斑点峰值约达490个PpIX计量单位/每毫秒.
(4)如图8所示，用50nM 3389-FECH-siRNA处理MDA-MB-435细胞后，再加上1mM剂量的ALA，可诱导更高浓度的PpIX在肿瘤细胞内积聚，代表PpIX荧光强度的荧光斑点峰值高达3000个PpIX计量单位/每毫秒。
这些结果表明了：与单用ALA处理组相比，先用siRNA处理再加上同等剂量的ALA，可诱导肿瘤细胞合成更高产量的内源性PpIX。
5、激光共聚焦显微镜检测
利用激光共聚焦显微镜检查肿瘤细胞内积聚的PpIX荧光，同时还设置了阴性对照siRNA组，目的是为了证明有效的实验组siRNA没有脱靶作用而设计的一段与实验组siRNA核苷酸数目相同，但打乱序列，并经过“BLAST”证实与人类基因无关的一段siRNA。
结果如附图9所示。肿瘤细胞先用siRNA处理再加上0.05mM的极低剂量的ALA，可以在肿瘤细胞内观察到很强的PpIX红色荧光(图9C)，而单用ALA组(图9A)和阴性对照siRNA加ALA组(图9B)则观察不到PpIX荧光。
实施例5动物体内试验
1、材料及仪器
siRNA由本发明人设计后交由广州锐博生物有限公司合成；ALA购自Sigma-Aldrich Corporation,Beijing local agent,China；阳离子类脂DOTAP、胆固醇Cholesterol、二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC、二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE、叶酸修饰聚乙二醇磷脂DSPE-PEG(2000)-Folate购自美国avanti磷脂公司，HP1100型高效液相色谱仪(Agilent，美国)，Nano Series Zen 4003ZetaSizer(Malvern instruments，英国)，SPI3800N seriesSPA-400型原子力显微镜(日本)。
2、脂质体各组份摩尔比如表2所示：
表2脂质体的组成和配方(1000μl脂质体)
3、包裹siRNA脂质体的制备：
1)安装好旋转蒸发仪的各部件，使得仪器稳固，装上接受瓶，用卡口卡牢，打开冷凝水。将阳离子类脂DOTAP，胆固醇Cholesterol，二硬脂酰磷脂酰胆碱DSPC，二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE，叶酸修饰聚乙二醇磷脂DSPE-PEG(2000)-Folate按以上配方的摩尔比溶解在氯仿中混合溶解后加入烧瓶中，装好烧瓶，用卡口卡牢。
2)打开水泵电源，抽真空，待烧瓶吸住后，用升降控制开关将烧瓶置于水浴内。
3)打开旋转蒸发仪的电源，转速旋钮慢慢往右旋，调整至稳定的转速。
4)加热水浴，设定加热温度58℃。
5)在设定温度下旋转蒸发，待烧瓶内液体挥发完全，瓶壁上形成一层均匀薄膜.
6)蒸发完后使用升降控制开关使烧瓶离开水浴，关闭转速旋钮,停止旋转,打开真空活塞，通大气，取下烧瓶，关闭水泵。在烧瓶内加入2ml PBS溶液以溶解薄膜，
7)在摇床上避光振摇过夜，
8)通过脂质体挤压器，制成100nm～120nm的ALA脂质体。
9)测脂质体纳米颗粒的平均粒径、多分散系数以及zeta电位后4℃保存。
4、动物实验过程
(1)选取5周龄雌性裸鼠36只，每组6只，用DMEM培养基制备细胞悬液，皮下注射细胞悬液0.2ml(每毫升细胞悬液含有MDA-MB-435细胞1×107个)，在SPF级中饲养。
(2)待肿瘤长至5mm大小时，动物标记好，开始进行实验。
(3)动物分组处理，共设6组，分别如下：
1)单用50μL转染剂瘤内注射组(空白对照组)；
2)单用1mg/kg ALA瘤内注射组；
3)0.067nmol/g of PCTsiRNA+1mg/kg ALA瘤内注射组；
4)0.067nmol/g of 740FECH-siRNA+1mg/kg ALA瘤内注射组；
5)0.067nmol/g of 1072FECH-siRNA+1mg/kg ALA瘤内注射组；
6)0.067nmol/g of 3389FECH-siRNA+1mg/kg ALA瘤内注射组。
(4)经上处理后用小动物成像仪检测裸鼠体内PpIX荧光。
5、结果
(1)单用50μL转染剂组、单用ALA组的裸鼠均看不到肿瘤组织所产生的PpIX荧光。
而联用FECH-siRNA和1mg每公斤体重浓度的小剂量的ALA后，直接用肉眼就能在裸鼠活体上观察到肿瘤组织所产生的PpIX红色荧光(如附图9所示)。
(2)统计结果如表3所示
表3
生物医学实验有一个特点，很多体外实验数据很不错，但一旦进入动物体内实验其效果就大打折扣了，所以，就采用外源性ALA的方式来增加肿瘤细胞内PpIX的合成量以便标示肿瘤病灶而言，实现体内试验的肿瘤灶的PpIX积蓄量才是硬指标，本发明利用RNAi技术成功阻断了亚铁螯合酶基因的表达，在此基础上辅以1mg/kg的极小剂量的外源性ALA，就能达到极佳的肿瘤荧光定位的效果。
本发明以纯天然的内源性PpIX作为荧光标示剂，所获得的实验数据会更加客观可信，因为在生命科学的领域中，以原生态的方式做研究是应该被优先考虑的，原生态方式是指被研究对象如肿瘤细胞等并没有被任何外来物标记，其各种生物过程并没有受到外来因素的干扰，不会因为被研究而失真，属真实天然环境下的行为，所以具备将来应用于人体的潜在优势，将PpIX介导的肿瘤荧光成像技术开发成为筛检早期肿瘤的首选方法之一，将会有巨大的医疗及商业价值。
SEQUENCE LISTING
<110> 温州医科大学，温嘉耀
<120> 一种RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的方法
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 3817
<212> DNA
<213> NM_000140.2
<400> 1
cgggcgcgcc gggagggcgc gaggtcaggg ggctggggac gcgcgtgggg atcgctaccc 60
ggctcggcca ctgctgggcg gacacctggg cgcgccgccg cgggaggagc ccggactcgg 120
gccgaggctg cccaggcaat gcgttcactc ggcgcaaaca tggctgcggc cctgcgcgcc 180
gcgggcgtcc tgctccgcga tccgctggca tccagcagct ggagggtctg tcagccatgg 240
aggtggaagt caggtgcagc tgcagcggcc gtcaccacag aaacagccca gcatgcccag 300
ggtgcaaaac ctcaagttca accgcagaag aggaagccga aaactggaat attaatgcta 360
aacatgggag gccctgaaac tcttggagat gttcacgact tccttctgag actcttcttg 420
gaccgagacc tcatgacact tcctattcag aataagctgg caccattcat cgccaaacgc 480
cgaaccccca agattcaaga gcagtaccgc aggattggag gcggatcccc catcaagata 540
tggacttcca agcagggaga gggcatggtg aagctgctgg atgaattgtc ccccaacaca 600
gcccctcaca aatactatat tggatttcgg tacgtccatc ctttaacaga agaagcaatt 660
gaagagatgg agagagatgg cctagaaagg gctattgctt tcacacagta tccacagtac 720
agctgctcca ccacaggcag cagcttaaat gccatttaca gatactataa tcaagtggga 780
cggaagccca cgatgaagtg gagcactatt gacaggtggc ccacacatca cctcctcatc 840
cagtgctttg cagatcatat tctaaaggaa ctggaccatt ttccacttga gaagagaagc 900
gaggtggtca ttctgttttc tgctcactca ctgcccatgt ctgtggtcaa cagaggcgac 960
ccatatcctc aggaggtaag cgccactgtc caaaaagtca tggaaaggct ggagtactgc 1020
aacccctacc gactggtgtg gcaatccaag gttggtccaa tgccctggtt gggtcctcaa 1080
acagacgaat ctatcaaagg gctttgtgag agggggagga agaatatcct cttggttccg 1140
atagcattta ccagtgacca tattgaaacg ctgtatgagc tggacatcga gtactctcaa 1200
gttttagcca aggagtgtgg agttgaaaac atcagaagag ctgagtctct taatggaaat 1260
ccattgttct ctaaggccct ggccgacttg gtgcattcac acatccagtc aaacgagctg 1320
tgttccaagc agctgaccct gagctgtccg ctctgtgtca atcctgtctg cagggagact 1380
aaatccttct tcaccagcca gcagctgtga cccccgccgg tggaccccgt ggcgttaggc 1440
aaatgcccaa cctccagata cctccgatgt ggagagggtg ttatttagag atcaaggaag 1500
gaagtcatcc ttccttgata tatatacagc ctttgggtac aaattgtgtg gtttcttgag 1560
gattggactc ttgatggatt tctattttta tataactata cagtaagcat ttgtattttc 1620
tctctctagg tataagttac tagtttggaa tgtccatcag gacctttaat aaatgagtta 1680
aaaatttgtc ttatgagaca cacctattta agtacagatt ttggctttat tgcccaaaac 1740
cctcctgaaa gggtacggag agtcccctct gtgggctggc agtgtgaatg agatctgttt 1800
agtctcgtgc atatagttgc tgttttttaa atgaacacag ttgagtattt gaagtgaatt 1860
tgaaaaagaa atgttactta atctttccct aagcccatgg gttacagaat gctagggagg 1920
caatttggtt acctgcaatg gctgcttttg ccagcgaggc caccattcat tggtcatctt 1980
ggtatttgtg tgtgaatctc actttcctca atgtaaaaag gaatcaagta tggatttcag 2040
aggtgctctt agattcccca tacacccaag ggtaataaac gtgtacaagt acagtgttca 2100
tgatacgtgc cttggtggga gtccgtggtg ccacagggaa ggggctccca ctgcttctgg 2160
tctccaggga cagtgctgct ggaaaggcta gtgatgagct tcaccctgga gctcctcccg 2220
ggaccttgca agcctctcca tccagcatct tctctatctt agttgaatgc cttctttctg 2280
aacatttgtt ttaagaatta ttttataaag tcaacaatac tttgcttgaa ttctttctta 2340
atttacgatt ttttattata aaaatgtata gtgatacaat gggacatgtg aagaatacag 2400
aaaagtaacc actttaatgc aataactgtt atcataatat tgtatttcgt ggtagtcctt 2460
tcctgtagat atttttaatg ccatttaatg ccattgtcac cttggattta tgagtgaaaa 2520
gtgtttctaa aaatatagaa ataatgtcag atcagagtct gatcttctat gtttgtattt 2580
aaatggatta aaagatcccc ggtggttcca tgaagaattt gtaaagatca ctttctcttt 2640
cctccaagcc ctgaaacttt gttcttcaaa agagcgtttc tttttttttt tttttttagc 2700
cagtttataa agtggaagta ttaggagatt cataaatctt ctatattgag aattggctat 2760
gttaataaat attacaacat cattaaggtt ttagctaagt ttgattcatg ctgtctgtta 2820
aatcaaaact gatctaaatc agaattatta aatgtgagga gcttttttaa tacaggaaaa 2880
gaaacatgtc atccacttga gttaatagtt ttcctacgtt gatgacagcc ctcatgagta 2940
gcatccacat ttttaaaatt tcaaattggt ttttctacta gtagattgtg tttctagaga 3000
aagatacaag gcataggtga ttgtttagga ttttcctcta gcctttgcca ttaccttttt 3060
ggggatgagg ttcacagtag actttgagtg accgtcccac cgtgaagtga attctctgag 3120
ctggtggtgt ggtgctggaa ggaaggttat ttttggagcc actctctccc cttaaggata 3180
tttcccaagg gcctgcttca attctttgat gactttagag gtgaaaaaat atttttatgg 3240
agatgatgca gaaaactcca attcaggagc ccttgcgagt atatctgaag cacttatttg 3300
ctaaggaaac ctgaattgat agcagtactg tgctgtctgg aataatgtcc ttgatactga 3360
gttgggacca gactggcttt tatagtgaca ggcaaagagg aatttattga gatcactgct 3420
catggcattt gttgctgtaa gaagtgttgc ctttgattgt tactaaccac ggatgggtaa 3480
cggtcataca ttaggctagt gtttggtagg acaaaatctt tttagagctt tgagaattgt 3540
catcctgttg gtcaactttg aaatacaaat gtttgccctg gtaattagca atgaactgct 3600
ggcagtttct tcagctgtgt atatacggat ctggctttta attgatgaat caacttctac 3660
agaaactttt gcagggacag tgttgatgag gcagtttagc ttgccagggt gatgataaag 3720
cccaggtccc tgcatgtata gtgctcttct aaagaatatg cattcttgaa ctacttaact 3780
ttttaaaaat cacaataaat ttttgcactc aaaattt 3817
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 双链740FECH-siRNA的正义链
<400> 2
gcagcuuaaa ugccauuuau u 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 双链740FECH-siRNA的反义链
<400> 3
uucgucgaau uuacgguaaa u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 双链1072FECH-siRNA的正义链
<400> 4
gguccucaaa cagacgaauu u 21
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 双链1072FECH-siRNA的反义链
<400> 5
uuccaggagu uugucugcuu a 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 双链3389FECH-siRNA的正义链
<400> 6
caggcaaaga ggaauuuauu u 21
<210> 7
<211> 21
<212> RNA
<213> 双链3389FECH-siRNA的反义链
<400> 7
uuguccguuu cuccuuaaau a 21

Claims (4)

1.一种利用RNAi技术联合小剂量ALA诱导肿瘤细胞原卟啉IX积聚的试剂盒，其特征在于，包含有ALA和利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH表达所需的试剂；该试剂盒的使用方法是在外源性添加小剂量ALA的同时，利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达，从而使得外源性ALA所诱导产生的内源性PpIX能够更有效地积聚在肿瘤细胞；其中，所述利用RNAi技术沉默抑制亚铁螯合酶FECH表达所用的双链siRNA的反义链的核苷酸序列与靶基因部分或全部互补，双链siRNA的正义链与反义链部分或全部互补；所述沉默抑制亚铁螯合酶FECH的表达是利用双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一个或三者联用；所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的反义链的核苷酸序列分别与SEQ ID NO.1所示序列的740、1072、3389位开始的一段核苷酸序列互补；所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～7所示。
2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述添加小剂量ALA是指体外细胞实验中低于或等于0.1mM 的ALA浓度，或动物实验中低于或等于1毫克/公斤体重的ALA浓度。
3.一种干扰抑制亚铁螯合酶FECH表达的双链siRNA，其特征在于，为双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA中的任一个或三者的组合；所述双链740FECH-siRNA、1072FECH-siRNA和3389FECH-siRNA的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.2～7所示。
4.权利要求3所述双链siRNA在制备肿瘤诊断试剂方面的应用。
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"DFO联合FECH-siRNA提高PpIX在宫颈癌和子宫内膜癌细胞内积蓄的研究";李囡;《中国优秀硕士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》;20121015(第10期);正文第27页
"Silencing of ferrochelatase enhances 5-aminolevulinic acid-based fluorescence and photodynamic therapy efficacy";L Teng等;《British Journal of Cancer》;20110208;第2011卷(第104期);第798-807页
"亚铁螯合酶抑制诱导细胞内原卟啉IX积聚的肿瘤荧光成像";姚前尹等;《暨南大学学报( 医学版)》;20110830;第32卷(第4期);第388页左栏第1-2段，右栏第1-6段

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