CN112961917B

CN112961917B - snoRNA-U35A在检测以及治疗胰腺癌中的用途

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Publication number: CN112961917B
Application number: CN202110176844.1A
Authority: CN
Inventors: 李晨蔚; 周慧斌; 曹靖晨; 邓婷婷; 胡雪
Original assignee: Shanghai Sunstem Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Sunstem Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-02-07
Filing date: 2021-02-07
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2041-02-07
Also published as: CN112961917A

Abstract

本发明涉及医药生物技术领域，具体地本发明提供了一种snoRNA‑U35A基因、cDNA或其检测试剂的用途，即用于制备一诊断产品，所述诊断产品用于检测对象是否患有胰腺癌。此外本发明还提供了一种snoRNA‑U35A基因阻断剂，优选地为snoRNA‑U35A‑siRNA，在制备a)抑制胰腺癌细胞增殖的抑制剂；和/或b)治疗和/或预防和/或缓解由胰腺癌引起的相关疾病的药物中的应用。

Description

snoRNA-U35A在检测以及治疗胰腺癌中的用途

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体地涉及snoRNA-U35A在检测以及治疗胰腺癌中的用途。

背景技术

胰腺癌(pancreatic cancer,PC)在发达国家中是第四大致死性癌症，世界范围内每年相关死亡人数超过26万，五年生存率低于5％，手术切除是治愈胰腺癌的唯一机会，但是，通常诊断时已进展为晚期，只有20％的人可以进行手术。

胰腺癌约90％为起源于腺管上皮的胰腺导管腺癌(pancreatic ductaladenocarcinoma,PDAC)，其发病率和死亡率近年来逐年上升，恶性程度高，五年生存率小于1％，且预后非常差。

胰腺癌的早期转移是其主要的致命原因。有证据表明，这一过程可能是通过肿瘤干细胞(Cancer Stem Cells，CSCs)来实现的，并且这类细胞具有上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的特性。

核仁小分子RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)是一类具有特定结构的小分子非编码RNA，广泛存在于真核生物细胞核仁内，能够与核仁中的核糖核蛋白形成复合物——snoRNPs。编码snoRNA的基因，主要分布于蛋白编码基因或非蛋白编码基因的内含子区域，通过转录后的加工处理，形成成熟的snoRNA。

snoRNA与癌症发展密切相关，不仅参与癌细胞的增殖迁移，而且有望在癌症早期诊断中起重要作用。

因此本领域内，迫切需要研发与胰腺癌相关的snoRNA，并研究这种snoRNA在诊断以及治疗胰腺癌中的应用。

发明内容

本发明的主要目的在于研发与胰腺癌相关的snoRNA，并研究这种snoRNA在诊断以及治疗胰腺癌中的应用。具体地，本发明提供了一种胰腺癌中高表达的snoRNA，即snoRNA-U35A，以及snoRNA-U35A在诊断以及治疗胰腺癌中的应用。

在本发明的第一方面，提供了一种snoRNA-U35A基因、cDNA或其检测试剂的用途，用于制备一诊断产品，所述诊断产品用于检测对象是否患有胰腺癌。

在另一优选例中，所述诊断包括早期诊断、辅助性诊断、或其组合。

在另一优选例中，所述snoRNA-U35A基因、cDNA来源于人。

在另一优选例中，所述检测是针对离体样本的检测。

在另一优选例中，所述离体样本选自下组：血清样本、组织样本、石蜡切片样本或其组合。

在另一优选例中，所述检测试剂包括：特异性扩增snoRNA-U35A基因的引物对、探针或者其组合。

在另一优选例中，所述的检测试剂含有SEQ ID No:1和2所示的特异性扩增snoRNA-U35A基因的引物对。

在本发明的第二方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含第一检测试剂，所述第一检测试剂用于检测snoRNA-U35A基因、cDNA。

在另一优选例中，所述第一检测试剂含有SEQ ID No:1和2所示的特异性扩增snoRNA-U35A基因的引物对。

在另一优选例中，所述试剂盒还含有标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测对象是否患有胰腺癌。

在另一优选例中，所述对象为胰腺癌患者。

在本发明的第三方面，提供了一种snoRNA-U35A阻断剂的用途，用于制备a)抑制胰腺癌细胞增殖的抑制剂；和/或b)治疗和/或预防和/或缓解由胰腺癌引起的相关疾病的药物。

在另一优选例中，所述snoRNA-U35A阻断剂选自：如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4所示的snoRNA-U35A-siRNA、snoRNA-U35A-shRNA、或其组合。在另一优选例中，所述抑制剂或药物为口服的或非口服的。

在另一优选例中，所述抑制剂或药物的形式选自：片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、丸剂、溶液剂、糖浆剂、或注射剂。

在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，包含：

A)snoRNA-U35A阻断剂；

B)其他药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述所述snoRNA-U35A阻断剂选自：如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4所示的snoRNA-U35A-siRNA、snoRNA-U35A-shRNA、或其组合。

在另一优选例中，所述药物组合用于制备a)抑制胰腺癌细胞增殖的抑制剂；和/或b)治疗和/或预防和/或缓解由胰腺癌引起的相关疾病的药物。

在本发明的第五方面，提供了一种体外非诊断性非治疗性的调节EMT的方法，包括步骤：将细胞与医学有效量的snoRNA-U35A阻断剂接触，降低EMT相关基因的表达。

在另一优选例中，所述细胞来源于人，优选地为人、小鼠。

在另一优选例中，所述细胞为EMT活跃的细胞。

在另一优选例中，所述细胞为胰腺癌细胞或胰腺癌干细胞。

在另一优选例中，所述EMT相关基因选自：FN1、IGFBP4、或其组合。

在另一优选例中，所述snoRNA-U35A阻断剂选自：如SEQ ID No:3、SEQ ID No:4所示的snoRNA-U35A-siRNA、snoRNA-U35A-shRNA、或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种治疗胰腺癌的方法，给有需要的对象施用医学有效量的snoRNA-U35A阻断剂。

在另一优选例中，所述患者为胰腺癌患者。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1.胰腺癌干细胞、胰腺癌细胞中高表达snoRNA的芯片筛选结果图

图2.流式分析BXPC-3细胞中的CD24+CD44+ESA+的表达比例

图3.QPCR验证显著变化snoRNA的表达

图4.snoRNA-U35A-siRNA转染BXPC-3细胞的结果

图5.snoRNA-U35A-siRNA转染BXPC-3细胞后细胞增殖实验结果图

图6.snoRNA-U35A-siRNA转染BXPC-3细胞后transwell实验结果图

图7.snoRNA-U35A-siRNA转染BXPC-3细胞后细胞划痕实验结果图

图8.snoRNA-U35A-siRNA转染BXPC-3细胞后细胞中EMT相关基因表达变化

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究,意外地发现snoRNA-U35A在胰腺癌细胞以及胰腺癌干细胞中高表达，在此基础上，完成了本发明。

具体地，本发明发现一种在胰腺细胞以及胰腺癌干细胞中高表达的snoRNA为snoRNA-U35A，可以作为检测胰腺癌的靶标，因此可以用于制备早期诊断胰腺癌的产品或试剂盒。本发明还发现，抑制snoRNA-U35A，可以抑制胰腺癌细胞的生长以及迁移，因此snoRNA-U35A的阻断剂可以用于制备治疗胰腺癌的药物。

术语

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。

肿瘤干细胞

2006年AACR(American Association for Cancer Research)对肿瘤干细胞的定义是：肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质性肿瘤细胞的细胞，该细胞能分化成组成肿瘤的不同细胞。肿瘤干细胞的增殖是不受调控的，干细胞在体内存活时间长，具有自我复制的潜能，更有可能累积突变，从而由量变到质变成为肿瘤干细胞。2007年Li(李晨蔚)、Clarke和Simeone等首次证实胰腺癌干细胞存在(CD44+CD24+ESA+)，该类细胞具有高致瘤能力以及可自我更新并产生不同细胞群体的肿瘤干细胞特性。

snoRNA

snoRNA一般由60-400个核苷酸组成，具有特定的保守结果单元，按其结构可分为三大类：C/D box snoRNA、H/ACA box和MRP RNA(很少被研究)。主要功能包括：1)指导其他非编码RNA(如核糖体RNA(rRNA)和小核RNA(small nuclear RNA，snRNA)等)转录后的修饰，具体的功能包括参与核糖体RNA的2′-O-核糖甲基化和假尿嘧啶化等修饰；2)影响mRNA 3’末端加工，富含U/A的SNORD50A在mRNA 3’末端加工中存在竞争性的抑制作用，最终影响mRNA水平的表达。

本发明发现了snoRNA-U35A在胰腺癌中高表达，通过如SEQ ID No:1和2所示的引物对检测snoRNA-U35A，可以在达到早期检测胰腺癌的目的，snoRNA-U35A是一种有效的胰腺癌检测靶标。

引物

引物，是指在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补。

由于在本发明实施例表明snoRNA-U35A在胰腺癌细胞以及胰腺癌干细胞中高表达，因此可以作为检测胰腺癌的标志。基于此，本发明设计了以snoRNA-U35A基因为模板的引物对，通过检测snoRNA-U35A，来检测胰腺癌。

本发明的用于检测snoRNA-U35A基因的引物如SEQ ID No:1和2所示。

检测试剂盒

基于snoRNA-U35A在胰腺癌细胞以及胰腺癌干细胞中高表达，本发明还提供了基于检测snoRNA-U35A的检测试剂盒。

本发明提供的试剂盒包含第一检测试剂，所述第一检测试剂用于检测snoRNA-U35A基因、cDNA。

阻断剂

如本文所用，术语“阻断剂”指利用本发明SnoRNA(SnoRNA-U35A)，通过各种常规筛选方法，可筛选出与SnoRNA-U35A发生相互作用的物质，尤其是阻断剂等。

本发明SnoRNA-U35A的阻断剂在治疗上进行施用(给药)时，可阻断SnoRNA-U35A的表达和/或活性，进而抑制胰腺癌肿瘤干细胞的复制。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药。

可用于本发明的阻断剂包括：snoRNA-U35A的siRNA、shRNA等RNA干扰技术，以及CRISPR等基因编辑技术。

siRNA

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是有效沉默或抑制目标基因表达的过程，该过程通过双链RNA(dsRNA)使得目标基因相应的mRNA选择性失活来实现。小干扰RNA(Smallinterfering RNA；siRNA)是抑制基因表达的有效工具。siRNA进入细胞后容易被降解，通常与质粒、病毒类载体搭配转运至人体细胞内发挥作用。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的snoRNA-U35A的阻断剂(含量为0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％)，以及药学上可接受的载体(含量为余量)。所述的药物组合物可用于减弱紫杉烷类药物耐药性。

在本发明中，，所述的阻断剂还包括可以降低SnoRNA-U35A表达或活性的小分子化合物。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的SnoRNA-U35A阻断剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的SnoRNA-U35A阻断剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

施用方法

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性(即抗衰老功能)的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

典型地，当以口服方式给予SnoRNA-U35A阻断剂时，一个60kg体重的对象(人)，日平均剂量通常为10-500mg，较佳地20-300mg，更佳地50-250mg。所述日剂量可以分一次、二次或多次服用。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明首次发现了一种能够作为检测胰腺癌靶标的snoRNA-U35A。

(b)本发明发现的snoRNA-U35A可以用于早期诊断胰腺癌的靶标，从而帮助患者在病情早期进行治疗，不延误病情，提高康复几率。

(c)本发明发现了阻断snoRNA-U35A可以抑制胰腺癌的生长和迁移。

(d)本发明发现了snoRNA-U35A的阻断剂snoRNA-U35A-siRNA可以用于治疗胰腺癌。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

一、本发明实施例中涉及的实验方法

本发明实施例中涉及的胰腺癌干细胞分选方法、RNA芯片技术、qRT-PCR、CCK-8、transwell、细胞划痕、和统计学分析方法的操作步骤分别如下。

1.1胰腺癌干细胞分选方法

1.取人胰腺癌标本，或从裸鼠移植瘤模型获取肿瘤标本，利用胶原蛋白酶切消化方法制备细胞悬液，肿瘤组织37℃消化2-3h，消化后用40uM滤网过滤制得单细胞悬液。

2.用2％FCS RPMI 1640/HBSS调整细胞浓度为1百万～5百万/ml。细胞用抗体CD24、CD44和ESA标记(4℃孵育20min)用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液4ml左右，离心1000rpm×5分钟。

3.H2-Kd去除非胰腺癌细胞(裸鼠细胞)，4，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)去除死细胞

4.流式细胞仪(BD Aria)分选人原代胰腺癌CD44+CD24+ESA+和CD44-CD24-ESA-细胞，细胞分选2次，保证分选细胞纯度>90％。

1.2 RNA芯片技术

2、将胰腺癌患者的肿瘤组织消化成单细胞悬液，与特异性抗体孵育后，通过流式细胞仪分选，得到CD44+CD24+ESA+的胰腺癌干细胞和CD44-CD24-ESA-胰腺癌细胞。

3、提取CD44+CD24+ESA+的胰腺癌干细胞、CD44-CD24-ESA-胰腺癌细胞和癌旁细胞的RNA。

将RNA样本送去芯片检测。

1.3 qRT-PCR操作步骤

一)总RNA抽提

1)细胞培养皿中细胞样品用PBS洗两次后，用1ml枪将PBS吸干净，加入1ml Trizol(invitrogen)溶液，吹打混匀，并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解，室温静置5min；组织样品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol(Invitrogen)溶液，混匀，室温放置5min使其充分裂解；

2)加入200μl氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；(离心时离心管按顺序排放，离心完毕，离心管的顺序也按顺序排好，与第一步的顺序一致)

3)4℃下，14,000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管；

4)沉淀RNA：加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，室温静置10min；

5)4℃下，14,000g离心10min，收集RNA沉淀，去上清；

6)用75％乙醇洗涤两次(12,000g离心5min，超净台风干；

7)视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。

二)去基因组步骤操作：

1)加入等体积的苯酚/氯仿，上下颠倒混匀，室温放置5min，后14,000rpm，离心15min，取上清。

2)加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀，静置分层后14,000rpm，离心15min，取上清。

3)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，-20℃静置15min；

4)4℃下，14,000g离心15min，收集RNA沉淀，去上清；

5)用75％乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)，超净台风干；

6)加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。

三)总RNA纯度和完整性检测

1)纯度检测：取1μl RNA样品50倍稀释，在核酸蛋白检测仪上测定OD值，OD260/OD280的比值大于1.8，说明制备的RNA较纯，无蛋白质污染。

2)总RNA完整性检测：取RNA样品1μl，1％琼脂糖凝胶电泳80V×20min，EB染色10min，用凝胶成像系统观察并拍照总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带。

四)RNA逆转录操作步骤：

1)在RNase free的PCR管中，加入Total RNA 1.0μg和H2O配置总体积12μl溶液.

2)将上述溶液吹打均匀，置85℃保温5min，使RNA变性。随后立即冰上致冷，以防止RNA复性；

3)在该PCR管中加入Promega试剂

4)将上述20μl反应溶液30℃保温10min；

5)42℃保温50min；

6)85℃保温10min；

7)-20℃保存。

五)定量PCR检测

1、引物测试：

根据RNA设计的引物正式实验前需进行qPCR测试其特异性和扩增效率，具体反应体系和反应条件如正式实验，每对引物需做模板水对照。

2、体系配制：

总的体系配好后，在振荡器中振荡均匀或用枪吸打均匀，然后15ul每管分装至8连管中。

3、cDNA用灭菌纯水稀释适当的浓度，一般为1:20稀释，cDNA按一定顺序排好后，即可加至刚配好的反应体系中。加样完毕，盖好八连管盖，并在八连管盖最上沿的边上标记好1-12的顺序。

4、把各排八连管放在掌上离心机上离心数秒。

5、打开样品架，放入八连管，关上样品架，并在软件上选择已放反应管的孔位，剔除无反应管的孔位。

6、在7500软件上标记好每个反应孔的样品名称及检测基因的名称，分类保存好结果文件。

1.4 CCK-8检测细胞增殖实验步骤

1、用含10％胎小牛血清(Thermo)的DMEM培养液(Hyclone)5％CO2，37℃传代培养，配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积100ul.；

2、同一般培养条件，5％CO2，37℃，至细胞单层铺满孔底(96孔平底板)。

3、培养3-5天后，每孔加CCK-8溶液10ul，继续孵育1-2h，终止培养。

4、选择430nm、460nm波长，在酶标仪上测定各孔光吸收值，记录结果。

1.5 Transwell

一)Transwell小室制备

按说明书要求，将小室放入培养板中，在上室加入300ul预温的无血清培养基，室温下静置15-30min，使基质胶水化，再吸去多余培养液。

二)制备细胞悬液

用胰酶消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用无血清培养基重悬，调整细胞密度至1-10X10⁵。

三)接种细胞

取细胞悬液200ul加入Transwell小室，24孔板下室加入500ul含10％FBS的培养基，注意培养液和小室间不要出现气泡。放入培养箱常规培养48h。

四)结果统计用棉签擦去基质胶和上室内的细胞，结晶紫染色法计数穿过小室膜的细胞个数。并用显微镜拍照。

1.6细胞划痕实验

细胞划痕方法主要用于检测癌细胞迁移特性，在低血清(2.5％)生长条件下，观察肿瘤细胞系向无细胞划痕区迁移的情况，以及细胞伤痕愈合能力的差异。将细胞分别接种于6孔培养板，待细胞贴壁且融合后划痕，用PBS洗掉漂浮细胞，加低血清培养基继续培养，放入培养箱，按时取样，拍照。在显微镜下观察细胞向无细胞划痕区迁移的情况。

1.7统计学分析方法

数据显示为平均值±SE。统计学显著差异在不同情况下使用Student t检验和X2分析确定，并定义为P<0.05。

1.8引物

本实施例中用到的引物序列，以及阻断剂的序列如下表1所示：

表1本实施例中用到的序列表

二、实施例

实施例2.1 snoRNA的筛选

本实施例的目的是为了找到胰腺癌干细胞中浓度水平有变化的snoRNA。

取小鼠PDX模型的胰腺肿瘤，通过流式细胞仪分选出CD24+CD44+ESA+胰腺癌干细胞和CD24-CD44-ESA-的胰腺癌细胞，并与常规的胰岛管上皮细胞作为阴性对照。通过AffymetrixmiRNA 4.0芯片进行snoRNA的筛选。

经过分析计算，如图1所示，找到了其中癌细胞中表达量上调最为明显的snoRNA-U35A。为进一步确认其snoRNA水平的变化，提取BXPC-3细胞(BXPC-3细胞的CD24+CD44+ESA+的比例为70％左右，流式分析结果如图2所示，可作为近似干细胞)总RNA，用正常胰腺细胞的总RNA作为阴性对照，用定制的引物将其反转录为cDNA，再通过qRT-PCR实验进行验证，结果如图3所示，与芯片计算分析后的结果基本一致。

实验结果表明，在胰腺癌细胞以及胰腺癌干细胞中，snoRNA-U35A高表达。

实施例2.2 snoRNA-U35A-siRNA可以抑制胰腺癌干细胞的生长

本实施例的目的是为了进一步研究snoRNA-U35A对胰腺癌干细胞生长的影响。

构建了snoRNA-U35A小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)snoRNA-U35A-siRNA，并用snoRNA-U35A-siRNA对BXPC-3细胞进行脂质体法转染，通过qRT-PCR实验对其U35A的表达水平进行定量检测，对转染体系构建的成功与否进行验证结果如图4所示。并且，通过CCK-8试剂盒检测其活力变化。

实验结果发现snoRNA-U35A-siRNA干扰snoRNA-U35A的表达后，可以抑制BXPC-3细胞的生长(如图5所示)。

实施例2.3 snoRNA-U35A表达水平下调可以抑制胰腺癌干细胞的迁移能力

本实施例的目的是为了进一步研究snoRNA-U35A对胰腺癌干细胞迁移的影响。

使用snoRNA-U35A-siRNA转染胰腺癌干细胞BXPC-3后，通过transwell和细胞划痕实验，检测了snoRNA-U35A对细胞迁移能力的影响。

实验结果如图6、图7所示，snoRNA-U35A表达水平降低可以抑制胰腺癌干细胞BXPC-3的迁移。

实施例2.4 snoRNA-U35A表达水平下调可以影响EMT过程相关基因的表达

恶性肿瘤侵袭和转移的能力与上皮间质转化(EMT)密切相关，通过EMT，可以获得高迁移与侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力。使用snoRNA-U35A-siRNA转染胰腺癌干细胞BXPC-3后，通过qRT-PCR检测EMT过程相关基因的表达。

实验结果如图8所示，snoRNA-U35A表达水平下调可以显著降低FN1、IGFBP4的表达，FN1、IGFBP4这两个基因都是肿瘤EMT过程中很重要的基因，可以促进肿瘤侵袭转移或增殖。

讨论

snoRNA与癌症发展密切相关，不仅参与癌细胞的增殖迁移，而且有望在癌症早期诊断中起重要作用。例如，在非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)发展过程中，血浆中SNORD33，SNORD66和SNORD76水平显著升高，而SNORA42激活有显著地致癌作用。SNORD113-1在抑制肝癌细胞生长和增殖方面具有强大的能力，从而在肝癌发展过程中起到很好的抑癌作用

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海尚泰生物技术有限公司

<120> snoRNA-U35A在检测以及治疗胰腺癌中的用途

<130> P2021-0190

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

gcggcggggc agatgatgtc c 21

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

atccagtgca gggtccgagg 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

gaauggcgac aaugccaaut t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

auuggcauug ucgccauuct t 21

Claims

1.一种检测snoRNA-U35A基因表达水平的检测试剂的用途，其特征在于，用于制备一诊断产品，所述诊断产品用于检测对象是否患有胰腺癌。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述snoRNA-U35A基因来源于人。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断包括早期诊断、辅助性诊断、或其组合。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述检测试剂包括：特异性扩增snoRNA-U35A基因的引物对、探针或者其组合。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测试剂含有SEQ ID No: 1和SEQ IDNo: 2所示的特异性扩增snoRNA-U35A基因的引物对。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述诊断产品为试剂盒，所述试剂盒包含第一检测试剂，所述第一检测试剂用于检测snoRNA-U35A基因的表达水平；

所述第一检测试剂含有SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示的特异性扩增snoRNA-U35A基因的引物对。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还含有标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测对象是否患有胰腺癌。

8.一种snoRNA-U35A阻断剂的用途，其特征在于，用于制备抑制胰腺癌细胞增殖的抑制剂。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述snoRNA-U35A阻断剂选自：SEQ ID No: 3所示的snoRNA -U35A-siRNA、SEQ ID No: 4所示的snoRNA -U35A-siRNA、snoRNA-U35A-shRNA、或其组合。