CN115887679A - 一种基因-化疗纳米药物共递送系统、其制备方法和用途 - Google Patents
一种基因-化疗纳米药物共递送系统、其制备方法和用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种基因‑化疗纳米药物共递送系统、其制备方法和应用。所述基因‑化疗纳米药物共递送系统包括由小细胞外囊泡、基因药物和化疗药物组成的纳米颗粒，所述基因药物和化疗药物被包载到小细胞外囊泡中。本发明的基因‑化疗纳米药物共递送系统靶向并调控卵巢癌细胞中的表观遗传调控因子，同时联合化疗作用，实现高效、低毒的卵巢癌治疗策略，基因‑化疗药物表现出协同作用，联合治疗体现出比单一治疗更好的抗肿瘤效果。本发明的基因‑化疗纳米药物递送系统为靶向并调控m6A表观遗传因子联合化疗的卵巢癌治疗提供了可行的方法和技术具有临床应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种基因-化疗纳米药物共递送系统、其制备方法和应用。
背景技术
上皮性卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，历来被称为“沉默的杀手”。尽管多西紫杉醇是卵巢癌的一线化疗药物之一，但单独的常规治疗并不能令人满意地改善患者的总体生存结果。近年来研究表明，表观遗传调控可能在卵巢癌的起因和发展过程具有重要作用。N6-甲基腺苷(m6A)是所有高等真核信使RNA中最普遍的转录后修饰，通过调节RNA加工、定位、翻译和最终衰变来调节基因表达的结果。现有研究表明，m6A识别蛋白YTHDF1在卵巢癌中异常上调，会通过作用于EIF3C蛋白质翻译并随后调节癌症进展来发挥关键的致癌作用，证明了YTHDF1作为癌症治疗靶点的潜在价值。因此，靶向m6A调节剂的RNA干扰疗法有望成为一种新兴的癌症疗法，利用siRNA等手段的基因治疗方法敲降YTHDF1的表达而抑制肿瘤进程。然而，未经修饰的裸siRNA分子在血流中不稳定，可能具有免疫原性，并且不容易跨越细胞膜进入细胞。因此，具有增强的安全性和递送效率以实现m6A调节剂抑制作用的递送系统尤为重要。目前常见的siRNA药物载体(主要包括病毒、聚合物纳米颗粒、无机纳米颗粒以及脂质体等)存在肿瘤靶向能力低、利用率低、系统毒性和免疫原性高等特点，限制了其临床应用。此外，卵巢癌现有的化疗药物多西紫杉醇的系统毒性和副作用较大，并且游离的化疗药物的生物利用率较低。通过合适的载体包载可以降低全身毒性、提高利用率、提高肿瘤杀伤作用。因此，利用合适的药物载体共同包载递送能够敲降YTHDF1表达的基因药物及化疗药物多西紫杉醇到达卵巢癌细胞具有重要意义。
小细胞外囊泡是细胞产生的一种具有磷脂双分子层结构的纳米级囊泡，它具有良好的入胞能力和生物相容性。利用小细胞外囊泡作为共递送载体，可以实现药物联合治疗并防止基因药物降解和提高化疗药物的抗肿瘤效果。因此，利用小细胞外囊泡同时封装可以敲降YTHDF1表达的基因药物siYTHDF1和用于卵巢癌治疗的化疗药物多西紫杉醇，可以将二者有效地递送到卵巢癌细胞中，靶向并调控卵巢癌中的表观遗传调控因子，并且结合化疗抗肿瘤药效来实现高效的卵巢癌治疗策略。目前尚未有研究将基于小细胞外囊泡的纳米载药技术与共递送m6A表观遗传调控方式和化疗药物相结合来实现对卵巢癌的治疗。
发明内容
因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种基因-化疗纳米药物共递送系统、其制备方法和应用。本发明中的纳米药物共递送平台结合了基因治疗和化学疗法，提供了一种在肿瘤治疗中应用m6A表观遗传调控的方法，可解决相关的低肿瘤靶向性和给药效率等问题，并且封装其中的化疗药物多西紫杉醇没有明显表现出化疗诱导的全身毒性。该共递送系统显示出比单一疗法更好的治疗效果，具有临床应用潜力。
在阐述本发明之前，定义本文所使用的术语如下：
术语“MsEV”是指人骨髓间充质干细胞来源的小细胞外囊泡。
术语“DTX”是指多西紫杉醇。
术语“siRNA”是指小干扰RNA。
术语“MsEV-siYTHDF1”是指包载siYTHDF1的小细胞外囊泡。
术语“MsEV-DTX”是指包载DTX的小细胞外囊泡。
术语“MsEV-siNC”是指包载siYTHDF1的阴性对照(Negative Control)siRNA的小细胞外囊泡。
术语“MsEV-siNC-DTX”是指共包载siYTHDF1的阴性对照(Negative Control)siRNA和多西紫杉醇的小细胞外囊泡。
术语“MsEV-siYTHDF1-DTX”是指共包载siYTHDF1和DTX的小细胞外囊泡。
术语“siYTHDF1”是指能够敲降YTHDF1蛋白表达的siRNA。
术语“m6A”是指N6-甲基腺嘌呤核苷酸甲基化。
术语“YTHDF1”是指一种已知m6A RNA甲基化识别蛋白，亦称为YTH结构域N6-甲基腺嘌呤(m6A)核苷酸结合蛋白1。
术语“siNC”是指siYTHDF1的阴性对照(Negative Control)siRNA，序列为5’-AACGAGCCATAACGAAAGG-3’。
术语“Optiprep”是一种分离液。
术语“PBS”是指磷酸盐缓冲溶液。
术语“DAPI”是指4’,6-二脒基-2-苯基吲哚。
为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种基因-化疗纳米药物共递送系统，所述基因-化疗纳米药物共递送系统包括由小细胞外囊泡、基因药物和化疗药物组成的纳米颗粒，所述基因药物和化疗药物被包载到小细胞外囊泡中；其中，
所述基因-化疗纳米药物共递送系统中纳米颗粒的粒径为100nm～250nm，优选为120nm～230nm；更优选为140nm～200nm。
根据本发明第一方面的基因-化疗纳米药物共递送系统，其中，
所述小细胞外囊泡的来源为正常组织细胞，优选选自以下一种或多种：巨噬细胞、DC细胞、间充质干细胞，更优选为间充质干细胞，最优选为人骨髓间充质干细胞；
所述基因药物为siRNA，优选为能够敲降m6A识别蛋白YTHDF1表达的RNA序列siYTHDF1；和/或
所述化疗药物为卵巢癌临床用药，优选选自以下一种或多种：金属铂类、蒽环类、紫杉烷类，更优选为紫杉烷类，最优选为多西紫杉醇。
根据本发明第一方面的基因-化疗纳米药物共递送系统，其中，所述siYTHDF1的序列选自以下一种或多种：SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，最优选为SEQ ID NO.1。
根据本发明第一方面的基因-化疗纳米药物共递送系统，其中，所述基因药物、所述化疗药物和所述小细胞外囊泡投料的质量比为0.1～5:0.01～1:0.5～10，优选为0.5～1.5:0.05～0.4:0.5～4，最优选为1:1:0.1。
本发明的第二方面提供了制备第一方面所述的基因-化疗纳米药物共递送系统的方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备小细胞外囊泡；
(2)将基因药物和化疗药物包载到步骤(1)制备的小细胞外囊泡中得到所述基因-化疗纳米药物共递送系统。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(1)中还包括以下步骤：培养基培养并收集细胞上清液，离心重悬得到所述小细胞外囊泡，保存在冰箱中；
优选地，待小细胞外囊泡的来源细胞密度达到70～80％时，更优选为达到74～78％时，再进行培养基培养；和/或
优选地，所述培养基为无血清培养基。
根据本发明第二方面的方法，其中，
所述培养基培养的时间为18h～36h，优选为20h～30h，最优选为24h；和/或
所述冰箱的温度为-100℃～-70℃，优选为-90℃～-70℃，最优选为-80℃。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(2)中：
所述基因药物、所述化疗药物和所述小细胞外囊泡投料的质量比为0.1～5:0.01～1:0.5～10，优选为0.5～1.5:0.05～0.4:0.5～4，最优选为1:1:0.1；和/或
所述包载的方法选自以下一种或多种：电穿孔、超声、常温孵育，最优选为电穿孔。
根据本发明第二方面的方法，其中，所述步骤(2)中，当所述包载的方法为电穿孔时，电穿孔后还包括以下步骤：将制得的混合溶液培养，重悬，离心，纯化去除游离试剂，得到所述基因-化疗纳米药物共递送系统；
优选地，所述培养的时间为50min～90min，更优选为50min～80min，最优选为60min；和/或
优选地，所述离心的时间为60min～120min，更优选为80min～100min，最优选为90min。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的基因-化疗纳米药物共递送系统或按照第二方面所述的方法制备的基因-化疗纳米药物共递送系统在制备用于治疗癌症的药物或医疗产品中的应用；
优选地，所述癌症选自以下一种或多种：卵巢癌、胃癌、肝癌，最优选为卵巢癌；和/或
优选地，所述治疗为表观遗传调控的方式联合化疗；
更优选地，所述表观遗传调控为靶向并调控N6-甲基腺嘌呤核苷酸甲基化表观遗传因子。
本发明的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-3所示：
SEQ ID NO.1：5’-ACGGCAGAGTCGAAACAAA-3’(由于计算机可读载体无法识别5’和3’，SEQ ID NO.1以说明书此处记载的序列为准)。
SEQ ID NO.2：5’-AACGAGCCATAACGAAAGG-3’(由于计算机可读载体无法识别5’和3’，SEQ ID NO.2以说明书此处记载的序列为准)。
SEQ ID NO.3：5’-GCCGTCCATTGGATTTCCT-3’(由于计算机可读载体无法识别5’和3’，SEQ ID NO.3以说明书此处记载的序列为准)。
根据本发明的一个具体实施例，本发明的第一方面提供了一种小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统，所述小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统利用人骨髓间充质干细胞来源的小细胞外囊泡通过电穿孔的方法共包载能够敲降YTHDF1表达的siYTHDF1和卵巢癌临床化疗药物多西紫杉醇(DTX)。该小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统可以延长共递送药物的体内循环时间，避免siYTHDF1的降解，可靶向并调控卵巢癌中的表观遗传调控因子，同时DTX的化疗效果得以增强，实现高效、低毒的卵巢癌联合治疗研究。
本发明的第二方面提供了第一方面所述的小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)提取人骨髓间充质干细胞来源的小细胞外囊泡(MsEV)；
(2)利用电穿孔的方法将siYTHDF1和DTX包载到人骨髓间充质干细胞来源的小细胞外囊泡中得到小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统(MsEV-siYTHDF1-DTX)。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(1)包括以下步骤：
待小细胞外囊泡的来源细胞密度达到70～80％时，用无血清培养基培养24小时后收集上清液，然后进行以下步骤来分离细胞外囊泡：
(A)将收集到的细胞上清液在4℃条件下，用程序化离心的方法去除坏死细胞及细胞碎片等，并用0.22微米滤膜进行过滤。
优选地，步骤(A)所述的程序化离心方法优选地为800g的离心力4℃下离心5分钟，弃去沉淀、收集上清后再以2,000g离心力4℃下继续离心20分钟。
(B)将步骤(A)所得的细胞上清液分装到超速离心管中，配平后均匀放到超速离心机中，在4℃条件下，超速离心1.5-2小时去除上清，并收集离心管壁的细胞外囊泡样品。
优选地，步骤(B)所述的超速离心的离心力为120,000-150,000g，所述的配平应使所有离心管的质量差严格控制在0.05克以内。
(C)用PBS重悬步骤(B)所得的细胞外囊泡，在4℃条件下再次超速离心1.5-2小时，离心结束后去掉上清，向超离管中加入适量PBS重悬并收集离心管壁的小细胞外囊泡样品，分装后将其保存在-80℃冰箱中备用。
优选地，步骤(C)所述超速离心的离心力为120,000-150,000g。
根据本发明第二方面的制备方法，其中，所述步骤(2)包括以下步骤：
将MsEV、siYTHDF1、DTX按照上述比例溶解于电穿孔缓冲溶液中，然后将该溶液体系加入0.4cm电穿孔比色皿中，并将比色皿置于冰上预冷0.5小时。随后将比色皿放于电穿孔仪中进行电穿孔操作，结束后，先将该体系置于冰上10分钟，使siYTHDF1和DTX充分进入MsEV，然后将该体系置于37℃培养箱中1小时使MsEV膜进行恢复，随后在4℃条件下超速离心以分离游离的siYTHDF1和DTX。
优选地，所述电穿孔缓冲溶液为磷酸盐缓冲液，含1-1.5mM磷酸钾(pH值7.2)，20-30mM氯化钾和18％-25％的Optiprep。所述电穿孔方法采用的电穿孔参数为：体积，400μL；电压，350-450V；电容，100-150μF。
本发明的第三方面提供了第一方面所述的小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统/或按照第二方面所述的制备方法而制得的小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统通过靶向并调控m6A表观遗传因子的方式联合化疗药物多西紫杉醇实现对卵巢癌的肿瘤联合治疗研究。
本发明提供了一种小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统，所述小细胞外囊泡由人骨髓间充质干细胞分泌，经超速离心法获得，无明显毒副作用。该小细胞外囊泡通过电穿孔的方法共包载能够敲降YTHDF1蛋白表达的siYTHDF1和化疗药物多西紫杉醇，并将二者有效地递送到卵巢癌细胞中，靶向并调控卵巢癌细胞中的表观遗传调控因子，实现高效、低毒的卵巢癌治疗策略，并且联合治疗体现出比单一治疗更好的抗肿瘤效果。本发明构建的小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统为靶向并调控m6A表观遗传因子联合化疗的卵巢癌治疗提供了可行的方法和技术具有临床应用潜力。本发明通过电穿孔实现共包载基因-化疗药物，基因-化疗药物具有协同作用，提高了化疗药物的敏感性，实现了联合治疗，且联合治疗比单一治疗具有更强的肿瘤抑制能力。
本发明的基因-化疗纳米药物共递送系统可以具有但不限于以下有益效果：
1.本发明选择了人骨髓间充质干细胞来源的细胞外囊泡，无明显毒副作用，可以靶向肿瘤部位，实现药物在肿瘤部位的聚集。
2.本发明的小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送能有效地将敲降YTHDF1表达的siYTHDF1基因药物递送到卵巢癌细胞中，靶向并调控卵巢癌中的表观遗传调控因子m6A实现卵巢癌的治疗。
3.本发明的小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送也能有效地将化疗药物多西紫杉醇递送到卵巢癌细胞中，实现卵巢癌的化疗效果。
4.在共同递送的MsEV-siYTHDF1-DTX组中，siYTHDF1与多西紫杉醇具有协同治疗的效果。
5.本发明的小细胞外囊泡共递送系统具有较好的siRNA沉默效果和化疗效果，能够抑制小鼠肿瘤生长，能够实现基因-化疗联合治疗卵巢癌。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了实施例1中siYTHDF1序列从SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3中优选SEQ ID NO.1；
图2示出了实施例2中人骨髓间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的形貌图。
图3示出了实施例2中MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒的形貌图。
图4示出了实施例2中MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒的粒径分布图。
图5示出了实施例4中MsEV和MsEV-siYTHDF1-DTX两种纳米颗粒Hsp70，CD9蛋白的表达情况。
图6示出了实施例5中A2780和SKOV3两株卵巢癌细胞对MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒的摄取情况。其中DAPI用来染细胞核，Cy5荧光标记siYTHDF1，罗丹明荧光标记DTX，可以用来指示共递送的基因-化疗药物在卵巢癌细胞内各自的分布；Merge是将指示细胞核的DAPI荧光、指示共递送系统在细胞中分布的siYTHDF1的Cy5荧光和指示共递送系统在细胞中分布的DTX的罗丹明荧光进行合并分析。
图7示出了实施例6中MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX分别给予A2780卵巢癌细胞后，目标基因YTHDF1及下游EIF3C基因的mRNA相对表达水平。
图8示出了实施例7中MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX分别给予A2780卵巢癌细胞后，目标基因YTHDF1及下游EIF3C基因的蛋白表达情况。
图9示出了实施例8中MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX对A2780卵巢癌细胞的毒性作用。
图10示出了实施例10中给予荷A2780肿瘤细胞的小鼠尾静脉注射游离siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒，在注射0h,6h,12h,24h,48h和72h后肿瘤部位的荧光成像图。
图11示出了实施例11中给予荷A2780肿瘤细胞的小鼠尾静脉注射MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒72h后肿瘤组织的药物(siYTHDF1和DTX)分布情况。
图12示出了实施例12中给予荷A2780肿瘤细胞的的小鼠尾静脉注射MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒后，小鼠肿瘤体积变化图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中使用的试剂和仪器如下：
试剂：
siYTHDF1的序列SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3；siNC(阴性对照)的序列，均购自广州锐博生物技术有限公司；
GAPDH正向引物序列为5’-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3’，反向引物序列为5’-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3’；YTHDF1正向引物序列为5’-ATGACAATGACTTTGAGCCCTA-3’，反向引物序列为5’-AGGGAGTAAGGAAATCCAATGG-3’；EIF3C正向引物序列为5’-AGGTTCCACATCTTCCGAT-3’，反向引物序列为5’-GCCTTCTTGTCCTCATCTGT-3’，均购自上海生工生物有限公司。
多西紫杉醇(RP56976)，购自Selleck公司(上海)；
无菌无酶PBS(MA0015-D)，购自大连美仑生物公司；
总RNA提取试剂盒(DP419)和SYBR Green法荧光定量试剂盒(FP205-01)，均购自天根生化科技有限公司；
反转录试剂盒(AT241-01)，购自北京全式金生物技术股份有限公司；
罗丹明标记多西紫杉醇，均购自西安齐岳生物科技公司；
4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、BCA蛋白质测定试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；
人间充质干细胞无血清培养基，购自浙江美森细胞科技有限公司；
CCK8细胞增殖试剂盒，购自日本同仁公司；
RNAiMAX转染试剂、蛋白酶抑制剂(87785)，磷酸酶抑制剂(A32957)，蛋白裂解液(87787)和10％浓度Bis-Tris预制胶均购自美国赛默飞有限公司；
PVDF膜购自美国密理博公司。
仪器：
生物透射电镜，购自日本日立科技有限公司，型号Ht-7700；
纳米颗粒跟踪分析仪，购自英国马尔文仪器有限公司，型号NS300；
单光子激光共聚焦成像系统，购自德国蔡司有限公司，型号Zeiss LSM710；
实时荧光定量PCR仪，购自美国赛默飞有限公司，型号QuantStudio 6；
酶标仪，购自美国分子仪器(上海)有限公司，型号Molecular Devices I3；
小动物活体光学成像系统，购自美国珀金埃尔默公司，型号IVIS Spectrum；
冰冻切片机，购自德国徕卡公司，型号CM1520；
超速离心机，购自美国贝克曼公司，型号OPTIMA XPN-100；
X-cell电穿孔仪，购自美国伯乐公司，型号165-2081。
实施例1
本实施例用于说明siYTHDF1序列从SEQ ID NO.1～3中选取SEQ IDNO.1，包括如下步骤：
根据RNAiMAX试剂盒说明，待A2780细胞密度达到50～60％时，对其分别转染siNC以及siYTHDF1 SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3，继续培养48h后刮取细胞并收集细胞沉淀。然后，在细胞沉淀里加入含有1/100(v/v)蛋白酶抑制剂和1/10(v/v)磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液。充分涡旋混匀后，将样品置于冰上裂解60分钟左右，期间样品放置于冰水浴中利用超声清洗仪超声3次，之后使用BCA蛋白质测定试剂盒(Solarbio，PC0020)进行蛋白定量并计算蛋白浓度。将裂解好的蛋白溶液与5×Loading buffer缓冲液(NuPAGETM LDS样品缓冲液、NP0007)混合，在100℃下加热5分钟，冷却后储存在-20℃冰箱待用。
接下来，用蛋白质免疫印迹法分析siNC以及siYTHDF1 SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3对A2780细胞YTHDF1蛋白表达的影响，siNC作为siRNA阴性对照，GAPDH作为内参蛋白。将10μg总蛋白的样品加在10％浓度Bis-Tris预制胶上样孔中，通过电泳分离总蛋白并利用湿转法将蛋白从胶上转移到PVDF膜(Millipore)上。转移完毕后，用0.1％Tween 20-Tris(TBST)缓冲溶液清洗PVDF膜，然后用5％(w/v)的脱脂奶粉室温封闭2小时，再加入5mL的一抗抗体稀释液(抗体稀释液是用TBST溶液配置好的5％的脱脂奶粉)在4℃中孵育过夜。用TBST清洗膜3次(每次5分钟)，再加入连接HRP的二抗抗体稀释液(抗体稀释液和一抗相同)室温孵育1小时，再次用TBST清洗膜3次(每次5分钟)。最后，在PVDF膜上滴加显影液(索莱宝，中国)，放入凝胶成像仪(伯乐，美国)进行自动曝光。
如图1所示，SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3均对A2780细胞表达YTHDF1蛋白有影响；其中，siYTHDF1 SEQ ID NO.1优于SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3，因此选取SEQID NO.1进行后续实验。
实施例2
本实施例用于说明本发明小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统的制备方法，包括如下步骤：
(1)间充质干细胞来源的细胞外囊泡(MsEV)的提取：
待人骨髓间充质干细胞密度达到70～80％时，本实施例的人骨髓间充质干细胞密度为76％±2％，用无血清培养基培养并收集上清液，然后进行以下步骤分离MSC细胞的小细胞外囊泡：
(A)将收集到的MSC细胞上清液在4℃条件下，以800g的离心力离心5分钟并收集上清。将所得上清液在4℃条件下，以2,000g离心力继续离心20分钟，再次收集上清，并使用0.22μm滤膜进行过滤；
(B)将步骤(A)所得上清分装到26mL超速离心管中，用无菌无酶PBS补充满整个离心管并保证无气泡，配平使所有离心管的重量差均在0.05g内，随后将其放入贝克曼超速离心机中，在4℃条件下，以150,000g的离心力离心1.5小时后去除上清，保留离心管壁的沉淀样品；
(C)在各离心管中加入无菌无酶PBS，将沉淀吹打下来，并将各离心管的沉淀样品合并到一个离心管中，使沉淀重新悬浮于26mL的无菌无酶PBS中，于4℃条件下，以150,000g离心力再次离心1.5小时；
(D)超离结束后去除上清，向超离管中加入200μL的无菌无酶PBS分散并收集沉淀在离心管壁的小细胞外囊泡样品，分装后将其保存在-80℃冰箱中。
(2)通过电穿孔的方法将siYTHDF1和DTX包载到步骤(1)制备的小细胞外囊泡中得到MsEV-siYTHDF1-DTX颗粒：
将MsEV、siYTHDF1(序列为SEQ ID NO.1：5’-ACGGCAGAGTCGAAACAAA-3’，广州锐博生物技术有限公司)和多西紫杉醇(RP56976，Selleck公司)按照1:1:0.1的重量比溶解于400μL电穿孔缓冲溶液中(1.15mM磷酸钾(pH值为7.2)，25mM氯化钾，21％的Optiprep)，使MsEV的终浓度不超过0.5μg/μL。然后将体系放入0.4cm预冷的电穿孔比色皿中，并将比色皿置于4℃冰上0.5小时。随后将比色皿放于基因脉冲X-cell电穿孔仪(BioRad，165-2081)中进行电穿孔，电穿孔参数设置为：体积，400μL；电压，400V；电阻，∞Ω；电容，150μF。电穿孔后的脉冲时间约为10到15毫秒。电穿孔后，先将该体系置于冰上10分钟，使siYTHDF1和DTX充分进入MsEV，然后将体系置于37℃培养箱中1小时使MsEV膜恢复，再将其悬于26mL无RNA酶的PBS中，继续超速离心(4℃，150,000g，90分钟)以分离游离的siYTHDF1和DTX得到最终的MsEV-siYTHDF1-DTX。
图2示出了实施例2中人骨髓间充质干细胞来源的胞外囊泡的形貌图。
图3示出了实施例2中MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒的形貌图。图4示出了实施例2中MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒的粒径分布图。
实施例3
本实施例用于说明单独包载siNC、单独包载siYTHDF1、单独包载DTX以及共包载siNC和DTX的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统的制备方法。
本实施例将按照实施例2的方法分别合成单独包载siNC、单独包载siYTHDF1、单独包载DTX以及共包载siNC和DTX的细胞外囊泡核酸纳米药物递送系统。
实施例4
本实施例用于测试MsEV和MsEV-siYTHDF1-DTX两种纳米颗粒Hsp70，CD9标志蛋白的表达情况。
首先，测定MsEV和实施例2制备的MsEV-siYTHDF1-DTX小细胞外囊泡的蛋白裂解浓度用于免疫印迹法分析的小细胞外囊泡样品应加入尽量少的PBS进行重悬以得到较高的浓度。在20μL的小细胞外囊泡悬浮液中加入含有1/100(v/v)蛋白酶抑制剂和1/10(v/v)磷酸酶抑制剂的蛋白裂解液。充分涡旋混匀后，将样品置于冰上裂解60分钟左右，期间样品放置于冰水浴中利用超声清洗仪超声3次，之后使用BCA蛋白质测定试剂盒(Solarbio，PC0020)进行蛋白质定量并计算蛋白浓度。将裂解好的小细胞外囊泡与5×Loading buffer缓冲液(NuPAGETM LDS样品缓冲液、NP0007)混合，在100℃下加热5分钟，冷却后储存在-20℃冰箱待用。
接下来，按照实施例1的步骤，用蛋白质免疫印迹法分析MsEV和实施例2制备的MsEV-siYTHDF1-DTX两种纳米颗粒的小细胞外囊泡标志蛋白的表达，结果如图5所示。
图5示出了实施例4中MsEV和MsEV-siYTHDF1-DTX两种纳米颗粒Hsp70，CD9蛋白的表达情况。如图5所示，MsEV和MsEV-siYTHDF1-DTX均表达小细胞外囊泡标志蛋白Hsp70和CD9(β-actin作为内参对照)，说明MsEV包载前后并没有改变小细胞外囊泡相关标志蛋白的表达水平，即没有改变小细胞外囊泡的膜结构。
实施例5
本实施例用于测试A2780和SKOV3两株卵巢癌细胞对MsEV-siYTHDF1-DTX包载两种药物(siYTHDF1和DTX)的摄取情况。
将A2780和SKOV3细胞分别培养于共聚焦培养皿中(1×105细胞/孔)，培养过夜，再分别加入50μL的实施例1制备的MsEV-siYTHDF1-DTX(相同浓度的小细胞外囊泡：1×1011颗粒/mL)孵育8小时(本实施例所用的siYTHDF1是Cy5荧光标记的，可以用来指示小细胞外囊泡药物共递送系统中siYTHDF1在卵巢癌细胞内的分布；本实施例所用的DTX是罗丹明荧光标记的，可以用来指示小细胞外囊泡药物共递送系统中DTX在卵巢癌细胞内的分布)。A2780和SKOV3细胞用PBS洗涤，DAPI染色15分钟，洗涤后用单光子共聚焦显微镜(Zeiss公司，德国)观察两株卵巢癌细胞对纳米颗粒的摄取情况。分析摄取情况时，将指示细胞核的DAPI荧光和指示小细胞外囊泡药物共递送系统中的Cy5荧光和罗丹明荧光进行合并分析(Merge)。
图6示出了实施例5中A2780和SKOV3两株卵巢癌细胞对MsEV-siYTHDF1-DTX包载两种药物(siYTHDF1和DTX)的摄取情况。其中DAPI用来染细胞核；siYTHDF1是Cy5荧光标记的，可以用来指示小细胞外囊泡药物共递送系统中siYTHDF1在卵巢癌细胞内的分布；DTX是罗丹明荧光标记的，可以用来指示小细胞外囊泡药物共递送系统中DTX在卵巢癌细胞内的分布；Merge是将指示细胞核的DAPI荧光、指示小细胞外囊泡药物共递送系统细胞中siYTHDF1分布的Cy5荧光、指示小细胞外囊泡药物共递送系统细胞中DTX分布的罗丹明荧光进行合并分析。
实施例6
本实施例用于测试MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX分别给予A2780卵巢癌细胞后，目标基因YTHDF1及其下游基因EIF3C的mRNA水平的表达情况。
将A2780细胞置于六孔细胞培养板里(每孔2×105个细胞)，培养过夜后，各组加入MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒(所有样品的体积均为50μL，所含MsEV的个数相同，为1×1011颗粒/mL)分别孵育48小时，随后通过qRT-PCR实验分析各组细胞经纳米颗粒处理后，YTHDF1及下游EIF3C基因的mRNA表达水平。步骤如下：将每组处理完的细胞通过RNA提取试剂盒(DP419)离心柱法提取总RNA，然后通过反转录试剂盒(AT341-01)在将上一步的RNA在20μL体系中42℃孵育15分钟、85℃孵育5秒钟扩增反转录成cDNA。接下来，利用荧光定量PCR试剂盒(FP205-01)将cDNA与引物进行混合。加样完成后，在实时荧光定量PCR仪(QuantStudio6)通过SYBR Green法进行分析。
图7示出了实施例6中MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX分别给予A2780卵巢癌细胞后，以GAPDH作为内参基因进行半定量分析，目标基因YTHDF1和下游基因EIF3C的mRNA相对表达情况。
图7的qRT-PCR结果显示，MsEV-siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX组的YTHDF1 mRNA水平显著降低，说明构建的小细胞外囊泡药物共递送系统可将siYTHDF1递送到卵巢癌细胞，并成功地敲降YTHDF1的mRNA表达水平，DTX的加入没有影响siYTHDF1发挥作用。但是，EIF3C的mRNA水平没有变化，说明siYTHDF1并不影响下游基因EIF3C在mRNA水平的表达。
实施例7
本实施例用于测试MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX分别给予A2780卵巢癌细胞后，目标基因YTHDF1及其下游基因EIF3C的蛋白水平的表达情况。
将A2780细胞置于六孔细胞培养板里(每孔2×105个细胞)，培养过夜后，分别加入MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒(所有样品的体积均为50μL，所含MsEV的个数相同，为1×1011颗粒/mL)分别孵育48小时，接下来，按照实施例1的步骤提取各组样品孵育后A2780细胞的蛋白并用蛋白质免疫印迹法分析各组细胞经纳米颗粒处理后，其YTHDF1蛋白及下游EIF3C蛋白的表达水平。
图8示出了实施例7中MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX分别给予A2780卵巢癌细胞后，目标YTHDF1蛋白和下游EIF3C蛋白的表达情况，GAPDH为内参蛋白。
图8的Western blot结果显示，MsEV-siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX组的YTHDF1和EIF3C蛋白水平显著降低，说明构建的小细胞外囊泡药物共递送系统可将siYTHDF1递送到卵巢癌细胞，并成功地敲降YTHDF1及其下游EIF3C蛋白的表达水平，DTX的加入没有影响siYTHDF1发挥作用。
根据实施例6和7的mRNA和蛋白水平的变化分析，siYTHDF1可以降低YTHDF1基因的mRNA和蛋白表达水平，而下游基因EIF3C由于发生了m6A修饰，以表观遗传调控的方式发挥作用，因此在敲低YTHDF1之后，EIF3C只在蛋白水平下调，mRNA水平不变。
实施例8
本实施例用于测试MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX对A2780卵巢癌细胞的毒性作用。
将A2780细胞分别以0.5×104个/孔的密度接种到96孔板中并培养过夜。随后在A2780细胞中分别加入不同的样品(MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和实施例2制备MsEV-siYTHDF1-DTX)(siYTHDF1的量均为每孔50nM，DTX的量均为每孔2nM)，孵育0、24、48和72小时。孵育结束后分别向每孔加入10μL的CCK8在37℃孵育2小时，用酶标仪在450nm处测定吸光度。
图9示出了实施例8中MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX对A2780卵巢癌细胞的毒性作用。
图9的结果显示，MsEV和MsEV-siNC组对A2780细胞没有明显的毒副作用，而MsEV包裹的单一药物MsEV-siYTHDF1和MsEV-DTX表现出抑制卵巢癌细胞增殖的能力，并且MsEV共递送的MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒对肿瘤细胞增殖的抑制作用进一步被增强，说明基因-化疗联合治疗可以起到更强的抑瘤作用。
实施例9
本实施例用于测试siYTHDF1与DTX对A2780卵巢癌细胞的药物协同作用。
将A2780细胞分别以0.5×104个/孔的密度接种到96孔板中并培养过夜。随后在A2780细胞中分别加入不同的样品(MsEV-DTX，MsEV-siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX)。其中MsEV-DTX组中DTX的量为0-12nM浓度梯度；MsEV-siYTHDF1组中siYTHDF1的量为0-70nM浓度梯度；MsEV-siYTHDF1-DTX组中siYTHDF1：DTX按照25：1的浓度比，其中DTX浓度梯度0-2.4nM，siYTHDF1浓度梯度0-60nM。之后，将96孔板在37℃孵育48小时。孵育结束后，按照实施例8的步骤分别向每孔加入10μL的CCK8试剂再37℃孵育2小时，用酶标仪在450nm处测定吸光度。
表1 MsEV-DTX，MsEV-siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX对A2780卵巢癌细胞增殖的抑制率
表1示出了实施例9中MsEV-DTX，MsEV-siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX对A2780卵巢癌细胞增殖的抑制率在25％和50％时对应的DTX与siYTHDF1浓度值。根据单一用药和联合用药的浓度值，计算得到药物协同指数。
表1的结果显示，在细胞增殖抑制率25％和50％下，单一用药组MsEV-DTX中DTX的浓度值分别为4.819和10.259nM，而联合用药组MsEV-siYTHDF1-DTX中DTX的浓度值分别为0.514和1.955nM；单一用药组MsEV-siYTHDF1中siYTHDF1的浓度分别为36.637和69.494nM，而联合用药组MsEV-siYTHDF1-DTX中siYTHDF1的浓度分别为12.843和48.870nM，说明了联合用药可以减小用药量。同时，根据协同指数的说明：大于1是拮抗作用、等于1是加和作用、小于1是协同作用，在细胞增殖抑制率25％和50％下的协同指数均小于1，说明siYTHDF1与DTX联合使用具有协同效应，能增强抗肿瘤能力，说明联合用药的可行性和重要性。
实施例10
本实施例用于测试分别给予荷A2780肿瘤细胞的小鼠尾静脉注射游离siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒后，在注射0h,6h,12h,24h,48h和72h时小鼠活体荧光成像情况。
本实施例所用的游离siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX中的siYTHDF1是Cy5荧光标记的，可以用来指示siYTHDF1在小鼠体内的分布；本实施例所用的DTX是罗丹明荧光标记的，可以用来指示DTX在小鼠肿瘤组织中的分布。
为了检测游离siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒在小鼠体内荧光成像，给荷瘤小鼠尾静脉注射游离siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒(siYTHDF1为10nmoL/kg)，并在注射后不同时间点(0h、6h、12h、24h、48h和72h)采用小动物活体光学成像系统(珀金埃尔默公司,美国)采集活体荧光图像。
图10示出了实施例10中给予荷A2780肿瘤细胞的小鼠尾静脉注射游离siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒，在注射0h,6h,12h,24h,48h和72h后小鼠体内的活体荧光成像图。
图10的结果显示了静脉注射游离siYTHDF1和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒后，随着血液循环，siYTHDF1在6h都会先到达肝脏。不同的是，游离siYTHDF1随着时间延长逐渐被肝脏清除，荧光信号在12h减弱直至24h及以后无法被检测到；而MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒中的siYTHDF1虽然一部分被肝脏截留，但随着时间的延长，由于MsEV的肿瘤靶向作用，siYTHDF1会逐渐在肿瘤部位聚集，并且荧光信号在24h时达到最大值，随后慢慢减弱，72h时仍可在肿瘤部位检测到，表明MsEV包裹的共递送纳米颗粒具有良好的肿瘤靶向效果和防止基因药物被肝脏清除的作用。
实施例11
本实施例用于测试给予荷A2780肿瘤细胞的小鼠尾静脉注射MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒72h后小鼠肿瘤部位的药物(siYTHDF1和DTX)分布情况。
本实施例所用的siYTHDF1是Cy5荧光标记的，可以用来指示siYTHDF1在小鼠体内的分布；本实施例所用的DTX是罗丹明荧光标记的，可以用来指示DTX在小鼠肿瘤组织中的分布。
为了检测siYTHDF1和DTX在小鼠肿瘤部位的分布情况，取出尾静脉注射MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒72h后小鼠的肿瘤组织，采用冰冻切片机(Leica,德国)制成组织切片，并通过荧光显微镜采集荧光图像。
图11示出了实施例11中给予荷A2780肿瘤细胞的小鼠尾静脉注射MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒72h后，小鼠肿瘤组织的药物(siYTHDF1和DTX)分布情况。其中DAPI用来染细胞核；siYTHDF1是Cy5荧光标记的，可以用来指示小细胞外囊泡药物共递送系统中siYTHDF1在小鼠肿瘤组织内的分布；DTX是罗丹明荧光标记的，可以用来指示小细胞外囊泡药物共递送系统中DTX在小鼠肿瘤组织内的分布；Merge是将指示细胞核的DAPI荧光、指示siYTHDF1分布的Cy5荧光、指示DTX分布的罗丹明荧光进行合并分析。
图11的结果显示了尾静脉注射MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒72h后，siYTHDF1和DTX会到达小鼠肿瘤组织，说明基因-化疗药物在小鼠肿瘤部位的聚集。
实施例12
本实施例用于测试给予荷A2780肿瘤细胞的的小鼠尾静脉注射MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒后，小鼠肿瘤体积变化情况。
为了研究MsEV-siYTHDF1-DTX的抗肿瘤效果，我们首先利用A2780细胞在BALB/c裸鼠上建立了皮下细胞系异种移植模型并随机对其进行分为6组(每组5只)。每组小鼠通过尾静脉的方式注射MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX(每只注射的小细胞外囊泡量为1×1011个/mL，120μL；siYTHDF1的用量为3μg；DTX的用量为5mg/kg)。隔天进行给药治疗，并用游标卡尺测量各组裸鼠肿瘤的长径(L)和短径(W)，计算肿瘤体积。体积计算公式：体积＝L×W2/2。
图12示出了实施例12中给予荷A2780肿瘤细胞的的小鼠尾静脉注射MsEV，MsEV-siNC，MsEV-siYTHDF1，MsEV-DTX，MsEV-siNC-DTX和MsEV-siYTHDF1-DTX纳米颗粒后，小鼠肿瘤体积变化图。
图12结果显示，尽管单一治疗组(MsEV-siYTHDF1和MsEV-DTX)具有一定的抑制肿瘤生长的能力，但是联合治疗组(MsEV-siYTHDF1-DTX)对肿瘤体积的抑制作用最为明显，治疗18天后联合治疗组的小鼠肿瘤体积几乎没有明显生长，证明了小细胞外囊泡基因-化疗纳米药物共递送系统对卵巢癌的联合治疗作用。
尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。
Claims (10)
1.一种基因-化疗纳米药物共递送系统，其特征在于，所述基因-化疗纳米药物共递送系统包括由小细胞外囊泡、基因药物和化疗药物组成的纳米颗粒，所述基因药物和化疗药物被包载到小细胞外囊泡中；其中，
所述基因-化疗纳米药物共递送系统中纳米颗粒的粒径为100nm～250nm，优选为120nm～230nm；更优选为140nm～200nm。
2.根据权利要求1所述的基因-化疗纳米药物共递送系统，其特征在于：
所述小细胞外囊泡的来源为正常组织细胞，优选选自以下一种或多种：巨噬细胞、DC细胞、间充质干细胞，更优选为间充质干细胞，最优选为人骨髓间充质干细胞；
所述基因药物为siRNA，优选为能够敲降m6A识别蛋白YTHDF1表达的RNA序列siYTHDF1；和/或
所述化疗药物为卵巢癌临床用药，优选选自以下一种或多种：金属铂类、蒽环类、紫杉烷类，更优选为紫杉烷类，最优选为多西紫杉醇。
3.根据权利要求1或2所述的基因-化疗纳米药物共递送系统，其特征在于，所述siYTHDF1的序列选自以下一种或多种：SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3，最优选为SEQ ID NO.1。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的基因-化疗纳米药物共递送系统，其特征在于：所述基因药物、所述化疗药物和所述小细胞外囊泡投料的质量比为0.1～5:0.01～1:0.5～10，优选为0.5～1.5:0.05～0.4:0.5～4，最优选为1:1:0.1。
5.制备权利要求1至4中任一项所述的基因-化疗纳米药物共递送系统的方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)制备小细胞外囊泡；
(2)将基因药物和化疗药物包载到步骤(1)制备的小细胞外囊泡中得到所述基因-化疗纳米药物共递送系统。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中还包括以下步骤：培养基培养并收集细胞上清液，离心重悬得到所述小细胞外囊泡，保存在冰箱中；
优选地，待小细胞外囊泡的来源细胞密度达到70～80％时，更优选为达到74～78％时，再进行培养基培养；和/或
优选地，所述培养基为无血清培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述培养基培养的时间为18h～36h，优选为20h～30h，最优选为24h；和/或
所述冰箱的温度为-100℃～-70℃，优选为-90℃～-70℃，最优选为-80℃。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中：
所述基因药物、所述化疗药物和所述小细胞外囊泡投料的质量比为0.1～5:0.01～1:0.5～10，优选为0.5～1.5:0.05～0.4:0.5～4，最优选为1:1:0.1；和/或
所述包载的方法选自以下一种或多种：电穿孔、超声、常温孵育，最优选为电穿孔。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，当所述包载的方法为电穿孔时，电穿孔后还包括以下步骤：将制得的混合溶液培养，重悬，离心，纯化去除游离试剂，得到所述基因-化疗纳米药物共递送系统；
优选地，所述培养的时间为50min～90min，更优选为50min～80min，最优选为60min；和/或
优选地，所述离心的时间为60min～120min，更优选为80min～100min，最优选为90min。
10.权利要求1至4中任一项所述的基因-化疗纳米药物共递送系统或按照权利要求5至9中任一项所述的方法制备的基因-化疗纳米药物共递送系统在制备用于治疗癌症的药物或医疗产品中的应用；
优选地，所述癌症选自以下一种或多种：卵巢癌、胃癌、肝癌，最优选为卵巢癌；和/或
优选地，所述治疗为表观遗传调控的方式联合化疗；
更优选地，所述表观遗传调控为靶向并调控N6-甲基腺嘌呤核苷酸甲基化表观遗传因子。
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2022
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Patent Citations (6)
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