CN116144600A - 一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡(TF NVs)及其制备方法和应用。所述TF NVs由生物细胞膜构成，细胞膜表面表达转铁蛋白；并进一步制备得到了衍生化的TF NVs，包括载铁纳米囊泡、载药纳米囊泡及载铁与载药联用纳米囊泡。本发明研究显示，上述纳米囊泡可结合肿瘤细胞中转铁蛋白受体TFRC靶向肿瘤细胞，从而实现纳米囊泡的肿瘤靶向递送。同时能够显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞铁死亡；在体内生理环境中，均能抑制小鼠体内肿瘤生长和增殖，并促进肿瘤部位铁离子的积累，通过诱导肿瘤细胞铁死亡从而实现对肿瘤的治疗，可作为新型的药物递送工具或药物制剂，也为癌症治疗提供了一个新思路。

Description

一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及其制备方法和 应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
传统的癌症治疗方法包括化疗、放疗和手术，虽然有效，但副作用严重。此外，化疗和放疗的生存效益不足，手术治疗转移性肿瘤无效。因此，开发更有效、毒性更小的治疗方法是非常必要的。与传统疗法相比，癌症免疫疗法是通过激活免疫系统的免疫反应来治疗癌症。增强免疫系统来对抗癌症的方法是由威廉·科利博士在19世纪末首次提出的。此外，肿瘤内注射微生物毒素引发抗癌作用也是由他首先提出的。此后，癌症免疫治疗的研究蓬勃发展，取得了良好的临床效果，如肿瘤疫苗、免疫检查点封锁和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)治疗。当前，免疫治疗在各种恶性肿瘤的治疗中取得了良好的效果，在癌症治疗领域发挥着重要的作用。但由于免疫治疗具有明显的复杂性和不确定性，诱导免疫系统过度活跃可能导致严重的不良反应。因此，开发新的治疗方法，克服免疫治疗引起的不良事件具有重要意义。
细胞死亡是生命体更新换代的必经过程，细胞死亡方式可以包括多种，比如程序性细胞死亡方式(自噬)、细胞凋亡、细胞坏死等，随着科学研究的不断深入，新的细胞死亡方式也浮出水面。2012年，一种新的细胞死亡方式——铁死亡(Ferroptosis)由Dixon等提出，铁死亡是一种依赖铁离子的氧化死亡方式，以过度的氧化应激和膜脂质过氧化反应为主要表现，最终导致质膜破裂，从而造成细胞死亡。随着研究的不断深入，关于铁死亡的调节机制不断在丰富，但经典的两条分子机制还是谷胱甘肽过氧化物酶4(Glutathionperoxidase 4，GPX4)的活性阻断。第一种是通过抑制System Xc-(胱氨酸/谷氨酸膜上逆转运通道)抑制GPX4的合成；另一种是直接用药物降解或阻断GPX4的活性，这两条机制的最终结果都是膜上脂质过氧化物ROS的积累，产生细胞毒性并破坏膜的完整性，导致细胞死亡。但近些年，随着大量研究的不断深入，研究者们也发现了一些不依赖GPX4通路的分子机制，比如铁死亡抑制蛋白(Ferroptosis-suppressor-protein1，FSP1)通路、Keap1-Nrf2-ARE信号通路、p53调控机制、PUFAs(多不饱和脂肪酸)转运通路、谷氨酰胺转运通路、转铁蛋白转运通路等等。
转铁蛋白受体(Transferrin receptor，TFRC，CD71)是表达于快速增殖细胞表面的一种Ⅱ跨膜糖蛋白，由二硫键连接两个相同亚基(95KD)构成，是机体铁代谢、免疫功能和细胞调节的重要因素之一。多项研究表明，TFRC在多种肿瘤细胞(包括肺癌、肝癌、乳腺癌、胰腺癌等)过表达，TFRC的表达程度与肿瘤分级和分期呈正相关，而且TFRC在HCC组织中表达比正常组织高，与较差的生存率有关，可提示HCC的临床预后。TFRC在肿瘤细胞中过表达的原因主要有三点：1)铁是细胞增殖和能量代谢的重要元素，TFRC是细胞铁代谢所必需的重要蛋白成分，肿瘤细胞高表达TFRC，能够满足肿瘤细胞生长增殖对铁的大量需求；2)TFRC参与调节癌细胞NF-κB信号通路，打破细胞增殖与凋亡之间的平衡抑制细胞凋亡，从而提高肿瘤细胞生存率；3)TFRC促进线粒体呼吸，增加ROS产生，诱导DNA损失引发突变，促进肿瘤的发生转移。因此，TFRC被认为是一种有效的肿瘤标志物，能够有效地靶向肿瘤细胞，提高肿瘤治疗的效果。
同时，TFRC也是细胞铁死亡相关铁摄取受体，是细胞摄取转铁蛋白复合物所必需的，研究表明TFRC基因沉默能够抑制Erastin或其他诱导剂引起的铁死亡。相反地，在生长培养基中添加铁结合的转铁蛋白或生物可利用铁(如柠檬酸铁铵)，而不添加其他二价金属，会加速Erastin诱导的铁死亡。所以，通过TFRC靶向肿瘤细胞诱导铁死亡将会是极具开发潜力的肿瘤治疗新策略。然而目前还缺少可通过结合TFRC靶向肿瘤细胞诱导铁死亡的相关药物递送载体和药物制剂。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡。
本发明的第二个目的在于提供所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡的制备方法。
本发明的第三个目的在于提供一种载铁纳米囊泡。
本发明的第四个目的在于提供所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡或载铁纳米囊泡作为药物载体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明的第五个目的在于提供一种肿瘤靶向药物制剂。
本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：
一种经基因改造膜表面高表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡(TF NVs)，由生物细胞膜构成，细胞膜表面表达转铁蛋白。
近年来，细胞外囊泡给药被提出作为一种无细胞治疗的策略之一，因其提高免疫治疗的安全性和有效性而受到越来越多的关注。细胞外囊泡是由活细胞产生的异质膜囊泡，是细胞间信息和物质的天然载体。细胞外囊泡广泛存在于血液、尿液、唾液、脑脊液、胸液和母乳中，根据产生方式的不同可分为外泌体、微泡和凋亡小体。同时，细胞外囊泡作为天然载体，在药物传递领域得到了广泛的研究。与其他载药纳米材料不同的是，细胞外囊泡可以直接将载药物质送到细胞质中，优点是生物相容性好，免疫原性低。细胞外囊泡也显示出跨越生理障碍和同源靶向的潜力。此外，细胞外囊泡还具有广泛的生物调节功能，如免疫调节、信号转导等。因为以上的优点细胞外囊泡的使用有望发展出更安全、无细胞的免疫治疗策略。
而本申请通过基因工程改造，提供了一种膜表面高表达转铁蛋白的纳米囊泡(TFNVs)，所述TF NVs可靶向结合肿瘤细胞内的TFRC，靶向肿瘤细胞诱导铁死亡，抑制肿瘤生长，可高效载铁、载药，并且无生物安全性问题。可作为新型的肿瘤靶向载药递送工具，也为癌症治疗提供了一个新思路，具有较大的应用前景。
优选地，所述生物细胞膜来源于HEK-293T细胞系。
优选地，所述细胞膜仿生纳米囊泡的粒径为100～200nm。
进一步优选地，所述细胞膜仿生纳米囊泡的粒径为120～160nm。
再优选地，所述细胞膜仿生纳米囊泡的粒径为150～160nm。
优选地，所述细胞膜仿生纳米囊泡的电势为-37mv～-39mV。
进一步优选地，所述所述细胞膜仿生纳米囊泡的电势为-38mV。
本发明上述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡的制备方法，包括如下步骤：
S1.在分泌型转铁蛋白(Transferrin，TF)基因序列N端插入一段跨膜蛋白基因序列，并带上绿色荧光标签(GFP)标签，通过慢病毒感染方式构建出膜上稳定过表达转铁蛋白的细胞系；
S2.提取步骤S1膜上稳定过表达转铁蛋白的细胞系的细胞膜，通过挤压出泡的方式制备得到表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡。
优选地，步骤S1为在分泌型TF蛋白基因序列(NM_001063.4)N端插入一段跨膜蛋白基因序列(FIBCD1)，采用pLV-puro-GFPSpark载体使TF蛋白带上绿色荧光(GFP)标签，构建得到pLV-puro-FIBCD1-TF-GFPSpark载体，再通过慢病毒感染HEK-293T细胞，成功构建出膜上稳定过表达TF的HEK-293T细胞。
优选地，步骤S2为将过表达TF蛋白HEK-293T细胞裂解，4℃，5000r离心10min，弃未裂解的细胞沉淀，取上清再12000r离心10min，去掉上清，膜沉淀清洗后进行挤压出泡，即得表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡。
优选地，所述挤压出泡为先用0.4～0.5μm的滤膜进行初步挤压，再用0.2～0.25μm的滤膜进一步挤压并除菌分装，以此制备得到TF-GFP NVs。
进一步优选地，所述挤压出泡为先用0.45μm的滤膜进行初步挤压，再用0.22μm的滤膜进一步挤压并除菌分装，以此制备TF-GFP NVs。
本发明还提供一种载铁纳米囊泡(TF-Fe3+NVs)，包括上述任一所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及负载在其表面的Fe3+。所述TF-Fe3+NVs能够显著抑制肿瘤细胞的增殖和生长，能够显著诱导肿瘤细胞铁死亡指标分子ACSL4的表达、LIP的积累、ROS的产生，促进肿瘤部位铁离子的积累，诱导肿瘤细胞铁死亡。
所述TF-Fe3+NVs的制备方法为将TF NVs与Fe3+在36～38℃条件下共孵育25～35min制备成载铁纳米囊泡TF-Fe3+NVs。
本发明还提供上述任一所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡或载铁纳米囊泡作为药物载体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明还一种肿瘤靶向药物制剂，包括上述任一所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡(TF NVs)或载铁纳米囊泡(TF-Fe3+NVs)作为药物载体及包载在纳米囊泡内的抗肿瘤药物。即载药纳米囊泡(药物@TF NVs)或载铁与载药联合给药纳米囊泡(药物@TF-Fe3+NVs)。所述药物制剂中的纳米囊泡同时作为靶向肿瘤的药物载体和其本身具有的诱导肿瘤细胞铁死亡从而发挥抗肿瘤的功效。
所述载药纳米囊泡(药物@TF NVs)的制备方法为将TF NVs与抗肿瘤药物共孵育并通过电转实现药物包载，从而制备成载药纳米囊泡。
所述载铁与载药联合给药纳米囊泡(药物@TF-Fe3+NVs)的制备方法为将载药纳米囊泡(药物@TF NVs)与Fe3+在36～38℃条件下共孵育25～35min制备成载铁与载药联合给药纳米囊泡(药物@TF-Fe3+NVs)。
优选地，所述肿瘤治疗药物为能够诱导肿瘤细胞发生铁死亡的肿瘤治疗药物。可通过纳米囊泡具有的诱导肿瘤细胞铁死亡功能配合其它的诱导肿瘤细胞发生铁死亡的肿瘤治疗药物协同进行抗肿瘤。
进一步优选地，所述肿瘤治疗药物为索拉菲尼(SOR)。
优选地，所述肿瘤为肝癌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及一系列衍生化的表达转铁蛋白纳米囊泡，包括载铁纳米囊泡、载药纳米囊泡及载铁与载药联合给药纳米囊泡；本发明研究显示，上述纳米囊泡可结合肿瘤细胞中转铁蛋白受体TFRC靶向肿瘤细胞，从而实现纳米囊泡的肿瘤靶向递送；同时能够显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞铁死亡；在体内生理环境中，均能抑制小鼠体内肿瘤生长和增殖，并促进肿瘤部位铁离子的积累，并在原位肿瘤小鼠模型中也有良好的治疗效果。本发明上述纳米囊泡通过诱导肿瘤细胞铁死亡从而实现对肿瘤的治疗，可作为新型的药物递送工具或药物制剂，也为癌症治疗提供了一个新思路。
附图说明
图1为TF NVs制备及表征。A：TF NVs制备过程。B：利用qPCR检测293T细胞(NC)及293T-TF-GFP细胞的TF mRNA水平。C：利用激光共聚焦显微镜下观察绿色荧光标签(GFP)的表达情况，标尺：5μm，证明TF-GFP成功膜上表达。D：利用TEM观察纳米囊泡的形态，标尺：200nm。E：利用DLS分析TF纳米囊泡的粒径分布，主要分布在120-160nm。F：利用PALS分析TFNVs的Zeta电位分布，稳定保持在-38mV，说明膜结构稳定。G：利用激光共聚焦显微镜下观察带绿色荧光标签的TF-GFP NVs形态，标尺：2μm。H：利用WB分析293T NVs、293T细胞裂解液、293T-GFP NVs、293T-GFP细胞裂解液、293T-TF-GFP NVs、293T-TF-GFP细胞裂解液中GFP蛋白标签的表达情况，Na+K+ATPase膜蛋白定量内参，WCL：whole cell lysate。
图2为TF NVs体内生物学靶向功能。A：利用qPCR检测293T细胞(NC)及293T-TFRC-OFP细胞的TFRC mRNA水平。B：利用WB分析293T细胞裂解液、293T-OFP细胞裂解液、293T-TFRC-OFP细胞裂解液中OFP蛋白标签的表达情况，WCL：whole cell lysate。证明受体TFRC过表达细胞系构建成功。C：利用激光共聚焦显微镜观察绿色的纳米囊泡与红色的TFRC受体共定位，并被内吞进细胞，标尺：5μm。D：利用流式检测TF NVs在0、6h细胞内吞情况。E：用体内成像仪检测了Cy5.5标记的TF NVs和293T NVs在小鼠体内分布情况，可以看到TF NVs能够显著在肝脏、肝癌肿瘤中富集。
图3为TF NVs的应用扩展(药物靶向递送)。A：TF NVs与Fe3+在37℃共孵育30min能够制备成TF-Fe3+NVs，TF NVs与索拉菲尼(sorafenib，SOR)在共孵育并电转能够制备成SOR@TF-Fe3+NVs。B：TF-Fe3+NVs结合铁离子的量。C：SOR@TF-Fe3+NVs能够包载33％的sorafenib。D：利用DLS分析TF NVs、TF-Fe3+NVs、SOR@TF-Fe3+NVs的粒径分布，主要分布在160nm左右。E：利用PALS分析TF NVs、TF-Fe3+NVs、SOR@TF-Fe3+NVs的Zeta电位分布，稳定保持在-38mV，说明膜结构稳定。F：利用激光共聚焦显微镜观察绿色的载药纳米囊泡与红色的TFRC受体共定位，并被内吞进细胞，标尺：5μm。G：利用流式检测TF-Fe3+NVs在0、6、12、24h细胞内吞情况。H：肝癌细胞克隆形成实验，右边为各处理组克隆数的定量分析，HegG2-SR：HepG2 sorafenib-resistance cells；说明TF-Fe3+NVs、SOR@TF-Fe3+NVs能够显著抑制肿瘤细胞的增殖和生长。
图4为TF NVs体外诱导肿瘤细胞铁死亡。A：TF NVs制备成的SOR@TF-Fe3+NVs能够依靠TF的靶向递送功能将Fe3+、SOR递送到肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞发生铁死亡。B：qPCR分析铁死亡指标分子ACSL4的表达，ACSL4:Long-chain-fatty-acid-CoA ligase 4。C：流式检测肝癌细胞系、耐药细胞系中不稳定铁池的水平；LIP：Labile iron pool，铁死亡特征指标。D：流式检测肝癌细胞系、耐药细胞系中活性氧ROS的水平；ROS：Reactive Oxygen Species，由DCFH-DA标记，铁死亡特征指标。E：SOR@TF-Fe3+NVs处理下加入铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)、坏死抑制剂Decrostatin-1(Dec)、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(Z-VAD)同时检测肝癌细胞克隆形成情况，右边为各处理组克隆数的定量分析；说明铁死亡抑制剂能够挽救SOR@TF-Fe3+NVs导致的肿瘤细胞生长抑制，说明SOR@TF-Fe3+NVs诱导的确实是铁死亡。
图5为TF NVs体内抑制肿瘤增殖。A：肝癌皮下小鼠模型构建及给药方案的模式图。B：皮下肿瘤体积的变化图。C：小鼠生存率分析。D：取下各处理组肿瘤组织进性苏木精伊红染色(H&E)、Ki67免疫组化分析、普鲁士蓝染色分析。说明TF-Fe3+NVs、SOR@TF-Fe3+NVs能够显著抑制肿瘤细胞的增殖，并促进肿瘤部位铁离子的积累(普鲁士蓝染色)，标尺：100μm。E：qPCR分析肿瘤组织铁死亡指标分子ACSL4的表达。F：原位肝癌小鼠模型构建及给药方案的模式图。G：取出原位肝癌小鼠的肝脏，观察肿瘤组织的浸润及消退情况，并记录各组肝脏的重量。H：取出各处理组小鼠的心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色观察囊泡对正常脏器的影响，发现无明显组织损伤，标尺：100μm。I：全血细胞计数(CBC)检测给药后全血细胞的表达。
图6为本发明TF NVs的制备及应用概况图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1高表达转铁蛋白的细胞膜纳米囊泡(TF NVs)的制备
(1)首先，我们明确纳米囊泡主要由细胞膜衍生而来，主要通过呈递膜上蛋白发挥靶向功能，为了实现转铁蛋白(TF)的膜上表达，如图1A所示，我们在分泌型TF蛋白基因序列(NM_001063.4)N端插入一段跨膜蛋白基因序列(FIBCD1)，采用pLV-puro-GFPSpark载体使TF蛋白带上绿色荧光(GFP)标签，构建得到pLV-puro-FIBCD1-TF-GFPSpark，我们通过慢病毒感染方式成功构建出膜上稳定过表达TF的HEK-293T细胞(293T-TF-GFP)，并在荧光显微镜下观察到100％的绿色荧光表达率。
TF蛋白基因序列序列为：
ATGAGGCTCGCCGTGGGAGCCCTGCTGGTCTGCGCCGTCCTGGGGCTGTGTCTGGCTGTCCCTGATAAAACTGTGAGATGGTGTGCAGTGTCGGAGCATGAGGCCACTAAGTGCCAGAGTTTCCGCGACCATATGAAAAGCGTCATTCCATCCGATGGTCCCAGTGTTGCTTGTGTGAAGAAAGCCTCCTACCTTGATTGCATCAGGGCCATTGCGGCAAACGAAGCGGATGCTGTGACACTGGATGCAGGTTTGGTGTATGATGCTTACCTGGCTCCCAATAACCTGAAGCCTGTGGTGGCAGAGTTCTATGGGTCAAAAGAGGATCCACAGACTTTCTATTATGCTGTTGCTGTGGTGAAGAAGGATAGTGGCTTCCAGATGAACCAGCTTCGAGGCAAGAAGTCCTGCCACACGGGTCTAGGCAGGTCCGCTGGGTGGAACATCCCCATAGGC
TTACTTTACTGTGACTTACCTGAGCCACGTAAACCTCTTGAGAAAGCAGTG
GCCAATTTCTTCTCGGGCAGCTGTGCCCCTTGTGCGGATGGGACGGACTTC
CCCCAGCTGTGTCAACTGTGTCCAGGGTGTGGCTGCTCCACCCTTAACCAA
TACTTCGGCTACTCGGGAGCCTTCAAGTGTCTGAAGGATGGTGCTGGGGAT
GTGGCCTTTGTCAAGCACTCGACTATATTTGAGAACTTGGCAAACAAGGCT
GACAGGGACCAGTATGAGCTGCTTTGCCTGGACAACACCCGGAAGCCGGT
AGATGAATACAAGGACTGCCACTTGGCCCAGGTCCCTTCTCATACCGTCGT
GGCCCGAAGTATGGGCGGCAAGGAGGACTTGATCTGGGAGCTTCTCAACC
AGGCCCAGGAACATTTTGGCAAAGACAAATCAAAAGAATTCCAACTATTCA
GCTCTCCTCATGGGAAGGACCTGCTGTTTAAGGACTCTGCCCACGGGTTTT
TAAAAGTCCCCCCCAGGATGGATGCCAAGATGTACCTGGGCTATGAGTATG
TCACTGCCATCCGGAATCTACGGGAAGGCACATGCCCAGAAGCCCCAACA
GATGAATGCAAGCCTGTGAAGTGGTGTGCGCTGAGCCACCACGAGAGGCT
CAAGTGTGATGAGTGGAGTGTTAACAGTGTAGGGAAAATAGAGTGTGTATC
AGCAGAGACCACCGAAGACTGCATCGCCAAGATCATGAATGGAGAAGCTG
ATGCCATGAGCTTGGATGGAGGGTTTGTCTACATAGCGGGCAAGTGTGGTC
TGGTGCCTGTCTTGGCAGAAAACTACAATAAGAGCGATAATTGTGAGGATA
CACCAGAGGCAGGGTATTTTGCTATAGCAGTGGTGAAGAAATCAGCTTCTG
ACCTCACCTGGGACAATCTGAAAGGCAAGAAGTCCTGCCATACGGCAGTT
GGCAGAACCGCTGGCTGGAACATCCCCATGGGCCTGCTCTACAATAAGATC
AACCACTGCAGATTTGATGAATTTTTCAGTGAAGGTTGTGCCCCTGGGTCT
AAGAAAGACTCCAGTCTCTGTAAGCTGTGTATGGGCTCAGGCCTAAACCTG
TGTGAACCCAACAACAAAGAGGGATACTACGGCTACACAGGCGCTTTCAG
GTGTCTGGTTGAGAAGGGAGATGTGGCCTTTGTGAAACACCAGACTGTCC
CACAGAACACTGGGGGAAAAAACCCTGATCCATGGGCTAAGAATCTGAAT
GAAAAAGACTATGAGTTGCTGTGCCTTGATGGTACCAGGAAACCTGTGGA
GGAGTATGCGAACTGCCACCTGGCCAGAGCCCCGAATCACGCTGTGGTCA
CACGGAAAGATAAGGAAGCTTGCGTCCACAAGATATTACGTCAACAGCAG
CACCTATTTGGAAGCAACGTAACTGACTGCTCGGGCAACTTTTGTTTGTTC
CGGTCGGAAACCAAGGACCTTCTGTTCAGAGATGACACAGTATGTTTGGCC
AAACTTCATGACAGAAACACATATGAAAAATACTTAGGAGAAGAATATGTC
AAGGCTGTTGGTAACCTGAGAAAATGCTCCACCTCATCACTCCTGGAAGCC
TGCACTTTCCGTAGACCTTAA；
FIBCD1序列为：
ATGGTCCACGAGCGGTGGAAGACCGTGGGCAGCGCGTCCCAACTTGAGGACCGACCGCGCGACAAACCGCAGCGAGCAAGCTGCAGTTATGTCCTGTGCACGGTGCTCCTGTCCCTTGCGGTGCTGCTGGCGGTGGCTGTCACCGGTGTGGTTCTC。
(2)我们提取了稳定过表达TF蛋白HEK-293T细胞的RNA进行qPCR检测，结果显示过表达细胞的TF mRNA的水平是正常HEK 293T细胞的7万倍(图1B)。同时通过共聚焦显微镜证实了带绿色荧光的TF蛋白确实表达在膜上，而不是像普通GFP标签一样弥散在细胞质中(图1C)。
(3)收集过表达TF蛋白HEK-293T细胞(293T-TF-GFP)于HM裂解液中，再加入到杵磨棒中，冰上杵磨200次后将细胞裂解液取出进行梯度离心，首先4℃，5000r离心10min，弃未裂解的细胞沉淀，取上清再12000r离心10min，去掉上清，膜沉淀用PBS洗一遍后进行挤压出泡，首先用0.45μm的滤膜进行初步挤压，再用0.22μm的滤膜进一步挤压并除菌分装，以此制备了TF-GFP NVs(以下简称TF NVs，图1A)。
我们进一步对TF NVs的表征进行了检测以确定我们制备的纳米囊泡的正确性。我们利用透射电子显微镜(TEM)对纳米囊泡的形态进行了观察，发现大多数纳米囊泡颗粒呈双分子层膜包裹的微球结构，颗粒直径大小在100-200nm之间，呈现典型的细胞膜囊泡形态(图1D)，充分证实了我们制备的膜结构颗粒确实是纳米囊泡。同时，我们采用动态光散射(DLS)分析纳米囊泡的粒径分布范围，从粒径分布图(图1E)中我们可以看出TF NVs的粒径主要分布在150nm左右。而且，从Zeta电位图(图1F)中我们可以TF NVs的电势保持在-38mV左右，说明TF NVs的膜结构相对稳定。同时，我们在共聚焦显微镜下观察到TF NVs确实携带绿色荧光且呈点状分布(图1G)，此外，为了证明我们构建的TF NVs确实表达了TF蛋白，我们通过Western blot分析了293T细胞、293T纳米囊泡、293T-GFP细胞、293T-GFP纳米囊泡、293T-TF-GFP细胞、293T-TF-GFP纳米囊泡蛋白裂解液中GFP蛋白标签的表达情况，从图1H中我们可以看出在膜含量一定的情况下，TF纳米囊泡中确实包含了TF-GFP蛋白(116kDa)，且含量相对于细胞裂解液相差不大，说明TF NVs的膜产量优良，产率相对较高。以上数据均证实了我们成功制备了高表达TF蛋白的纳米囊泡，可用于后续实验的进一步研究。
实施例2TF NVs生物靶向性试验
为了证实TF-NVs具有良好的生物靶向性。首先，我们通过慢病毒感染的方式构建了过表达转铁蛋白受体(Transferrin receptor，TFRC)的稳定细胞系(293T-TFRC-OFP)，我们提取了293T细胞(NC)及293T-TFRC-OFP细胞的RNA进行qPCR检测，结果显示293T-TFRC-OFP细胞的TFRC mRNA的水平是正常HEK 293T细胞的200倍(图2A)，同时，我们利用WB分析293T细胞裂解液、293T-OFP细胞裂解液、293T-TFRC-OFP细胞裂解液中OFP蛋白标签的表达情况，结果显示293T-TFRC-OFP细胞裂解液中有OFP蛋白的高表达(图2B)，说明过表达转铁蛋白受体TFRC的稳定细胞系构建成功。接下来，为了探究TF NVs是否会与TFRC受体结合，我们利用激光共聚焦显微镜观察发现，当TF NVs与293T-TFRC-OFP细胞共孵育时，带绿色荧光的TF NVs纳米囊泡与带红色荧光的TFRC受体具明显共定位的情况(图2C)。随后，我们利用流式细胞仪检测了的TF NVs在TFRC受体过表达、敲低表达和正常表达的人肝癌细胞HepG2中的内吞情况，结果显示TFRC过表达的HepG2细胞在6h时TF NVs内吞率达88％，正常HepG2细胞为55％，均远高于敲低TFRC表达HepG2细胞的43％，说明TFRC的表达量越高，TF NVs的靶向结合率就越高(图2D)。为了进一步验证TF NVs也能够在体内发挥靶向作用，我们构建了裸鼠皮下肝癌移植瘤模型，同时将Cyanine5.5 NHS ester标记的TF NVs经尾静脉注射进小鼠体内，1h后将小鼠处死并取出各种器官组织，随即在小鼠成像仪中观察TF NVs的体内分布情况，从结果图2E中我们可以看出，与对照293T NVs相比，TF NVs在TFRC普遍高表达的肿瘤组织中明显积累，说明经基因改造膜表面表达TF的纳米囊泡比空纳米囊泡更能够实现纳米囊泡的靶向递送。
实施例3衍生化的TF NVs的制备与应用
为了验证TF NVs具有药物靶向递送的应用前景，我们制备了几种衍生化的TF NVs(图3A)，①TF NVs与Fe3+在37℃条件下共孵育30min制备成载铁纳米囊泡TF-Fe3+NVs；②TFNVs与肝癌一线治疗药物索拉菲尼(sorafenib，SOR)共孵育并通过电转实现药物包载，从而制备成载药纳米囊泡SOR@TF NVs；③载药纳米囊泡SOR@TF NVs与Fe3+在37℃条件下共孵育30min制备成联合给药纳米囊泡SOR@TF-Fe3+NVs。首先，我们检测了TF NVs的载铁率情况，结果显示TF NVs与铁离子的结合率能够达到90％左右(图3B)。同时，我们将载药纳米囊泡SOR@TF NVs进行超声破碎，离心后取药物上清检测到药物的包封率在35％，优于其他纳米囊泡10％-25％的药物包封率(图3C)。为了验证衍生化的TF NVs是否会对纳米囊泡的结构产生影响，我们利用DLS分析了TF NVs、TF-Fe3+NVs、SOR@TF-Fe3+NVs的粒径分布，发现它们的粒径主要分布在160nm左右(图3D)，说明无论是载铁还是包载药物均不会对囊泡的大小造成明显改变。同时我们利用PALS分析了TF NVs、TF-Fe3+NVs、SOR@TF-Fe3+NVs的Zeta电位情况，发现所有囊泡的电位均稳定保持在-38mV，说明无论是载铁还是包载药物均不会破坏纳米囊泡的膜结构稳定(图3E)。为了探究衍生的TF NVs是否会与TFRC受体结合，我们利用激光共聚焦显微镜观察发现，当衍生TF NVs与293T-TFRC-OFP细胞共孵育1h时，带绿色荧光的衍生TF NVs纳米囊泡与带红色荧光的TFRC受体在细胞膜上具明显共定位的情况，继续孵育3h后，TF-NVs绿色荧光斑点与TFRC红色荧光共定位于细胞内，说明TF NVs确实能够结合TFRC受体并被受体内吞进入细胞(图3F)。随后，我们利用流式细胞仪检测了的衍生的TFNVs在TFRC受体过表达、敲低表达和正常表达的人肝癌细胞HepG2中的内吞情况，与TF NVs内吞结果一致(图2D)，衍生TF NVs在多个时间点的靶向结合率均较高(图3G)。接下来，我们通过肝癌细胞克隆形成实验来验证TF NVs、TF-Fe3+NVs、SOR@TF-Fe3+NVs的体外药理活性，结果显示TF-Fe3+NVs、SOR@TF NVs均能够显著抑制肿瘤细胞的增殖和生长，而且联合给药囊泡SOR@TF-Fe3+NVs作用效果更甚(图3H)。同时，我们发现SOR@TF-Fe3+NVs在索拉菲尼耐药细胞系HepG2-SR(HepG2 sorafenib-resistant cells)也表现出优良的肿瘤抑制效果(图3H)。
实施例4TF NVs发挥肿瘤抑制作用可能影响的信号通路探究
为了研究TF NVs发挥肿瘤抑制作用可能影响的信号通路，我们通过大量文献调研发现转铁蛋白能够通过受体的内吞作用将铁离子转运进细胞，过量的铁离子积累会通过芬顿反应产生大量的活性氧ROS(Reactive Oxygen Species)从而诱导细胞发生铁死亡，此外肝癌一线用药索拉菲尼SOR也被证实能够诱导肿瘤细胞发生铁死亡。为了进一步验证TFNVs发挥肿瘤抑制作用是通过诱导肿瘤细胞铁死亡(图4A)，我们通过qPCR分析了肝癌细胞系和耐药细胞系经不同实验组处理后(NC、293T NVs、TF NVs、TF-Fe3+NVs、SOR、SOR@TF NVs、SOR@TF-Fe3+NVs)铁死亡指标分子ACSL4(Long-chain-fatty-acid-CoAligase 4)的表达，结果显示TF-Fe3+NVs、SOR@TF NVs均能显著诱导ACSL4的差异表达，而且SOR@TF-Fe3+NVs组ACSL4 mRNA的表达水平是最高的(图4B)。我们进一步通过流式细胞术检测了肝癌细胞系、耐药细胞系中不稳定铁池(Labile iron pool，LIP)的水平，结果显示TF-Fe3+NVs、SOR@TFNVs、SOR@TF-Fe3+NVs均能导致肿瘤细LIP的显著积累(图4C)。LIP的过量积累将导致活性氧ROS的产生，随后我们检测了肝癌细胞系、耐药细胞系中活性氧ROS的水平，结果显示联合给药囊泡组SOR@TF-Fe3+NVs组ROS的表达水平普遍高于单独给药囊泡组(图4D)。以上结果均说明TF-Fe3+NVs、SOR@TF NVs、SOR@TF-Fe3+NVs能够显著诱导肿瘤细胞铁死亡指标分子ACSL4的表达、LIP的积累、ROS的产生，为了进一步确认SOR@TF-Fe3+NVs是可以诱导肿瘤细胞铁死亡，我们将铁死亡抑制剂Ferrostatin-1(Fer-1)、坏死抑制剂Decrostatin-1(Dec)、凋亡抑制剂Z-VAD-FMK(Z-VAD)加入到各实验组中检测肝癌细胞、耐药细胞系克隆形成情况，结果显示仅铁死亡抑制剂能够挽救SOR@TF-Fe3+NVs导致的肿瘤细胞生长抑制(图4E)，说明SOR@TF-Fe3+NVs诱导的确实是铁死亡。
实施例5
为了进一步研究在体内生理环境中TF NVs是否能够有效抑制肿瘤生长，我们构建了小鼠体内肿瘤模型进性验证。
在中山大学动物实验中心平台上购买6-8周龄的SPF级BALB/c-nu小鼠，于中山大学东校区动物实验中心无菌环境中饲养。首先将皮下移植瘤(HepG2)模型小鼠随机分为7组，每组5只，分别为293T NVs组、TF NVs组、Fe3+组(3mg/kg)、TF-Fe3+NVs组、SOR组(5mg/kg)、SOR@TF NVs组、SOR@TF-Fe3+NVs组，在肿瘤生长至第7天开始给药，囊泡给药量为25mg/kg(蛋白重量)。每隔一天进行尾静脉注射给药，每日观察小鼠体征，第15天给药结束后取样进行组织病理学和分子生物学检测(图5A)。
比较不同组别皮下肿瘤体积的变化可知，TF NVs、TF-Fe3+NVs、SOR@TF NVs均能抑制肿瘤生长，其中SOR@TF-Fe3+NVs组的肿瘤抑制效果最为显著(图5B)。同时通过分析生存曲线的数据可以看出，TF-Fe3+NVs、SOR@TF NVs、SOR@TF-Fe3+NVs均能明显改善肿瘤小鼠生存率(图5C)。此外，各处理组肿瘤组织苏木精伊红染色(H&E)、Ki67免疫组化、普鲁士蓝染色结果显示TF NVs衍生纳米囊泡均能显著抑制肿瘤细胞的增殖，并促进肿瘤部位铁离子的积累(图5D)。同时qPCR分析肿瘤组织铁死亡指标分子ACSL4的表达，结果显示SOR@TF-Fe3+NVs组处理的肿瘤组织中ACSL4 mRNA表达含量最高(图5E)。
为了进一步验证TF NVs在小鼠原位肝癌模型也有一定治疗效果，我们构建了原位肝癌小鼠模型(图5F)，模型小鼠被随机分为4组，每组5只，分别为Free NVs(293T NVs)组、SOR组(5mg/kg)、SOR@TF-Fe3+NVs组及不做处理的NC组。在肿瘤生长至第5天开始给药，囊泡给药量为25mg/kg(蛋白重量)。每隔一天进行尾静脉注射给药，每日观察小鼠体征，第13天给药结束后取出原位肝癌小鼠的肝脏，观察肿瘤组织的浸润及消退情况，并记录各组肝脏的重量(图5G)。结果显示，SOR@TF-Fe3+NVs组处理后的小鼠肝脏肿瘤浸润程度明显降低，且具有肿瘤消退现象，肝脏肿胀情况也是最轻的。证明SOR@TF-Fe3+NVs在原位肿瘤小鼠模型中也有良好的治疗效果。
最后在安全性的验证中，我们取出各处理组小鼠的心、肝、脾、肺、肾进行H&E染色观察囊泡对正常脏器的影响，切片结果显示TF NVs等一系列衍生纳米囊泡对小鼠心、肝、脾、肺、肾无明显组织损伤(图5H)。同时，通过监测给药后的小鼠血常规可知，对照组和TF-Fe3+NVs组给药后小鼠的淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的含量没有显著性差异(图5I)，表明TF-Fe3+NVs组给药后对血液系统没有影响。以上结果说明TF NVs等一系列衍生纳米囊泡给药的安全性。
综上，如图6所示，本发明制备了高表达转铁蛋白的细胞膜纳米囊泡(TF NVs)及一系列衍生化的TF NVs，包括载铁纳米囊泡TF-Fe3+NVs，载药纳米囊泡SOR@TF NVs及联合给药纳米囊泡SOR@TF-Fe3+NVs。本发明研究显示TF NVs及衍生化的TF NVs可结合肿瘤细胞中转铁蛋白受体TFRC靶向肿瘤细胞，从而实现纳米囊泡的肿瘤靶向递送。进一步研究显示，TF-Fe3+NVs、SOR@TF NVs、SOR@TF-Fe3+NVs能够显著抑制肿瘤细胞增殖，诱导肿瘤细胞铁死亡；在体内生理环境中，TF NVs、TF-Fe3+NVs、SOR@TF NVs均能抑制小鼠体内肿瘤生长和增殖，并促进肿瘤部位铁离子的积累，而其中SOR@TF-Fe3+NVs的肿瘤抑制效果最为显著，且SOR@TF-Fe3+NVs在原位肿瘤小鼠模型中也有良好的治疗效果。因此，可将TF NVs及一系列衍生化的TF NVs作为药物递送载体或药物制剂通过结合TFRC靶向肿瘤细胞诱导肿瘤细胞铁死亡从而实现对肿瘤的治疗。

Claims (10)

1.一种表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡，其特征在于，由生物细胞膜构成，细胞膜表面表达转铁蛋白。
2.根据权利要求1所述细胞膜仿生纳米囊泡，其特征在于，所述细胞膜仿生纳米囊泡的粒径为100～200nm。
3.根据权利要求1所述细胞膜仿生纳米囊泡，其特征在于，所述细胞膜仿生纳米囊泡的电势为-37mv～-39mV。
4.权利要求1～3任一所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.在分泌型转铁蛋白基因序列N端插入一段跨膜蛋白基因序列，并带上绿色荧光标签，通过慢病毒感染方式构建出膜上稳定过表达转铁蛋白的细胞系；
S2.提取步骤S1膜上稳定过表达转铁蛋白的细胞系的细胞膜，通过挤压出泡的方式制备得到表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡。
5.一种载铁纳米囊泡，其特征在于，包括权利要求1～3任一所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡及负载在其表面的Fe3+。
6.权利要求1～3任一所述表达转铁蛋白的细胞膜仿生纳米囊泡或权利要求5所述载铁纳米囊泡作为药物载体在制备肿瘤治疗药物中的应用。
7.一种肿瘤靶向药物制剂，其特征在于，包括权利要求1～3、5任一所述纳米囊泡及包载在纳米囊泡内的抗肿瘤药物。
8.根据权利要求7所述肿瘤靶向药物制剂，其特征在于，所述肿瘤治疗药物为能够诱导肿瘤细胞发生铁死亡的肿瘤治疗药物。
9.根据权利要求8所述肿瘤靶向药物制剂，其特征在于，所述肿瘤治疗药物为索拉菲尼。
10.根据权利要求6所述应用或权利要求7～9任一所述肿瘤靶向药物制剂，其特征在于，所述肿瘤为肝癌。
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