CN107858351A - 一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用。针对新核仁蛋白Rsl1d1的核苷酸序列设计合成siRNA,利用该分子干扰治疗靶点的表达,从而影响其功能,然后给肿瘤模型施用常用抗肿瘤药物,通过测量肿瘤体积和小鼠体重的变化,发现siRNA转入HCT116结直肠癌细胞及其实体瘤后能显著抑制其生长。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,涉及一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用。
背景技术
核仁是细胞核内合成核糖体RNA和组装核糖体的重要场所(Tan BC, et al.Epigeneitc silencing of ribosomal RNA genes by Mybbp1a. J Biomed Sci. 2012;19: 57)。最近发现,核仁是一个高度复杂的多功能核内区域[Pederson T. Theplurifunctional nucleolus. Nucleic Acids Res. 1998; 26: 3871-6.]。核仁的结构蛋白如nucleophosmin和nucleostemin以及核糖体蛋白如RPL6和RPL11等,具有促进肿瘤发生、调节细胞增殖和凋亡的功能,是潜在的肿瘤治疗靶点。
Rsl1d1 (Ribosomal L1 domain-containing protein 1) 是新发现的一种核仁蛋白,该蛋白由细胞衰老抑制基因(CSIG)编码(郭淑贞等.衰老相关新基因CSIG的cDNA 克隆和功能.中国生物化学与分子生物学报.2003: 612-7),通过抑制PTEN的翻译延缓复制性衰老进程(Ma L, et al. CSIG inhibits PTEN translation in replicativesenescence. Mol Cell Biol. 2008; 28: 6290-301)。最近发现,Rsl1d1是促进肿瘤细胞增殖的重要因素(Cheng Q, et al. CSIG promotes hepatocellular carcinomaproliferation by activating c-MYC expression. Oncotarget. 2015; 6: 4733-44)。我们最近发现(数据未发表),Rsl1d1沉默使肿瘤细胞发生凋亡。因此,Rsl1d1是一个潜在的肿瘤治疗靶点。
发明内容
本发明的目的是提供一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用。
本发明以Rsl1d1为靶标,设计其特异性双链siRNA分子,并以PEI为载体,通过瘤内注射给药高效抑制肿瘤的生长,从而达到治疗肿瘤的目的。
本发明的技术方案:
本发明公开了一种双链siRNA分子,所述siRNA是靶向Rsl1d1 mRNA的siRNA,其双链核苷酸序列如下:
正义链:5’-CGAAGGAUGAACCCAAUUCAAdTdT-3’
反义链:5’-UUGAAUUGGGUUCAUCCUUCGdTdT-3’
本发明还公开了上述的双链siRNA分子在制备恶性肿瘤的药物中的应用。
所述恶性肿瘤包括结直肠癌。
具体步骤如下:
1.合成Rsl1d1 siRNA(siRsl1d1)。
根据siRNA的设计原则和Rsl1d1基因编码区的核苷酸序列,寻找长度为21 nt的候选区域,选择GC含量为40-50%的siRNA序列,并用Blast进行比对,以确保没有同源性。最终选择靶序列为CGAAGGATGAACCCAATTCAA(SEQ ID No:1),对应编码区296-316核苷酸位点。合成的siRsl1d1序列如下:
正义链:5’-CGAAGGAUGAACCCAAUUCAAdTdT-3’(SEQ ID No:2)
反义链:5’-UUGAAUUGGGUUCAUCCUUCGdTdT-3’(SEQ ID No:3)
将上述序列委托上海吉玛公司进行化学合成。同时,该公司提供阴性对照siRNA(negative control siRNA,siNC),其序列如下:
正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID No:4)
反义链:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID No:5)
2.荧光定量PCR和免疫印迹法检测siRsl1d1对Rsl1d1基因的沉默效果:以聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)为siRNA载体,转染处于对数生长期的人结直肠癌细胞HCT116,用荧光定量PCR和免疫印迹法分别检测胞内Rsl1d1的mRNA和蛋白质水平,以评价该siRsl1d1分子的基因沉默效果。
3.MTT法检测Rsl1d1基因的沉默对HCT116细胞增殖的抑制作用:将转染siRsl1d1的HCT116细胞接种至96孔细胞培养板,置二氧化碳培养箱继续培养,用MTT法在不同时间点检测细胞活力,以考察Rsl1d1基因的沉默对HCT116细胞增殖的影响。
4.Rsl1d1基因的沉默对荷瘤小鼠的治疗效果:用常规方法制备HCT116荷瘤小鼠,每3天瘤内注射一次转染复合物,一共给药5次,其间测量肿瘤直径和小鼠体重,绘制肿瘤生长曲线和小鼠体重变化曲线,计算抑瘤率,15天疗程结束后,剥离肿瘤拍照,制作H&E染色组织切片,分析Rsl1d1基因表达的沉默是否导致肿瘤细胞凋亡、坏死。
上述的双链siRNA分子在制备恶性肿瘤的药物中的应用。
所述恶性肿瘤包括直肠癌。
本发明突出效果:
本发明设计的siRsl1d1分子能显著降低HCT116肿瘤细胞内Rsl1d1的表达水平,高效抑制体外培养的HCT116细胞增殖速率及其实体瘤的生长速率;经siRsl1d1转染复合物治疗后,荷瘤小鼠体内肿瘤的平均体积为生理盐水对照组的1/18,为siNC对照组的1/14.5,为阿霉素对照组的1/6.3;因此,本发明设计的siRsl1d1分子可用于制备治疗结直肠癌的药物。
附图说明
图1荧光定量PCR检测结果图。
图2免疫印迹法检测结果图。
图3MTT法检测siRsl1d1影响HCT116肿瘤细胞增殖的结果图。
图4各试验组对HCT116结直肠癌治疗前后肿瘤体积的变化对比图。
图5各试验组对HCT116结直肠癌治疗结束后的肿瘤实物大小对比照片。
图6 HCT116结直肠癌组织H&E染色结果图。
图7各试验组对HCT116结直肠癌治疗前后小鼠体重的变化对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式进一步阐述本发明的保护内容。
实施例
、合成Rsl1d1 siRNA(siRsl1d1)
根据siRNA的设计原则和Rsl1d1基因编码区的核苷酸序列,寻找长度为21 nt的候选区域,选择GC含量为40-50%的siRNA序列,并用Blast进行比对,以确保没有同源性。最终选择靶序列为CGAAGGATGAACCCAATTCAA(SEQ ID No:1),对应编码区296-316核苷酸位点。合成的siRsl1d1序列如下:
正义链:5’-CGAAGGAUGAACCCAAUUCAAdTdT-3’(SEQ ID No:2)
反义链:5’-UUGAAUUGGGUUCAUCCUUCGdTdT-3’(SEQ ID No:3)
将上述序列委托上海吉玛公司进行化学合成。同时,该公司提供阴性对照siRNA(negative control siRNA,siNC),其序列如下:
正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQ ID No:4)
反义链:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQ ID No:5)
2、用siRNA转染HCT116细胞并评价其沉默效果
在6孔细胞培养板中接种HCT116人结直肠癌细胞,2×105/孔,于37℃、5% CO2培养箱中培养24小时,用1 mg/mL聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)进行细胞转染,具体方法按试剂说明书进行。转染时,用0.36 nmol siRNA转染HCT116细胞,siRNA和PEI的比例为360pmol:9 µL。6小时后更换新鲜培养基,2天后收集细胞。一部分细胞用于提取总RNA并反转录合成cDNA,再用荧光定量PCR检测细胞内Rsl1d1 mRNA的相对水平;另一部分细胞用于提取总蛋白,并用免疫印迹法检测转染细胞内Rsl1d1蛋白的相对水平。最后根据荧光定量PCR法和免疫印迹法的检测结果综合评价siRsl1d1的基因沉默效果。结果如图1所示,和对照比较,siRsl1d1能降低肿瘤细胞HCT116中Rsl1d1 mRNA的水平85%;如图2所示,siRsl1d1明显抑制肿瘤细胞内Rsl1d1蛋白的表达水平。说明:Rsl1d具有高度的特异性,能与肿瘤细胞中Rsl1d1的mRNA很好地结合,并降解mRNA,从而抑制细胞内Rsl1d1蛋白的表达。
3、MTT法检测Rsl1d1基因沉默对HCT116细胞增殖的抑制作用
将转染siRsl1d1和siNC的HCT116细胞分别接种于96孔细胞培养板中,每孔104个细胞;于37℃、5% CO2培养箱中培养0、1、2、3天,然后加入MTT(终浓度为0.5 mg/mL);于37℃孵育4小时,小心弃去培养上清,加入150 µL二甲亚砜,充分溶解;用酶标仪检测各细胞孔在波长为570 nm的吸光值,参比波长为630 nm;最后,比较转染siRsl1d1和siNC的各细胞孔吸光值OD570nm的差异,以考察Rsl1d1基因沉默对HCT116细胞增殖的抑制作用。结果如图3所示,siRsl1d1能明显抑制肿瘤细胞HCT116的增殖。说明:Rsl1d1是维持肿瘤细胞的增殖所必需的一个关键基因。
4、Rsl1d1基因沉默对荷瘤裸鼠的治疗效果
(1)构建HCT116荷瘤鼠模型:选取5-6周龄、体重18-22克的雌性裸鼠25只,每只小鼠于右侧腋窝下接种2.5×106个处于对数生长期的HCT116细胞。当肿瘤直径长至3-4 mm时,即可用于肿瘤治疗实验。动物饲养过程中各项操作均按照《实验动物管理条例(2017年3月1日修正版)》严格执行。
(2)将HCT116荷瘤裸鼠随机分为5组,每组5只,分别给药:
A: 生理盐水
B: 生理盐水+siNC
C: 阿霉素+siNC
D: 生理盐水+siRsl1d1
E:阿霉素+siRsl1d1
其中,生理盐水或阿霉素经腹腔注射给药,siRNA-PEI复合物经瘤内注射给药;siRNA给药剂量为1 nmol/只,阿霉素给药剂量为5 mg/kg体重;siRNA和PEI的比例为360 pmol:9 µL,siRNA-PEI复合物给药体积为50 µL/只/次,生理盐水或阿霉素给药体积为200 µL/只/次;所有药物3天给药一次,共计给药5次,疗程15天;给药期间每3天测量小鼠的体重、肿瘤体积,并绘制肿瘤、体重生长曲线。
(3)15天疗程结束后,处死小鼠,剥离肿瘤,拍照后用福尔马林固定液(10%)固定肿瘤组织,委托杭州华安生物技术有限公司制作组织切片和H&E染色,进行组织病理学分析,考察Rsl1d1沉默对HCT116肿瘤细胞凋亡和坏死的影响。
结果如图4和5所示,经过siRsl1d1治疗15天后,肿瘤体积明显小于正对照阿霉素治疗组,但是经阿霉素和siRsl1d1联合治疗后,并不会进一步减小肿瘤体积;如图6所示,经siRsl1d1治疗后的肿瘤组织中出现空泡,并伴有明显的胞质浓缩和细胞核异染色质化;如图7所示,经siRsl1d1治疗不会使小鼠的体重减轻,但经阿霉素治疗后,小鼠体重却明显下降。说明:siRsl1d1通过诱导肿瘤细胞凋亡和坏死发挥治疗作用,其治疗效果明显优于阿霉素,但与阿霉素联合用药并不能进一步增强其疗效,更重要的是,该siRsl1d1的副作用明显小于阿霉素。
序列表
<110> 扬州大学
<120> 一种双链siRNA在制备恶性肿瘤的药物中的应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
cgaaggatga acccaattca a 21
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
cgaaggauga acccaauuca adtdt 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
uugaauuggg uucauccuuc gdtdt 25
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
uucuccgaac gugucacgud tdt 23
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
acgugacacg uucggagaad tdt 23
Claims (3)
1.一种双链siRNA分子,其特征在于,所述siRNA是靶向Rsl1d1 mRNA的siRNA,其双链核苷酸序列如下:
正义链:5’-CGAAGGAUGAACCCAAUUCAAdTdT-3’;
反义链:5’-UUGAAUUGGGUUCAUCCUUCGdTdT-3’。
2.权利要求1所述的双链siRNA分子在制备恶性肿瘤的药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述恶性肿瘤包括结直肠癌。
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CN108893485A (zh) * | 2018-07-13 | 2018-11-27 | 东莞市第三人民医院 | 一种RNA干扰钙敏感受体CaSR的Caco-2稳定细胞株的建立方法 |
CN115855894A (zh) * | 2022-11-01 | 2023-03-28 | 深圳大学 | 识别核仁的探针和试剂盒、核仁标记方法 |
-
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