CN104561000B - 抑制cd44基因的寡聚核酸及其应用 - Google Patents
抑制cd44基因的寡聚核酸及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了抑制CD44基因的寡聚核酸，所述寡聚核酸为双链RNA，所述寡聚核酸的碱基组成为：包括有(1)含有SEQ.ID NO.18组成的70％以上同源的寡聚核酸；(2)含有与(1)所述寡聚核酸序列反向互补配对的寡聚核酸50％以上序列同源的寡聚核酸；且(3)所述(1)和(2)寡聚核酸经过退火后能形成双链结构。并公开了含有上述寡聚核酸的DNA、载体、组合物及其应用。本发明提供了一类对CD44有显著抑制作用的寡聚核酸，该寡聚核酸能在动物实验中实现抑制炎症作用，是一种十分有前景的炎症治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体是涉及一类抑制CD44基因的寡聚核酸及其应用。
背景技术
骨关节炎(OA)是世界上致残的重要原因之一，大约多于10％的老年人有骨关节炎的症状。风湿性关节炎(RA)是一个慢性炎症疾病，影响着世界上约0.5％到1％的成年人，通常导致关节损坏并危及生活质量。多种炎性细胞因子如TNF-α.IL-1.IL-6等参与了RA和OA的发病和进展，其通过激活免疫细胞及诱导金属蛋白酶产生而促进关节破坏、滑膜炎、血管增生等。多种炎性细胞因子如TNF-α.IL-1.IL-6等参与了RA和OA的发病和进展，其通过激活免疫细胞及诱导金属蛋白酶产生而促进关节破坏、滑膜炎、血管增生等。
CD44分子是广泛表达于细胞表面的I类跨膜单链糖蛋白，其分布包括淋巴细胞、单核细胞、红细胞、成纤维细胞、上皮细胞、平滑肌细胞、神经胶质细胞及肿瘤细胞等。CD44分子最初作为粘附分子，介导细胞与细胞之间、细胞与细胞外基质之间的相互作用，随着研究发现，CD44分子也可以参与细胞间的信号传导，并与肿瘤的生长、侵袭、转移以及造血干细胞的归巢等密切相关；研究表明CD44作为多种肿瘤干细胞的标志物，是潜在的肿瘤治疗靶点，且CD44的生物学功能及其表达调控模式因肿瘤种类以及生长条件的不同而有所不同.另外，CD44还与炎症因子的释放、淋巴细胞的激活、伤口的愈合、自身免疫病等相关。
在过去的20多年里，大多数新型治疗方法的研发工作是关于疾病缓解的抗关节炎药物(DMARDs)和疾病缓解的抗风湿性关节炎的药物(DMOADs)。到目前为止，制药业在研制有效安全的疾病缓和性药物(DMOADs)上并不成功，致使成千上万的病人仍受到该严重致残性疾病所带来的痛苦。随着新途径和给药方法的应用，在该治疗领域预期将有更多的发展，这为可阻断、逆转疾病过程并缓和疾病的药物，如siRNA提供了巨大的发展空间。
RNA干预是生命科学上具革命意义的发现，成为研究基因功能的重要工具，它能够导致生物体，哺乳动物细胞，甚至动物中的基因失活。RNA干预技术可应用于治疗有关有害基因过度表达的疾病，具有创造人类疾病治疗新方法的潜力。
在本发明中，我们提供一种全新的siRNA作为关节炎及相关炎症的治疗药物；一种通过骨关节腔局部注射siRNA及其制剂抑制炎症因子表达，实现了对关节炎症的治疗作用。
发明内容
本发明目的旨在提供一类抑制CD44基因表达的寡聚核酸。
实现上述目的的技术方案如下。
一类抑制CD44基因的寡聚核酸，所述寡聚核酸为双链RNA，所述寡聚核酸的碱基组成为：
包括有(1)含有SEQ.ID NO.18所示的70％以上同源的反义链；(2)含有与(1)所述反义链反向互补配对的寡聚核酸50％以上序列同源的正义链；且(3)所述(1)和(2)寡聚核酸经过退火后能形成双链结构。
在其中一个实施例中，所述寡聚核酸包括有(1)由SEQ.ID NO.18碱基序列所示的反义链；(2)含有SEQ.ID NO.17所示至少50％序列同源构成的正义链；且(3)正义链和反义链经过退火后能形成双链结构。
在其中一个实施例中，所述寡聚核酸包括有(1)含有SEQ.ID NO.18所示至少70％序列同源构成的反义链；(2)由SEQ.ID NO.17碱基序列所示的正义链；且(3)正义链和反义链经过退火后能形成双链结构。
在其中一个实施例中，所述寡聚核酸包括有(1)含有SEQ.ID NO.18所示至少70％序列同源构成的反义链；(2)含有SEQ.ID NO.17所示至少70％序列同源构成的正义链；且(3)正义链和反义链经过退火后能形成双链结构。
在其中一个实施例中，所述寡聚核酸由碱基组成如SEQ.ID NO.18所示的反义链以及碱基组成如SEQ.ID NO.17所示的正义链组成。
在其中一个实施例中，所述寡聚核酸由碱基组成如siRNA-CD-28、siRNA-CD-36、siRNA-CD-39、siRNA-CD-40、siRNA-CD-41、siRNA-CD-42所示。
本发明提供寡聚核酸是双链RNA，其中所述双链RNA中的特征为：反义链含有核苷酸序列为“5'AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'”如序列表中序列18，或与其具有至少70％以上同源性的同源序列；正义链含有与反义链反向互补链具有50％同源性以上的核苷酸序列。上述寡聚核酸可经过(1)-(4)中任一种或多种修饰：
1)对所述寡聚核酸的连接核苷酸的磷酸二酯键进行修饰，优选将所述磷酸二酯键的氧用硫取代；
2)对所述寡聚核酸的所含核糖进行修饰，优选将核糖2’-OH用甲氧基或氟取代或者对所述2’-OH进行脱氧修饰，或以开环核酸(UNA)进行修饰；
3)对所述寡聚核酸的核苷酸碱基的修饰，优选胞嘧啶5位甲基修饰、5-乙炔基尿嘧啶、吲哚修饰；
4)对所述寡聚核酸末端修饰，优选末端连接胆固醇、多肽、荧光、糖、抗体分子、磷酸化修饰；
5)本发明所述寡聚核酸在3’末端可以添加悬挂碱基，优选悬挂碱基为dTdT。
本发明的另一目的还在于提供一种有抑制CD44基因表达功能的DNA。
具体技术方案如下。
可表达上述任一种寡聚核酸且具有抑制CD44基因表达功能的DNA。
本发明的另一目的还在于提供一种具有抑制CD44基因表达功能的载体。
具体技术方案如下。
含有上述任一种寡聚核酸或者上述DNA的载体，所述载体为脂质体、聚合物材料、多肽、纳米材料。其中脂质体载体材料为本领域常用的阳离子脂质体，优选lipo2000；聚合物载体材料优选透明质酸或聚赖氨酸；多肽材料优选RGD；纳米材料优选为壳聚糖纳米粒。
本发明的另一目的还在于提供一种具有抑制CD44基因表达功能的组合物。具体技术方案如下。
一种具有抑制CD44基因表达功能的组合物，含有上述任一种寡聚核酸或者上述DNA，以及药学上可接受的载体。
本发明的另一目的还在于提供上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物的应用。
具体技术方案如下。
上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物在制备抑制细胞中CD44基因表达制品中的应用。
上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物在制备调节细胞中CD44基因制品中的应用。
上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物在制备诊断CD44基因异常引发的疾病CD44的试剂中的应用。
上述寡聚核酸、DNA、载体或者组合物制备治疗CD44基因异常引发的疾病的药物中的应用。
在其中一个实施例中，所述CD44基因异常引发的疾病可选自炎症、癌症。
在其中一个实施例中，所述CD44基因异常引发的疾病为关节炎、风湿性关节炎或滑膜炎。
本发明针对CD44基因CDs区域内的不同位置进行优化设计，选择了9对针对人与鼠同源基因的siRNA进行筛选试验。研究结果表明：与阴性对照siRNA相比，反义链含有核苷酸序列为“5'AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'”的siRNA-CD-06对CD44基因mRNA表达抑制效果最强，对CD44基因的mRNA沉默效率达87％(实施例二)。在免疫印迹(western blotting)实验中，与空白和阴性对照组相比加入siRNA-CD-06后，CD44蛋白表达水平明显下降，差异有显著性(P<0.05)(实施例三)。经IL 1-α刺激后的细胞中加入siRNA-CD-06，与加入阴性对照寡聚核酸相比，细胞炎症因子TNF、COX-2、IL-1β含量明显下降，表明siRNA-CD-06具有消除炎症效果(实施例四)。在实施例五中，本发明对序列进行了优化，实验结果表明:反义链含“5'AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'的同源序列的双链寡核酸对CD44基因mRNA具有抑制效果；正义链与反义链反向完全互补或部分仅部分互补对CD44基因mRNA也具有抑制效果，且含有与反义链70％同源序列的双链RNA也具有抑制效果。实施例六应用质粒载体表达“5'AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'”序列，在细胞中也具有良好的CD44基因的mRNA抑制效果。实施例七研究了化学修饰对核酸沉默CD44基因效果的影响，结果表明：经适当的修饰后的寡聚核酸对CD44基因具有良好的抑制作用。实施例八的研究表明，经化学修饰后，本发明的siRNA在血清中的稳定性显著提高。实施例九和实施例十为siRNA的活体大鼠试验，在关节炎模型大鼠的关节腔内单独或混合注射含反义链“5'AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'”的化学修饰物，后续的组织病理切片和关节液炎症因子含量检测试验表明，寡聚核酸在大鼠体内有明显的炎症抑制作用。
本发明的创新性主要体现在：1、本发明运用基因沉默技术，经过大量的设计、筛选、分析与验证发现了一类对CD44有显著抑制作用的寡聚核酸，在一类hFLS细胞中，抑制效率达到88％，且与该序列具有70％以上同源性的核酸序列都能起到基因沉默的效果，表明本发明是一类对CD44沉默效果极强的核酸序列；2、本发明还涉及一类核酸化学修饰物，其具有的高稳定性、高活性、高特异性与低细胞毒性使之能成为活体施用的有效药物；3、本发明涉及的核酸能在动物实验中实现抑制炎症作用。在细胞水平对炎症因子IL-1β的表达抑制率达70％；在大鼠骨关节炎症模型中，连续注射本发明寡核酸对炎症因子和炎症基因的表达均有明显的抑制作用，疾病动物关节在病理上有显著改善。以上实验均表明，本发明的寡核酸具有良好的抗炎症药用前景。4实时定量PCR结果显示沉默CD44基因后，细胞内的炎症因子基因在mRNA水平呈现出明显下降趋势，而这种趋势与CD44的表达水平明显相关,CD44和炎症因子的表达的正向相关性预示着它们可能通过相同的信号通路参与共同的生物学功能。
附图说明
图1siRNA-CD-06免疫印迹实验结果示意图。
图2siRNA-CD-06下调炎症因子结果示意图。
图3不同siRNA结构的靶基因表达量结果示意图。
图4化学修饰增强寡聚核酸血清稳定性结果示意图。
图5大鼠组织病理切片分析结果示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。下述实施例中，如无特殊说明，均为常规公知方法。
本发明中所描述的“TNF”为“TNF-α”。
抑制率＝NC(negative contral)对照表达量-目的基因表达量/NC(negativecontral)对照表达量。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。hFLS细胞购自Cell Applications，Hela细胞购自ATCC，Human IL-1βimmunoassay检测试剂盒购自Assay Pro，Lipofectamine2000试剂盒购自Invitrogen，胰酶、Trizol、PBS为sigma产品，雄性SD大鼠为广东医学实验动物中心产品，引物、siRNA等核酸序列均为广州市锐博生物科技有限公司提供。
本发明所述“药学上可接受的载体”是指本领域中常用的体内转染试剂，如聚乙烯亚胺(PEI)，jetPEI(线性聚乙烯亚胺)，羟基脂肪酸酯(PHA)，阳离子聚合物，氨基酸，脂质体等。
实施例一寡聚核酸的化学合成
(1)实施例中所应用的RNA和修饰寡核酸单体均按照以下方法获得：
寡核酸中的RNA核苷酸以2’-O-TBDMS亚磷酰胺单体制备；DNA核苷酸以脱氧核苷亚磷酰胺单体制备；核苷酸糖基修饰核苷以2’-OCH3、2’-F、锁核酸(LNA)、开环核酸(UNA)、5-甲基胞嘧啶、吲哚、5-乙炔基尿嘧啶亚磷酰胺单体制备；骨架磷酸硫代核酸以Beaucage试剂或PADS试剂代替碘水制备；胆固醇、荧光标记、糖修饰、磷酸化寡聚核酸由对应单体制备；多肽修饰寡核酸由巯基修饰寡核酸与多肽经过迈克尔加成反应得到，以上所述单体从SigmaAldrich，Chem Genes，Glen research公司购买。
(2)寡聚核酸、糖基、碱基、骨架硫代修饰、胆固醇、荧光标记修饰寡核酸制备方法:
理论产量1umol合成规格完成，称取通用固相支持物CPG 20mg(载量50umol/g)，各类亚磷酰胺的单体溶解于无水乙腈溶液中(0.15M)。5-乙硫基-1H-四唑乙腈溶液作为活化剂(0.25M)，氧化剂碘水(0.02M)，3％三氯乙酸二氯甲烷溶液。按照标准RNA合成程序设置程序循环合成，每步偶合时间2-10分钟，经20个循环后，完成寡核苷酸固相合成。吹干CPG，转移到5ml EP管中，加入氨水/乙醇溶液(3/1)1-20ml，55℃加热5～20小时。在10000rpm的转速下离心10min取上清液，抽干浓氨水/乙醇后得到白色胶状固体。固体溶于200μl 1M TBAFTHF溶液，室温震荡20小时。加入0.5ml 1M Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)，室温震荡15分钟，置于离心抽干机抽至体积为原体积1/2，除去THF。溶液用0.5ml氯仿萃取2次，加入1ml 0.1MTEAA上样液，将混合溶液倒入固相萃取柱，按照标准RNA除盐流程，除去溶液中过量盐，所得核酸浓度由微量紫外分光光度计测定，由质谱确认核酸结构。
3)多肽、抗体连接寡核酸制备方法：
以上方法制备100nmol HS修饰寡聚核酸后，溶解于950μl 100mM HEPES-KOH缓冲液(pH1－14)。与500nmol含烯键修饰的多肽或抗体溶于50μl的水溶液混合。在氮气保护下0－100℃，进行反应，反应效率由HPLC监控，定量转化后，将溶液超滤浓缩后用于实验。
退火：以上制备的寡核酸等量混合于1ml水或缓冲液中，95℃加热2－20分钟，室温静置冷却至室温备用。
实施例二抑制CD44基因mRNA表达的有效寡聚核酸筛选
进行siRNA设计以确定靶向于CD44的siRNA，进行生物信息筛选，确保序列对于CD44序列是特异性的且对于来自任何其他基因的序列不是特异性的。靶序列使用NCBI提供的BLAST搜索引擎相对于GenBank中的序列进行核对，经过初步实验筛选出9对有效siRNA，进行进一步优化。
1、Si-h-CD44_001：GCCGCTTTGCAGGTGTATT SEQ ID NO.1
靶序列：GCCGCTTTGCAGGTGTATT
正义链(5'-3')：5'GCCGCUUUGCAGGUGUAUU dTdT 3'SEQ ID NO.2
反义链(5'-3')：5'AAUACACCUGCAAAGCGGC dTdT 3'SEQ ID NO.3
2、Si-h-CD44_002：GCAGTCAACAGTCGAAGAA SEQ ID NO.4
靶序列：GCAGTCAACAGTCGAAGAA
正义链(5'-3')：5'GCAGUCAACAGUCGAAGAA dTdT 3'SEQ ID NO.5
反义链(5'-3')：5'UUCUUCGACUGUUGACUGC dTdT 3'SEQ ID NO.6
3、Si-h-CD44_003：GCAGATCGATTTGAATATA SEQ ID NO.7
靶序列：GCAGATCGATTTGAATATA
正义链(5'-3')：5'GCAGAUCGAUUUGAAUAUA dTdT 3'SEQ ID NO.8
反义链(5'-3')：5'UAUAUUCAAAUCGAUCUGC dTdT 3'SEQ ID NO.9
4、Si-h-CD44_004：GAATATAACCTGCCGCTTT SEQ ID NO.10
靶序列：GAATATAACCTGCCGCTTT
正义链(5'-3')：5'GAAUAUAACCUGCCGCUUU dTdT 3'SEQ ID NO.11
反义链(5'-3')：5'AAAGCGGCAGGUUAUAUUC dTdT 3'SEQ ID NO.12
5、Si-h-CD44_005：GGATTTGAGACCTGCAGTT SEQ ID NO.13
靶序列：GGATTTGAGACCTGCAGTT
正义链(5'-3')：5'GGAUUUGAGACCUGCAGUU dTdT 3'SEQ ID NO.14
反义链(5'-3')：5'AACUGCAGGUCUCAAAUCC dTdT 3'SEQ ID NO.15
6、Si-h/r-CD44_006：CCAGCAAGTCTCAGGAAAT SEQ ID NO.16
靶序列：CCAGCAAGTCTCAGGAAAT
正义链(5'-3')：5'CCAGCAAGUCUCAGGAAAU dTdT 3'SEQ ID NO.17
反义链(5'-3')：5'AUUUCCUGAGACUUGCUGG dTdT 3'SEQ ID NO.18
7、Si-h-CD44_007：GCAAGGCTTTCAATAGCAC SEQ ID NO.19
靶序列：GCAAGGCTTTCAATAGCAC
正义链(5'-3')：5'GCAAGGCUUUCAAUAGCAC dTdT 3'SEQ ID NO.20
反义链(5'-3')：5'GUGCUAUUGAAAGCCUUGC dTdT 3'SEQ ID NO.21
8、Si-h-CD44_008：CCGCTTTGCAGGTGTATTC SEQ ID NO.22
靶序列：CCGCTTTGCAGGTGTATTC
正义链(5'-3')：5'CCGCUUUGCAGGUGUAUUC dTdT 3'SEQ ID NO.23
反义链(5'-3')：5'GAAUACACCUGCAAAGCGG dTdT 3'SEQ ID NO.24
9、Si-h-CD44_009：CGTGGAGAAAAATGGTCGC SEQ ID NO.25
靶序列：CGTGGAGAAAAATGGTCGC
正义链(5'-3')：5'CGUGGAGAAAAAUGGUCGC dTdT 3'SEQ ID NO.26
反义链(5'-3')：5'GCGACCAUUUUUCUCCACG dTdT 3'SEQ ID NO.27
细胞转染实验。hFLS细胞用0.25％的胰酶进行消化，制成细胞悬液接种于12孔培养板中，当hFLS细胞生长至对数生长期(即生长达80％融合成片时)，siRNA与转染试剂Lip2000混合后，进行分组转染，实验共分为11组：Notarget(NTC)为阴性对照组、NC为空白对照组、siRNA-CD-01至siRNA-CD-09为针对CD44基因序列不同位置设计的siRNA序列。转染24h后收集hFLS细胞，于1000rpm离心5分钟，去除上清，在细胞沉淀物中加入1ml Trizol裂解液，反复吹打或剧烈震荡使细胞充分裂解，然后转移至新的EP管(1.5ml)中，在室温15-30℃下静置5分钟。加入0.2ml氯仿，盖紧离心管，振荡15s使其充分混匀，在室温下静置10分钟左右于4℃低温离心机离心，12000rpm，15分钟，离心后液体分为3层：上层无色液体为总RNA，约0.5ml；中层白色蛋白质层；下层红色物为DNA，用吸管吸取上层水相0.5ml上清转移至另一备用的1.5ml EP管中，同时加入0.5ml预冷的异丙醇，充分混匀后于4℃放置10分钟于4℃，12000rpm离心10分钟后，小心弃去上清液，可见在管壁底部附着有少量白色片状物。加入1ml 75％用DEPC处理过的新鲜配制的乙醇，洗涤沉淀，垂直震荡后于4℃，10000rpm离心5min，倒掉大部分上清于4℃，10000rpm再次离心5min，吸去上清加入20μl DEPC处理过的水，至沉淀物完全溶解，紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
将1μl Oligo dT(0.5μg/μl)和2.0μg总RNA加入到PCR管中，再加入DEPC水至9ul；充分混匀后在离心机上进行离心，于70℃温浴10分钟；随后将其放入0℃冰水混合物中冰浴，使Oligo dT和模板退火将EP管取出后置于冰上与试剂混合，配制反应体系，混匀后短暂离心。将上述反应体系置于42℃中反应1小时，随后再于70℃水浴锅中水浴10分钟使逆转录酶失活将所得到的逆转录产物—cDNA。将cDNA、荧光染料与上、下游引物混合，进行定量PCR检测，检测结果见表1。荧光定量PCR引物：(F)5’-TGAGCATCGGATTTGAGA-3’SEQ ID NO.38；(R)5’-AGTCCACTTGGCTTTCTGT-3’SEQ ID NO.39。
表1 hFLS细胞水平CD44-siRNA靶基因的相对表达量
结果表明，同阴性对照组相比我们经过前期筛选获得的9对有效siRNA序列中，siRNA-CD--06对CD44的沉默效果最好，抑制了87％以上的靶基因表达。其中siRNA-CD--06的正义链为序列17，反义链为序列18。
实施例三Western blot法检测滑膜细胞中CD44蛋白的表达
经siRNA-CD-06转染的细胞，取出培养瓶，弃去细胞培养液，用PBS洗涤2遍，倒掉PBS，加入适量预冷的2×Lysis Buffer，用细胞刮将细胞刮下，置于冰上充分裂解细胞30min，于低温离心机4℃，12000g，离心15min，取上清液，用Bradford法测定蛋白浓度，最后将样品蛋白的终浓度均调整为2μg/μl，于-80℃冰箱保存备用。分别取12μg总蛋白量的样品，加入等体积的2X loading buffer上样缓冲液。将二者充分混匀后，在沸水中煮浴10分钟，4℃存放备用。根据目的蛋白分子量大小配制相应浓度的胶(10％的SDS-PAGE分离胶和5％的浓缩胶)，等胶制备好后，将梳子拔去后用电泳缓冲液清洗上样孔，将之前准备好的样品上样，每孔加入蛋白样品，进行电泳。电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃，400mA恒流条件下电转2小时，将蛋白转移到PVDF膜上。随后进行显色和曝光分析，分析结果见图1。
结果表明，siRNA-CD-06显著抑制了CD44的蛋白表达，后续选用siRNA-CD-06做进一步的试验。
实施例四寡聚核酸对炎症因子的抑制
细胞转染实验。原代培养hFLS细胞至6孔板，细胞密度约50％利用转染试剂lipofectamineTM2000转染siRNA-CD-06和对照，浓度50nM。转染24小时后,换无血清饥饿培养24小时。IL 1-α(10ng/ml)刺激24小时，随后提取RNA利用荧光定量PCR检测靶基因表达，与实施例二操作步骤相同。利用real time PCR检测hFLS细胞中TNF、COX2和IL-1β基因的表达水平。收取上清液。Human IL-1βimmunoassay检测试剂盒检测hFLS细胞IL-1β的分泌水平。
结果请见图2，结果表明，与阴性对照组相比siRNA-CD-06在Hela与hFLS细胞中均能有效抑制cox-2、TNF多种炎症因子的基因表达与分泌，其中在hFLS细胞中对IL-1β的基因抑制率达到70％。
实施例五同源寡核酸对CD44基因抑制效果的验证
为验证同源比率对siRNA-CD-06效果的影响，分三组开展设计制备了其同源siRNA，将这些序列按照实施例二方法，转染，荧光定量PCR检测对CD44基因mRNA表达抑制效率。第一组反义链均为5'AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'，正义链为5'CCAGCAAGUCUCAGGAAAU3'及其同源序列，如下表2。注:S＝正义链，AS＝反义链。正义链分别选择11nt、15nt、23nt、27nt、dT悬垂、错配。
表2 反义链组
第二组：正义链均为5'CCAGCAAGUCUCAGGAAAU3'，反义链为5'AUUUCCUGAGACUUGCUGG3'同源序列，如下表3
表3 正义链组
第三组：正义链和反义链为以上两组组合，如下表4。
表4 组合组
结果参见图3。结果表明三组设计的siRNA均起到了沉默靶基因的作用，表明与序列18有70％以上同源性的siRNA均能干扰CD44基因的表达。其中添加了悬挂碱基的21nt的siRNA-CD-14干扰效果最好，为88％；仅11nt互补的siRNA-CD-21干扰效果最差，为22％，但也起到了干扰靶基因表达的作用。
实施例六质粒靶基因沉默效果影响
根据CD44全长序列，利用SiRNA在线设计软件设计含siRNA-CD-06序列的双链寡核苷酸序列，设计完成后用Blast程序比对序列的同源性,设计序列如表5。采用不对人类任何基因产生干扰的siRNA双链作为阴性对照(NC)。注：划线部分为碱基互补区域(从5’→3’)，粗体部分为干扰靶序列，方框部分为限制性内切酶位点。
表5 含siRNA-CD-06序列的双链
对表5的寡核苷酸退火后形成双链，插入到siRNA表达载体中，构建含siRNA-CD-06序列的干扰载体，并转化感受态细胞DH5α。在转化平板挑取阳性克隆进行酶切和测序鉴定，随后对干扰效果进行检测。在感染前一天，将生长状态良好的hFLS细胞接种于六孔板中进行感染:无血清培养基洗细胞一次后加入1.5mL细胞培养基；分别用250uL培养基稀释质粒载体，轻轻混匀；将10uL Lipofectamine2000试剂以250uL细胞培养基稀释后，轻轻混匀，室温孵育5min，感染后48h收集细胞，利用Trizol法提取其总RNA,实时定量PCR方法检测目的基因mRNA表达情况(见表6)。
表6 质粒载体干扰后的基因表达量
实施例七化学修饰对CD44抑制效果的影响
对siRNA-CD-06进行不同的化学修饰及其组合修饰，以提高siRNA稳定性，提升干扰效果。化学修饰包括核糖的卤素修饰(2’-F修饰)、甲氧基修饰(2’-OMe)、硫代修饰、胆固醇修饰等。实验方法如实施例二，其中胆固醇、多肽、半乳糖、修饰siRNA组未加入转染试剂，其他组均与lip2000或PEI或PHA转染材料混合。
表7 修饰种类
表8 化学修饰对siRNA沉默效果的影响
从表8可知，经各类适当的化学修饰后，本发明的siRNA均起到了沉默目的基因表达的效果。其中siRNA-CD-28、siRNA-CD-36、siRNA-CD-39、siRNA-CD-40、siRNA-CD-41、siRNA-CD-42干扰效果较好，表明2’-氧甲基(2’-甲氧基)、硫代、胆固醇或磷酸化修饰能够保持较好的干扰效果。
实施例八化学修饰对寡聚核酸血清稳定性的影响
对实施例七的若干化学修饰核酸分子进行血清稳定性检测。将siRNA分子经无RNA酶水稀释至5μM后加入等体积的新鲜血清,然后在37℃孵育30分钟，取样进行电泳观察不同siRNA完整性。结果见图4，结果表明未修饰siRNA-CD-14在30分钟后已明显降解，而修饰核酸siRNA-CD-42，siRNA-CD-41，siRNA-CD-39，siRNA-CD-36，siRNA-CD-28，siRNA-CD-40在30分钟内无明显分解。
实施例九关节炎模型大鼠病理切片实验：为进一步验证siRNA药物对关节炎的治疗作用，进行病理切片检测大鼠模型中相关基因的表达水平。建模方案：雄性大鼠(240±20g,广东省医学实验动物中心提供)共21只，用II型胶原酶作为诱导剂促进关节炎的形成。将II型胶原酶(Sigma产品)注射到后肢关节腔，一次性给予200μL(500U)的II型胶原酶，剂量为100μL/腿。健康组给予PBS作为空白对照，用量与注射时间与炎症模型组相同。给药方案：在注射II型胶原酶6d后，将SD大鼠随机分为7组，每组3只。一组为PBS组，其他六组为siRNA给药实验组，其中siRNA实验组每次每只大鼠注射20nmol的siRNA溶液(10nmol/腿)，注射体积100μL，PBS组每次每只大鼠注射等体积的PBS，每组均每周给药2次。
取给药1-2周后的大鼠进行病理切片检测，将第2次及第4次给药后的大鼠隔天处死，然后剪开皮肤，用镊子分离皮下组织和肌肉，逐步暴露出关节，取膝关节关节经固定、脱钙、石蜡包埋、切片，进行苏木素-伊红(HE)染色和甲苯胺蓝(TB)染色，在显微镜下观察组织病理表现(X10)，其中给药组为siRNA-CD-42。
从图5中可知炎症模型大鼠第一周半月板出现纤维化和骨化，关节内结缔组织也出现了明显的纤维化；第二周关节面纤维化面积变大，局部纤维化组织深入到软骨下层；siRNA给药组第一周时软骨层表面平滑，软骨细胞保持活性；第二周时虽然出现轻微的局部纤维化增生，但软骨细胞保持了一定程度的活性。表明本发明的siRNA可以抑制炎症的病理进程，可作为潜在的预防或治疗关节炎的药物。
实施例十大鼠关节液炎症因子含量试验建模方案及给药方案如实施例九，取给药2周后的大鼠进行real-time PCR检测：最后一次给药后隔天处死大鼠，然后剪开皮肤，用镊子分离皮下组织和肌肉逐步暴露出关节，将膝关节浸泡于组织保存液中，防止RNA降解。将关节置入倒入液氮的研钵中，充分研磨至骨组织成粉末，按照Qiagen公司Rneasy Mini kit说明书，抽提RNA，Aglient2200确定RNA抽提质量，紫外分光光度计测定浓度后可用于下一步的逆转录反应。定量PCR分别检测给药组、对照组、模型组中CD44基因与炎症因子基因的表达量，统计分析后结果见表9。其中给药组siRNA-CD-39的siRNA由壳聚糖纳米粒包裹。
表9 大鼠中炎症因子的表达量
从表9可知，关节炎模型中炎症相关基因CD44、TNF、COX-2、IL-1β表达升高，siRNA-M8-42，siRNA-M8-41，siRNA-M8-28、NA-M8-39，siRNA-M8-36，siRNA-M8-40可显著下调大鼠炎症疾病中的CD44、COX-2、IL-1β的表达，起到了保护软骨与滑膜，改善炎症的效果，表明本发明的siRNA分子是潜在的可预防或治疗炎症的药物。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (12)
1.抑制CD44基因的寡聚核酸，所述寡聚核酸为双链RNA，其特征是，所述寡聚核酸的反义链如SEQ.ID NO.18所示，所述寡聚核酸的正义链如SEQ.ID NO.17所示，且所述正义链和所述反义链经过退火后形成双链结构。
2.根据权利要求1所述的寡聚核酸，其特征是，所述寡聚核酸经过以下至少一种修饰：
(1)对所述寡聚核酸的连接核苷酸的磷酸二酯键的氧用硫取代；
(2)对所述寡聚核酸的所含核糖2’-OH用甲氧基或氟取代或者对所述2’-OH进行脱氧修饰，或以开环核酸进行修饰；
(3)对所述寡聚核酸的胞嘧啶5位甲基修饰、5-乙炔基尿嘧啶、吲哚修饰；
(4)对所述寡聚核酸末端连接胆固醇、多肽、荧光、糖、抗体分子、磷酸化修饰；
(5)对所述寡聚核酸的末端添加悬挂碱基。
3.根据权利要求1所述的寡聚核酸，其特征是，所述寡聚核酸由如下经修饰的碱基组成或所述寡聚核酸由如下经修饰碱基且末端添加悬挂碱基组成：
siRNA-CD-42：5’Chol-CmsCmsAmsGCAAGUCUCAGGAAmsAmsUms3'
5'p-AmsUmsUmsUCCUGAGACUUGCUmsGmsGms3'；或
siRNA-CD-41：5’Chol-CmCmAmGCAAGUCUCAGGAAmAmUm3'
5'p-AmUmUmUCCUGAGACUUGCUmGmGm3'；或
siRNA-CD-28：5'CmCmAmGCAAGUCUCAGGAAmAmUm'
5'AmUmUmUCCUGAGACUUGCUmGmGm3'；或
siRNA-CD-39：5’CmsCmsAmsGCAAGUCUCAGGAAmsAmsUms3'
5'AmsUmsUmsUCCUGAGACUUGCUmsGmsGms3'；或
siRNA-CD-36：5'CmCmAmGCAAGUCUCAGGAAmAmUm3'
5'p-AmUmUmUCCUGAGACUUGCUmGmGm3'；或
siRNA-CD-40：5'Chol-CmCmAmGCAAGUCUCAGGAAmAmUm3'
5'AmUmUmUCCUGAGACUUGCUmGmGm3'；
其中s表示硫代修饰，m表示2’-甲氧基修饰，Chol表示胆固醇修饰，p表示磷酸化修饰。
4.根据权利要求2或3所述的寡聚核酸，其特征是，对所述寡聚核酸的3’末端添加悬挂碱基，所述悬挂碱基为dTdT。
5.可表达权利要求1-4任一种所述寡聚核酸且具有抑制CD44基因表达功能的DNA。
6.含有权利要求1-4任一种所述寡聚核酸或者权利要求5所述DNA的载体，所述载体为脂质体、聚合物材料、多肽、纳米材料。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征是，所述脂质体为阳离子脂质体；所述聚合物材料为透明质酸或聚赖氨酸；纳米材料为壳聚糖纳米粒。
8.一种具有抑制CD44基因表达功能的组合物，含有权利要求1-4任一种所述寡聚核酸或者权利要求5所述DNA，以及药学上可接受的载体。
9.权利要求1-4任一种所述寡聚核酸或者权利要求5所述DNA或者权利要求6或7所述载体或者权利要求8所述的组合物在制备抑制细胞中CD44基因表达制品中的应用。
10.权利要求1-4任一种所述寡聚核酸或者权利要求5所述DNA或者权利要求6或7所述载体或者权利要求8所述的组合物在制备治疗CD44基因异常引发的疾病的药物中的应用。
11.根据权利要求9或10所述的应用，其特征是，所述CD44基因异常引发的疾病为炎症、癌症或免疫性疾病。
12.根据权利要求9或10所述的应用，其特征是，所述CD44基因异常引发的疾病为骨关节炎、风湿性关节炎、滑膜炎或哮喘。
Priority Applications (1)
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Applications Claiming Priority (3)
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