CN105177000A - 一种抑制Survivin基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子，其由正义链和反义链组成，其中，所述正义链的序列为：5’-GGACCACCGCAUCUCUACAdTdT-3’；所述反义链的序列为：5’-UGUAGAGAUGCGGUGGUCCdTdT-3’。由于survivin是一种凋亡抑制蛋白，与肿瘤细胞的凋亡有关，当该siRNA双链序列进入到生物体内时，能够高效抑制survivin基因的表达，诱导癌细胞的凋亡，达到治疗癌症的目的。双链siRNA分子能够用于制备治疗肺癌和乳腺癌的药物。

Description

一种抑制Survivin基因表达的siRNA及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种抑制Survivin基因表达的双链siRNA分子及其应用。

背景技术

RNA干扰(RNAinterference，RNAi)现象最初发现于植物和线虫当中是指内源或外源性的双链RNA分子导致细胞内特定基因表达的沉默。通过导入外源siRNA分子(即siRNA递送)可以对细胞内目的蛋白的表达水平进行调控。当被下调的蛋白为疾病相关蛋白时，RNAi就有可能成为一种新的治疗策略。在肿瘤、感染和糖尿病等疾病的治疗中，RNAi已经成为国际上的研究热点之一。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，Survivin具有肿瘤特异性，只表达于肿瘤和胚胎组织，特别是在肺癌细胞和乳腺癌上高度表达，且与肿瘤细胞的凋亡密切相关。Survivin主要通过两条途径来抑制细胞凋亡：①直接抑制凋亡终末效应酶Caspase-3和Caspase-7的活性来阻断各种刺激诱导的细胞凋亡过程；②Survivin与周期蛋白激酶相互作用阻断凋亡信号转导通路。

在肿瘤治疗过程中，耐药性是困扰医生的一大难题，因此，设计一种双链siRNA分子，导入生物体内后，既能特异高效地沉默相应的Survivin基因，又能改善机体的耐药状态，对肺癌和乳腺癌的治疗提供了指导意义。

发明内容

为了解决目前癌症治疗的不足，本发明人进行了广泛深入的研究，并最终完成本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子，该双链siRNA分子既可以特异高效地抑制Survivin基因的表达，又能改善机体的耐药状态本发明的另一个目的是提供上述双链siRNA分子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

在本发明的一个方面，提供了一种抑制Survivin基因表达的siRNA，其由正义链和反义链组成，其中，

所述正义链的序列为：5’-GGACCACCGCAUCUCUACAdTdT-3’(SEQIDNO.1)；

所述反义链的序列为：5’-UGUAGAGAUGCGGUGGUCCdTdT-3’(SEQIDNO.2)。

在本发明的siRNA的序列中的A、G、C、U分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，dT(或表示为t)表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。

在本发明的另一个方面，提供了上述双链siRNA分子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明中，优选地，所述肿瘤为肺癌或乳腺癌。

上述双链siRNA分子能够用于制备治疗肿瘤(特别是，肺癌和乳腺癌)的药物。

由于survivin是一种凋亡抑制蛋白，与肿瘤细胞的凋亡有关，当该siRNA双链序列进入到生物体内时，能够高效抑制survivin基因的表达，诱导癌细胞的凋亡，达到治疗癌症的目的。双链siRNA分子能够用于制备治疗肺癌和乳腺癌的药物。本发明的积极效果在于：提供了一种新的高效靶向survivin基因的双链siRNA分子，同时还能改善机体的耐药状态，对肺癌和乳腺癌的治疗提供了指导意义。

附图说明

图1是显示WesternBlot检测肿瘤细胞中转染双链siRNA分子后survivin蛋白表达水平的图；

图2是显示荧光定量PCR检测肿瘤细胞中转染双链siRNA分子后survivinmRNA表达水平的图；

图3是实施例10中的显影结果。

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。然而，这些实施例只用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：一种抑制Survivin基因表达的siRNA的化学合成

根据survivin基因的核苷酸序列，设计小分子干扰siRNA：

正义链：5′-GGACCACCGCAUCUCUACAdTdT-3′(SEQIDNO.1)

反义链：5′-UGUAGAGAUGCGGUGGUCCdTdT-3′(SEQIDNO.2)

将该序列在人类EST数据库中比对，确定没有与它相同的其它基因序列。siRNA由广州锐博生物科技有限公司合成。该siRNA序列中的A、G、C、U分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和尿嘧啶核糖核苷酸，t表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。

实施例2：MCF-7乳腺癌细胞的活化与复苏

将MCF-7乳腺癌细胞(购自ACTT)冻存管从液氮中取出，迅速将冻存管投入到37℃的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。溶化后，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。将MCF-7细胞转移至15ml离心筒中，将10mlDMEM完全培养基加入到装有MCF-7细胞的离心筒中，1000rpm，离心5min，弃上清，再次加入新鲜的完全培养基重悬细胞，将重悬后的细胞分装到细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，次日更换新鲜培养基，待细胞长至占细胞培养瓶底部70％～80％，即可进行消化传代。

实施例3：MCF-7乳腺癌细胞的传代

当MCF-7乳腺癌细胞密度达到70％～80％时，在超净台中，将培养瓶中的培养基倒掉，用PBS溶液洗两次后，加入胰蛋白酶1ml，置于37℃培养箱中消化3～4min，待细胞变圆，敲打培养瓶底部，使贴壁细胞全部变成悬浮状态，加入1ml的完全培养基终止消化。吹打细胞使其成为悬浮单个细胞，取一定量的细胞悬液放回至细胞培养瓶中继续培养。

实施例4：MCF-7乳腺癌细胞的转染

将约2×10⁵个的MCF-7细胞悬液接种到两个6孔板中，在37℃、5％CO₂培养箱细胞培养24小时后，用lipofectame2000将siRNA-lipo2000混合液进行转染，使siRNA的最终浓度分别为10nM、20nM、30nM，同时设置一组空白对照组(Control)。对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：

a.稀释实施例1中合成的siRNA：用50μl不含血清培养基稀释5，10，15pmolsiRNA(加入细胞中的siRNA终浓度分别为10nM、20nM、30nM)，轻轻混匀，室温孵育5min；

b.稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基稀释1μllipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min；

c.将步骤a与步骤b得到的液体轻轻混匀，室温孵育20min，得到siRNA-lipo2000混合液。

d.转染：将siRNA-lipo2000混合液加入含有MCF-7细胞以及培养液的培养板各孔中，轻轻混匀；

e将培养板置于37℃的CO₂培养箱中培养48h，培养4h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基继续培养至48h，转染48h后，收集细胞，进行Survivin基因和蛋白的含量的检测。

实施例5：A549肺癌细胞的活化与复苏

将A549肺癌细胞(购自ACTT)冻存管从液氮中取出，迅速将冻存管投入到37℃的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管中的液体迅速融化。溶化后，用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再拿入超净台内。将A549细胞转移至15ml离心筒中，将10mlRPMI-1640完全培养基加入到装有A549细胞的离心筒中，1000rpm，离心5min，弃上清，再次加入新鲜的完全培养基重悬细胞，将重悬后的细胞分装到细胞培养瓶中，置于37℃、5％CO₂培养箱培养，次日更换新鲜培养基，待细胞长至占细胞培养瓶底部70％～80％，即可进行消化传代。

实施例6：A549肺癌细胞的传代

当A549肺癌细胞密度达到70％～80％时，在超净台中，将培养瓶中的培养基倒掉，用PBS溶液洗两次后，加入胰蛋白酶1ml，置于37℃培养箱中消化3～4min，待细胞变圆，敲打培养瓶底部，使贴壁细胞全部变成悬浮状态，加入1ml的完全培养基终止消化。吹打细胞使其成为悬浮单个细胞，取一定量的细胞悬液放回至细胞培养瓶中继续培养。

实施例7：A549肺癌细胞的转染

将约2×10⁵个的A549细胞悬液接种到两个6孔板中，在37℃、5％CO₂培养箱细胞培养24小时后，用lipofectame2000将siRNA-lipo2000混合液进行转染，使siRNA的最终浓度分别为10nM、20nM、30nM，同时设置一组空白对照组(Control)。对于每个转染样品，按如下步骤准备siRNA-lipo2000混合液：

a.稀释实施例1中合成的siRNA：用50μl不含血清培养基稀释5，10，15pmolsiRNA(加入细胞中的siRNA终浓度分别为10nM、20nM、30nM)，轻轻混匀，室温孵育5min；

b.稀释lipo2000：用50μl不含血清培养基稀释1μllipo2000，轻轻混匀并室温孵育5min；

c.将步骤a与步骤b得到的液体轻轻混匀，室温孵育20min，得到siRNA-lipo2000混合液。

d.转染：将siRNA-lipo2000混合液加入含有A549细胞以及培养液的培养板各孔中，轻轻混匀；将培养板置于37℃的CO₂培养箱中培养48h，培养4h后，可以将孔里含有siRNA-lipo2000混合液的培养基移去，更换新鲜的生长培养基继续培养至48h，转染48h后，收集细胞，进行Survivin基因和蛋白的含量的检测。

实施例8：荧光定量PCR检测survivinmRNA表达水平

分别将实施例4和7中的细胞，用胰酶消化，收集到DEPC处理的1.5ml的EP管中，用mRNA提取试剂盒RNAisoPlus提取纯化总RNA，操作按试剂盒说明书进行，提取后的RNA，按照反转录试剂盒说明书进行，将RNA反转成cDNA备用。

将上述制备的cDNA作荧光定量PCR检测，荧光定量PCR采用SYBRGreen的方法，所用PCR试剂为SYBRPremixExTaq^TM(宝生物工程大连有限公司生产)，PCR程序设置按照该试剂盒提供的说明书进行，PCR检测中使用GAPDH基因作为内参基因，进行相对定量分析Survivin基因的表达水平。检测结果如图2所示，由图可见，survivin基因的表达水平明显受到siRNA的抑制而降低，且在siRNA为30nM时，survivin基因的沉默效率即可达到85％以上，特别是在MCF-7细胞系中，在siRNA为30nM时，survivin基因的沉默效率即可达到90％，所以本发明所述的siRNA可以用于乳腺癌和肺癌的治疗。

实施例9：WesternBlot检测siRNA对survivin蛋白表达的抑制情况

分别将实施例4和7中的细胞，去除培养基后，用PBS洗两遍，加入100μL细胞裂解液，在冰浴上裂解10min，用细胞刮将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中，10000rpm离心5min后，取上清液测定蛋白浓度。每组取30μg蛋白进行SDS-PAGE，电泳完成后转至PVDF膜上，封闭后进行survivin一抗及羊抗兔二抗的处理，然后进行化学发光反应，显影。结果见图1，在MCF-7和A549细胞系中，siRNA都能显著的降低survivin蛋白的表达，所以本发明所述的siRNA可以用于乳腺癌和肺癌的治疗。

实施例10：WesternBlot检测siRNA对耐药基因MDR的蛋白表达的抑制情况

从上述实施例8和9可以看出，当SurvivinRNA的转染浓度在30nM时，能显著地降低survivin蛋白的表达，因此，我们在实施例7中考察30nMSurvivinRNA作用细胞时，对细胞的耐药性基因MDR表达的影响。分别将MCF-7和A549按照实施例4和7的方法进行转染，转染48h后，去除培养基，用PBS洗两遍，每孔加入100μL细胞裂解液，在冰浴上裂解10min，用细胞刮将细胞刮下，转移至1.5ml离心管中，10000rpm离心5min后，取上清液测定蛋白浓度。每组取30μg蛋白进行SDS-PAGE，电泳完成后转至PVDF膜上，封闭后进行MDR一抗及羊抗兔二抗的处理，然后进行化学发光反应，显影。结果见图3，在MCF-7和A549细胞系中，siRNA都能一定程度降低MDR蛋白的表达，所以本发明所述的siRNA可以改善细胞的耐药情况，对肿瘤的治疗提供了指导意义。

Claims (4)

1.一种抑制survivin基因表达的双链siRNA分子，其由正义链和反义链组成，其中，

所述正义链的序列为：5’-GGACCACCGCAUCUCUACAdTdT-3’；

所述反义链的序列为：5’-UGUAGAGAUGCGGUGGUCCdTdT-3’。

2.如权利要求1所述的双链siRNA分子在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

3.如权利要求2所述的用途，其中，所述肿瘤为肺癌。

4.如权利要求2所述的用途，其中，所述肿瘤为乳腺癌。