CN104774929A - miR-455-3p在食管鳞状细胞癌中的诊断、治疗和预后的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miR-455-3p在食管鳞状细胞癌中的诊断、治疗和预后的应用,本发明发现miR-455-3p在ESCC病人中高表达,与ESCC病人的生存率低显著相关。体内、外实验研究发现miR-455-3p能够促进ESCC的恶性发展;而抑制miR-455-3p的表达能够抑制ESCC干细胞特性并增强其对化疗药物的敏感性;可见miR-455-3p的表达抑制剂是肿瘤干细胞的重要抑制物,能够抑制肿瘤的干细胞特性和增加癌症干细胞对化疗药物的敏感性。本发明首次发现检测癌症病人中miR-455-3p的表达,可以作为ESCC的辅助诊断和/或预后判断。本发明为肿瘤疾病提供了新的诊断、治疗方法和药物筛选平台。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种新的microRNA及其Antagomir的应用,特别涉及miR-455-3p及Antagomir-455-3p的应用。
背景技术
食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其死亡率占第六位。我国大约90%的食管癌为鳞状细胞癌,并且其具有显著的地域性,高发区的食管鳞状细胞癌发病率是低发区的500倍。烟酒史、营养缺失、热食以及摄入致癌物等因素都与食管鳞状细胞癌相关。外科手术、放化疗是食管鳞状细胞癌的重要治疗手段,但是其5年生存率只有10%左右。耐药性是食管鳞状细胞癌治疗难以攻克的难关。传统的药物难以杀灭肿瘤干细胞。肿瘤干细胞既具有类似于正常干细胞的特性,如自我更新,低分化及药物抵抗;又具有肿瘤细胞的恶性发展能力。深入了解食管鳞状细胞癌的耐药机制可以制定食管鳞状细胞癌风险评估和有效的诊断措施,并且可以为肿瘤治疗提供新的靶点。
microRNA,通常长度为19~25个核苷酸,广泛存在于各种动植物甚至单细胞真核生物中,是一类在进化上高度保守的小分子单链RNA。最近的研究发现,microRNA表达与多种癌症相关,大约50%得到注解的miRNAs在基因组上定位于与肿瘤相关的脆性位点(fragile site)。这说明miRNAs在肿瘤发生过程中起至关重要的作用,其主要通过结合到多种靶向mRNAs的3’UTR从而抑制mRNAs的转录。
Antagomir是根据microRNA成熟体序列而设计,经过特殊标记与修饰的单链RNA,专门用于抑制内源性microRNA的高效阻断剂。Antagomir长度一般在22-25nt,3’端进行胆固醇(cholesterol)标记和四个硫代磷酸(PS)位点修饰,5’端两个硫代磷酸(PS)位点修饰,全链2-甲基化修饰,提高杂交效率和优越的稳定性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食管鳞状细胞癌的检测试剂盒。
本发明的另一目的在于提供一种食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种治疗食管鳞状细胞癌的药剂。
本发明所采取的技术方案是:
miR-455-3p作为肿瘤检测、治疗、预后靶点的应用。
一种肿瘤检测试剂盒,该试剂盒中含有能够定量检测miR-455-3p的试剂。
进一步的,上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列。
进一步的,上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列:5’-GCAGTCCATGGGCATATACAC-3’ (SEQ ID NO:1)和5’-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’ (SEQ ID NO:2)。
一种肿瘤的预后试剂盒,该试剂盒中含有能够定量检测miR-455-3p的试剂。
进一步的,上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列。
进一步的,上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列:5’-GCAGTCCATGGGCATATACAC-3’ (SEQ ID NO:1)和5’-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’ (SEQ ID NO:2)。
一种治疗食管鳞状细胞癌的药剂,该药剂中含有抑制miR-455-3p表达的试剂。
进一步的,上述抑制miR-455-3p表达的试剂选自miR-455-3p的拮抗剂Antagomir、miR-455-3p的反义链中的至少一种。
本发明的有益效果是:
本发明在食管鳞状细胞癌的肿瘤细胞中发现了miR-455-3p,在207例病人组织样本及15例健康组织样本中发现,miR-455-3p在食管鳞状细胞癌病人中高表达,这提示miR-455-3p具有成为肿瘤辅助诊断标记物的潜能。进一步,发明人发现miR-455-3p高表达与食管鳞状细胞癌患者5年总生存率及无病生存率显著负相关,miR-455-3p高表达明确指示较差的生存预后。这提示了miR-455-3p具有成为食管鳞状细胞癌患者生存预后指标的潜能。体内和体外的功能性研究分析表明,miR-455-3p能够促进食管鳞状细胞癌细胞的恶性发展,Antagomir-455-3p功效与其相反。此外,抑制miR-455-3p的表达能够抑制肿瘤干细胞特性和增强其对化疗药物的敏感性。并且,抑制miR-455-3p的表达可抑制肿瘤干细胞相关生物标志物的表达。综上所述,本研究发现Antagomir-455-3p是肿瘤干细胞的重要抑制物,在癌症的发展过程中具有重要意义。此外,Antagomir-455-3p能够降低癌症干细胞对化疗药物的敏感性。检测癌症病人中miR-455-3p的表达,可以作为食管鳞状细胞癌的辅助诊断和/或预后判断。本发明为肿瘤疾病提供了新的诊断、治疗方法和药物筛选平台。
附图说明
图1为miR-455-3p在ESCC临床标本和细胞系中表达情况及生存预后情况;显示为miR-455-3p在ESCC的TCGA数据库、临床标本和细胞系中表达上调,miR-455-3p高表达与患者5年总生存率(Overall survival, OS)及无病生存率(Disease-free survival, DFS)呈显著负相关;
图2为原代ESCC肿瘤细胞经CDDP药物筛选后分为CDDP处理的ESCC(EC-CR)和CDDP未处理的ESCC(EC-NT),EC-CR的耐药性、肿瘤发生率、肿瘤干性等功能均高于EC-NT;
图3为microRNA表达谱分析EC-CR和EC-NT细胞中microRNA 的表达情况,显示miR-455-3p在EC-CR和EC-NT细胞中均表达上调;
图4为miR-455-3p的体内体外的功能实验。体外实验中的克隆形成实验、SP+分选实验、CD90+实验显示高表达miR-455-3p促进ESCC的肿瘤细胞干性;而抑制miR-455-3p的表达抑制了ESCC肿瘤细胞干性。体内实验中高表达miR-455-3p增强了ESCC细胞的体内成瘤能力,而沉默miR-455-3p的表达减弱了ESCC细胞的体内成瘤能力;
图5为miR-455-3p的表达量对ESCC肿瘤的的影响,高表达miR-455-3p增强了ESCC细胞的淋巴结和肺内转移,而沉默miR-455-3p的表达减弱了ESCC细胞淋巴结和肺内转移;
图6为miR-455-3p表达量与肿瘤对化疗药物的敏感性的关系,显示为高表达miR-455-3p增强对化疗药物CDDP和5-FU的耐药性;在肿瘤形成过程中高表达miR-455-3p促进了肿瘤细胞的生长;在肿瘤形成过程中,注射Antagomir-455-3p可抑制肿瘤细胞对化疗的药物的影响,抑制肿瘤的生长;
图7为TargetScan 网站预测结果显示 miR-455-3p可能通过作用于PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A这8个基因mRNA的3'UTR发挥功能;miRNPs免疫共沉淀实验、免疫印迹实验检测表明高表达miR-455-3p促进RISC复合体(RNA-induced silencing complex)与靶基因PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的mRNA结合,下调靶基因的蛋白表达水平, 进一步,双荧光素酶活性检测结果表明miR-455-3p通过作用于靶基因的mRNA 的3'UTR元件抑制荧光素酶的表达。
具体实施方式
miR-455-3p作为肿瘤检测、治疗、预后靶点的应用。
一种肿瘤检测试剂盒,该试剂盒中含有能够定量检测miR-455-3p的试剂。
优选的,上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列。
优选的,上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列:5’-GCAGTCCATGGGCATATACAC-3’ (SEQ ID NO:1)和5’-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’ (SEQ ID NO:2)。
一种肿瘤的预后试剂盒,该试剂盒中含有能够定量检测miR-455-3p的试剂。
优选的,上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列。
优选的,上述试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列:3’-GCAGTCCATGGGCATATACAC-5’ (SEQ ID NO:1)和3’-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-5’ (SEQ ID NO:2)。
一种治疗食管鳞状细胞癌的药剂,该药剂中含有抑制miR-455-3p表达的试剂。
优选的,上述抑制miR-455-3p表达的试剂选自miR-455-3p的拮抗剂Antagomir、miR-455-3p的反义链中的至少一种。
优选的,上述miR-455-3p的拮抗剂Antagomir为Antagomir-455-3p,其序列为GTGTATATGCCCATGGACTGC(SEQ ID NO:3)并携带有一个锁环结构。
优选的,上述miR-455-3p的反义链的序列为GTGTATATGCCCATGGACTGC(SEQ ID NO:4)。
优选的,上述肿瘤为食管鳞状细胞癌。
下面结合具体实施例子,进一步阐明本发明内容。下列实施例中未标明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如《分子克隆实验指南》(第三版)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 miR-455-3p在ESCC样本中表达上调
(1)TCGA数据库分析
方法:运用SPSS统计学分析法,分析The Cancer Genome Altas Project (TCGA)中186例ESCC病人和13例ESCC癌旁组织的miR-455-3p的表达水平及其与生存率的关系。所有统计学分析用SPSS17.0 统计软件进行处理。数值用均数±SD 表示,P<0.05 认为在统计学上有显著性差异。
分析结果显示ESCC肿瘤组织中miR-455-3p表达量明显高于癌旁组织样本(P<0.001),差异具有统计学意义(如图1-A所示);定义miR-455-3p在ESCC肿瘤组织中的表达超过中位数的表达,称为miR-455-3p高表达;ESCC肿瘤组织miR-455-3p表达低于中位数的表达,称为miR-455-3p低表达,从图1-B中可以看出miR-455-3p的高表达预示了病人较差的预后。
(2)RT-qPCR检测miR-455-3p在ESCC的临床标本中的表达
方法:采用RT-qPCR方法检测miR-455的表达水平:逆转录引物:CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGTGTATAT(SEQ ID NO:9), miR-455 PCR检测引物序列:5’-GCAGTCCATGGGCATATACAC-3’ (SEQ ID NO:1), 通用引物序列:5’-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’ (SEQ ID NO:2)。(1)依靠逆转录酶将RNA转变成cDNA;(2)PCR扩增cDNA;(3)实时监测和定量测定cDNA的量。检测207例ESCC肿瘤标本和15例健康成人食管组织中miR-455-3p的表达。运用SPSS统计软件分析miR-455-3p的表达与ESCC病人的5年总生存率及无病生存率的关系。
从图1-C中可以看出,miR-455-3p在ESCC肿瘤组织中的表达量显著高于健康组中miR-455-3p的表达量(P < 0.001)。
根据RT-qPCR的结果,定义miR-455-3p在ESCC肿瘤组织中的表达超过中位数的表达,称为miR-455-3p高表达;ESCC肿瘤组织miR-455-3p表达低于中位数,称为miR-455-3p低表达。统计学分析得出,miR-455-3p表达高低与食管鳞状细胞癌患者的5年总生存率及无病生存率呈负相关(P<0.001),提示miR-455-3p的表达量可作为ESCC患者的预后指标,miR-455-3p表达量越高则患者可预后的生存情况越差(见图1-D)。
(3)ESCC临床肿瘤标本和细胞系中miR-455-3p的表达情况
方法:RT-qPCR检测8对ESCC病人癌组织和癌旁组织,以及12个ESCC细胞系(Kyse140、Kyse180、HKESC1、Eca109、Kyse410、、Kyse 510、Kyse 30、EC18、TE-1、Kyse 520、108CA、Ec9706)中miR-455-3p的表达情况,原位食管鳞状上皮细胞(NEECs)作对照。
检测结果显示,8份ESCC病人癌组织的miR-455-3p表达量均显著高于相应的癌旁组织(见1-E),且在12个ESCC的细胞系中miR-455-3p的表达量相对细胞NEEC均明显增高(见图1-F)。
上述结果说明miR-455-3p的高表达(miR-455-3p在ESCC肿瘤组织中的表达超过其在正常组织中的表达2倍)与ESCC存在密切的相关,可作为ESCC的辅助诊断指标。
综合上述所有结果,可获知 ESCC肿瘤组织中miR-455-3p的表达量不仅可以作为ESCC的辅助诊断指标,还可以作为ESCC独立的预后指标(P < 0.001),ESCC肿瘤组织miR-455-3p的高表达预示着病人较差的预后。
实施例2 构建对化疗药物耐药和敏感的ESCC肿瘤细胞株
(1)耐药株与非耐药株的建立
方法:将ESCC病人的肿瘤细胞皮下接种到NOD/SCID小鼠(4–5周龄, 18-20g),一周后,在小鼠腹腔内注射PBS缓冲液或者5mg/kg的顺-双氨双氯铂(CDDP),每周两次,持续4周。之后分离小鼠体内的ESCC肿瘤细胞进行平皿培养,重复上述步骤3次。分离第4次接种后的小鼠肿瘤细胞进行平皿培养,CDDP组中获得的ESCC肿瘤细胞为CDDP处理ESCC株(以下简称为EC-CR),PBS组的为非CDDP处理ESCC株(以下简称为EC-NT)(见2-A)。分别利用化疗药物顺-双氨双氯铂(CDDP)、5-氟脲嘧啶(5-FU)处理EC-CR 、EC-NT细胞。将2×105个肿瘤细胞重悬,离心收集悬浮细胞,微量离心机转速2000rpm,离心时间5min,弃培养基;用冷PBS洗涤细胞两次;用400μl 1×Binding Buffer悬浮细胞,浓度大约为1×106 cells/ml;在细胞悬浮液中加入5μl Annexin V-FITC,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟;加入5μl PI后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5分钟;在1小时内用流式细胞仪观察。
实验结果显示:EC-CR细胞在CDDP和5-F-U处理之后,肿瘤细胞的存活率分别为95.8%、95.7%,高于EC-NT细胞在CDDP和5-FU的存活率(分别为63.9%、62.7%),说明经过药物筛选后,EC-CR的耐药性高于EC-NT(见图2-B)。
(2)耐药株与非耐药株肿瘤细胞的自我更新能力
1. 体内成瘤能力检测
方法:将一批NOD/SCID小鼠(4–5周龄, 18-20g)随机分成两组,其中一组为EC-CR组,另一组为EC-NT组,分别将数量为1×105、1×104、5×13、1×103、5×102、1×102的EC-CR肿瘤细胞、EC-NT肿瘤细胞皮下接种到NOD/SCID小鼠体内,在相同条件下培养各组小鼠10天,检测该两种肿瘤细胞成瘤所需的最低细胞数。
实验结果显示,10天后,EC-CR组的小鼠最低成瘤细胞个数为1×102个,而EC-NT组的小鼠最低成瘤细胞个数为1×103个(见图2-C),并且在接种相同肿瘤细胞数的条件下,耐药株EC-CR组的成瘤能力明显大于非耐药株EC-NT组,进一步通过分析表明耐药株EC-CR组的肿瘤起始细胞频数(TIC频数)明显大于非耐药株EC-NT组。
2. 体外肿瘤成球能力检测
方法:分别将500个EC-CR、EC-NT肿瘤细胞接种在6孔板超低吸附板 (Corning, NY)。球体是在DMEM/F12培养基中培养(Invitrogen, Grand Island, NY),补充2% B27(Invitrogen, Grand Island, NY), 20 ng/ml的EGF和20μg/ml bFGF(PeproTech, Offenbach, Germany),0.4%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma, St. Louis, MO, USA)和5μg /ml胰岛素。检测EC-CR和EC-NT细胞的球体形成情况,进行计数。将EC-CR与EC-NT所形成的球体重悬,重新铺板培养,检测EC-CR和EC-NT细胞的球体形成情况,重复培养3代。
实验结果显示,十天后,EC-CR细胞所形成的肿瘤在体积和数量上远高于EC-NT细胞,随着培养代数的增加,EC-CR细胞所形成的肿瘤在体积和数量上依旧明显高于EC-NT细胞。(见图2-D),说明EC-CR细胞中的肿瘤干细胞特性优于EC-NT细胞,更易于发展成肿瘤组织。
(3)耐药株与非耐药株肿瘤细胞的CD90
+
比例
方法:分别将2×105个EC-CR和EC-NT细胞重悬,离心收集悬浮细胞,微量离心机转速2000rpm,离心时间5min,弃培养基;用冷PBS洗涤细胞两次;用400μl 1×Binding Buffer悬浮细胞,浓度大约为1×10 cells/ml;在细胞悬浮液中加入5μl CD90抗体,轻轻混匀后于2~8℃避光条件下孵育15分钟;1×孵育缓冲液洗1次;500μl 1×PBS重悬,滤膜过滤,在1小时内用流式细胞仪观察。
实验结果显示,EC-CR 细胞CD90的细胞计数为17.3%,高于EC-NT细胞的细胞计数1.5%(见图2-E)。进一步说明EC-CR 细胞维持细胞干性的能力强于EC-NT细胞。
(4)耐药株与非耐药株肿瘤细胞中侧群细胞SP
+
的分选实验
方法:分别在消化后的EC-CR细胞和EC-NT细胞中加入含10% FBS的RPMI-1640培养液重悬(37℃),使细胞浓度为1×106个/ml;分别取出1ml细胞加入抑制剂维拉帕米(verapamil) 30μl或加入等体积的无菌水,37℃ 10min;之后加入染料Hoechest33342(终浓度5μg/ml),37℃ 90min,15min颠倒一次混匀。在流式细胞仪中检测各组细胞中侧群(SP)细胞的数量。
检测结果显示,在未加抑制剂维拉帕米(verapamil)实验中,EC-CR组中的SP细胞的数量(6.78%)明显高于EC-NT组(0.64%)(见图2-F),说明EC-CR细胞具有较高的肿瘤干细胞特性。
(5) 耐药株与非耐药株肿瘤细胞与干细胞相关基因的关系
方法:Trizol试剂盒提取EC-CR和EC-NT细胞中的总RNA,利用RT-qPCR检测多能干基因ABCG2,SOX2,OCT4,NANOG和 KLF4的mRNA表达量。
检测结果显示,EC-CR 细胞的上述5种干细胞相关基因表达量高于EC-NT 细胞(见图2-G),进一步说明EC-CR细胞具有较高的肿瘤干细胞特性。
综合上述所有研究结果,可获知ESCC耐药细胞EC-CR的肿瘤细胞自我更新能力和泵药能力高于非耐药株的肿瘤细胞。
实施例3构建miR-455-3p稳定高表达和抑制表达的细胞
(1)ESCC肿瘤干细胞相关的microRNA
利用microRNA表达谱分析,检测EC-CR和EC-NT细胞中microRNA 的表达情况,发现EC-CR和EC-NT细胞的miR-455-3p高表达,EC-CR的miR-455-3p的表达量高于EC-NT的表达量(见图3-A)。
(2)构建miR-455-3p高表达的稳定细胞
ESCC细胞EC-NT由DMEM培养基(DMEM;Gibco)添加10%的胎牛血清(Gibco)在37℃的二氧化碳培养箱进行培养。
1)构建miR-455-3p的过表达质粒
用PCR扩增miR-455-3p的mRNA全长序列UCCCUGGCGUGAGGGUAUGUGCCUUUG GACUACAUCGUGGAAGCCAGCACCAUGCAGUCCAUGGGCAUAUACACUUGCCUCAAGGCCUAUGUCAUC(SEQ ID NO:5)。
引物序列如下:
FP:5’-GCCAGATCTCCCCAGAATGGTGACGAG -3’ (SEQ ID NO:6);
RP:5’-GCCCTCGAGACGCAGCACTTTGGCAGT -3’ (SEQ ID NO:7)。
将纯化的miR-455-3p全长序列构建到pMSCV-retro-puro表达载体中(购自Clontech 公司),获得miR-455-3p过表达质粒pMSCV-miR-455-3p。
2)转染ESCC细胞EC-NT
利用磷酸钙转染技术将上述过表达质粒pMSCV-miR-455-3p和空质粒pMSCV-Vector分别转入HEK293T细胞中,并于6小时后更换含有10%的胎牛血清的DMEM培养基(DMEM;Gibco)。48小时及72小时后收集慢病毒上清,并感染EC-NT细胞。
用嘌呤霉素(0.5μg/ml; Sigma-aldrich)筛选10天得到miR-455-3p过表达稳定细胞EC-NT/miR-455-3p,对照细胞分别为EC-NT/Vector。图3-B显示以EC-NT/Vector的miR-455-3p的表达值为1,EC-NT/miR-455-3p的miR-455-3p的相对表达值远高于EC-NT/Vector的表达值,证明构建了miR-455-3p高表达的稳定细胞。
(3)构建抑制miR-455-3p表达的细胞
EC-CR细胞由DMEM培养基(DMEM;Gibco)添加10%的胎牛血清(Gibco)在37℃的二氧化碳培养箱进行培养。
1)构建miR-455-3p反义链的过表达质粒
miRzip,即反义microRNAs,是稳定表达具有抗microRNA活性的RNAi发夹序列。miRzip shRNAs产生短的、单链的抗microRNAs,可以竞争性地与内源靶向性microRNA相结合,并抑制其功能,从而使被结合的microRNA的表达达到抑制。
用PCR扩增miR-455-3p的反义链GTGTATATGCCCATGGACTGC(SEQ ID NO:4),将纯化的miR-455-3p反义链序列构建到miRzip(San Francisco, CA),获得抑制miR-455-3p表达的质粒miRzip-455-3p,对照细胞为miRzip-Vector(为空载)。
2)转染ESCC耐药细胞EC-CR
利用磷酸钙转染技术将上述过表达质粒miRzip-455-3p和miRzip-Vector分别转入HEK293T细胞中,并于6小时后更换含有10%的胎牛血清的DMEM培养基(DMEM;Gibco)。48小时及72小时后收集慢病毒上清,并感染EC-CR细胞。
用嘌呤霉素(0.5μg/ml; Sigma-aldrich)筛选10天得到抑制miR-455-3p表达的稳定细胞EC-CR/miRzip-455-3p,对照细胞分别为EC-CR/miRzip-V。见图3-C显示以EC-CR/ miRzip-V的miR-455-3p的表达值为1,EC-CR/miRzip-455-3p的miR-455-3p的相对表达值低于EC-CR/ miRzip-V的表达值,证明构建了miR-455-3p反义链的过表达质粒。
3)制备miR-455-3p拮抗剂Antagomir(可由生物公司合成,如锐博生物公司),本实施例采用的miR-455-3p 拮抗剂Antagomir(以下简称为Antagomir-455-3p)是根据miR-455-3p成熟体序列GCAGUCCAUGGGCAUAUACAC(SEQ ID NO:8)而设计的。Antagomir-455-3p的序列为GTGTATATGCCCATGGACTGC(SEQ ID NO:3)并携带有一个锁环结构。
ESCC细胞EC-CR由DMEM培养基(DMEM;Gibco)添加10%的胎牛血清,将Antagomir-455-3p与阴性对照(一段不能与miR-455-3p结合的寡聚核苷酸序列,GFP siRNA序列并携带有一个锁环结构,以下简称control)分别瞬时转染到EC-CR,得到抑制miR-455-3p表达的细胞EC-CR/Antagomir-455-3p,以及对照细胞EC-CR/Antagomir-ctrl细胞。见图3-C显示以EC-CR/Antagomir-ctrl的miR-455-3p的表达值为1,EC-CR/Antagomir-455-3p的miR-455-3p的相对表达值低于EC-CR/Antagomir-ctrl的表达值,证明构建了抑制miR-455-3p表达的质粒。
实施例4 miR-455-3p在ESCC细胞中的功能研究
(1) 检测肿瘤干细胞特性
1)体外实验: 球体形成实验
通过球体形成实验检测高表达miR-455-3p和沉默miR-455-3p的细胞自我更新的能力。分别将500个miR-455-3p过表达稳定细胞EC-NT/miR-455-3p、对照细胞EC-NT/Vector、以及抑制miR-455-3p表达的细胞EC-CR/miRzip-455-3p、及对照细胞EC-CR/ miRzip-V细胞接种在6孔板超低吸附板(Corning, NY),球体是在DMEM/F12培养基培养(Invitrogen, Grand Island, NY),在培养基中补充2% B27(Invitrogen, Grand Island, NY),20ng/ml的EGF,和20μg/ml bFGF(PeproTech, Offenbach, Germany),0.4%牛血清白蛋白(BSA)(Sigma, St. Louis, MO, USA)和5μg /ml胰岛素。在不同培养阶段检测细胞球体形成情况。将所形成的细胞重悬,重新铺板培养,检测EC-CR和EC-NT细胞的球体形成情况,重复培养3代。
检测结果显示,在培养10天后,miR-455-3p过表达稳定细胞EC-NT/miR-455-3p能形成明显的球体,球体体积大且数量多,球体数量显著多于对照组EC-NT/Vector;而抑制miR-455-3p表达的细胞EC-CR/miRzip-455-3p的成球数及球体体积相比对照组EC-CR/ miRzip-V明显减少(见图4-A)。
上述实验结果说明miR-455-3p促进了ESCC的自我更新能力,更有利于其维持肿瘤干细胞的特性,而抑制了miR-455-3p的表达使ESCC的成球性能减弱,逐渐失去肿瘤干细胞的特性。
2)体外实验:SP分选实验
方法:同实施例2中(4)所述的方法,除了消化的细胞为EC-NT/miR-455-3p、EC-NT/Vector、EC-CR/miRzip-455-3p、EC-CR/ miRzip-V,其他处理方法均一样。
检测结果显示,EC-NT/miR-455-3p组中的SP细胞的数量明显高于EC-NT/Vector组中的SP细胞的数量(见图4-B),说明EC-NT/miR-455-3p的细胞具有较高的肿瘤干细胞特性,同时也说明miR-455-3p的表达量可作为ESCC诊断检测的标记物。而EC-CR/miRzip-455-3p组中的SP细胞的数量明显低于对照组EC-CR/ miRzip-V(见图4-B),说明抑制miR-455-3p表达的细胞EC-CR/miRzip-455-3p和EC-CR/miRzip-V具有较低的肿瘤干细胞特性。
3)体外实验:CD90+实验
方法:同实施例2中(3)所述的方法,除了消化的细胞为EC-NT/miR-455-3p、EC-NT/Vector、EC-CR/miRzip-455-3p、EC-CR/ miRzip-V,其他处理方法均一样。
实验结果显示,EC-NT/miR-455-3p组中的CD90+表达值明显高于EC-NT/Vector组(见图4-C),说明EC-NT/miR-455-3p细胞具有较高的肿瘤干细胞特性,同时也说明miR-455-3p的表达量可作为ESCC诊断检测的标记物。而EC-CR/miRzip-455-3p组中的CD90+表达值明显低于对照组EC-CR/miRzip-V(见图4-C),说明抑制miR-455-3p表达的细胞具有较低的肿瘤干细胞特性。
4)体内实验:皮下成瘤实验
方法:购买12只NOD/SCID小鼠(4–5周龄,18-20g),随机分为2组,每组6只小鼠。在其中一组小鼠中,将1 × 106 个EC-NT/miR-455-3p、EC-NT/Vector细胞分别皮下接种在其左右背部,在另一组小鼠中,将EC-CR/miRzip-455-3p、EC-CR/miRzip-V分别皮下接种在其左右背部,每天观察肿瘤细胞的肿瘤生长情况。
实验结果显示,接种了EC-NT/miR-455-3p 的小鼠肿瘤生长率和体积明显高于EC-NT/Vector,接种了EC-CR/miRzip-V 的小鼠肿瘤生长率和体积明显高于EC-CR/miRzip-455-3p,说明miR-455-3p高表达可以促进肿瘤生长 (见图4-D)。
(2) 检测肿瘤转移
1)腹股沟淋巴结转移模型
方法:购买48只NOD/SCID小鼠(4–5周龄, 18-20g),随机分为4组,每组12只小鼠。EC-NT- miR-455-3p/ Vector细胞中均能够稳定表达荧光酶(luciferase)。之后在其中两组的小鼠中,统一在其左脚掌中注射5×105个EC-NT- miR-455-3p/ Vector;在另外两组的小鼠中,统一在其左脚掌中注射5×105个EC-CR细胞,10天之后在小鼠脚掌中注射2mg/ml Antagomir-455-3p或者Antagomir-ctrl,一周两次,持续3周。35天后处死小鼠,分析脚掌肿瘤大小和腹股沟淋巴结数量,采用石蜡包埋淋巴结,采用荧光抗体(anti-luciferase,Abcam, Cambridge, MA)进行免疫组化染色,采用AxioVision Rel.4.6计算机图像分析系统(Carl Zeiss, Jena, Germany)观察肿瘤细胞。
结果分析:高表达miR-455-3p的细胞小鼠腹股沟淋巴结大于对照组。而在注射了Antagomir-455-3p的EC-CR细胞的小鼠腹股沟淋巴结明显小于对照组(见图5-A和5-B)。在淋巴结的免疫组化片中检测到EC-NT/ miR-455-3p的荧光素酶的染色强于EC-NT/ Vector,而在注射了Antagomir-455-3p的EC-CR细胞的荧光素酶的染色弱于对照组(见图5-C),说明高表达miR-455-3p促进了肿瘤细胞向淋巴结转移,而抑制miR-455-3p抑制了肿瘤细胞向淋巴结转移。
2)肺成瘤模型
方法:购买48只NOD/SCID小鼠(4–5周龄, 18-20g),随机分为4组,每组12只。在其中的2组NOD/SCID裸鼠的尾静脉分别注射2×106个EC-NT-miR-455-3p和EC-NT-Vector细胞;在另2组NOD/SCID 裸鼠的尾静脉注射2×106个EC-CR细胞,之后每星期尾静脉注射2mg/ml Antagomir-455-3p和control,每周2次,重复上述实验持续3周。活体荧光成像仪检测肿瘤细胞在肺中肿瘤形成能力。一个月之后解剖小鼠,肺用苦味酸-福尔马林固定染色后拍照,观察每组肺巢的数量,之后再石蜡包埋病理切片,并进行HE染色,统计癌巢点(a low power field, LPF),使用均值+ SD表示,P< 0.05为有统计意义。
结果分析:高表达miR-455-3p的EC-NT细胞在肺中形成的肿瘤结节多于对照组EC-NT-vector细胞,而在EC-CR细胞中抑制miR-455-3p的表达之后在肺中形成的肿瘤结节明显受到抑制 (见图5-D)。
结论:miR-455-3p能促进ESCC肿瘤细胞的肺转移和淋巴结转移。
(3)检测细胞对化疗药物敏感性
1)体外实验:细胞凋亡实验检测肿瘤细胞对化疗药物的敏感性
方法:分别利用化疗药物顺-双氨双氯铂(CDDP)、5-氟脲嘧啶(5-FU)处理实验组细胞(EC-NT/miR-455-3p、EC-CR/Antagomir-455-3p)或对照组的肿瘤细胞(EC-NT/Vector、EC-CR/Antagomir-ctrl)。将2×105个肿瘤细胞重悬,离心收集悬浮细胞,微量离心机转速2000rpm,离心时间5min,弃培养基;用冷PBS洗涤细胞两次;用400μl 1×Binding Buffer悬浮细胞,浓度大约为1×10 cells/ml;在细胞悬浮液中加入5ul Annexin V-FITC,轻轻混匀后于2-8℃避光条件下孵育15分钟;加入5μl PI后轻轻混匀于2-8℃避光条件下孵育5分钟;在1小时内用流式细胞仪观察。
实验结果如图6-A所示,从中可以看出EC-NT/miR-455-3p和EC-CR/Antagomir-ctrl 抵抗CDDP和5-FU的能力明显高于EC-NT/Vector 和EC-CR/Antagomir-455-3p(见6-A)。这说明miR-455-3p能够增强ESCC肿瘤细胞的耐药性,而其拮抗剂Antagomir-455-3p能够抑制ESCC肿瘤细胞的耐药性。
2)体内实验:检测体内肿瘤对化疗药物的敏感性
方法:在一组小鼠分别皮下接种1×106 个EC-NT/miR-455-3p和EC-NT/Vector细胞,在第16天时,注射CDDP,一周两次,共三周,检测不同培养时间点的肿瘤体积(如图6-B),而在另一组小鼠皮下接种1×106 个EC-CR细胞,在第13天时,在注射CDDP的同时瘤内注射Antagomir-455-3p或control,一周两次,共三周,检测不同培养时间点的肿瘤体积(图6-C)。
实验结果如图6-B所示,EC-NT-miR-455-3p肿瘤细胞处理的小鼠肿瘤在注射了CDDP之后,肿瘤依旧在增大,而对照组EC-NT-Vector处理的小鼠肿瘤在注射了CDDP之后,肿瘤在逐渐变小(见6-B),这说明miR-455-3p促进了肿瘤的生长,而抑制miR-455-3p的表达可以抑制肿瘤的生长。
上述结果说明了,在CDDP药物治疗ESCC肿瘤中,ESCC肿瘤细胞中miR-455-3p表达量越高,越有利于增强肿瘤的耐药性,促进肿瘤增长,而miR-455-3p拮抗剂Antagomir-455-3p能够增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,抑制肿瘤的生长。进一步说明了miR-455-3p促进了ESCC肿瘤增长通过抑制肿瘤干细胞的分化和增强肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。
综上所述,体内和体外的功能性研究分析表明,miR-455-3p能够促进食管鳞状细胞癌细胞的生长和转移,Antagomir-455-3p则抑制了食管鳞状细胞癌细胞的生长和转移。更重要的是,Antagomir-455-3p能够促进食管鳞状细胞癌干细胞分化和其对化疗药物的敏感性。Antagomir-455-3p可抑制肿瘤干细胞相关生物标志物的表达。在ESCC病人中加入Antagomir-455-3p的药物治疗,可以促进ESCC对化疗药物的敏感性,达到靶向治疗的功效。
实施例5 miR-455-3p 的靶基因分析
1. 软件预测分析miR-455-3p作用于STAT3、Wnt/β-catenin和TGFβ/Smad的多个负调控基因
方法:利用publicly available algorithms (TargetScan6.2 和miRanda),预测结果表明miR-455-3p可能作用于PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A这8个基因mRNA的3'UTR发挥作用。
PTPN9、PIAS3、SOCS3为STAT3的负调控基因;DKK3、GSK3β为Wnt/β-catenin的负调控基因;SMURF1、NEDD4L、PPM1A为TGFβ/Smad的负调控基因。miR-455-3p可能通过结合到PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A这8个基因的3’UTR从而抑制了其表达,从而激活STAT3、Wnt/β-catenin和TGFβ/Smad信号通路促进肿瘤的恶性发展。
结果:TargetScan 网站预测结果如图7-A所示,miR-455-3p可能与PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A这8个基因mRNA的3'UTR结合。
结果分析:miRNAs已经被证明在肿瘤进程中扮演着一个重要的角色,其主要通过结合到多种靶向mRNAs的3’UTR从而抑制mRNAs的翻译,降低其蛋白表达水平。因此,PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A这8个mRNAs的3’UTR结合,抑制这8个基因的mRNAs的翻译,从而激活了STAT3、Wnt/β-catenin和TGFβ/Smad信号通路(见图7-A)。
2. miRNPs免疫共沉淀检测miR-455-3p与靶基因相互结合
方法:将HA-Ago1转染到EC-NT/miR-455-3p和EC-NT/Vector细胞中,培养24h后用anti-HA抗体进行Ago1的免疫共沉淀,进一步分离提取与Ago1组成的RISC复合体结合的mRNA。运用RT-qPCR分析免疫共沉淀后mRNA中PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A这8个基因的表达水平,从而进一步证明高表达miR-455-3p可促进RISC复合体靶向这8个基因,调控其表达。
结果:如图7-B所示,相比对照组EC-NT/Vector,高表达miR-455-3p的细胞中Ago1结合的PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的mRNA量明显增多,说明高表达miR-455-3p的细胞中8种靶基因PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的mRNA与RISC复合体结合明显增加。
结果分析:实验结果显示miR-455-3p能够介导RISC复合体与基因PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的mRNA结合,使相关基因蛋白表达下调。
3. 蛋白免疫印迹实验检测靶蛋白表达水平
蛋白免疫印迹实验检测高表达miR-455-3p或沉默miR-455-3p对食管鳞状细胞癌EC-NT、 EC-CR中PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A这9个蛋白的表达影响。
方法:分别提取EC-NT/miR-455-3p细胞,对照组EC/NT-Vector细胞, EC-CR/Antagomir-455-3p以及对照组EC-CR/Antagomir-ctrl细胞的总蛋白;应用SDS-PAGE电泳分离蛋白后,将蛋白转到硝酸纤维素膜上,脱脂牛奶封闭蛋白;用分别与PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A这8个蛋白特异性结合的单克隆抗体(一抗)与其充分结合后,再用与一抗特异性结合的二抗与其结合后,进行荧光显影,定影;将图片扫描并定量分析。
上述方法中,EC-NT细胞分别稳定表达miR-455-3p载体质粒、对照载体质粒pMSCV-retro-puro;EC-CR细胞分别瞬转Antagomir-455-3p和Antagomir-ctrl。转染48h后提取细胞总蛋白,检测靶蛋白PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的蛋白表达水平。
结果:如图7-C所示,与对照组相比,EC-NT/miR-455-3p的细胞中可明显下调靶蛋白PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的表达水平。另外,与对照组相比,miR-455-3p沉默的细胞EC-CR/Antagomir-455-3p可明显上调靶蛋白PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的表达水平。
结果分析:高表达miR-455-3p可明显下调靶蛋白PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的表达水平,另外,沉默miR-455-3p的表达可明显上调靶蛋白PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的表达水平,从而抑制了Wnt/β-catenin、STAT3和TGFβ/Smad信号通路。
3、双荧光素酶活性检测
方法:设计引物分别扩增PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的mRNA 3'UTR以及3'UTR-mut序列(过表达的基因的3'UTR序列被突变),并分别将其连接到pGL3质粒中荧光素酶基因的3'UTR位置,获得重组质粒。再将所获得的重组质粒分别转染EC-NT、EC-CR,即实验组细胞EC-NT/miR-455-3p、EC-CR/antagomir-455-3p、及对照组细胞EC-NT/Vector和EC-CR /antagomir-ctrl,培养一定时间后用酶标仪检测荧光素酶的表达情况。
结果:如图7-D所示运用酶标仪进行荧光素水平的检测,结果表明高表达miR-455-3p显著抑制荧光素酶的表达。反之,沉默miR-455-3p上调荧光素酶的表达。
结果分析:运用酶标仪进行吸光度的检测发现高表达miR-455-3p的细胞中荧光素酶的表达降低,而转入antagomir-455-3p的细胞中荧光素酶的表达升高。结果证实,miR-455-3p通过作用于靶基因PTPN9、PIAS3、SOCS3、DKK3、GSK3β、SMURF1、NEDD4L、PPM1A的mRNA的3'UTR元件调控基因的表达。
为本领域的专业技术人员容易理解,以上所述仅为本发明专利的较佳实施例,并不用以限制本发明,凡本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均落在本发明要求的保护范围之内。
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<160> 9
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<212> DNA
<213> 人工序列
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augggcauau acacuugccu caaggccuau gucauc 96
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<213> 人工序列
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gcaguccaug ggcauauaca c 21
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<211> 44
<212> DNA
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ctcaactggt gtcgtggagt cggcaattca gttgaggtgt atat 44
Claims (10)
1.miR-455-3p作为食管鳞状细胞癌检测靶点的应用。
2.一种食管鳞状细胞癌的检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒中含有能够定量检测miR-455-3p的试剂。
3.根据权利要求2所述的一种食管鳞状细胞癌的检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列。
4.根据权利要求3所述的一种食管鳞状细胞癌的检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列5’-GCAGTCCATGGGCATATACAC-3’ (SEQ ID NO:1)和5’-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’ (SEQ ID NO:2)。
5.miR-455-3p作为食管鳞状细胞癌预后靶点的应用。
6.一种食管鳞状细胞癌的预后诊断试剂盒,其特征在于:该试剂盒中含有能够定量检测miR-455-3p的试剂。
7.根据权利要求6所述的一种食管鳞状细胞癌的预后试剂盒,其特征在于:该试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列。
8.根据权利要求7所述的一种食管鳞状细胞癌的预后试剂盒,其特征在于:该试剂盒中含有实时荧光定量检测miR-455-3p的引物序列5’-GCAGTCCATGGGCATATACAC-3’ (SEQ ID NO:1)和5’-ACTGGTGTCGTGGAGTCGG-3’ (SEQ ID NO:2)。
9.一种治疗食管鳞状细胞癌的药剂,其特征在于:该药剂中含有抑制miR-455-3p表达的试剂。
10.根据权利要求9所述的药剂,其特征在于:所述抑制miR-455-3p表达的试剂选自miR-455-3p的拮抗剂Antagomir、miR-455-3p的反义链中的至少一种。
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