CN103768601A - 抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法。具体地，miR-155表达的显著升高与动脉粥样硬化的严重程度呈现正向相关联，miR-155在动脉粥硬化小鼠（ApoE^-/-/C57BL/6J）的腹腔巨噬细胞和血清中表达显著升高，oxLDL能特异性诱导小鼠的腹腔巨噬细胞表达和分泌miR-155；在oxLDL诱导的巨噬细胞中，miR-155表达量提高能促进脂质吞噬和活性氧生成；miR-155抑制剂可以显著抑制小鼠腹主动脉的斑块形成；miR-155是动脉粥样硬化疾病治疗一个重要靶点，miR-155抑制剂可以用于预防和治疗动脉粥样硬化。

Description

抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明涉及抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法。

背景技术

心血管疾病目前已经逐渐成为危害人类生命的头号杀手，对心血管疾病的机制的研究一直是生命科学研究的热点问题。动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）是心脑血管系统的常见疾病，是由脂质沉积、平滑肌细胞增殖和钙化而引起的一种以动脉损伤为特征的疾病；其表现为脂质和坏死组织的聚集，因此往往认为动脉粥样硬化是退行性病变。现在认为，动脉粥样硬化病变是多因素协同作用的结果，首先，巨噬细胞被招募，并附着于在主动脉内壁并转化为泡沫细胞；进一步地，胶原、弹性纤维及蛋白质多糖等结缔组织基质和平滑肌细胞增生；最后，脂质（主要含胆固醇结晶及游离胆固醇）和结缔组织在动脉壁大量积累形成质核。

目前的研究表明，巨噬细胞在动脉粥样硬化过程中发挥了重要的作用。在动脉粥样硬化形成早期，低密度脂蛋白被氧化成氧化的低密度脂蛋白（oxLDL），oxLDL通过扩散的方式进入血管内壁，并招募血液中循环的单核细胞。循环的单核细胞被这些oxLDL活化并形成巨噬细胞，这些巨噬细胞吞噬大量的oxLDL，分化成泡沫化的细胞，泡沫化细胞将释放大量的炎症因子（如：TNF-α，MIF，IL-6等炎症因子）。这些炎症因子进一步招募更多的单核细胞分化成泡沫化细胞堆积在血管内层形成动脉粥样硬化斑，然而，巨噬细胞转化为泡沫细胞的分子机制尚未被完全的理解。

microRNAs（miRNAs）是一类长度在19~25bp大小的非编码RNA，它们的主要功能是在转录后水平调控基因的表达。最近的研究表明大量的miRNAs存在于各种生物体液中，例如血液中。已经发现几个mRNAs在固有免疫系统有着重要的功能，例如miR-125b，miR-146。

目前尚不清楚microRNA在动脉粥样硬化中扮演什么样的作用，因此本领域迫切需要研究MicroRNA在预防和治疗动脉粥样硬化中的作用及其应用。

发明内容

本发明的目的就是提供一种抑制micro-RNA155用于预防和治疗动脉粥样硬化的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种micro-RNA155抑制剂的用途，用于制备预防或治疗动脉粥样硬化的药物组合物。

在另一优选例中，所述的micro-RNA155具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述micro-RNA155抑制剂选自下组：micro-RNA155抗体、micro-RNA155结合蛋白、micro-RNA155小分子抑制剂、micro-RNA155拮抗剂、AntagomiR-155、micro-RNA155海绵、或其组合。

在另一优选例中，所述的AntagomiR-155为具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或其衍生物或修饰物。

在另一优选例中，所述的修饰包括（但不限于）：甲基化修饰、甲氧基乙基修饰、烃基修饰、胆固醇修饰、糖基化修饰（如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等）、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰（如氟代修饰等）、核酸修饰（如“TT”修饰等）、硫代磷酸化修饰、锁核苷酸修饰等。

在另一优选例中，对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的一个或多个碱基进行甲基化修饰。

在另一优选例中，对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5′端和/或3′端进行胆固醇修饰。

在另一优选例中，对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5′端和/或3′端的一个或多个核苷酸进行硫代磷酸化修饰。

在本发明的第二方面，提供了一种可用于预防或治疗动脉粥样硬化的药物组合物，所述的药物组合物包括：药学上可接受的载体；和有效量活性成分，所述的活性成分为micro-RNA155抑制剂。

在另一优选例中，所述药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。

在另一优选例中，所述micro-RNA155抑制剂选自下组：micro-RNA155抗体、micro-RNA155结合蛋白、micro-RNA155小分子抑制剂、micro-RNA155拮抗剂、AntagomiR-155、micro-RNA155海绵、或其组合。

在另一优选例中，所述的AntagomiR-155为具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列或其衍生物或修饰物。

在另一优选例中，所述的修饰包括（但不限于）：甲基化修饰、甲氧基乙基修饰、烃基修饰、胆固醇修饰、糖基化修饰（如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等）、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰（如氟代修饰等）、核酸修饰（如“TT”修饰等）、硫代磷酸化修饰、锁核苷酸修饰等。

在另一优选例中，对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的一个或多个碱基进行甲基化修饰。

在另一优选例中，对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5′端和/或3′端进行胆固醇修饰。

在另一优选例中，对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5′端和/或3′端的一个或多个核苷酸进行硫代磷酸化修饰。

在本发明的第三方面，提供了一种筛选用于预防或治疗动脉粥样硬化潜在物质的方法，包括步骤：

(1)分别向检测体系中加入待检测的物质或阴性对照物；和

(2)分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中miR-155的表达水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的miR-155的表达水平降低，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。

在另一优选例中，所述的检测体系是细胞体系。

在另一优选例中，所述的检测体为巨噬细胞体系。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：

(3)：分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平降低，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。

在另一优选例中，如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平降低幅度≥5%，较佳地≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。

在本发明的第四方面，提供了一种预防或治疗动脉粥样硬化的方法，给需要的对象施用第二方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的药物组合物包括活性成分：AntagomiR-155。

在本发明的第五方面，提供了一种诊断/检测动脉粥样硬化的方法，包括步骤：分别检测待测样本和阴性对照样本miR-155的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-155的表达水平提高，则是潜在的动脉粥样硬化疾病患病样本。

在另一优选例中，所述的待测样本为血液样本。

在另一优选例中，所述的提高是指：与阴性对照样本相比，相应miRNA-155的表达水平的提高幅度≥5%，较佳地≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示：miR-155在动脉粥样硬化小鼠的血清中升高；图1A：实时定量PCR检测正常饮食的野生型小鼠（Wide-Type ND）和ApoE^-/-小鼠（ApoE^-/-ND），高脂饮食的野生型小鼠（Wide-Type HFD）和ApoE^-/-小鼠（ApoE^-/-HFD）血清中miRNAs表达；图1B：实时定量PCR检测正常饮食ApoE^-/-小鼠和高脂饮食ApoE^-/-小鼠腹腔巨噬细胞miR-155的表达；图1C，图1D：实时定量PCR分析巨噬细胞和它的培养基上清中miRNAs的表达；图1E、图1F：将oxLDL在不同的时间和剂量加入到Raw264.7细胞中，实时定量PCR检测miR-155的表达；图1G：oxLDL在不同时间刺激Raw264.7细胞，实时定量PCR分析BIC（pri-mir-155）和miR-155的表达动力学。

图2显示：oxLDL诱导的小鼠巨噬细胞中miR-155调控脂质吸收和活性氧释放；图2A：不同剂量的miR-Ctrl、miR-155、anti-Ctrl或anti-miR-155寡核苷酸分别转染Raw264.7细胞，48小时后加入Di-oxLDL孵育6小时，使用激光共聚焦显微镜检测巨噬细胞对脂质的吸收，；图2B和图2C：使用流式细胞仪分析巨噬细胞对脂质吞噬结果；图2D：将miR-ctrl、miR-155、anti-ctrl和anti-mir-155分别转染Raw264.7细胞，之后加入oxLDL刺激6小时，最后加入DCFH-DA（10μM）孵育20分钟，使用荧光检测仪检测细胞内活性氧释放。

图3：oxLDL诱导的人巨噬细胞中miR-155调控脂质吸收和活性氧释放；图3A：将miR-Ctr、miR-155、anti-Ctrl或anti-mir-155分别转染THP1细胞，48小时后实施定量PCR，检测miR-155的表达；图3B：将miR-Ctrl、miR-155、anti-Ctrl或anti-mir-155分别转染THP1细胞，48小时后加入PMA（100nM/mL）孵育16小时，之后加入DiI-oxLDL刺激6小时，激光共聚焦显微镜检测细胞的脂质吞噬；图3C：将miR-Ctrl、miR-155、anti-Ctrl或anti-mir-155分别转染THP1细胞，检测细胞内活性氧的浓度。

图4：antagomiR-155抑制小鼠的动脉粥样硬化形成；图4A：在antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE^-/-小鼠腹腔中分离巨噬细胞，实时定量PCR检测miR-155的表达；图4B：从antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE^-/-小鼠腹腔中分离巨噬细胞，使用oil red O染色的方法检测巨噬细胞的脂质吞噬；图4C：从antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE^-/-小鼠腹腔中分离血液上清，检测血清中的TNF-α和IL-6；图4D：分离antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE^-/-小鼠的胸腹主动脉做油红染色，并对油红染色面积进行统计（image-pro plus 6.0）；图4E：对antagomiR-155和antagomiR尾静脉注射的ApoE^-/-小鼠弓主动脉冰冻切片染色，并对切片油红染色并统计染色面积（image-proplus 6.0）。

图5：在冠心病病人的CD14⁺单核细胞中检测miR-155和炎症因子的表达模式：图5A：分离病人和正常人的CD14⁺单核细胞，使用实时定量PCR检测miR-155的表达；图5B-D：使用实时定量PCR的方法检测病人和正常人的单核细胞中的HBP1、TNF-α和IL-6mRNA¹⁴表达；图5E-图5F，使用实时定量PCR检测所有人的CD14⁺单核细胞中TNF-α和IL-6mRNA的表达，并将TNF-α，IL-6表达水平与miR-155的表达做关联分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现并提出micro-RNA155在预防和治疗动脉粥样硬化中的应用。具体地，miR-155在动脉粥样硬化小鼠的血清中升高，oxLDL在巨噬细胞中显著活化可miR-155的表达；miR-155在oxLDL诱导的巨噬细胞中增强脂质吞噬和活性氧生成；降低miR-155的水平可以抑制小鼠动脉粥样硬化的形成。miR-155还可以作为筛选预防和治疗动脉粥样硬化的靶点。在此基础上完成了本发明。

miRNA-155及其前体

本发明提供了涉及预防和治疗动脉粥样硬化相关的micro-RNA 155。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有19~25个核苷酸(nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA (Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环（发夹）结构，所述的茎环结构长度一般在50~100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成成熟的miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA-155是指：miRNA-155或经修饰的miRNA-155衍生物、和与miRNA-155功能相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物。在本发明的一个优选例中，miRNA-155的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1（5′-UUAAUGCUAAUUGUGAUAGGGGU-3′）所示。

在另一优选例中，所述的微小RNA  （miRNA）来源于人或非人哺乳动物。

所述的“与miRNA-155功能相同或基本相同”是指保留了miRNA-155的≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％的调节动脉粥样硬化的功能。

本发明还包括miRNA-155变体和衍生物，本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA-155进行修饰，修饰方式包括（但不限于）：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰（如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等）、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰（如“TT”修饰）等。

根据本发明所提供的miRNA-155序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。

由此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA-155，所述的前体miRNA-155可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miRNA-155的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III

式III中，Seq正向、Seq反向和X的定义如上述；

||表示在Seq正向和Seq反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA-155，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

miRNA-155抑制剂

如本文所用，术语“miRNA-155抑制剂”是指抑制miRNA-155表达量或减少（消除）miRNA-155作用的物质的统称。

在本发明的一个优选的实施例中，miRNA-155抑制剂是miRNA-155海绵。“miRNA-155海绵”或“miRNA-155sponge”可以互换使用，都是指一种吸收目标miRNA-155的DNA序列，使得目标miRNA-155无法与天然靶点结合，起到调节天然靶点的目的。

在本发明的一个优选例中，miRNA-155抑制剂是AntagomiR-155。miRNAantagomir是经过特殊化学修饰的miRNA拮抗剂，其化学本质是一段经修饰的RNA序列。它通过与体内的成熟miRNA-155强竞争性结合，阻止miRNA-155与其靶基因mRNA的互补配对，抑制miRNA发挥作用。通常antagomir在Ago2的剪切位点设计非配对碱基或对寡居核苷酸进行一定形式的修饰，增强其抵抗降解的能力。

本发明提供了一种有效的预防或治疗动脉粥样硬化的AntagomiR-155，其基本的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示：

5′-ACCCCUAUCACAAUUAGCAUUAA-3′。

本发明还包括AntagomiR-155的变体和修饰形式，本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对AntagomiR-155进行修饰，所述的修饰包括（但不限于）：甲基化修饰、甲氧基乙基修饰、烃基修饰、胆固醇修饰、糖基化修饰（如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等）、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰（如氟代修饰等）、核酸修饰（如“TT”修饰等）、硫代磷酸化修饰、锁核苷酸修饰等。

在另一优选例中，对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的一个或多个碱基进行甲基化修饰。

在另一优选例中，对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5′端和/或3′端进行胆固醇修饰。

在另一优选例中，对SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列的5′端和/或3′端的一个或多个核苷酸进行硫代磷酸化修饰。

在本发明的一个优选例中，对5′-ACCCCUAUCACAAUUAGCAUUAA-3′的一个或多个碱基进行甲基化修饰，对5′和3′末端的多个核苷酸进行硫代磷酸化修饰，并在3′端进行胆固醇修饰。

本发明还涉及AntagomiR-155的阴性对照antagomiR，其RNA序列如SEQ IDNO：3所示：5’-GGCAAGACGAAACGAGACGACAG-3’（SEQ ID NO：3）。

在本发明的一个优选例中，对5’-GGCAAGACGAAACGAGACGACAG-3’的一个或多个碱基进行甲基化修饰，对5′和3′末端的多个核苷酸进行硫代磷酸化修饰，并在3′端进行胆固醇修饰。

本发明提供的所述miRNA-155抑制剂可以用于制备预防或治疗动脉粥样硬化的药物组合物。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体和有效量活性成分：miRNA-155抑制剂。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备预防或治疗动脉粥样硬化的药物，或预防或治疗动脉粥样硬化。

药物筛选

本发明还提供了一种筛选用于预防或治疗动脉粥样硬化潜在药物的方法，包括步骤：分别向检测体系中加入待检测的药物或阴性对照物；分别检测加入了待检测的药物的样本和加入了阴性对照物的样本中miR-155的表达水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的药物的样本的miR-155的表达水平降低，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的药物。

在本发明的一个优选例中，所述的检测体系是细胞体系；优选巨噬细胞体系。优选地，所述方法还包括步骤：分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平降低，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。

如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平降低幅度≥5%，较佳地≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。

本发明的主要优点包括：

(1)miR-155表达的显著升高与动脉粥样硬化的严重程度呈现正向相关联；

(2)oxLDL（动脉粥硬化的炎症因子）能特异性诱导小鼠的腹腔巨噬细胞表达和分泌miR-155；

(3)在oxLDL诱导的巨噬细胞中，miR-155表达量提高能促进脂质吞噬和活性氧生成；

(4)miR-155抑制剂可以显著抑制小鼠腹主动脉的斑块形成；

(5)miR-155是动脉粥样硬化疾病治疗一个重要靶点，miR-155抑制剂可以用于预防和治疗动脉粥样硬化；

(6)miR-155是筛选能治疗或预防动脉粥样硬化疾病药物的潜在靶点。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

细胞株

Raw264.7细胞：购自上海生科院细胞库

THP1细胞：购自上海生科院细胞库

动物实验

雄性C57BL/6J小鼠购自上海斯莱克动物实验中心。

ApoE-/-小鼠购自南京大学模式动物中心，ApoE^-/-小鼠为ApoE基因剔除小鼠，其ApoE-/-小鼠模型表现出异常高血脂症状，在3月龄时即出现动脉脂肪堆积，随着月龄增加将出现大量类似动脉粥样硬化前期的损伤，17月龄时小鼠脑内将出现脂瘤性纤维瘤，同时还有脂质小球和泡沫细胞，小鼠的学习记忆能力出现障碍。

动物饲养条件：温度22±2℃，相对湿度为55%±5%，光照时间为12小时/每天。

高脂饲料（21%的脂肪，1.25%的胆固醇）购买自上海斯莱克动物实验中心，高脂饲料喂养ApoE^-/-小鼠8-10周，小鼠主动脉形成明显动脉斑快。动脉粥样硬化模型造成后处死小鼠，分离巨噬细胞和血清抽提总RNA保存于-80℃。

从小鼠中分离泡沫细胞和腹腔巨噬细胞

取6周龄的ApoE-/-雄性小鼠（n=5），分别使用高脂饲料和正常饲料喂养10周，然后使用Takahashi et al的说明书（Takahashi N,Kawada T,Goto T,KimCS,Taimatsu A,Egawa K,Yamamoto T,Jisaka M,Nishimura K,Yokota K,YuR,Fushiki T.Abietic acid activates peroxisome proliferator-activatedreceptor-gamma(PPAR gamma)in RAW264.7macrophages and 3T3-L1adipocytes to regulate gene expression involved in inflammation and lipidmetabolism.FEBS Lett.2003;550:190-194.）分离腹腔巨噬细胞。

具体步骤如下：将4%硫乙醇酸盐肉汤2mL（购自sigma公司）注射到小鼠腹腔，3天后将小鼠断颈处死后，使用含有10%FBS（购自Hyclone公司）1640培养基10mL冲洗腹腔，将巨噬细胞分离出来，计数，将细胞稀释成1.0×10⁶/mL铺板，在37℃孵育3小时，洗去非粘附细胞，保留粘附细胞，即为泡沫化巨噬细胞。保存泡沫化巨噬细胞，用于下一步的western blot，实时定量PCR或油红染色分析。

腹腔巨噬细胞直接分离与8周龄的C57BL/6小鼠，分离策略如上所述，分离完成后加入oxLDL孵育24小时，取上清和细胞抽提总RNA，以进行后面的实时定量PCR分析。

小鼠血清的收集与储存

将小鼠麻醉处死，收集血液，存放于EDTA管。在1小时内将血液离心（4℃，800g，10分钟），离心后的血清转移到新的RNase/DNase-free Axygen管，第二次离心（4℃，16000g，10分钟）去除坏死的细胞碎片，将血液上清转移到新的RNase/DNase-free Axygen管，保存于-80℃。

RNA提取

使用TRIzol（MRC，TR126）抽提小鼠的血清和细胞上清的总RNA，具体步骤如下：取100μl小鼠血清加入0.75ml TRIzol并补充20μl的乙酸（5mol/L），在氯仿加入之前5μl合成的人工合成的miRNA类似物，50pmol/L）作为内参，氯仿清洗完成后加入异丙醇沉淀RNA（-80℃，2小时），最后RNA沉淀用RNase-free的水溶解，放于-80℃。

实时定量PCR

将来自于血清，组织，细胞的总RNA用M-MLV逆转录酶合成cDNA，所用的引物为miRNAs特异颈环引物，U6特异引物，mRNA随机引物。cDNA产物用特定基因引物在实时定量PCR仪上检测，所用荧光试剂为SYBR Green（TOYOBO Co）。基因的相对表达使用ΔΔCt方法分析。microRNA以U6为内参，mRNA以actin为内参。

Dil-oxLDL吞噬和活性氧释放检测

FACS和激光共聚焦显微镜分析巨噬细胞对Dil-oxLDL的吞噬。步骤如下：分别将siCtrl、miR-155（SQ）、siHBP1、siYY1、anti-Ctrl、anti-mir-155和HBP1表达质粒转染到Raw264.7细胞或THP 1细胞，48小时后加入20ug/mL Dil-oxLDL（购自YiYuan biotech公司）在37℃孵育6小时，使用PBS洗三次，然后进行FACS(BD Biosciences)或激光共聚焦图像(Leica SP5II)分析。

细胞内活性氧浓度通过二氯荧光素双醋酸盐（DCFH-DA）检测，具体步骤如下：将siCtrl、miR-155、siHBP1、anti-Ctrl、anti-mir-155分别转染到Raw264.7细胞或THP1细胞，24小时后加入PMA(100nm/mL)诱导16小时，然后加入oxLDL（购自YiYuan biotech公司）孵育24小时，最后加入10uM DCFH-DA在37℃孵育20分钟。荧光密度使用laser-scanning VARIOSKAN FLAS(Thermo scientific)检测。

antagomiR-155注射ApoE^-/-小鼠动物实验

AntagomiR-155和antagomiR购买自广州锐博生物科技有限公司。antagomir-155的RNA序列为：ACCCCUAUCACAAUUAGCAUUAA（SEQ IDNO：2）。作为实验对照antagomiR的RNA序列为：5’-GGCAAGACGAAACGAGACGACAG-3’（SEQ ID NO：3）。

这两条RNA序列的修饰形式为：核苷酸全部甲基化修饰，3’末端连接胆固醇，5’末端两个位点硫代磷酸（PS）修饰，3’末端4个位点PS修饰。

每次每只小鼠注射antagomiR和antago-miR-155，剂量25mg/kg,尾静脉注射。

六周ApoE-/-雄性成年鼠喂食高脂饲料，喂食一周后尾静脉注射antagomiR或antagomiR-155,前两次为每三天注射一次（25mg/kg），之后为每周一次，总注射时间为10周，注射完成之后继续高脂饲料喂食一周。实验总体时间为12周。

在另一实验中，六周雄性成年鼠喂食高脂饲料，喂食八周后，小鼠形成明显的动脉斑，对形成动脉斑的小鼠，尾静脉注射antagomiR或antagomiR-155，前两次为每三天注射一次，之后为每周一次，总注射时间为4周。

油红染色

心脏固定过夜后剥离外围结缔组织，梯度蔗糖脱水（10%，20%，30%)，OCT包埋，超低温速冻。从主动脉瓣开始以50微米为间距保存5张厚度为6微米的切片。油红O储存液（0.5g油红溶于100ml异丙醇）与去离子水进行3：2稀释，混匀，定性滤纸过滤，室温静置10分钟后作为油红O染色工作液。切片用60%异丙醇浸泡10分钟，油红O染色工作液室温染色30分钟，60%异丙醇分化10秒数次至背景呈透明状，PBS浸泡5分钟，苏木精复染，吸干标本边缘水分，甘油明胶封片，拍照。结果用IPP6.0分析。

主动脉整体染色

剥离血管外结缔组织，沿主动脉弓内缘剪开主动脉至髂总动脉处，沿主动脉弓外缘剪至胸主动脉起始处，同时平分头臂干、颈总动脉和左锁骨下动脉。将主动脉在60%异丙醇中浸泡10分钟，转移入油红O工作液室温染色2小时，用60%异丙醇分色数次至动脉壁呈白色，PBS清洗数次，用细针将主动脉摊开固定于黑色硬质防水纸上，拍照。结果用IPP6.0分析。

泡沫细胞形成检测

细胞培养于含10%FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的DMEM内，置于5%CO₂37℃培养箱中，每2天更换1次培养液。吸弃培养基，D-PBS冲洗2次，加入含有oxLDL（50μl/ml）及5%PBS（胎牛血清）的DMEM培养24小时。D-PBS清洗2次，4%多聚甲醛室温固定30分钟，D-PBS清洗2次，60%异丙醇浸泡5秒钟，油红O染色工作液室温染色30分钟，60%异丙醇分色5秒3次，苏木精复染5分钟，盐酸酒精分化，稀氨水返蓝，拍照。

统计分析

所有实验至少3次重复。如无特别说明数据表示均为平均值±标准差，P<0.05表示差异有统计学意义。

实施例1

为了探索microRNAs是否与动脉粥样硬化的病理相关，发明人首先使用高脂饲料喂养ApoE^-/-和野生型小鼠，正常饲料喂养ApoE^-/-和野生型小鼠10周，获取小鼠血液，通过分级离心获取上清。进一步使用Trizol试剂抽提血清中的总RNA，应用实时定量PCR检测十四个与心血管疾病相关的microRNAs。

结果表明：喂食高脂饲料的ApoE^-/-小鼠血清中的miR-155表达显著高于喂养正常饲料ApoE^-/-的小鼠，miR-146b-5p的表达次之（图1A）。

实施例2

现有技术已经证明，巨噬细胞在动脉粥样硬化初期通过吞噬脂质形成泡沫细胞扮演重要功能，为了探索血液中的miR-155是否来自于活化的巨噬细胞分泌。发明人在本实施例中，分离高脂饲料喂食的ApoE^-/-小鼠和正常饲料喂食的ApoE^-/-小鼠（n=6）的巨噬细胞，并检测miR-155的表达水平。

结果表明，在高脂饲料喂食小鼠的腹腔巨噬细胞中，miR-155表达显著高于正常饲料喂食小鼠的腹腔巨噬细胞(图1B)。

进一步从野生型小鼠的腹腔分离巨噬细胞，oxLDL处理24小时，使用TRIzol抽提细胞内和细胞分泌到培养基上清中的总RNA，实时定量PCR检测miR-155在细胞和培养基上清中的表达水平。

结果表明：在oxLDL的诱导下，miR-155在细胞和培养基上清中的表达显著升高(图1C、图1D)。

根据上述结果，推测miR-155在血清中的升高可能来源于oxLDL诱导的巨噬细胞分泌。

实施例3

为了进一步检测oxLDL在巨噬细胞中怎样诱导miR-155的表达，发明人在不同的时间点和加入不同剂量的oxLDL，刺激Raw264.7细胞。

结果表明：miR-155在Raw264.7细胞中表达是随时间和剂量增加而显著增加(图1E、图1F)。

为了进一步研究miR-155及其宿主基因BIC（pri-miR-155）表达动力学，使用oxLDL在16小时内的不同时间点刺激Raw264.7细胞。

结果表明：Pri-miR-155的表达在起始快速增加，并在两小时达到顶峰，之后下降；相反miR-155的表达在两小时时仅增加12倍，但在16小时内一直增加，表明oxLDL在转录水平调控miR-155的表达(图1G)。

综上表明，oxLDL在巨噬细胞中诱导miR-155的表达，并且和动脉粥样硬化的形成相关。

实施例4

miR-155在oxLDL诱导的巨噬细胞中增强脂质吞噬和活性氧生成

已知在动脉粥样硬化的发病初期，巨噬细胞吞噬脂质，进而自我活化，释放大量的活性氧，并转化为泡沫细胞，泡沫细胞堆积在血管内壁形成动脉斑。为了探索miR-155在泡沫细胞形成过程中是否参与这两个过程的调控，发明人检测了miR-155在巨噬细胞中是否参与调控脂质吸收。

将不同剂量的miR-Ctrl，miR-155，anti-miR-155或anti-Ctrl寡核苷酸片段转染Raw264.7细胞，之后使用DiI-oxLDL刺激细胞6小时。

结果如下：使用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪检测发现，在oxLDL诱导的巨噬细胞中过表达miR-155，细胞的脂质吸收显著增加；相反，在oxLDL诱导的巨噬细胞中沉默miR-155的表达，细胞的脂质吸收被显著抑制(图2A-图2C)。

为进一步检测miR-155是否在巨噬细胞中参与活性氧释放的调控，使用与上面同样的寡核苷酸片段转染Raw264.7细胞，之后用oxLDL处理6小时。

活性氧检测发现，在Raw264.7细胞中过表达miR-155，显著地增加了细胞内活性氧浓度，而在Raw264.7细胞中敲除miR-155，有效地抑制这个过程(图2D)。

发明人还将miR-Ctrl、miR-155、anti-miR-155和anti-Ctrl寡核苷酸片段转染THP1细胞，之后使用DiI-oxLDL刺激细胞6小时，使用激光共聚焦显微镜进行检测。结果与Raw264.7细胞类似：在oxLDL诱导的巨噬细胞中过表达miR-155，增加了细胞的脂质吸收；在oxLDL诱导的巨噬细胞中沉默miR-155的表达，显著抑制了细胞的脂质吸收(图3A，图3B)。为进一步检测miR-155是否在巨噬细胞中参与活性氧释放的调控，使用与上面同样的寡核苷酸片段转染Raw264.7细胞，之后用oxLDL处理6小时，活性氧检测发现，在Raw264.7细胞中过表达miR-155，显著地增加了细胞内活性氧浓度(图3C)。

这些结果表明，miR-155能够有效促进增强脂质吞噬和活性生成。

实施例5

antagomiR-155抑制小鼠动脉粥样硬化形成

六周雄性成年鼠喂食高脂饲料，喂食一周后尾静脉注射antagomiR或antagomiR-155，前两次为每三天注射一次，之后为每周一次，总注射时间为10周，然后继续高脂饲料喂食一周。在处死小鼠的前一天将高脂饲料移去，过夜饥饿小鼠。第二天将小鼠处死，眼球取血，分离腹腔巨噬细胞，以及分离心脏和腹主动脉。

结果显示，注射antagomiR-155的ApoE^-/-小鼠与注射的antagomiR ApoE^-/-小鼠相比，腹腔巨噬细胞中miR-155的表达显著降低(图4A)，脂质吞噬能力降低(图4B)。

进一步检测血液中的炎症因子变化，结果表明：注射antagomiR-155的ApoE^-/-小鼠血液中TNF-α和IL-6表达水平降低(图4C)。

通过对小鼠血管主动脉斑分析发现，注射antagomiR-155的小鼠腹主动脉的斑块明显减少(图4D)。

对小鼠弓主动脉冰冻切片发现，注射antagomiR-155的小鼠的动脉斑块面积明显降低(图4E)。

这些结果表明，antogomiR-155抑制小鼠血管动脉斑的形成。

实施例6

冠心病病人的单核细胞中miR-155含量升高

为了研究miR-155在冠心病病人中的表达模式，使用美天旎公司的磁珠（CD14⁺）将冠心病病人（n=21）和正常人对照（n=12）CD 14⁺单核细胞分离出来，其中正常人对照年龄显著低于病人组，没有任何疾病记录。

实时定量PCR检测发现，与正常人对照相比，冠心病病人分离的CD14⁺单核细胞中miR-155的表达显著升高(图5A)。

发明人进一步检测了在正常人和冠心病病人CD14+单核细胞中，HBP1、TNF-α、IL-6、IL-17A和IFN-γ的表达，结果表明，HBP1mRNA的表达水平在冠心病病人的CD14+单核细胞中的表达显著降低；相反TNF-α和IL-6mRNA表达水平在冠心病病人的CD14+单核细胞显著增加(图5B-图5D)。进一步对CD14+单核细胞中ITNF-α和IL-6mRNA表达对miR-155表达做线性回归分析，结果发现，这些基因表达同miR-155的表达存在相关性(图5E、图5F)。

上述结果表明，与正常人对照相比在，主动脉瓣狭窄病人的CD14+单核细胞中miR-155表达升高，并且miR-155的表达动脉粥样硬化存在显著相关性。

实施例7

应用antagomiR-155治疗动脉粥样硬化

方法：六周雄性成年鼠喂食高脂饲料，喂食八周后，小鼠形成明显的动脉斑，对形成动脉斑的小鼠，尾静脉注射antagomiR或antagomiR-155，前两次为每三天注射一次，之后为每周一次，总注射时间为4周。在处死小鼠的前一天将高脂饲料移去，过夜饥饿小鼠。第二天将小鼠处死，眼球取血，分离腹腔巨噬细胞，以及分离心脏和腹主动脉。

检测血液中的炎症因子的表达以及通过对小鼠血管主动脉斑分析发现，注射antagomiR-155的小鼠腹主动脉的斑块明显减少。对小鼠弓主动脉冰冻切片发现，注射antagomiR-155的小鼠的动脉斑块面积明显降低。

上述结果表明，antogomiR-155对小鼠血管动脉斑具有显著和良好的治疗作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种micro-RNA155抑制剂的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗动脉粥样硬化的药物组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述micro-RNA155抑制剂选自下组：micro-RNA155抗体、micro-RNA155结合蛋白、micro-RNA155小分子抑制剂、micro-RNA155拮抗剂、AntagomiR-155、micro-RNA155海绵、或其组合。

3.一种可用于预防或治疗动脉粥样硬化的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物包括：

药学上可接受的载体；和

有效量活性成分，所述的活性成分为micro-RNA155抑制剂。

4.如权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述micro-RNA155抑制剂选自下组：micro-RNA155抗体、micro-RNA155结合蛋白、micro-RNA155小分子抑制剂、micro-RNA155拮抗剂、AntagomiR-155、micro-RNA155海绵、或其组合。

5.一种筛选用于预防或治疗动脉粥样硬化潜在物质的方法，其特征在于，包括步骤：

(1)分别向检测体系中加入待检测的物质或阴性对照物；和

(2)分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中miR-155的表达水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的miR-155的表达水平降低，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的检测体系是细胞体系；较佳地为巨噬细胞体系。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：

(3)：分别检测加入了待检测的物质的样本和加入了阴性对照物的样本中巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平；如果与加入了阴性对照物的样本相比，加入了待检测的物质的样本的巨噬细胞脂质吞噬和/或活性氧的释放水平降低，则是潜在的预防或治疗动脉粥样硬化疾病的物质。

8.一种预防或治疗动脉粥样硬化的方法，其特征在于，给需要的对象施用权利要求3所述的药物组合物。

9.一种诊断/检测动脉粥样硬化的方法，其特征在于，包括步骤：

分别检测待测样本和阴性对照样本miR-155的表达水平，如果与阴性对照样本相比，待测样本的miR-155的表达水平提高，则是潜在的动脉粥样硬化疾病患病样本。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述的提高是指：与阴性对照样本相比，相应miRNA-155的表达水平的提高幅度≥5%，较佳地≥10%，较佳地≥20%，较佳地≥50%，更佳地≥80%，最佳地≥100%。

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