CN103263676A

CN103263676A - 一种应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法

Info

Publication number: CN103263676A
Application number: CN2013100506659A
Authority: CN
Inventors: 魏敏杰; 何苗; 马孟涛; 赵琳; 白雪峰; 于兆进; 孙明立; 陈秋晨
Original assignee: 魏敏杰
Priority date: 2013-02-07
Filing date: 2013-02-07
Publication date: 2013-08-28

Abstract

本发明提供一种治疗肿瘤药物领域，特别涉及一种miR-487a在逆转乳腺癌细胞耐药中的应用。该方法包括：（1）利用miR-487a的模拟物miR-487amimic，抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中的BCRP表达与药物转运功能，增加对BCRP转运底物盐酸米托蒽醌MX的敏感性；（2）利用miR-487a的模拟物miR-487aagmir脂质体，靶向抑制MCF-7/MX诱导的乳腺癌裸鼠移植瘤内BCRP的表达，增加在体瘤细胞对MX的药物敏感性；（3）利用miR-487a的抑制剂miR-487ainhibitor上调药物敏感细胞MCF-7的BCRP表达和药物转运功能，增加对MX的耐药性。本发明的目的在于应用miR-487a逆转乳腺癌细胞耐药的问题。

Description

一种应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法

技术领域：

本发明提供一种治疗肿瘤药物领域，特别涉及一种miR-487a在逆转乳腺癌细胞耐药中的应用。

背景技术：

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，严重影响着妇女的身心健康甚至危及生命。化疗是乳腺癌治疗的常用方法，但化疗过程中出现的耐药问题严重影响了临床疗效和患者预后。与乳腺癌耐药作用密切相关的乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistant protein,BCRP)是从耐药的人乳腺癌细胞株MCF7/AdrVP中用mRNA指纹分析法分离出来的跨膜半转运蛋白。其基因定位于人染色体4q22，由ABCG2基因编码，2.4kb mRNA翻译的655个氨基酸残基构成，含有一个ATP结合域和一个疏水性跨膜结构域，是继多药耐药相关蛋白(MRP)、P糖蛋白(P-gp)和肺耐药蛋白(LRP)之后，肿瘤多药耐药机制研究中的又一热点蛋白。BCRP通过水解ATP供能将转运底物（化疗药物）从细胞内逆浓度梯度泵到细胞外，使乳腺癌细胞内米托蒽醌（MX）、拓扑替康等浓度下降，从而导致细胞对药物抵抗、诱导耐药性产生。

近年来微小RNA(microRNA，miRNA)在逆转耐药中的作用受到相关学者的关注。miRNA是长度约22nt的内源性单链的非蛋白编码RNA，在个体发育、细胞分化、增殖、凋亡等生理活动中以及在肿瘤发生、发展等病理过程中起重要调控作用。miRNA一般通过与目标mRNA分子的3’端非编码区域（3’UTR）特异结合调节基因的表达。由于BCRPmRNA-3’UTR长度约为2kb(Genebank:accession no.NM_004827;UTR数据库:UTR database entry UTR:3HSA117529)，远长于人类mRNAs-3’UTR的平均长度700bp，因此，提示BCRPmRNA-3’UTR可能存在miRNA调控BCRP表达的作用靶点。

一些研究证实某些miRNAs可通过作用于BCRPmRNA-3’UTR调节BCRP的表达。Wang等在胰腺癌细胞的研究发现miR-520h能够下调BCRP的蛋白表达水平；To KK等在结肠癌细胞的研究结果也证实了这一点：miR-519c具有降低SI结肠癌细胞内源性BCRP转录及蛋白表达作用；Pan等研究发现在耐药的乳腺癌细胞MCF-7/MX100中转染miR-328或miR-519c后BCRP的蛋白表达水平明显下降。可见miRNA对靶向调控BCRP参与乳腺癌耐药起到了关键的作用。

本发明中我们应用生物学信息分析可得到，BCRPmRNA-3’UTR存在miR-487a调控BCRP表达的作用靶点，但是miR-487a是否对BCRP的表达进行调节以及由此而逆转乳腺癌细胞的耐药目前尚不清楚。因此，本发明在乳腺癌药物敏感细胞MCF-7（BCRP低表达）和耐药细胞MCF-7/MX（BCRP高表达）中，分别转染miR-487a inhibitor和miR-487a mimic，构建miR-487a沉默表达和过表达的乳腺癌细胞模型，及对裸鼠进行MCF-7/MX细胞皮下注射，构建在体移植瘤模型，MX处理上述模型后，观察细胞及小鼠对MX的敏感性、BCRP的表达及细胞内MX含量变化，探讨离体和在体水平时miRNA-487a对乳腺癌细胞耐药性的影响及可能机制。

发明内容：

本发明所要解决的技术问题是提供一种应用miR-487a逆转乳腺癌细胞耐药的方法。

本发明是通过以下技术方案来实现的：

一种应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，所述方法包括：

（1）利用miR-487a的模拟物miR-487a mimic，抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中的BCRP表达与药物转运功能，增加对BCRP转运底物盐酸米托蒽醌MX的敏感性；

（2）利用miR-487a的模拟物miR-487a agmir脂质体，靶向抑制MCF-7/MX诱导的乳腺癌裸鼠移植瘤内BCRP的表达，增加在体瘤细胞对MX的药物敏感性；

（3）利用miR-487a的抑制剂miR-487a inhibitor上调药物敏感细胞MCF-7的BCRP表达和药物转运功能，增加对MX的耐药性。

步骤（1）中miR-487a模拟物miR-487a mimic为包含miR-487a核酸序列“茎-环”结构的发夹状结构，主要序列如下：5’-UUGACCUACAGGGACAUACUAA-3’。步骤（1）中所述肿瘤细胞为乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX。乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX为过表达BCRP乳腺癌细胞。

步骤（3）中使用的细胞为乳腺癌敏感细胞MCF-7；乳腺癌敏感细胞MCF-7为miR-487a过表达的乳腺癌细胞。

步骤（1）中miR-487a模拟物miR-487a mimic转染入乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中的终浓度范围为：10nM-80nM，转染时间为48小时。

步骤（2）中利用miR-487a模拟物miR-487a agmir脂质体，作用于MCF-7/MX诱导的乳腺癌裸鼠移植瘤时，采用的注射方法为裸鼠瘤周及瘤内多点注射，脂质体注射量为1nmol，注射次数为每星期注射两次，共计注射五次。

优点及效果：在乳腺癌药物敏感细胞MCF-7（BCRP低表达）和耐药细胞MCF-7/MX（BCRP高表达）中，通过real time-RCR检测miR-487a表达和蛋白免疫印迹分析BCRP表达，观察在两细胞中miR-487a和BCRP的表达差异及负性关系；通过荧光素酶报告分析，明确在BCRPmRNA-3’UTR区是否存在miR-487a的作用靶点；进一步在MCF-7和MCF-7/MX细胞中，分别通过转染miR-487a inhibitor和miR-487a mimic，构建miR-487a沉默表达和过表达的乳腺癌细胞模型，及对裸鼠进行MCF-7/MX细胞皮下注射，构建在体移植瘤模型，MX处理上述模型后，观察细胞及小鼠对MX的敏感性、BCRP的表达及细胞内MX含量变化，探讨离体和在体水平时miR-487a对乳腺癌细胞耐药性的影响及可能机制。

本发明的结果证实，miR-487a通过与BCRPmRNA-3’UTR靶向结合，抑制BCRP表达。干预miR-487a表达可影响乳腺癌细胞药物敏感性，与靶向作用BCRP、影响细胞内MX药物浓度相关。因此，本发明可以用作预测乳腺癌患者对化疗药物敏感性程度的分子标志物，为临床个体化用药提供依据，同时为抗耐药乳腺癌药物设计和筛选提供新的靶点，又可开发为一种miRNA小分子药物。

附图说明：

图1miRNAs芯片分析MCF-7和MCF-7/MX两种细胞中miRNAs的表达情况。

图2Real-time PCR检测MCF-7和MCF-7/MX两种细胞内miR-487a的表达水平；

与MCF-7细胞组比：^*P<0.05。

图3Western Blotting检测MCF-7和MCF-7/MX两种细胞内耐药蛋白MRP、PGP、LRP和BCRP的表达情况（A）及统计分析结果（B）；

与MCF-7细胞组比：^*P<0.05。

图4生物学信息分析miR-487a靶向结合BCRPmRNA-3’UTR区（A）应用TargetScan理论预测BCRPmRNA-3’UTR存在miR-487a的结合位点；（B）RNAhybrid理论分析miR-487a与BCRPmRNA-3’UTR的核酸碱基序列，预测两者的理论结合位点。

图5荧光素酶报告基因分析miR-487a靶向作用于BCRPmRNA-3’UTR区；

与control组比：^*P<0.05。

图6miR-487a抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中的BCRP表达（A）Real-time PCR检测转染miR-487a mimic或NC-mimic48h后MCF-7/MX中miR-487a的表达情况。（B）Real-time PCR检测转染miR-487a mimic或NC-mimic48h后，MCF-7/MX中四种耐药蛋白MRP、PGP、LRP、BCRP的mRNA的表达水平。（C）Western Blotting检测转染miR-487a mimic或NC-mimic48h后MCF-7/MX中四种耐药蛋白的表达图。（D）统计分析四种耐药蛋白表达水平；

与control组比：^*P<0.05。

图7miR-487a可抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中BCRP的转运功能，增加细胞内MX的含量（A）MCF-7/MX中转染miR-487a mimic或NC-mimic 48h后，MX处理细胞0.5小时，流式细胞技术检测细胞内荧光强度（B）统计分析细胞内药物浓度。

与control组比：^*P<0.05。

图8miR-487a增加乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX对MX的敏感性（A）MCF-7/MX中转染miR-487a mimic或NC-mimic48h后，以不同浓度MX处理细胞48h后，检测细胞对药物敏感性的变化。（B）MCF-7/MX中转染miR-487amimic或NC-mimic48h后，以不同浓度依托泊苷处理细胞48h后，检测细胞对药物敏感性的变化；

与control组比：^*P<0.05。

图9miR-487a增加了乳腺癌裸鼠移植瘤对MX的药物敏感性（A）各组典型的移植瘤图（B）肿瘤生长曲线图（C）瘤体重曲线图（D）Real-time PCR检测各组瘤内miR-487a的表达情况；

与control组比：^*P<0.05。

图10miR-487a靶向抑制BCRP在乳腺癌裸鼠移植瘤的表达（A）Real-timePCR检测各组瘤内MRP、PGP、LRP、BCRP四种耐药蛋白mRNA表达。（B）Western Blotting检测各组瘤内MRP、PGP、LRP、BCRP四种耐药蛋白表达；

与control组比：^*P<0.05。

图11抑制miR-487a上调了乳腺癌药物敏感细胞MCF-7的BCRP表达（A）Real-time PCR检测转染miR-487a inhibitor或NC-inhibitor48h后MCF-7中miR-487a的表达情况。（B）Real-time PCR检测转染miR-487a inhibitor或NC-inhibitor 48h后，MCF-7中四种耐药蛋白MRP、PGP、LRP、BCRP的mRNA的表达水平。（C）Western Blotting检测转染miR-487a inhibitor或NC-inhibitor48h后MCF-7中四种耐药蛋白的表达图。（D）统计分析四种耐药蛋白表达水平；

与control组比：^*P<0.05。

图12抑制miR-487a增强了乳腺癌药物敏感细胞MCF-7中BCRP的转运功能，降低细胞内MX的含量（A）MCF-7中转染miR-487a inhibitor或NC-inhibitor 48h后，MX处理细胞0.5小时，流式细胞技术检测细胞内荧光强度（B）统计分析细胞内药物浓度；

与control组比：^*P<0.05。

图13抑制miR-487a增加了药物敏感细胞MCF-7对MX的耐药性（A）MCF-7中转染miR-487a inhibitor或NC-inhibitor 48h后，以不同浓度MX处理细胞48h后，检测细胞对药物敏感性的变化。（B）MCF-7中转染miR-487ainhibitor或NC-inhibitor 48h后，以不同浓度依托泊苷处理细胞48h后，检测细胞对药物敏感性的变化；

与control组比：^*P<0.05。

实施方式：

一种应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，所述方法包括：

以下结合具体施例对本发明做进一步的详细说明，但并不是对本发明的限定：

实施例1：miRNA芯片分析乳腺癌敏感细胞MCF-7和耐药细胞MCF-7/MX中miRNAs表达谱差异；

本发明所采用的人类乳腺癌细胞MCF-7购自美国ATCC细胞库，由本室自行冻存。MCF-7/MX由本实验室诱导。培养基为含10%胎牛血清的DMEM培养基（高糖），其中添加青霉素100U/ml和链霉素100U/ml，5%CO₂，37℃培养箱中培养。通过miRNA芯片分析乳腺癌敏感细胞MCF-7和耐药细胞MCF-7/MX中miRNAs表达谱差异，发现48个miRNAs存在表达差异（见图1），其中miR-21、miR-302a、miR-302b、miR-487a等在MCF-7/MX中均低表达。

实施例2：Real-time PCR检测miR-487a在MCF-7和MCF-7/MX中的表达差异；

MCF-7和MCF-7/MX细胞培养24小时后收集细胞，按照RNA提取试剂盒（Bioteke，RP5301）步骤，提取总RNA，并用紫外分光光度计测定RNA的浓度和质量。采用SYBR real-time PCR试剂盒（Takera，DRR036S），按10μl体系（DEPC H₂O0.45μl，5*buffer 2μl，RRI0.25μl，M-MLV0.3μl，RT-primmer1μl，dNTP 1μl，RNA 5μl），反应条件为：30℃，10min；42℃，1h；85℃，5min；5℃，5min；4℃，2h，逆转录得cDNA。再按25μl体系（去离子水9μl，2*SYBRgreen12.5μl，Rox0.5μl，上游引物0.5μl，下游引物0.5μl，cDNA2μl）进行real-time PCR实验，反应条件为：95℃，2min；95℃，15s；60℃，30s，40循环；95℃，1min；55℃，30s；95℃，30s。实验最少重复三次，对miR-487a细胞内表达量进行统计分析。本发明real-time PCR检测结果显示在MCF-7/MX细胞中miR-302a、miR-302b、miR-487a的表达水平均下降，其中miR-487a的表达下降了60%（见图2）。

实施例3：Western Blotting检测BCRP在MCF-7和MCF-7/MX中的表达差异；

MCF-7和MCF-7/MX细胞培养24小时后，将细胞用预冷的PBS洗一遍，按照膜蛋白提取试剂盒（Thermo，89826）操作，加入新鲜配置的细胞裂解液，立即用细胞刮刀刮下细胞，冰浴摇床摇30分钟，充分裂解细胞。4℃、13,000g离心15分钟，收集上清至新的EP管中，用BCA法（碧云天，P0012）进行蛋白定量。取等量蛋白样品，加5*上样缓冲液（20%甘油，4%十二烷基硫酸钠，10%β-巯基乙醇，0.05%溴酚蓝，1.25M Tris–HCl,pH6.8），金属浴95℃变性10分钟后，用8%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF膜上，用含有5%脱脂奶粉的1%吐温20的Tris-HCl缓冲盐溶液（TBST）封闭两小时，TBST冲洗3次，每次10分钟，分别进行五种蛋白鼠源一抗：ABCG2/BCRP（abcam，ab3380），PGP（abcam，ab3366），LRP（Santa，sc23916），MRP(abcam，ab24102)，β-actin（SANTA，sc47778），稀释500倍，室温孵育两小时，4°C过夜。TBST冲洗三次，每次10分钟。添加抗鼠二抗（1:3000，中杉金桥，ZB2305），室温孵育1.5小时，TBST冲洗三次，ECL发光。实验最少重复三次，测定灰度值，进行统计学分析。应用蛋白免疫印迹分析显示四种耐药蛋白MRP、PGP、LRP、BCRP在MCF-7/MX中均比在MCF-7中表达增高，其中BCRP表达差异最大（P<0.05），增高达80%（见图3A及图3B）。本发明综合实施例2结果提示导致乳腺癌细胞耐药性增加的BCRP过表达与miR-487a低表达相关。

实施例4：生物学信息分析及荧光素酶报告基因分析miR-487a靶向作用于BCRPmRNA-3’UTR区；

首先应用TargetScan(www.targetscan.org)理论预测，发现包括miR-487a在内的6个miRNA可能与BCRPmRNA-3’UTR区结合（见图4A）。进一步通过RNAhybrid发现miR-487a与BCRPmRNA-3’UTR区的3007bp-3029bp存在结合位点（图4B）。

为了进一步验证miR-487a是否与BCRPmRNA-3’UTR有结合位点，本发明应用Luciferase荧光素酶报告分析进行检测。将pEGFP-BCRP3’UTR与pcDNA3.3-miR-487a或pcDNA3.3空质粒（阴性对照）按lipofectamine^TM2000转染试剂盒操作步骤共转染入293T细胞48h后，应用荧光检测仪检测荧光强度。实验最少重复三次，对荧光素酶结果进行统计分析。结果本发明发现（见图5）：在293T细胞中共转染pcDNA3.3-miR-487a和PGL3-BCRP-3’UTR48h后，与转染pcDNA3.3空质粒（阴性对照）和PGL3-BCRP-3’UTR相比，酶活性下降30%（P<0.05）。提示miR-487a与BCRPmRNA-3’UTR区3007bp-3029bp处存在直接结合位点。

实施例5：miR-487a抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中的BCRP表达；

为了检测miR-487a是否对BCRP的表达有调节作用，首先在实施例2和实施例3中发现的BCRP高表达的耐药细胞MCF-7/MX中转染miR-487a mimic，构建miR-487a过表达的细胞模型。其转染具体步骤为：将乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX在六孔板（3×10⁵个/孔）或100mm培养皿（2×10⁶个）中培养24小时后，用不含抗生素的无血清培养基饥饿培养1小时，之后按lipofectamine^TM2000转染试剂盒操作步骤分别转染miR-487a mimic（Ribobio）及非特异性的阴性对照质粒（miR-NC）（Ribobio），终浓度分别为10、20、40、80nM。4小时后，用新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM培养基替换原培养基培养48小时，备用。

按实施例2所述通过real-time PCR检测miR-487a在MCF-7/MX中的表达情况，结果发现10、20、40、80nM miR-487a mimic转染48小时后，其在细胞内的表达量增大分别为106、220、236、289倍（见图6A），说明miR-487a过表达模型构建成功。进一步检测MRP、PGP、LRP、BCRP四种耐药蛋白mRNA表达情况，发现在10、20、40、80nM miR-487a mimic转染48小时后，与阴性对照组比，BCRPmRNA表达分别下降27%、40%、31%、29%（P<0.05）（见图6B）。可见，20nM miR-487a mimic抑制BCRPmRNA表达的作用最明显。此外，其他三种MRP、PGP、LRP耐药蛋白mRNA无明显变化。进一步按实施例3所述进行Western Blotting检测20nM miR-487a mimic对MCF-7/MX中BCRP蛋白表达的影响，结果发现BCRP的蛋白表达下降了30%（P<0.05），而其他三种耐药蛋白均无明显变化（见图6C及图6D）。说明miR-487a能抑制耐药细胞MCF-7/MX中的BCRP表达。

实施例6：miR-487a可抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中BCRP的转运功能，增加细胞内MX的含量；

按实施例5所述转染方法在六孔板中瞬时转染后的MCF-7/MX细胞，分别设置空白组1，空白组2，阴性对照组，miR-487a mimic组，其中后三组加入3μM的BCRP的特异性转运底物盐酸米托蒽醌（MX），1小时后用冷的PBS洗，添加含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，1.5小时后收获细胞，用流式细胞仪测定细胞内荧光强度，检测细胞对药物的外排作用。实验最少重复3次。结果发现与对照组比，miR-487a转染组细胞内MX含量明显升高（见图7A及图7B，P<0.05）。证实了miR-487a可抑制耐药细胞MCF-7/MX中BCRP的转运功能，增加细胞内MX的含量。

实施例7：miR-487a增加乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX对MX的敏感性；

取MCF-7/MX的空白组、阴性对照组及miR-487a mimic转染组细胞经转染48h后，在96孔板中培养，每孔细胞数为1×10⁴。分别给予浓度为0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30μM的MX及0、1、3、10、30、100、300、1000、3000μM的依托泊苷培养48小时后，添加20μl（5mg/ml）MTT，37℃孵育4小时后，吸出上清液，添加100μl/孔二甲基亚砜（DMSO)，摇床摇晃10min，用酶标仪（安图）在570nm测量吸光度，同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养基、MTT、二甲基亚砜）。计算抑制率，抑制率%=1-（加药孔-调零孔）/（对照孔-调零孔），用16.0SPSS软件计算IC50。实验最少重复三次，对实验结果进行统计分析。本发明发现：与对照组比（IC50=1.578±0.198μM），miR-487a转染组（IC50=0.778±0.109μM）细胞对MX的敏感性明显增加（见图8A，P<0.05），而对依托泊苷的敏感性无明显改变（见图8B）。综上结果证实了miR-487a抑制乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中的BCRP表达与药物转运功能，增加对MX的敏感性。

实施例8：miR-487a增加了乳腺癌裸鼠移植瘤对MX的药物敏感性；

为了进一步明确miR-487a对MCF-7/MX耐药性的影响，进行了裸鼠在体实验。首先进行裸鼠移植瘤模型构建：取4-6周雌性无胸腺BALB/C小鼠（购于上海斯莱克实验动物有限公司），均在中国医科大学实验动物中心SPF级条件下无菌分笼饲养，操作过程中水和食物充足给予。采用常规培养细胞种植法，取对数生长期的乳腺癌MCF-7和MCF-7/MX细胞，分别制成4×10⁷/ml的细胞悬液，取0.2ml接种于每只BALB/C鼠右肩胛皮下，待移植瘤长到5*5*5mm后，随机将成瘤裸鼠分为四大组：其中I组（耐药株空白组）、II组（耐药株正常给药组）、III组（耐药株对照给药组）IV组（耐药株miR-487a给药组），每组6只。

每组裸鼠均采用瘤周及瘤内多点注射处理。I组：生理盐水（总量200μl），II组：生理盐水（总量200μl），III组：对照脂质体1nmol+生理盐水（总量200μl），IV组：miR-487a agmir脂质体1nmol+生理盐水（总量200μl），每星期注射两次，共计注射五次。第一次给予瘤内注射3天后，按照1.5mg/kg尾静脉注射药物，I组：生理盐水，II组、III组、IV组：盐酸米托蒽醌，每星期注射两次，共计注射四次。每次给药前，以游标卡尺测量肿瘤最大直径及相对应的横径，根据公式V(mm³)=π/6×肿瘤直径(mm)×肿瘤横径(mm)×肿瘤横径(mm)，计算肿瘤体积大小。两星期后处死4组裸鼠，取肿瘤。测量瘤块质量。提RNA及蛋白用于相关实验分析。

结果本发明发现：两周后，与对照组比，miR-487a组瘤体积和瘤重明显受到抑制（见图9A及图9B，P<0.05），表明miR-487a增加了乳腺癌裸鼠移植瘤对MX的药物敏感性。进一步按实施例2所述方法应用real-time PCR检测各组瘤内miR-487a的表达情况，结果显示：与对照组比，miR-487a组瘤内miR-487a表达水平明显升高（P<0.05），说明裸鼠模型构建成功（见图9C）。

实施例9：miR-487a靶向抑制BCRP在乳腺癌裸鼠移植瘤的表达；

应用实施例2所述方法进行real-time PCR检测（反转录条件：预变性95℃，5min；95℃，30s；60℃，45s；72℃，20s，8循环。Real-time PCR条件：95℃，30s；56℃，45s；72℃，20s，35循环；95℃，1min；55℃，30s；95℃，30s。）实施例8中各组乳腺癌移植瘤内MRP、PGP、LRP、BCRP四种耐药蛋白mRNA表达。结果本发明发现：与对照组比，miR-487a组瘤内BCRPmRNA表达水平明显降低（P<0.05），与实施例5中体外实验结果具有一致性（见图10A）。蛋白免疫印迹结果也显示BCRP蛋白表达明显下降（见图10B，P<0.05），而另外三种蛋白表达水平无明显改变。这些发明表明了在体环境下，miR-487a仍可抑制MCF7/MX细胞BCRP表达，增加对MX的敏感性。

实施例10：抑制miR-487a上调了乳腺癌药物敏感细胞MCF-7的BCRP表达；

为了检测抑制miR-487a是否可上调BCRP表达而增加乳腺癌细胞对MX的耐药性，进一步在BCRP低表达的敏感细胞MCF-7中转染miR-487a inhibitor，构建miR-487a低表达的细胞模型。其转染具体步骤为：将乳腺癌敏感细胞MCF-7在六孔板（3×10⁵个/孔）或100mm培养皿（2×10⁶个）中培养24小时后，用不含抗生素的无血清培养基饥饿培养1小时，之后按lipofectamine^TM2000转染试剂盒操作步骤分别转染miR-487a inhibitor（Ribobio）及其阴性对照质粒（Inhibitor-NC），终浓度为20nmol/l。4小时后，用新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM培养基替换原培养基培养48小时，备用。

首先应用实施例2所述Real-time PCR检测miR-487a的表达，发现转染组细胞内miR-487a表达明显下降，表达减少30%（见图11A，P<0.05），表明miR-487a沉默细胞模型构建成功。进一步应用Real-time PCR检测各组细胞内MRP、PGP、LRP、BCRP四种耐药蛋白mRNA表达，结果本发明发现：与对照组比，miR-487a inhibitor转染组细胞BCRPmRNA表达明显增加20%（P<0.05），其他三种蛋白mRNA无明显变化（见图11B）。Western Blotting检测结果也显示：与对照组比，miR-487a inhibitor转染组细胞BCRP蛋白表达增加15%（P<0.05），其他三种蛋白表达水平无明显改变（见图11C及图11D）。

实施例11：抑制miR-487a增强了乳腺癌药物敏感细胞MCF-7中BCRP的转运功能，降低细胞内MX的含量；

按实施例10所述转染方法在六孔板中瞬时转染后的MCF-7各组细胞，分别设置空白组1，空白组2，阴性对照组，miR-487a inhibitor组，其中后三组加入3μM的MX，1小时后用冷的PBS洗，添加含10%胎牛血清的DMEM培养基培养，1.5小时后收获细胞，用流式细胞仪测定细胞内荧光强度，检测细胞对药物的外排作用。结果本发明发现：与对照组比，miR-487a inhibitor转染组细胞内MX含量明显下降（见图12A及图12B，P<0.05）。证实了抑制miR-487a可增强乳腺癌药物敏感细胞MCF-7中BCRP的转运功能，即药物外排能力增加，降低细胞内MX的含量。

实施例12：抑制miR-487a增加了药物敏感细胞MCF-7对MX的耐药性；

各组MCF-7细胞经转染48h后，分别给予浓度为0、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10、30μM的MX及0、1、3、10、30、100、300、1000、3000μM的依托泊苷培养48h后，观察细胞对药物耐药性的变化。结果本发明发现：与对照组比（IC50=0.859±0.174μM），miR-487a inhibitor转染组（IC50=0.719±0.0074μM）细胞对MX的耐药性明显增加（见图13A，P<0.05），而对依托泊苷的耐药性无明显改变（见图13B）。综上结果证实了抑制miR-487a上调了药物敏感细胞MCF-7的BCRP表达和与药物转运功能，增加对MX的耐药性。

Claims

1.一种应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，所述方法包括：

2.根据权利要求1所述的应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，其特征在于，步骤（1）中miR-487a模拟物miR-487a mimic为包含miR-487a核酸序列“茎-环”结构的发夹状结构，主要序列如下：5’- UUGACCUACAGGGACAUACUAA-3’。

3.根据权利要求1所述的应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，其特征在于步骤（1）中所述肿瘤细胞为乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX。

4.根据权利要求3所述的应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，其特征在于：步骤（1）中乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX为过表达BCRP乳腺癌细胞。

5.根据权利要求1所述的应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，其特征在于步骤（3）中使用的细胞为乳腺癌敏感细胞MCF-7。

6.根据权利要求5所述的应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，其特征在于乳腺癌敏感细胞MCF-7为miR-487a过表达的乳腺癌细胞。

7.根据权利要求1所述的应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，其特征在于步骤（1）中miR-487a模拟物miR-487a mimic转染入乳腺癌耐药细胞MCF-7/MX中的终浓度范围为：10 nM-80 nM，转染时间为48小时。

8.根据权利要求1所述的应用miR-487a逆转乳腺癌耐药的方法，其特征在于步骤（2）中利用miR-487a模拟物miR-487a agmir脂质体，作用于MCF-7/MX诱导的乳腺癌裸鼠移植瘤时，采用的注射方法为裸鼠瘤周及瘤内多点注射，脂质体注射量为1nmol，注射次数为每星期注射两次，共计注射五次。