CN107412250B - miR-193a-3p的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于基因工程领域，特别涉及miR‑193a‑3p的应用，本发明通过揭示miR‑193a‑3p在胰腺癌细胞中作为抑癌基因控制肿瘤细胞迁移及生长、miR‑193a‑3p拮抗胰岛素对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤干细胞的促进能力、胰岛素通过抑制miR‑193a‑3p促进调节胰腺癌细胞增殖和迁移，提供了miR‑193a‑3p在制备治疗胰腺癌的药物、抑制胰岛素影响胰腺癌的药物中的应用，同时miR‑193a‑3p还可用做诊断伴有胰腺癌发生的糖尿病患者中，是否可用胰岛素进行治疗的标志物，用于制备判断伴随胰腺癌的糖尿病患者是否适宜采用胰岛素治疗的装置，其判断结果可为伴随胰腺癌的糖尿病患者的治疗方案提供依据。

Description

miR-193a-3p的应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，特别涉及miR-193a-3p的应用。
背景技术
非编码RNA是指经过基因组转录但不翻译成蛋白质的RNA，其中microRNA(miRNA)是一类具有进化保守性的小分子非编码RNA，在癌症、心血管、糖尿病等疾病中已证实发挥重要作用；miRNA在不同癌症中被证实对癌症的发生具有调节作用，可作为临床潜在的治疗靶标。
胰腺癌为致死率最高的癌症，2年生存率不足20％，而5年生存率仅为2％，具有“癌中之王”之称，全球每小时胰腺癌患者死亡人数约为20人，通常被称为“隐形杀手”，主要是胰腺癌在早期阶段不显现任何症状，往往确诊的胰腺癌病人已处于癌症晚期，因而常规手术和化学疗法对胰腺癌治疗已失去作用；胰腺癌超强的转移能力是其致死的一个主要原因；胰腺癌的转移是其自身多基因多步骤的一个综合过程，包括EMT的发生、肿瘤血管生成、癌细胞对胞外基质的降解及肿瘤细胞干性的加强，这些过程并不是独立事件，而是一个相互影响的过程。但是，目前关于胰腺癌转移的具体分子调控机制还不是很清楚。
胰腺癌病人较一般人群患糖尿病几率增大，具有1年以上糖尿病史患者发生胰腺癌的危险为无糖尿病患者的2.1倍；糖尿病为胰腺癌的危险因子或并发症，在胰腺癌病人中约50％伴有糖尿病的发生，约1％(>50岁)的病人诊断出糖尿病后3年内会伴有胰腺癌的发生；目前，临床对已确诊的糖尿病病人会进一步做胰腺病理检查，以确认糖尿病患者是否伴有胰腺癌的发生，可见糖尿病与胰腺癌的关系在临床诊断中被重视。
糖尿病的治疗及早期预防是否可以减缓或阻止胰腺癌发生，已有的研究工作并没有解释清楚。目前，通常采用胰岛素(insulin)与降糖药的联合使用治疗糖尿病，但胰岛素影响细胞糖代谢，而增强糖代谢是肿瘤细胞后期获能的主要方式，关于胰岛素的治疗是否对癌症的起始或恶性发展具有影响，这也是目前关于胰岛素治疗中最为关切的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-193a-3p在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
在胰腺癌细胞株中转染miR-193a-3p，利用划痕愈合、Trans-well细胞迁移和3D细胞培养分析发现，细胞的迁移和转移能力被显著下调；通过流式细胞分选技术检测胰腺肿瘤干细胞标志物CD133的表达，CD133阳性胰腺癌细胞所占比例明显减少；胰腺癌细胞形成微球体的能力同样被显著下调；细胞增殖、软琼脂克隆形成与裸鼠成瘤能力均被下调；说明miR-193a-3p在胰腺癌细胞中作为抑癌基因控制肿瘤细胞迁移及生长。
本发明还提供miR-193a-3p在制备抑制胰岛素影响胰腺癌的药物中的应用。
利用qRT-PCR分析与胰腺癌发生相关miRNAs的表达发现，相比未经胰岛素治疗的胰腺癌病人样本组织，miR-193a-3p的表达在胰岛素治疗的病人样本组织中被显著下调；在胰岛素处理的胰腺癌细胞中转染miR-193a-3p发现，miR-193a-3p拮抗胰岛素对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤干细胞的促进能力。
本发明还提供miR-193a-3p用做诊断伴胰腺癌的糖尿病患者在用胰岛素治疗时，是否促进胰腺癌发展的标志物。
通过流式细胞分选分析胰腺癌干细胞标志物CD133发现，胰岛素处理后CD133阳性胰腺癌细胞数目增多；同时，利用mammosphere微球体培养分析胰腺癌微球体形成，发现MIAPaCa-2细胞微球体形成能力在胰岛素刺激下显著增强。这些实验结果表明，胰岛素可显著提高胰腺癌细胞的迁移及肿瘤形成能力；利用qRT-PCR分析与胰腺癌发生相关miRNAs的表达发现，相比未经胰岛素治疗的胰腺癌病人样本组织，miR-193a-3p的表达在胰岛素治疗的病人样本组织中被显著下调；通过胰岛素处理胰腺癌细胞株MIA PaCa-2和PANC-1，经qRT-PCR分析发现，胰岛素处理胰腺癌细胞后miR-193a-3p的表达同样被显著下调；胰岛素通过抑制miR-193a-3p促进调节胰腺癌细胞增殖和迁移；伴有胰腺癌发生的糖尿病患者在接受胰岛素治疗时应区别对待,当检测出胰腺癌组织的miR-193a-3p表达量明显高于癌旁组织时(变化倍数大于2倍)，不宜采用胰岛素治疗糖尿病。
本发明还提供miR-193a-3p应用于制备判断伴随胰腺癌的糖尿病患者能否采用胰岛素治疗的装置。
优选地，所述装置包括RNA提取试剂、缓冲体系、反转录试剂、PCR扩增试剂和针对miR-193a-3p的引物对。
相对于现有技术，本发明的优点如下，
本发明通过揭示miR-193a-3p在胰腺癌细胞中作为抑癌基因控制肿瘤细胞迁移及生长、miR-193a-3p拮抗胰岛素对胰腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤干细胞的促进能力、胰岛素通过抑制miR-193a-3p促进调节胰腺癌细胞增殖和迁移，提供了miR-193a-3p在制备治疗胰腺癌的药物、抑制胰岛素影响胰腺癌的药物中的应用，同时miR-193a-3p还可用做诊断糖尿病患者在用胰岛素治疗时促进胰腺癌发展的标志物，用于制备判断伴随胰腺癌的糖尿病患者是否适宜采用胰岛素治疗的装置，其判断结果可为伴随胰腺癌的糖尿病患者的治疗方案提供依据。
附图说明
图1：miR-193a-3p抑制BxPC-3细胞转移；在BxPC-3细胞中转染或感染pSIF-miR-193a-3p(miR-193a-3p)或pSIF-H1(Ctrl RNA)，24小时后进行实验：
(A)划痕愈合实验：上，划痕0小时和14小时后代表性视图；下，愈合面积量化结果；标尺为200μm；
(B)Trans-well细胞迁移实验(左)和Trans-well基质胶侵袭实验(右)：上，代表性视图，标尺为100μm；下，单位面积迁移细胞数目量化结果；
(C)3D细胞培养实验：上，细胞培养21天相差结构，标尺为200μm；下，插图显示单个细胞侵袭到周围基质胶中的放大图像，标尺为100μm；
(D)4×104BxPC-3细胞感染pSIF-miR-193a-3p或对照pSIF-H1慢病毒，生物发光检测小鼠肺部转移灶点荧光信号强度。
图2：miR-193a-3p抑制BxPC-3细胞干性维持；肿瘤细胞微球体形成实验：
流式细胞分选统计CD133阳性肿瘤细胞数目(A)，1×104单细胞BxPC-3种植于低吸附的6孔细胞培养板,培养7天(B)，标尺为200μm。
图3：miR-193a-3p抑制BxPC-3细胞增殖：
(A)细胞增殖实验；左，MTT增殖曲线图；右，Western blot检测DVL3和PCNA蛋白水平，β-actin作为标准化内参；
(B)软琼脂克隆实验；左，代表性视图；右，量化结果；
(C)裸鼠皮下成瘤实验；左，肿瘤生长曲线；右，皮下注射6周后肿瘤代表性视图。
图4：在MIA PaCa-2中抑制miR-193a-3p表达提高细胞肺转移能力：
(A)划痕愈合实验；左，划痕0小时和16小时后代表性视图；右，愈合面积量化结果；标尺为200μm；
(B)Trans-well细胞迁移实验(左)和Trans-well基质胶侵袭实验(右)；上，代表性视图，标尺为100μm；下，单位面积迁移细胞数目量化结果；
(C)3D细胞培养实验；上，细胞培养21天相差结构，标尺为200μm；下，插图显示细胞侵袭到周围基质胶中的放大图像，标尺为100μm；
(D)1×105MIA PaCa-2细胞感染pSIF-miR-193a-3p或对照pSIF-H1慢病毒，生物发光检测小鼠肺部转移灶点荧光信号。
图5：anti-miR-193促进MIA PaCa-2细胞干性维持；肿瘤细胞微球体形成实验：
流式细胞实验统计CD133阳性肿瘤细胞数目(A)，1×104单细胞MIA PaCa-2种植于低吸附的6孔细胞培养板7天(B)，标尺为200μm。
图6：anti-miR-193a-3p增强MIA PaCa-2细胞增殖能力：
(A)细胞增殖实验；左，MTT增殖曲线图；右，Western blot检测DVL3和PCNA蛋白水平，β-actin作为标准化内参；
(B)软琼脂克隆实验；左，代表性视图；右，量化结果；
(C)裸鼠成瘤实验；左，肿瘤生长曲线；右，皮下注射6周后肿瘤代表性视图。
图7：DVL3为miR-193a-3p靶基因：
(A)DVL3为miR-193a-3p预测的潜在靶基因；上，人源DVL3mRNA与miR-193a-3p种子序列互补的序列；下，DVL3 3`UTR野生型及突变型报告基因序列示意图；
(B)293T细胞中双荧光实验分析DVL3 3`UTR报告基因荧光活性；
(C)miR-193a-3p与DVL3表达在胰腺癌细胞中负相关；
(D)qRT-PCR检测组织样本中miR-193a-3p与DVL3表达：miR-193a-3p与DVL3表达水平在胰腺癌样本组织中负相关；
(E)Pearson'scorrelation test分析miR-193a-3p与DVL3表达的相关性：miR-193a-3p与DVL3表达水平在胰腺癌样本组织中负相关；
(F)miR-193a-3p与DVL3在胰腺癌样本组织中表达统计分析，数据来源于(D)图；
(G)胰腺癌细胞株BxPC-3转入miR-193a-3p(左)和anti-miR-193a-3p(右)；左，Western blot检测DVL3蛋白水平；右，qRT-PCR检测DVL3mRNA表达；
(H)胰腺癌细胞株MIA PaCa-2转入miR-193a-3p(左)和anti-miR-193a-3p(右)；左，Western blot检测DVL3蛋白水平；右，qRT-PCR检测DVL3mRNA表达。
图8：胰岛素和miR-193a-3p在胰腺癌细胞中促进细胞增殖、迁移及干性维持；胰岛素(1μM))、胰岛素+miR-193a-3p、胰岛素+control RNA(Ctrl RNA)处理胰腺癌细胞：
(A)细胞增殖实验；左，MTT增殖曲线；右，Western blot检测细胞增殖标志蛋白PCNA，β-actin为标准化内参；
(B)3D细胞培养实验；上，结构相差显微视图(21天)，标尺为200μm；下，插图显示细胞侵袭到周围基质胶中的放大图像，标尺为100μm；
(C和D)Trans-well细胞迁移实验分析细胞迁移和侵袭能力；实验细胞数分别为2×104MIA PaCa-2和2×105MIAPaCa-2细胞；上，代表性图像，标尺为100μm；下，量化结果；
(E)流式细胞检测CD133+MIA PaCa-2细胞数目；上，流失分选图；下，量化结果；
(F)微球体形成实验；上，代表性图像，标尺为200μm；下，数目量化结果。
图9：胰岛素下调胰腺癌样本组织及细胞中miR-193a-3p表达：
(A)热图显示胰腺癌样本组织中50个普遍差异表达的miRNAs(n＝6)；
(B)热图显示胰岛素处理胰腺癌细胞株MIA PaCa-2和PANC-1，细胞使用浓度为1μM胰岛素处理2小时。
图10：MIA PaCa-2细胞中pSIF-miR-193a-3p梯度性表达变化倍数：
qRT-PCR实验检测miR-193a-3p表达；胰腺癌细胞MIA PaCa-2中转入pSIF-miR-193a-3p表达质粒，48小时候后进行实验分析，U6为标准化内参。
注：附图中所写的miR-193a均为miR-193a-3p的简写。
具体实施方式
实施例1：
miR-193a-3p对胰腺癌细胞迁移和转移能力的影响
在BxPC-3细胞中转染或感染pSIF-miR-193a-3p(miR-193a-3p)或pSIF-H1(CtrlRNA)，24小时后进行划痕愈合实验、Trans-well细胞迁移实验、Trans-well基质胶侵袭实验、3D细胞培养实验和生物成像实验：
划痕愈合实验
首先在细胞6孔培养板反面做坐标标记线，后将不同实验及对照组细胞种植于6孔培养板，使用DMEM或DMEM/F12完全培养基进行培养，待细胞密度达到90％后，利用仅含0.2％血清浓度的培养基进行过夜培养，待细胞密度达到100时利用10ul枪头进行划痕操作，随后在不同时间点利用倒置显微镜进行拍照，观察不同实验组在迁移方面的变化。
细胞迁移实验(Trans-well assay)
转染后的各组细胞，用不含FBS的培养基配制成细胞悬液，取300μL含有1×104的细胞悬液加入底部为8μm聚碳酸酯滤膜的Trans-well小室内，小室下部分加入500μL含10％FBS的DMEM培养基。培养箱中孵育24小时。取出Trans-well板，PBS清洗，4％甲醛固定滤膜15min，用PBS清洗滤膜3次。DAPI进行染色，用棉签将聚碳酸酯滤膜上表面的细胞擦去。显微镜下倒置滤膜观察拍摄多个视野中细胞的数量，并统计穿过聚碳酸酯滤膜的细胞数。
细胞3D培养
首先，将基质胶(BD biosciences)平铺于8孔玻璃小室(Corning)，每孔70μL。随后在单细胞悬液中加入1％基质胶，以3×103/孔接种于8孔细胞培养玻璃小室。细胞置于37℃，5％CO2细胞培养箱培养19天，每4天左右置换含有1％基质胶的新鲜完全培养液。利用倒置显微镜进行图像采集，分析细胞的增值及侵袭结果。
NOD/SCID小鼠活体成像(In vivo bioluminescent image)
取6-8周龄大小的雌性小鼠，每组6只。将经过实验处理的细胞株用胰酶消化为单细胞悬液，取20ul于细胞计数板计数，1×DPBS重悬细胞，每只小鼠尾部静脉注射4×104个细胞，35min后给裸鼠腹部注射荧光底物，10min后将小鼠置于小室用异氟烷麻醉，最后利用IVIS光谱成像系统(Xenogen)进行生物成像。50天后CO2安乐死小鼠。图像使用Live Image处理。
上述结果如下：
图1-A为划痕愈合实验中划痕0小时和14小时后代表性视图以及愈合面积量化结果，标尺为200μm；图1-B为Trans-well细胞迁移实验(左)和Trans-well基质胶侵袭实验(右)的代表性视图和单位面积迁移细胞数目量化结果，标尺为100μm；图1-C为3D细胞培养实验中细胞培养21天相差结构，标尺为200μm，插图显示单个细胞侵袭到周围基质胶中的放大图像，标尺为100μm；图1-D为4×104BxPC-3细胞感染pSIF-miR-193a-3p或对照pSIF-H1慢病毒，生物发光检测小鼠肺部转移灶点荧光信号强度。从图1A-C可以看出，细胞的迁移和转移能力被显著下调；从图1-D可知，相比对照pSIF-H1，经pSIF-miR-193a-3p感染的luc-BxPC-3细胞其小鼠肺部转移灶点的荧光信号强度被显著下调。
因为胰腺癌细胞具有强肿瘤干细胞特性，为此，我们通过肿瘤细胞微球体形成实验分析胰腺癌细胞中肿瘤干细胞干性强度：
细胞流式分选CD133+细胞
收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃PBS洗一次。4％多聚甲醛室温固定40min后，800rpm离心5min，弃上清，加1mlPBS重悬，800rpm离心5min。用含2.5％BSA的PBS冰上孵育10min，800rpm离心5min后弃上清。加入含2.5％BSA的PBS和荧光标记抗体，避光冰孵30min，离心弃上清。含2.5％BSA的PBS洗两次，加入200ul 1％的PFA固定，Calibur(BD)待检，数据使用flowjo软件进行分析。
肿瘤干细胞微球体形成(mammosphere culture)
取对数生长期的细胞，细胞以2×104/ml接种于低吸附6孔细胞培养板(Corning,3471,)。加入含20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF、5ug/ml胰岛素和B27的培养液(DMEM/F12)的培液，37℃，5％CO2于细胞培养箱中培养，2.3天更换一次新鲜培液。培养7天后根据实际情况体视镜进行影像拍摄。取直径大于100um的进行计算。
通过流式细胞分选技术检测胰腺肿瘤干细胞标志物CD133的表达，结果如图2-A：转染miR-193a-3p后，CD133阳性胰腺癌细胞BxPC-3所占比例明显减少；与此相一致的是，肿瘤干细胞微球体形成实验结果如图2-B：在转入miR-193a-3p时BxPC-3细胞微球体的能力同样被显著下调。
接着，我们进一步探究miR-193a-3p对胰腺癌细胞肿瘤生长影响：
MTT实验
瞬时转染后的各组细胞，胰酶消化，采用血球计数板进行细胞计数，以3×103/孔接种于96孔培养板中，每组设6个复孔。待细胞贴壁，设为起始点零点，分别于6h，24h，48h，72h，96h各取其中一组细胞，加入0.5mg/mL MTT反应液0.1mL/孔,37℃孵育4h，弃去培养基，加入DMSO 200μL/孔置于摇床上震荡5min，溶解紫色甲瓒。用酶标仪测定570nm处的吸光度值，统计学分析。
免疫印迹(Western blot)
细胞或组织样品预先用PBS清洗一遍，随后使用Western blot细胞裂解液(20mMTris,pH 7.5,150mM NaCl,1％Triton X-100,1mM Na3VO4和完全蛋白水解酶抑制剂混合物)于4℃处理细胞或组织样品10分钟，充分裂解后，10,000-14，000g离心5分钟。取上清液与等体积的2×SDS蛋白质上样缓冲液(130mM Tris-Cl,20％(v/v)Glycerol,4.6％(w/v)SDS,0.02％Bromophenol blue,2％DTT,pH8.0)混合，于沸水中煮5分钟。蛋白质样品经SDS-PAGE胶分离后，转移至PVDF膜上，随后使用含2％BSA(牛血清白蛋白)及0.05％Tween 20的磷酸缓冲液PBS于4℃进行封闭1.2小时。后将一抗与PVDF膜4℃孵育过夜，经PBST洗涤5次，每次8分钟后，再与用辣根过氧化物酶偶联的(horseradish peroxidase-conjugated，HRP)二抗反应。最后加入底物SuperSignal West Pico Chemiluminescence(ThermoScientific)进行显影。
软琼脂克隆实验(Soft-agar assay)
预先将2％琼脂糖溶液与2×细胞培养基以1:1的体积比混合，然后在6孔细胞培养板中每孔加入1.5mL混合液，放置于超净工作台待其琼脂凝固。取对数期细胞，利用胰酶对细胞进行消化处理，待完全消化后将细胞吹散成单个细胞悬液，进行计数，其细胞终浓度为50,000个/mL，将0.6％琼脂糖与2×细胞培养基以1:1的体积比混合，制备0.4％的上层琼脂，将1mL上层琼脂溶液和100μL单细胞悬液(约5000个细胞/孔)混匀，铺于下层凝胶之上，培养箱中培养4-5周，用含MTT培养液培养过夜，显微镜下计数，计算单位面积，细胞集落形成率。
裸鼠皮下成瘤实验(Xenograft assay)
细胞株经处理后用胰酶消化，利用PBS重悬细胞。将200μL约含1×107个细胞接种于6-8周龄大小的雌性裸鼠裸鼠乳房垫处，每组6只。接种后1周开始测量肿瘤的最长和最短直径，按公式：肿瘤大小＝a×b2/2(a代表肿瘤最长径，b代表肿瘤的最短径)计算肿瘤的体积。平均一周测量一次大小。最后经过统计学分析做出肿瘤大小的变化。
在胰腺癌细胞BxPC-3中高表达miR-193a-3p发现，细胞增殖、软琼脂克隆形成与裸鼠成瘤能力均被下调(图3A-C)。综上所述，miR-193a-3p在胰腺癌细胞中作为抑癌基因控制肿瘤细胞迁移及生长。
为了进一步验证，miR-193a-3p对胰腺癌细胞迁移及增殖能力具有影响。我们通过在MIA PaCa-2细胞中转染anti-miR-193a-3p发现，胰腺癌细胞的转移(图4A-D)、微球体(图5A和B)和增殖能力均被不同程度提高(图6A-C)。结合前面实验结果，已有的实验数据充分证明，miR-193a-3p抑制胰腺癌细胞的转移及增殖能力。因此miR-193a-3p可用于制备治疗胰腺癌的药物。
实施例2：
miR-193a-3p可靶向作用DVL3基因表达
由于miR-193a-3p在正常胰腺组织中的表达量，相比胰腺癌组织有明显的提高，因此miR-193a-3p可能在胰腺癌的发展中发挥重要的抑癌作用。发明人利用生物信息学分析软件miRwalk2.0软件来预测miR-193a-3p的潜在靶基因。我们发现散在蛋白(Dishevelled3,DVL3)为miR-193a-3p潜在靶向基因(图7-A，上)。为验证miR-193a-3p是否直接靶向调控DVL3，我们首先构建了包含野生型DVL3 3′UTR的荧光素酶报告基因质粒(图7-A，下)，以及包含miR-193a-3p种子序列(7nt)缺失突变的报告基因质粒DVL3 3′UTR-Mut质粒(图7-A，下)。进行双荧光素酶报告基因分析。
双荧光报告基因检测
将预测的miRNA靶基因3'UTR克隆到pRL-TK质粒中海肾荧光素酶基因编码区(renilla luciferase)的下游，构建含有预测靶基因3'UTR的报告基因质粒；同时将miRNA潜在识别位点缺失突变，构建突变3'UTR报告基因质粒。将miRNA与对应报告基因质粒及内参萤火虫荧光素酶基因(firefly luciferase)表达质粒共转到293T细胞中，24小时后，裂解细胞，使用Promega公司的双荧光素酶报告系统检测试剂盒进行检测。通过报告基因的荧光活性，判断所预测的靶基因是否能真正受miRNA靶向调控。
通过双荧光素酶报告基因分析发现，高表达miR-193a-3p显著下调携带DVL3 3′UTR报告基因的荧光素酶活性，但对DVL3 3′UTR-Mut报告基因活性无明显影响(图7-B)。进一步，我们发现不仅在胰腺正常细胞与癌细胞中miR-193a-3p表达与DVL3蛋白水平负相关，同时与DVL3mRNA表达也呈现负相关(图7-C)。随后，为了检测miR-193a-3p与DVL3间存在的负调控关系是否存在于胰腺癌临床病理中，我们检测了30例胰腺癌病人临床样本组织。通过qRT-PCR分析了miR-193a-3p与DVL3mRNA表达水平(图7-D)，证实miR-193a-3p与DVL3mRNA在胰腺癌临床样本中呈现负相关(图7-E)。通过进一步统计分析我们发现，高表达miR-193a-3p的组织中DVL3阳性率为16％，而低表达miR-193a-3p的组织中DVL3阳性率高达95％(图7-F)。进一步，经Western blot和qRT-PCR检测发现，在內源高表达DVL3的胰腺癌细胞株BxPC-3中转染miR-193a-3p，可有效抑制DVL3蛋白及mRNA表达(图7-G)；与之相反，在MIAPaCa-2细胞中转染anti-miR-193a-3p，DVL3蛋白和mRNA表达被显著上调(图7-H)。以上这些实验结果充分证明，DVL3[nt2291-5062(NM-004423.3)]的3′UTR含有miR-193a-3p的潜在识别位点。
实施例3：
miR-193a-3p对胰岛素处理的胰腺癌细胞迁移和转移能力的影响
用胰岛素(1μM))、胰岛素+miR-193a-3p、胰岛素+control RNA(Ctrl RNA)处理胰腺癌细胞株MIA PaCa-2。通过胰岛素处理恶性程度较低的胰腺癌细胞株MIA PaCa-2，经MTT细胞增殖和Trans-well细胞迁移分析发现，MIA PaCa-2细胞的增殖、迁移与侵袭能力均不同程度被提高(图8A-D)。由于胰腺癌细胞具有较强的肿瘤干细胞特性，为此我们进一步分析了胰岛素对胰腺癌细胞干性的影响。通过流式细胞分选分析胰腺癌干细胞标志物CD133发现，胰岛素处理后CD133阳性胰腺癌细胞数目增多(图8-F)；这些实验结果表明，胰岛素可显著提高胰腺癌细胞的迁移及肿瘤形成能力。
利用qRT-PCR分析与胰腺癌发生相关miRNAs的表达发现，相比未经胰岛素治疗的胰腺癌病人样本组织，miR-193a-3p的表达在胰岛素治疗的病人样本组织中被显著下调(图9)。为了进一步证实胰岛素在胰腺癌中下调miR-193a-3p的表达，我们通过胰岛素处理胰腺癌细胞株MIA PaCa-2和PANC-1，经qRT-PCR分析发现，胰岛素处理胰腺癌细胞后miR-193a-3p的表达同样被显著下调(图9B)。
RNA逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量PCR(qRT-PCR)
逆转录程序：特定引物：42℃15min，85℃5sec，4℃终止反应。
Oligo通用引物：37℃15min，85℃5sec，4℃终止反应。
qRT-PCR反应体系(20μL)
qRT-PCR程序：95℃30s预变性；95℃3s,30s，60℃30s，循环40次。GAPDH和U6分别作为mRNA和miRNA的内参。利用ABI 7500fast Real-Time PCR仪及软件进行分析。RNA相对表达＝2-△△CT，△CT＝目标基因CT-内参CT值，其中CT值代表每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所需循环数。
糖尿病临床病理检测显示，糖尿病往往伴随胰腺癌的发生。糖尿病的临床治疗用药中，主要以胰岛素或与降糖药的联合使用为主。为了更好的模拟细胞体内miR-193a-3p的生物学作用，实验中胰腺癌细胞转染pSIF-miR-193a-3p(miR-193a-3p)提高miR-193a-3p变化的倍数，应与胰岛素提高miR-193a-3p变化倍数相一致。通过不同浓度pSIF-miR-193a-3p质粒转染胰腺癌细胞株MIA PaCa-2，经qRT-PCR分析miR-193a-3p表达水平(图10)，拟定后续细胞转染所使用pSIF-miR-193a-3p的量为50ng/ml。通过在胰岛素处理的胰腺癌细胞MIAPaCa-2中瞬转miR-193a-3p发现，miR-193a-3p拮抗胰岛素对MIA PaCa-2细胞增殖、迁移、侵袭和肿瘤干细胞的促进能力(图8A-F)。综合以上实验结果充分证实，胰岛素通过抑制miR-193a-3p促进调节胰腺癌细胞增殖和迁移。因此miR-193a-3p可用于制备抑制胰岛素影响胰腺癌的药物；另一方面，miR-193a-3p还可用做诊断糖尿病患者在用胰岛素治疗时促进胰腺癌发展的标志物，用于制备判断伴随胰腺癌的糖尿病患者能否采用胰岛素治疗的装置。
上述3个实施例所用到的引物序列如下表：
需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京北恒生物科技有限公司
<120> miR-193a-3p的应用
<160> 15
<210> 1
<211> 44
<212> RNA
<213> 人源
<400> 1
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACTGGGAC 44
<210> 2
<211> 28
<212> RNA
<213> 人源
<400> 2
ACACTCCAGCTGGGAACTGGCCTACAAA 28
<210> 3
<211> 25
<212> RNA
<213> 人源
<400> 3
TATCATGAAGGGTGGGGCCGTGGCT 25
<210> 4
<211> 25
<212> RNA
<213> 人源
<400> 4
GGTGATGGGCCCCGGTTTGTGCACA 25
<210> 5
<211> 26
<212> RNA
<213> 人源
<400> 5
TCTTTTTTACTTTGTCTGGTACCTGA 26
<210> 6
<211> 25
<212> RNA
<213> 人源
<400> 6
TTTGAGACAGAATCTCACTCTGTCA 25
<210> 7
<211> 24
<212> RNA
<213> 人源
<400> 7
TGAGGTTGGGCAAGGAGACTTCCA 24
<210> 8
<211> 24
<212> RNA
<213> 人源
<400> 8
TGTGGGCTCCTGTGTCCTTGCTCT 24
<210> 9
<211> 24
<212> RNA
<213> 人源
<400> 9
TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC 24
<210> 10
<211> 24
<212> RNA
<213> 人源
<400> 10
ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC 24
<210> 11
<211> 21
<212> RNA
<213> 人源
<400> 11
GTCGGGGACGCACCCCGAACT 21
<210> 12
<211> 23
<212> RNA
<213> 人源
<400> 12
CGAGGACCGGGGAGAAGACGCT 22
<210> 13
<211> 44
<212> RNA
<213> 人源
<400> 13
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGAAAATATG 44
<210> 14
<211> 30
<212> RNA
<213> 人源
<400> 14
ACACTCCAGCTGGGCGCAAATTCGTGAAGC 30
<210> 15
<211> 23
<212> RNA
<213> 人源
<400> 15
CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGG 23

Claims (4)

1.miR-193a-3p在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。
2.miR-193a-3p在制备抑制胰岛素影响胰腺癌的药物中的应用。
3.miR-193a-3p应用于制备判断伴随胰腺癌的糖尿病患者能否采用胰岛素治疗的装置。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述装置包括RNA提取试剂、缓冲体系、反转录试剂、PCR扩增试剂和针对miR-193a-3p的引物对。
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MiR-193a-3p在胰腺癌中的功能机制研究;朱利靖;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》;20160315(第03期);中文摘要
The microRNA Signature in Response to Insulin Reveals Its Implication in the Transcriptional action of insulin in Human Skeletal Muscle and the Role of a sterol Regulatory Element-Binding Protein-1c/Myocyte Enhancer Factor 2C Pathway;Aurelie Granjon et al.;《Diabetes》;20091130;第58卷;第2555-2564页

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