CN105624159B - 一种针对人EDIL3基因的siRNA及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种特异性抑制人EDIL3的干扰序列，正义链如SEQ ID NO:1所示，反义链如SEQ ID NO:2所示。本发明还提供上述干扰序列在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。本发明的针对EDIL3基因表达的干扰序列，可以抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移、管样形成，可以诱导细胞周期的阻滞；本发明干扰序列可以用于制备成稳定、有效、低毒的抑制EDIL3表达的、治疗新生血管性疾病的生物靶向制剂或药物。

Description

一种针对人EDIL3基因的siRNA及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体地说，是一种特异性抑制EDIL3的小核酸干扰分子，以及在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。
背景技术
新生血管是一种在原有血管的基础上生长出新血管的过程，其具有重要的生理及病理意义。新生儿的新生血管生成利于组织器官的生长，然而在成年后，大部分血管维持在静止状态；在病理性刺激下，血管内皮内皮细胞可以恢复增殖能力，进而促进新生血管形成。病理性新生血管的生成涉及到多种细胞因子的分泌及调节紊乱，并参与了多种疾病的发生发展，如肿瘤、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎及肺动脉高压等。在过去的十数年间，研究人员进行了大量研究探询抑制新生血管的治疗策略，以期预防和治疗肿瘤、眼底和皮肤病变等。目前抗新生血管药物，血管内皮生长因子单抗，已经应用于临床治疗新生血管性疾病。然而，由于血管内皮生长因子单抗发挥作用时效较短，需要多次治疗，并且对增殖期糖尿病视网膜病变效果不佳。因此，寻求其它安全有效的治疗手段，对治疗新生血管性疾病具有重要的意义。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近来发展日趋成熟的一门基因沉默技术，是内源性或外源性的双链RNA在基因转录后水平上，介导细胞内信使RNA(mRNA)发生特异性降解，导致靶基因表达沉默，从而产生相应功能表型的缺失，是特异性抑制靶基因表达的过程，具有高效性、特异性的特点。在不影响正常基因功能的前提下，RNA干扰可以抑制重要基因的表达，从而达到基因治疗的目的，其对靶基因具有很好特异性及对目的基因抑制作用是其它药物难以匹敌的。随着RNA干扰技术的不断完善，针对病理性新生血管的RNAi具有广阔的应用前景。
表皮生长因子样重复折叠1结构域蛋白3(EGF-like repeat and discoidin I-like domain-containing protein 3,EDIL3,also known as Del-1 and integrin-binding DEL1)是内皮细胞分泌分子量大小为52kDa的胞外基质相关糖蛋白。早期研究发现EDIL3在胚胎内皮细胞中短暂表达，并可以促进血管内皮细胞的粘附和迁移(Aoka Y,Johnson FL,Penta K,Hirata Ki K,Hidai C,Schatzman R,Varner JA,QuertermousT.The embryonic angiogenic factor Del1 accelerates tumor growth by enhancingvascular formation.Microvasc Res.2002 Jul；64(1):148-61)。近来研究发现，EDIL3在许多肿瘤中高表达，且与肿瘤预后密切相关(Sun JC,Liang XT,Pan K,Wang H,Zhao JJ,LiJJ,Ma HQ,Chen YB,Xia JC.High expression level of EDIL3 in HCC predicts poorprognosis of HCC patients.World J Gastroenterol.2010 Sep 28；16(36):4611-5.Watanabe T1,Kobunai T,Yamamoto Y,Ikeuchi H,Matsuda K,IshiharaS.et.al.Predicting ulcerative colitis-associated colorectal cancer usingreverse-transcription polymerase chain reaction analysis.Clin ColorectalCancer.2011 Jun；10(2):134-41)。这些研究表明EDIL3在血管形成及肿瘤发生发展过程中起着重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性抑制EDIL3的siRNA，本发明另一目的在于提供该siRNA在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。
本发明以RNA干扰技术为基础，从NCBI基因数据库中获得EDIL3的cDNA序列(GeneID:10085)，根据siRNA靶序列的基本原则，针对EDIL3设计了三条21个核苷酸的siRNA，其序列如下，
以上所述的siRNA还可以在正义链和反义链的3’端再加上TT以增加siRNA的稳定性。
将上述干扰RNA转染进脐静脉血管内皮细胞后发现，siRNA1抑制EDIL3基因表达的干扰效果最明显。
本发明的第一方面，提供一种抑制人表皮生长因子样重复折叠1结构域蛋白3(EDIL3)的干扰序列(siRNA1)，其序列如下：
正义链5’-GGUGAUAUUUGUGAUCCCA-3’(SEQ ID NO:1)
反义链5’-UGGGAUCACAAAUAUCACC-3’(SEQ ID NO:2)
所述的正义链和反义链还可以在3’端再加上TT以增加siRNA的稳定性。
本发明的第二方面，提供上述抑制人EDIL3的干扰序列(siRNA1)在制备人EDIL3抑制剂中的应用。
本发明的第三方面，提供上述抑制人EDIL3的干扰序列(siRNA1)在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。
所述的抑制人EDIL3的干扰序列(siRNA1)通过抑制EDIL3基因表达抑制血管内皮细胞的增殖、迁移、管样形成。
所述的新生血管性疾病，具体是指一种病理性新生血管的生成症状，即在病理性刺激下，血管内皮内皮细胞恢复增殖能力，在原有血管基础上生长出新血管，例如炎症性疾病、肿瘤、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎及肺动脉高压等等。
本发明的第四方面，提供一种重组载体，所述的重组载体中包含上述的抑制人EDIL3的干扰序列(siRNA1)。
所述的重组载体在制备人EDIL3抑制剂中的应用。
所述的重组载体在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。
本发明的第五方面，提供一种药物组合物，所述的药物组合物中包含上述的抑制人EDIL3的干扰序列(siRNA1)，以及药学上可接受的载体。
所述的药物组合物在制备人EDIL3抑制剂中的应用。
所述的药物组合物在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。
本发明优点在于：
1、本发明针对EDIL3基因表达的siRNA，可以抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移、管样形成，可以诱导细胞周期的阻滞；
2、本发明siRNA可以用于制备成稳定、有效、低毒的抑制EDIL3表达的、治疗新生血管性疾病的生物靶向制剂或药物。
附图说明
图1为EDIL3基因干扰后脐静脉血管内皮细胞EDIL3的mRNA表达及蛋白表达水平效果图；其中A为蛋白凝胶电泳图，B为mRNA表达量统计图。
图2为EDIL3基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞增殖能力的统计图。
图3为EDIL3基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞迁移能力的影响图及统计图，其中A为空白对照组光镜图，B为阴性对照组光镜图，C为干扰组光镜图，D为统计图。
图4为EDIL3基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞管样形成能力的影响图及统计图，其中A为空白对照组光镜图，B为阴性对照组光镜图，C为干扰组光镜图，D为统计图。
图5为EDIL3基因干扰效率及干扰后对晶状体上皮细胞增殖能力的统计图，其中AEDIL3基因干扰后晶状体上皮细胞EDIL3蛋白表达水平效果图；B为晶状体上皮细胞增殖能力的统计图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增与检测、细胞转染、RNA提取及反转录等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。
实施例1：siRNA的合成
检索NCBI GeneBank得到EDIL3全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对EDIL3进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除aitisense链的5’端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。
本实施例设计并合成的siRNA序列如下所示，正义链和反义链都在3’端再加上TT以增加siRNA的稳定性。
从图1中看出，siRNA1可以将EDIL3表达抑制掉60％以上；siRNA2可以将EDIL3表达抑制到30％左右，siRNA3可以将EDIL3抑制掉20％左右。
因此，本发明从中筛选出干扰效果最好，即抑制EDIL3表达效果最显著的siRNA1进行进一步的实验。
实施例2：细胞转染
(1)转染前1天，收集对数生长期细胞，接种于12孔板内，接种数量约为5×104个细胞，加入1mL培养基。
(2)100μL Opti-MEM培养基内加入4μL脂质体转染试剂，轻轻吹打，室温静置5min。
(3)100μL Opti-MEM培养基内加入60Nm,柔和混匀。
(4)混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹匀，室温静置20min。
(5)转染后8h换液，继续培养48h后，进行转染后其它操作。
实施例3：实时荧光定量RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测脐静脉血管内皮细胞中EDIL3的mRNA和蛋白表达
具体过程如下：
1.实时荧光定量RT-PCR
(1)总RNA提取：收集细胞至1.5mL无RNA酶离心管中，加入0.5mLTrizol，在冰上充分混匀吹打，静置10min。加入0.125mL氯仿，剧烈振荡20s，冰上静置5min。4℃离心，12000r/min×15min，吸取0.2mL上清至另一个1.5mL,进而加入与上清等量的异丙醇，轻轻混匀，冰上静置10min。4℃离心，12000r/min×15min，弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃离心，12000r/min×15min。弃上清，晾干，溶于20μLDEPC水中。多功能酶标仪测定提取RNA的浓度和纯度。
(2)反转录：利用takara反转录试剂盒将抽提的总RNA反转录为cDNA，反应体系如下，
混匀后离心，37℃15min，85℃5sec。
(3)荧光定量RT-PCR：利用takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行反应，反应体系如下，
利用Rotor Gene 3000A仪器进行两步法扩增，95℃预变性2min，进入40个PCR循环，95℃5s，60℃30s。
2.蛋白免疫印迹。
(1)HUVECs总蛋白用改进的蛋白裂解液提取。
(2)30ug蛋白加到12.5％浓度的蛋白胶中电泳，并用电转仪转到PVDF膜上。
(3)蛋白的非特异性位点用脱脂牛奶封闭后用一抗封闭，4℃过夜，然后用TBST缓冲液洗三遍。
(4)然后用HRP标记二抗室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。
(5)最后，利用显色液显色并拍照分析。
3.结果
如图1所示，EDIL3的siRNA可以明显抑制EDIL3的mRNA及蛋白表达。
实施例4：CCK-8方法检测细胞增殖
(1)收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。
(2)细胞过夜贴壁后，利用脂质体转染试剂介导转染，换液后48h检测细胞增殖情况。
(3)吸弃原有培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，培养3h后用多功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。
(4)实验重复3次，结果如图2所示，EDIL3干扰后细胞增殖能力较阴性对照组及空白对照组明显降低。
实施例5：细胞迁移实验
(1)细胞迁移实验是利用孔径为8μM的transwell小室实施的。
(2)将转染siRNA 48h后的细胞消化重悬，接种1×105细胞于transwell小室的上室，培养基的血清浓度为0.5％。
(3)下室加入700μL含1％血清浓度的培养基。
(4)在孵箱孵育12h后弃去培养基，将小室用多聚甲醛固定20分钟。
(5)将上室膜上层的细胞用棉签擦去，继而用结晶紫对细胞进行染色15分钟。
(6)迁移至膜下层的细胞用倒置显微镜观察并拍照分析。
(7)结果如图3所示，EDIL3干扰后细胞迁移能力较阴性对照组及空白对照组明显降低。
实施例6：细胞管样形成实验
(1)用无血清培养基将基质胶稀释至浓度为5mg/mL并混匀，将50uL稀释好的基质胶加入96孔板孔中，在37℃孵箱中孵育40分钟使基质胶变为固态。
(2)将转染siRNA48h后的细胞消化重悬，将含4×104细胞的100μL培养基加入铺有基质胶的96孔板中并孵育3小时。
(3)管样形成的结构用倒置显微镜观察并拍照分析。
(4)结果如图4所示，EDIL3干扰后细胞管样形成能力较阴性对照组及空白对照组明显降低。
实施例7：EDIL3的siRNA抑制晶状体上皮细胞增殖
材料：细胞为SRA01/04细胞系，用含10％血清的DMEM培养基培养；CCK8试剂购自碧云天生物科技有限公司。
方法：CCK8方法检测增殖
(1)收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。
(2)细胞过夜贴壁后，利用脂质体转染试剂介导转染，换液后48h检测细胞增殖情况。
(3)吸弃原有培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，培养3h后用多功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。
(4)实验重复3次，结果如图5所示，EDIL3干扰后细胞增殖能力较阴性对照组及空白对照组明显降低。
结果：EDIL3干扰后，SRA01/04细胞EDIL3表达明显降低，其增殖能力明显降低(图5)。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (1)

1.一种抑制人EDIL3的干扰序列在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用，其特征在于，所述的抑制人EDIL3的干扰序列包括正义链和反义链，所述的正义链如SEQ ID NO:1所示，反义链如SEQ ID NO:2所示；该干扰序列抑制血管内皮细胞的增殖、迁移、管样形成。
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Identification of EDIL3 on Extracellular vesicles involved in breast cancer cell invasion;Jeong-Eun Lee et al.;《Journal of Proteomics》;20151014;第131卷;摘要，第19页右栏第5段，第27页右栏第2段，图3

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