CN104328122A - 一种针对人膜联蛋白A2受体基因的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，本发明提供了一种特异性抑制膜联蛋白A2受体的小核酸干扰分子，以及该siRNA在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。本发明针对AXIIR基因表达的siRNA，实验证明可以抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移、管样形成，可以诱导细胞周期的阻滞。本发明的siRNA可以用于制备成稳定、有效、低毒的抑制AXIIR表达的、治疗新生血管性疾病的生物靶向制剂或药物。

Description

一种针对人膜联蛋白A2受体基因的siRNA及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及特异性抑制膜联蛋白A2受体的小核酸干扰分子，以及在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。

背景技术

新生血管性疾病是一种在原有血管基础上生长出新血管的过程，具有重要的生理及病理意义。在出生后新生血管生成利于组织器官的生长，但在成年时期，大部分血管维持在静止状态，在病理性刺激下，血管内皮内皮细胞可以恢复增殖能力，以进一步促进新生血管形成。病理性新生血管的生成涉及到多种细胞因子的分泌及调节失控，其参与了多种疾病的发生发展，如肿瘤、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎及肺动脉高压等等。在过去的十年间，研究人员进行了大量研究寻求抑制新生血管的治疗策略，以预防及治疗肿瘤、关节、眼底和皮肤病变等。目前抗新生血管药物，血管内皮生长因子单抗，已经应用于临床治疗新生血管性疾病。然而，由于血管内皮生长因子单抗发挥作用时效较短，需要多次治疗，并且存在一定的全身性副作用。因此，寻求其它安全有效的治疗手段，对治疗新生血管性疾病具有重要的意义。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是近来发展日趋成熟的一门基因沉默技术，是内源性或外源性的双链RNA在基因转录后水平上，介导细胞内信使RNA(mRNA)发生特异性降解，导致靶基因表达沉默，从而产生相应功能表型的缺失，是特异性抑制靶基因表达的过程，具有高效性、特异性的特点。在不影响正常基因功能的前提下，RNA干扰可以抑制重要基因的表达，从而达到基因治疗的目的，其对靶基因具有很好特异性及对目的基因抑制作用是其它药物难以匹敌的。随着RNA干扰技术的不断完善，针对病理性新生血管的RNAi具有广阔的应用前景。

膜联蛋白A2受体(Annexin Ⅱ receptor,AXIIR)，又称5号染色体开放阅读框39(Chromosome5open reading frame39,C5orf39)，最早是在人骨髓cDNA中被克隆出来，并发现其可以与膜联蛋白A2相互作用，后鉴定为膜联蛋白A2的受体(Lu G,Maeda H,Reddy SV,Kurihara N,Leach R,Anderson JL,et al.Cloning and characterization of the annexin II receptor on human marrow stromalcells.The Journal of biological chemistry2006；281:30542-50)。AXIIR的基因编码蛋白为193个氨基酸，并且其表达具有种属差异性，在人、猿、猴等中表达，而在鼠、兔等中不表达。研究人员发现AXIIR可以与膜联蛋白A2相互作用，介导膜联蛋白A2促进细胞增殖，迁移和黏附(Annexin II interactions with theannexin II receptor enhance multiple myeloma cell adhesion and growth in the bonemarrow microenvironment.Blood2012；119:1888-96)。然而，有研究发现，AXIIR不是膜联蛋白A2的特异性受体，可以诱导多种细胞的凋亡(Xiong Y,Fan C,Kong L,Dong L,Zhu N,Zhang J,et al.Annexin II receptor induces apoptosisindependent of Annexin II.Apoptosis:an international journal on programmed celldeath2013；18:925-39.)。这些研究表明，AXIIR除介导膜联蛋白A2功能外，还发挥着广泛的功能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种特异性抑制膜联蛋白A2受体的siRNA，本发明另一目的在于提供该siRNA在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。

本发明以RNA干扰技术为基础，从GenBank获得人膜联蛋白A2受体(AnnexinⅡreceptor,AXIIR)的cDNA序列(GenBank:AY032883.1)，根据siRNA靶序列的基本原则，针对AXIIR设计了三条21个核苷酸的siRNA，其序列如下：

将上述干扰RNA转染进脐静脉血管内皮细胞后发现，siRNA2抑制AXIIR基因表达的干扰效果最明显。

本发明的第一方面，是提供了一种抑制人膜联蛋白A2受体的干扰序列(siRNA2)，其序列如下：

正义链5’-CCACCUAUUGUGAGUUCAG-3’(SEQ ID NO:3)

反义链5’-CUGAACUCACAAUAGGUGG-3’(SEQ ID NO:4)

3’端再加上TT以增加siRNA的稳定性。

本发明的第二方面，提供了上述的siRNA2在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。

本发明的siRNA2可用于制备AXIIR受体的抑制剂。

本发明所述的新生血管性疾病，具体是指一种病理性新生血管的生成症状，即在病理性刺激下，血管内皮内皮细胞恢复增殖能力，在原有血管基础上生长出新血管，例如炎症性疾病、肿瘤、糖尿病视网膜病变、类风湿性关节炎及肺动脉高压等等。

本发明的有益效果是，本发明针对AXIIR基因表达的siRNA，可以抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移、管样形成，可以诱导细胞周期的阻滞。

本发明siRNA可以用于制备成稳定、有效、低毒的抑制AXIIR表达的、治疗新生血管性疾病的生物靶向制剂或药物。

附图说明

图1为AXIIR基因干扰后脐静脉血管内皮细胞AXIIR的mRNA表达及蛋白表达水平效果图；其中A为蛋白凝胶电泳图，B统计图。

图2为AXIIR基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞增殖能力的统计图。

图3为AXIIR基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞迁移能力的影响图及统计图，其中A为空白对照组光镜图，B为阴性对照组光镜图，C为干扰组光镜图，D为统计图。

图4为AXIIR基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞贴壁能力的影响图及统计图，其中A为空白对照组光镜图图，B为阴性对照组光镜图图，C为干扰组光镜图图，D为统计图。

图5为AXIIR基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞管样形成能力的影响图及统计图，其中A为空白对照组光镜图图，B为阴性对照组光镜图图，C为干扰组光镜图图，D为统计图。

图6为AXIIR基因干扰后对脐静脉血管内皮细胞细胞周期影响图及统计图，其中A为空白对照组细胞周期分布图，B为阴性对照组细胞周期分布图，C为干扰组细胞周期分布图，D为统计图。

具体实施方式

现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。

以下实施例中所使用的技术，包括PCR扩增与检测、细胞转染、RNA提取及反转录等分子生物学技术，以及细胞培养、检测技术等，除非特别说明均为本领域内的技术人员已知的常规技术；所使用的仪器设备、试剂和细胞系等，除非是本说明特别注明，均为一般本领域的研究和技术人员可以通过公共途径获得的。

实施例1：siRNA的合成

检索NCBI GeneBank得到AXIIR全序列和mRNA序列，利用现有的网络资源及常用软件对AXIIR进行生物学分析，选择编码区作为siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则，并通过GeneBank数据库的blast功能与人类基因组序列进行对比，确保无同源性；排除aitisense链的5’端连续8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA；排除任何一段连续14个碱基与其它基因配对的潜在siRNA。

本实施例设计并合成的siRNA序列为

从图1中看出，siRNA2可以将AXIIR表达抑制掉20％左右；siRNA2可以将AXIIR表达抑制到50％以上，siRNA3可以将AXIIR抑制掉20％左右。

因此，本发明从中筛选出干扰效果最好，即抑制AXIIR表达效果最显著的siRNA2进行进一步的实验。

实施例2：细胞转染

(1)转染前1天，收集对数生长期细胞，接种于12孔板内，接种数量约为5×10⁴个细胞，加入1mL培养基。

(2)100μL Opti-MEM培养基内加入4μL脂质体转染试剂，轻轻吹打，室温静置5min。

(3)100μL Opti-MEM培养基内加入60Nm,柔和混匀。

(4)混合转染试剂和siRNA稀释液，轻轻吹匀，室温静置20min。

(5)转染后8h换液，继续培养48h后，进行转染后其它操作。

实施例3：实时荧光定量RT-PCR和蛋白免疫印迹法检测脐静脉血管内皮细胞中AXIIR的mRNA和蛋白表达

具体过程如下：

1实时荧光定量RT-PCR

(1)总RNA提取：收集细胞至1.5mL无RNA酶离心管中，加入0.5mLTrizol，在冰上充分混匀吹打，静置10min。加入0.125mL氯仿，剧烈振荡20s，冰上静置5min。4℃离心，12000r/min×15min，吸取0.2mL上清至另一个1.5mL,进而加入与上清等量的异丙醇，轻轻混匀，冰上静置10min。4℃离心，12000r/min×15min，弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃离心，12000r/min×15min。弃上清，晾干，溶于20μLDEPC水中。多功能酶标仪测定提取RNA的浓度和纯度。

(2)反转录：利用takara反转录试剂盒将抽提的总RNA反转录为cDNA，反应体系如下，

混匀后离心，37℃15min，85℃5sec。

(3)荧光定量RT-PCR：利用takara的SYBR Premix Ex Taq试剂盒进行反应，反应体系如下，

利用Rotor Gene3000A仪器进行两步法扩增，95℃预变性2min,进入40个PCR循环，95℃5s,60℃30s。

2蛋白免疫印迹。

(1)HUVECs总蛋白用改进的蛋白裂解液提取。

(2)30ug蛋白加到12.5％浓度的蛋白胶中电泳，并用电转仪转到PVDF膜上,。

(3)蛋白的非特异性位点用脱脂牛奶封闭后用一抗封闭，4℃过夜，然后用TBST缓冲液洗三遍。

(4)然后用HRP标记二抗室温孵育2小时，继而用TBST缓冲液洗三遍。

(5)最后，利用显色液显色并拍照分析.

3结果

如图所示1，AXIIR的siRNA可以明显抑制AXIIR的mRNA及蛋白表达。

实施例4：CCK-8方法检测细胞增殖

(1)收集对数生长期细胞，以每孔3000个的密度接种于96孔板。

(2)细胞过夜贴壁后，利用脂质体转染试剂介导转染，换液后48h检测细胞增殖情况。

(3)吸弃原有培养基，每孔加入含10μL CCK-8的新鲜培养基110μL，培养3h后用多功能酶标仪在450nm波长检测各孔吸光度值。

(4)实验重复3次，结果如图2所示，AXIIR干扰后细胞增殖能力较阴性对照组及空白对照组明显降低。

实施例5：细胞迁移实验

(1)细胞迁移实验是利用孔径为8μM的transwell小室实施的。

(2)将转染siRNA48h后的细胞消化重悬，接种1×10⁵细胞于transwell小室的上室，培养基的血清浓度为0.5％。

(3)下室加入700μL含1％血清浓度的培养基。

(4)在孵箱孵育12h后弃去培养基，将小室用多聚甲醛固定20分钟。

(5)将上室膜上层的细胞用棉签擦去，继而用结晶紫对细胞进行染色15分钟。

(6)迁移至膜下层的细胞用倒置显微镜观察并拍照分析。

(7)结果如图3所示，AXIIR干扰后细胞迁移能力较阴性对照组及空白对照组明显降低。

实施例6：细胞贴壁实验

(1)将转染siRNA48h后的细胞消化重悬，接种1×10⁵细胞于24孔板。

(2)在孵箱孵育4h后弃去培养基，用预冷的PBS轻轻洗去未贴壁细胞。

(3)用多聚甲醛固定20分钟，继而用结晶紫对细胞进行染色15分钟。

(4)对贴壁的细胞用倒置显微镜观察并拍照分析。

(5)结果如图4所示，AXIIR干扰后细胞贴壁能力较阴性对照组及空白对照组明显降低。

实施例7：细胞管样形成实验

(1)用无血清培养基将基质胶稀释至浓度为5mg/mL并混匀，将50uL稀释好的基质胶加入96孔板孔中，在37℃孵箱中孵育40分钟使基质胶变为固态。

(2)将转染siRNA48h后的细胞消化重悬，将含4×10⁴细胞的100μL培养基加入铺有基质胶的96孔板中并孵育3小时。

(3)管样形成的结构用倒置显微镜观察并拍照分析。

(4)结果如图5所示，AXIIR干扰后细胞管样形成能力较阴性对照组及空白对照组明显降低。

实施例8：细胞周期分析

(1)收集对数生长期细胞，接种于12孔板内，接种数量约为5×10⁴个细胞，加入含0.5％血清的培养基，饥饿16h。

(2)细胞转染48h后，用胰酶消化收集细胞，磷酸盐缓冲液洗一遍后用70％的乙醇固定16小时。

(3)固定后的细胞离心去乙醇并用PBS洗2遍。

(4)细胞用0.5mL含20ug/mLPI及200ug/mLRNA酶的PBS重悬，并室温孵育30分钟。

(5)样品用MACSQuant流式细胞仪分析，数据用Modfit软件处理分析。

(6)结果如图6所示，AXIIR干扰组较阴性对照组及空白对照组处于S期细胞明显增多。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (4)

1.一种抑制人膜联蛋白A2受体的siRNA，其序列如下：

正义链如SEQ ID NO:3所示；

反义链如SEQ ID NO:4所示。

2.一种如权利要求1所述的抑制人膜联蛋白A2受体的siRNA在制备治疗新生血管性疾病药物中的应用。

3.一种如权利要求1所述的抑制人膜联蛋白A2受体的siRNA在制备AXIIR受体抑制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的抑制人膜联蛋白A2受体的siRNA在制备AXIIR受体抑制剂中的应用，该应用是该siRNA抑制脐静脉血管内皮细胞的增殖、迁移、管样形成，诱导细胞周期的阻滞。