CN106668876A

CN106668876A - 一种过表达c5orf39基因质粒构建方法及其在新生血管形成中的应用

Info

Publication number: CN106668876A
Application number: CN201611189174.2A
Authority: CN
Inventors: 赵世红; 郭婷; 赵子畅
Original assignee: Shanghai Changhai Hospital
Current assignee: Shanghai Changhai Hospital
Priority date: 2016-12-21
Filing date: 2016-12-21
Publication date: 2017-05-17

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体是人c5orf39基因在制备抑制新生血管形成药物中的应用。本发明将所述的重组质粒包装慢病毒感染人的视网膜血管内皮细胞及人脐静脉内皮细胞后，重组质粒作用于人c5orf39基因可抑制人视网膜血管内皮细胞及脐静脉内皮细胞的增殖。因此，本发明有助于研究c5orf39基因功能，并且为研究c5orf39基因在人视网膜血管内皮细胞及其他部位异常新生血管中发病的作用机制提供了有用的分子生物学工具。

Description

一种过表达c5orf39基因质粒构建方法及其在新生血管形成中的应用

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体地说，是一种能过表达c5orf39基因的真核重组质粒，以及利用该重组过表达质粒为研究c5orf39功能提供了良好工具，也为研究人视网膜新生血管及其他病理性新生血管中c5orf39基因的功能提供有效实验方法。

背景技术

视网膜新生血管(retinal neovascularization,RNV)病变是眼部多种疾病的病理改变，包括早产儿视网膜病变、糖尿病视网膜病变、年龄相关性的黄斑变性和视网膜中央静脉阻塞等。RNV为病理性的异常血管，因其丧失正常的血管结构和功能，一经形成，即会产生出血、渗出、增生等严重并发症，已成为世界范围内的致盲性疾病。目前临床对于RNV的治疗方法主要包括激光光凝、光动力疗法、经瞳孔的温热疗法和外科手术干预等。这些方法可以挽救部分患者的视力，但由于它们只是去除了新生血管组织而没有解决病理性新生血管发生的原因，因而大部分患者视力不能恢复到较好。探索新生血管的形成过程以寻求对其进行靶向治疗的方法，是眼底病患者及广大学者共同的愿望。

基因工程，又称基因重组技术，是二十世纪七十年代发展起来的在体外对DNA进行操作的一门技术，广泛用于疾病基础研究、基因治疗、基因免疫、基因疫苗等。其三要素分别为：酶、目的基因、载体。而真核表达载体是基因工程中用于构建真核基因表达系统的一种载体，近几十年来，各国学者围绕真核表达载体进行了各种疾病、基因等相关研究，在基因工程方面做了大量研究工作，为医学科学研究开辟了崭新途径。C5orf39基因编码的蛋白C5ORF39，是一个193个氨基酸的蛋白质，被认为是膜联蛋白A2的受体，通过与膜联蛋白A2结合来促进肿瘤细胞的迁移、增殖、粘附等，后来又发现C5ORF39可以独立于膜联蛋白A2参与多种人源细胞的凋亡与自噬，因此，我们猜测C5ORF39可能以一种更广泛的方式参与细胞的活动。

本发明应用基因重组技术，针对c5orf39基因，构建重组真核表达载体(Lenti-c5orf39)，并将其包装慢病毒感染HREC、HUVEC等血管内皮细胞，构建稳定感染c5orf39基因的细胞株，为研究c5orf39功能提供了良好工具，亦为进一步研究c5orf39基因在视网膜新生血管中的生物学功能打下基础，同时也为研究人其他部位病理性新生血管中c5orf39基因的功能提供有效实验方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的真核重组质粒及其制备方法，并证明所述重组质粒为c5orf39功能研究提供了良好的实验工具，也为研究人眼底视网膜新生血管及其他部位异常新生血管中c5orf39基因的功能提供有效实验方法。

人c5orf39基因已在GenBank注册，注册号为NM-001014279.2，定位于5p12，全长1280bp，编码193个氨基酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第一方面，提供人c5orf39基因在制备抑制新生血管形成药物中的应用。

优选的，所述的抑制新生血管形成药物为抑制人眼底视网膜新生血管形成的药物。

优选的，所述的抑制新生血管形成药物为抑制肿瘤新生血管形成的药物。

本发明的第二方面，提供一种真核重组质粒，所述的真核重组质粒包含核苷酸序列SEQ ID NO.1所述的人c5orf39基因，所述的质粒为lenti载体质粒。

所述的真核重组质粒的制备方法包括以下步骤：

a、通过PCR合成人的c5orf39基因片段；

b、将步骤a扩增的核苷酸序列片段与真核质粒连接，该插入片段的酶切位点分别为Xbar I和Sal I，再将所述的真核重组质粒转化到感受态细菌细胞中、涂板子、挑克隆、摇菌扩增，使用碱裂解法抽提真核重组质粒；

c、通过DNA测序筛选出正确插入的重组质粒克隆。

本发明的第三方面，提供上述真核重组质粒在制备抑制新生血管形成药物中的应用。

本发明的第四方面，提供一种重组慢病毒载体，所述的重组慢病毒载体包含核苷酸序列SEQ ID NO.1所述的人c5orf39基因。

所述的重组慢病毒载体的制备方法包括以下步骤：将上述真核重组质粒与三种包装质粒MDL、REV、VSVG共转染人胚肾细胞(293T)，在细胞上清液中收获只有感染能力而无复制能力的重组慢病毒载体颗粒。

本发明的第五方面，提供上述重组慢病毒载体在制备抑制新生血管形成药物中的应用。

本发明的第六方面，提供一种抑制新生血管形成的药物，所述的药物包括上述真核重组质粒或重组慢病毒载体。

本发明将所述的重组质粒包装慢病毒感染人的视网膜血管内皮细胞及人脐静脉内皮细胞后，重组质粒作用于人c5orf39基因可抑制人视网膜血管内皮细胞及脐静脉内皮细胞的增殖。因此，本发明有助于研究c5orf39基因功能，并且为研究c5orf39基因在人视网膜血管内皮细胞及其他部位异常新生血管中发病的作用机制提供了有用的分子生物学工具。

附图说明

图1，2为本发明真核重组载体(Lenti^c5orf39)在人视网膜血管内皮细胞HREC和在人脐静脉血管内皮细胞HUVEC中表达的图片。其中，图1A为HREC细胞中c5orf39基因mRNA表达的统计图，图1B为HUVEC细胞中c5orf39基因mRNA表达的统计图，图2A为HREC细胞中C5ORF39蛋白表达图，图2B为HUVEC细胞中C5ORF39蛋白表达图。

图3为感染Lenti^c5orf39真核重组质粒组，感染空载体的阴性对照组，未感染质粒的空白对照组HREC和HUVEC细胞增殖统计图。其中，图3A为各组处于复制期的HREC细胞(蓝色为DAPI染核，代表全部的细胞，红色代表处于复制期的细胞)，图3B为各组处于增殖期的HREC细胞的百分比统计图，图3C为各组处于复制期的HUVEC细胞，图3D为各组处于增殖期的HUVEC细胞的百分比统计图。

图4为感染Lenti^c5orf39真核重组质粒组，感染空载体的阴性对照组，未感染质粒的空白对照组HREC和HUVEC细胞迁移图。其中，图4A为三个组HREC细胞迁移的代表性图片，图4B为三个组HUVEC细胞迁移的代表性图片，图4C为HREC细胞迁移细胞数百分比的统计图，图4D为HUVEC细胞迁移细胞数百分比的统计图。

图5为感染Lenti^c5orf39真核重组质粒组，感染空载体的阴性对照组，未感染质粒的空白对照组HREC和HUVEC细胞管腔形成图。其中，图5A为各组HREC管样形成的代表性图片，图5B为为各组HREC管样形成的代表性图片，图5C为HREC细胞管样结构数量的统计图，图5D为HUVEC细胞管样结构数量的统计图。

图6感染Lenti^c5orf39真核重组质粒组，感染空载体的阴性对照组，未感染质粒的空白对照组HREC和HUVEC细胞周期图。其中，图6A为流式细胞仪检测HREC细胞细胞周期的分析结果图，图6B为HREC细胞处于各个期细胞数的统计图，图6C流式细胞仪检测HUVEC细胞细胞周期的分析结果图为，图6D为HUVEC细胞处于各个期细胞数的统计图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。下述实施例中，凡未注明具体实施条件的，均可按照本领域技术人员熟知的常规条件；实验室手册中的条件、按照制作厂商所建议的条件。

实施例1：构建重组真核表达载体Lenti-c5orf39

1、c5orf39基因的克隆

根据Gene Bank的编码序列，用primer premier 5软件设计引物(c5orf39)，分别如下：

引物序列：

F-TCTAGAGCCGCCACCATGGAGCAACATTTTCTTGGC(SEQ ID NO.2)

R-GTCGACCTAAGGCTGCTTAGCTCCACAGATCCG(SEQ ID NO.3)

(PCR反应中的PrimerSTAR HS保真酶由Takara公司提供)

反应体系：50ul

PCR成功扩增出人c5orf39基因编码序列(CDS)，PCR产物电泳后在582bp出获得扩增产物条带，与目的基因片段大小基本一致。

2、PCR产物电泳后纯化回收，试剂盒为TIANGEN公司的PCR纯化回收试剂盒，操作按说明书。实验步骤为：

1)切取PCR产物所在位置凝胶，称重，c5orf39基因为0.25g；

2)加入250ul binding buffer，55℃水浴温至凝胶全部融化；

3)将2步所得的液体全部移入吸附柱，12000rpm离心1分钟，弃滤过液；

4)加入500ul washing buffer于吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃滤过液；

5)加入750ul washing buffer于吸附柱中，12000rpm离心1分钟，弃滤过液；

6)吸附柱再次离心，12000rpm离心3分钟，弃滤过液；

7)将吸附柱移入干净1.5mlEP管中，加入45ul无核酶水于吸附柱中洗脱DNA；

8)12000rpm离心1分钟，收集滤过液，即为纯化的DNA溶液。

3、真核表达载体线性化与c5orf39基因连接

反应条件：37℃水浴温育2-3小时。

所述的Lenti-载体序列如SEQ ID NO.9所示，其中SalI和XbaI的酶切位点：XbaIT/CTAGA 1:4731，SalI G/TCGAC 1:5485。

酶切产物回收(试剂盒同PCR产物回收)，酶切后的载体和PCR产物用于下一步的连接反应，连接反应体系如下：

反应体系10ul

反应条件：16℃金属浴温育，过夜。

4、真核重组质粒Lenti-c5orf39转化Top10感受态细胞，实验步骤如下：

1)冰上化开Top10感受态取20ul，

2)加入5u连接产物，快速轻弹混匀，静置冰浴30min；

3)42℃水浴热激30sec，轻轻拿出放在冰上2min；

4)加入等体积的无抗生素的LB培养基，37℃，200rpm摇床活化1h；

5)取一半培养物涂布LB琼脂平板(含Amp100ug/mL)，37℃敷箱培养过夜；

6)挑取单个克隆菌落摇菌。c50rf39挑取4个克隆，编号为1，2，3，4。分别进行摇菌过夜，菌液12000rpm离心1min，弃上清，沉淀送检进行DNA测序分析(上海睿迪生物科技有限公司)。测序结果见SEQ ID NO.8，将本实验的测序结果通过BALST比对，发现与GeneBank中公布的序列一致，目的基因片段长度实为582bp。测序正确的克隆进行培养过夜提取质粒备用(质粒提取试剂盒，QIAGEN公司)。

实施例2：真核重组表达载体Lenti-c5orf39的活性鉴定

1.细胞培养

分别用5％的胎牛血清ECM培养基(Sciencell公司购买)和10％DMEM高糖培养基(Gibco公司购买)于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中培养人视网膜血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞细胞株和人胚肾细胞(293T)(HREC从Sciencell公司购买，HUVEC、293T从ATCC购买)至铺满培养瓶。

2.真核表达质粒Lenti-c5orf39慢病毒包装

2.1铺满培养瓶的293T细胞接种到10cm的皿，培养过夜，待皿里的293T细胞约90％-95％时，进行慢病毒包装。

2.2①将200ulLipofectamine2000与3mLOpti-MEM预混5分钟；

2.3②将22.2ugMDL、16.65ugREV、16.65ugVSVG包装质粒分别与40ugLenti-c5orf39质粒、40ugEGFP质粒预混；

2.4③将预混好的①各取1.6mL加入293T细胞中，混匀，37℃，5％CO敷箱敷育20min；

2.5④10cm皿中培养过夜的293T细胞用Opti-MEM换液后，将③加入每个皿，皿盖上注明目标质粒名称、转染量及时间；

2.6⑤6h后，用DMEM进行换液；

2.7⑥从DMEM换液开始算起，分别在24h、48h、72h收取细胞上清液(每次收取上清液后加入新的培养基)，12000rpm，离心10分钟，上清液用病毒浓缩柱(Millipore公司购买)将上清液浓缩为1mL，留作后续感染HREC及HUVEC备用。

实施例3：真核重组表达载体Lenti-c5orf39的活性鉴定

1.1)细胞培养同实施例2.1.细胞培养；

2)分别取培养瓶中1/4视网膜血管内皮细胞HREC接种于6孔板的每一孔中；

3)待细胞贴壁后加入5ul预先包好的慢病毒，感染人视网膜血管内皮细胞HREC；

4)37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育；实验设置三个组：实验组(lenti-c5orf39)，阴性对照组(lenti-EGFP)，空白组(control)。

5)感染24h后，弃细胞培养板内原有的培养基，每孔各加入2.5mL含5％胎牛血清ECM培养基，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育。48h后用含600ug/mLG418的ECM培养基，筛选14d，每隔3天换一次培养基。挑选单克隆细胞群维持G418抗性培养，G418的维持浓度为33ug/mL，得到稳定感染的HREC细胞株。

人脐静脉血管内皮细胞HUVEC稳定细胞株的构建及筛选过程与上述一致。

2.总RNA的提取

1)取稳定感染后的实验组(lenti-c5orf39)，阴性对照组(lenti-EGFP),空白组(control)加入TRIzol试剂(Sigma公司)500uL，然后转移到1.5mLEP管中，室温静置5分钟；

2)加入150ul的氯仿，上下颠倒摇匀5-10次左右，离心(提前打开离心机预冷)15min，12500rpm，4℃；

3)将上清液转移到新的1.5mL EP管中，加入200uL的异丙醇上下颠倒混匀，室温静置10min，离心15min，12500rpm，4℃，弃上清，在管底部可见乳白色小沉淀物，即为RNA；

4)加入75％的乙醇，混合震荡，离心10min，12000rpm，4℃，弃上清，通风，室温干燥5min，让乙醇挥发，然后加入20uL质量浓度为0.1％DEPC水溶解RNA，充分混匀；

5)酶标仪检测每个样品的浓度，确保OD260/0D280的值在1.8-2.0之间，并且每个样品的RNA均使用DNA酶进行处理以去除基因组污染。

3.cDNA第一链的合成

反应体系20uL：

5×Primescript RT Master Mix 4uL

mRNA 1ug

RNase Free dH₂O 补齐至20ul

(Primescript RT Master Mix Kit购买于TaKaRa公司)

42℃，水浴，30min

4.荧光定量PCR实验

4.1荧光定量PCR引物设计

根据人(homo spaiens)c5orf39基因全长cDNA的开放阅读框(Open readingFrame,ORF)序列，设计荧光定量PCR所需引物。所用软件为Primer Preimer5.0及OLig6。保证PCR产物长度在150-250bp。引物设计好后，进一步在NCBI上通过BLAST比对验证引物的特异性是否良好。采用人(homo spaiens)gapdh(脱氧核苷酸序列见NCBI数据库)作为内参，引物序列见下表。

表1定量PCR引物

4.2荧光定量PCR扩增

采用SYBR GREEN染料法进行荧光定量PCR扩增，并根据荧光定量PCR试剂盒操作说明书(TaKaRa company)控制实验规范性。反应体系为20uL：

然后放入eppendorf管在荧光定量PCR仪进行扩增。分别检测实验组、阴性对照组、空白对照组c5orf39基因的mRNA的表达水平。反应完毕后对实验结果进行分析，实验结果表明：人视网膜血管内皮细胞感染后，实验组中c5orf39基因相对表达水平明显高于其它两组，脐静脉内皮细胞实验组c5orf39的表达同样也高于其它两组，其差异均有统计学意义(见图1A,1B)。

实施例4：Western blot检测c5orf39目的基因表达

1、总蛋白提取(在冰上操作)

稳感细胞弃掉培养基，PBS洗一遍，根据细胞量加入适量的蛋白裂解液(HREC一瓶细胞加400u裂解液，HUVEC一瓶细胞加2mL裂解液)，于冰上左右摇床上裂解10-15min左右，收集裂解液于EP管中，离心15min，12000rpm，4℃，转移上清至新的EP管中，-80℃保存。

2、BCA蛋白定量法测定蛋白质的含量

按照BCA蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime)制备蛋白标准曲线；根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积试剂B(50:1)配置适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定；取1uL蛋白样品到96孔板的样品板中，加标准品稀释液补足到20uL；对照组加50uL去离子水；各孔加入200uL的BCA工作液，37℃放置30min，测定A570nmd处读取A值；根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

3、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳

样品制备：经过定量后的蛋白样品按体积加入5×loading buffer，沸水浴煮15min分钟左右，离心5min，12000rpm，-20℃保存。根据待检测蛋白分子量的大小配置12.5％的凝胶。每孔加入40ug蛋白，以起始电压50V电泳，待样品电泳至分离胶，电压调整为110V，继续电泳约1.5h，溴酚蓝刚跑出凝胶即终止电泳，取下凝胶后适当裁剪后进行转膜。

4、转膜

准备配套的海绵、滤纸和PVDF膜，将PVDF膜置于甲醇中浸泡以活化膜，后将膜转移至转膜缓冲液中浸泡。在转膜仪上按照“黑胶白膜”，即转膜仪黑色的一面放置凝胶，白色的一面放置PVDF膜，以海绵-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵的顺序装好，排除气泡，在转膜缓冲液中280mA恒流转膜，转膜时间依据分子量的大小而不同(c5orf39基因蛋白是22KDa，转膜时间1.5h)。

5、免疫反应

转膜完毕后，将膜放入封闭液(含5％脱脂奶粉的1×TBST(1×TBS，0.1％Tween20)溶液中，室温下摇床上封闭。2-2.5h后，用TBST液在摇床上洗膜3次，每次5min。抗体稀释液稀释的一抗4℃孵育过夜。第二天用1×TBST在摇床上洗膜3次，每次5min。孵育用5％的脱脂奶粉稀释的二抗，室温下孵育2h左右，用1×TBST在摇床上洗膜3次，每次5min。

6、曝光

在EP管中等体积混合ECL液的A液和B液，加到PVDF膜的正面。置于凝胶成像系统，曝光共10min，每30s收集照片一张。

7、凝胶图像分析

目的蛋白及内参照gapdh蛋白条带用Quantity one analysis software(Bio-Rad，美国)分析，测其吸光度值(optical density,OD)，取目的蛋白与内参蛋白gapdh蛋白的吸光度的比值作为目的蛋白的相对含量。

实验结果显示：HREC细胞中C5ORF39蛋白的表达水平较其它两组明显升高，其差异具有统计学意义，HUVEC细胞中C5ORF39蛋白的表达水平检测也得到同样的结果(见图2A,2B)。

实施例5：感染c50rf39基因后对人视网膜血管内皮细胞株HREC与人脐静脉血管内皮胞株HUVEC的功能(包括增殖、迁移、管样形成)影响

1.细胞增殖影响

稳定感染后的人视网膜血管内皮细胞实验组(lenti-c5orf39)，阴性对照组(lenti-EGFP)，空白组(control)HREC的细胞弃去培养基，PBS洗一遍，胰酶消化后进行细胞计数，以每孔4000个细胞种于96孔板，48h后，进行EdU细胞增殖检测(Cell-Light^TM EdUApollo567in Vitro Kit在广州锐博公司购买)，实验步骤如下：

1.1EdU标记

1)用ECM培养基按1000:1的比例EdU溶液(试剂A)，制备适量的50uMEdU培养基；

2)每孔加入100uL50uM EdU培养基孵育2h，弃去培养基；

3)PBS清洗细胞1-2次，每次5min。

1.2.细胞固定化

1)每孔加入50uL细胞固定液(4％多聚甲醛)，室温孵育30min，弃固定液；

2)每孔加入50uL 2mg/Ml甘氨酸，脱色摇床孵育5min，弃甘氨酸溶液；

3)每孔加入100uLPBS，脱色摇床孵育5min，弃PBS；

4)(加强)每孔加入100uL渗透剂(0.5％TrionX-100的PBS)脱色摇床孵育10min，PBS清洗一遍，5min；

1.3.Apollo染色

1)每孔加入100uL的1×Apollo染色反应液(配液比例按照说明书配置)，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；

2)加入100uL渗透剂(0.5％TrionX-100的PBS)脱色摇床清洗2-3次，每次10min，弃渗透剂；

3)(加强)每孔每次加入100uL甲醇清洗1-2次，每次5min，PBS清洗1次，每次5min。

1.4.DNA染色

1)用去离子水按100:1的比例稀释试剂F，制备适量1×Hoechest3342反应液，避光保存；

2)每孔加入100UL1×Hoechest3342反应液，避光、室温、脱色摇床孵育30min后，弃染色反应液；

3)每孔每次加入100uLPBS，清洗1-3次；

4)每孔加入100uLPBS保存待用。

1.5实验结果分析：荧光显微镜观察：视野中1×Hoechest3342反应液染核显示蓝色，代表视野中所有的细胞，EdU染色显示红色，代表视野中处于增殖期的细胞。对视野中的细胞进行计数、相对比(红色细胞计数/蓝色细胞计数)计算得出：人视网膜血管内皮细胞实验组的细胞增殖减慢，细胞数相较于阴性对照组、空白组HREC明显减少；人视网膜血管内皮细胞实验组的红色细胞计数/蓝色细胞计数比值明显低于其他两种，其差异具有统计学意义，表明c5orf39基因能抑制人视网膜血管内皮HREC细胞的增殖(见图3A,3B)。

人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖实验操作同人视网膜血管内皮细胞HREC，实验结果分析：人脐静脉血管内皮细胞实验组的细胞增殖减慢，细胞数相较于阴性对照组、空白组HUVEC明显减少；人脐静脉血管内皮细胞实验组红色细胞计数/蓝色细胞计数比值明显低于其他两种，其差异具有统计学意义，表明c5orf39基因能抑制人脐静脉血管内皮HUVEC细胞的增殖(见图3C,3D)。

2.细胞迁移影响

稳定感染后的人视网膜血管内皮细胞实验组、阴性对照组、空白组HREC细胞进行transwell小室(Corning Incorporated公司购买)细胞迁移：

1)将胎牛血清为5％ECM培养基稀释配成1％、2％ECM各2mL；

2)24孔板中取3个孔每孔加入500uL的2％ECM，随后将trasnwell小室放入孔内；

3)稳定感染的实验组、阴性对照组、空白组HREC的细胞一瓶弃去培养基，PBS洗一遍，胰酶消化取部分细胞用1％ECM稀释，进行细胞计数，

4)将计数好的三组细胞均以35000个/孔加入小室，放入37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育；

5)14h左右，将24孔板内的小室移到新孔，4％多聚甲醛固定30min；

6)PBS洗一遍，20％的结晶紫溶液染色2h；

7)PBS洗一遍，白光显微镜观察三组穿移到小室另一侧的细胞数。

实验结果分析：白光显微镜观察细胞呈结晶紫染色后的紫色，实验组的迁移细胞数明显少于阴性对照组和空白组，其差异具有统计学意义，表明c5orf39基因能抑制人视网膜血管内皮HREC细胞的迁移(见图4A,4C)。

人脐静脉内皮细胞HUVEC增殖实验操作同人视网膜血管内皮细胞HREC，不同的是每组加入20000个/孔进行细胞迁移，实验结果分析：白光显微镜观察细胞呈紫色，实验组的迁移细胞数明显少于阴性对照组和空白组，其差异具有统计学意义，表明c5orf39基因能抑制人脐静脉血管内皮HUVEC细胞的迁移(见图4B,4D)。

3.管样形成影响

稳定感染后的人视网膜血管内皮细胞实验组、阴性对照、空白组HREC的细胞进行管样形成实验：

1)150uL matrigel铺48孔板3个(冰上操作)，4℃孵育30min，37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育30min；

2)实验组、阴性对照组、空白组三组计数，以每孔30000个细胞加入48孔板，37℃，5％CO₂细胞培养箱孵育2-4h；

3)轻轻弃去培养基，4％多聚甲醛固定30min；

4)加入自带荧光的骨架蛋白抗体F-actin，左右摇床孵育30分钟，PBS洗3遍，每次15分钟；

5)每孔加入100uL1:10000稀释的DAPI，左右摇床孵育20min；

6)PBS洗3遍，每次5min，每孔加入100uLPBS保存备用。

实验结果分析：荧光显微镜观察：视野中DAPI染核呈蓝色，F-actin染骨架蛋白呈红色。对视野中细胞所成的管样结构进行计数分析得：人视网膜血管内皮细胞实验组相较于阴性对照组、空白组成管数量明显减少，其差异具有统计学意义，经c5orf39基因处理后细胞多数不能形成完整的管样结构，表明c5orf39基因能够抑制人视网膜血管内皮细胞的管样形成(见图5A,5C)。

人脐静脉内皮细胞HUVEC管样形成实验操作同人视网膜血管内皮细胞HREC，不同的是每组加40000个/孔进行管样形成实验，实验结果分析：人脐静脉血管内皮细胞实验组HUVEC相较于阴性对照组、空白组成管数量明显减少，其差异具有统计学意义，经c5orf39基因处理后细胞多数不能形成完整的管样结构，表明c5orf39基因能够抑制人脐静脉血管内皮细胞的管样形成(见图5B,5D)。

实施例6：感染c50rf39基因后对人视网膜血管内皮细胞株HREC与人脐静脉血管内皮细胞株HUVEC的细胞周期的影响

采用流式细胞仪检测：

1.稳定感染后的人视网膜血管内皮细胞实验组HREC、阴性对照组、空白组HREC细胞弃去培养基，PBS洗一遍，胰酶消化，5％ECM中和胰酶后取部分细胞于1.5mL EP管中；

2.4000rpm，10min，离心；

3.弃上清液，600uLPBS洗一遍；

4.4000rpm，10min，离心；

5.弃废液，加入预冷的70％无水乙醇(先加300uLPBS，将细胞混匀，再加入700uL的无水乙醇)固定过夜；

6.隔天4000rpm，10min，离心；

7.弃废液，根据细胞量加入适当体积的PI(三箭生物购买CY2001-P)染液，避光、室温、左右摇床孵育30min后，流式细胞仪(Benkman Coulter,美国)上机检测。

流式细胞仪检测结果分析：人视网膜血管内皮细胞实验组相较于阴性对照组和空白组，G1的峰值不变，S期升高，G2期的峰值降低，从S期进入G2期的细胞减少，其差异具有统计学意义。实验结果表明：c5orf39基因可以通过抑制人视网膜血管内皮细胞的细胞周期来减慢细胞的增殖(见图6A,6B)。

人脐静脉内皮细胞HUVEC流式细胞仪检测细胞周期实验操作同人视网膜血管内皮细胞HREC，流式细胞仪检测结果分析：人脐静脉血管内皮细胞实验组相较于阴性对照组和空白组，G1的峰值不变，S期的峰值升高，G2期的峰值降低，细胞从S期进入G2期的细胞减少，其差异具有统计学意义。实验结果表明：c5orf39基因可以通过抑制人脐静脉血管内皮细胞的细胞周期来减慢细胞的增殖(见图6C,6D)。

以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海长海医院

<120> 一种过表达c5orf39基因质粒构建方法及其在新生血管形成中的应用

<130> /

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 582

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

atggagcaac attttcttgg ctgtgtgaag cgggcttggg attccgcaga ggtggcgcca 60

gagccccagc ctccacctat tgtgagttca gaagatcgtg ggccgtggcc tcttcctttg 120

tatccagtac taggagagta ctcactggac agctgtgatt tgggactgct ttccagccct 180

tgctggcggc tgcccggagt ctactggcaa aacggactct ctcctggagt ccagagcacc 240

ttggaaccaa gtacagcgaa gcccactgag ttcagttggc cggggacaca gaagcagcaa 300

gaggcacccg tagaagaggt ggggcaggca gaggaacccg acagactcag gctccagcag 360

cttccctgga gcagtcctct ccatccctgg gacagacagc aggacaccga ggtctgtgac 420

agcgggtgcc ttttggaacg ccgccatcct cctgccctcc agccgtggcg ccacctcccg 480

ggtttctcag actgcctgga gtggattctt cgcgttggtt ttgccgcgtt ctctgtactc 540

tgggcgtgct gttcacggat ctgtggagct aagcagcctt ag 582

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctagagccg ccaccatgga gcaacatttt cttggc 36

<210> 3

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

gtcgacctaa ggctgcttag ctccacagat ccg 33

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cggagtctac tggcaaaacg 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccttctgct gctatctaag 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

accacagtcc atgccatcac 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tccaccaccc tgttgctgta 20

<210> 8

<211> 991

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actctagatg catgctcgag cggccgccag tgtgatggat atctgcagaa ttgcccttag 60

ccgccaccat ggagcaacat tttcttggct gtgtgaagcg ggcttgggat tccgcagagg 120

tggcgccaga gccccagcct ccacctattg tgagttcaga agatcgtggg ccgtggcctc 180

ttcctttgta tccagtacta ggagagtact cactggacag ctgtgatttg ggactgcttt 240

ccagcccttg ctggcggctg cccggagtct actggcaaaa cggactctct cctggagtcc 300

agagcacctt ggaaccaagt acagcgaagc ccactgagtt cagttggccg gggacacaga 360

agcagcaaga ggcacccgta gaagaggtgg ggcaggcaga ggaacccgac agactcaggc 420

tccagcagct tccctggagc agtcctctcc atccctggga cagacagcag gacaccgagg 480

tctgtgacag cgggtgcctt ttggaacgcc gccatcctcc tgccctccag ccgtggcgcc 540

acctcccggg tttctcagac tgcctggagt ggattcttcg cgttggtttt gccgcgttct 600

ctgtactctg ggcgtgctgt tcacggatct gtggagctaa gcagcctcac catcatcatc 660

atcattaggt cgacaatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg actggtattc 720

ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct ttgtatcatg 780

ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg ttgctgtctc 840

tttatgagga gttgtggccc gtgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga 900

cgcaacccca ctggttgggc attgccacca cctgtcagct cctttccggg acttcgcttc 960

ccctccctat tgcacggcgg aactcatcgc g 991

<210> 9

<211> 7525

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180

tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 240

agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 300

gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360

cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420

agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 480

taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 540

tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600

taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660

acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 720

ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 780

cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840

agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 900

tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 960

agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 1020

tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1140

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1260

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1320

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1380

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1440

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1500

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1620

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 1680

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 1740

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 1800

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 1860

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 1920

aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1980

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2040

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2100

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2160

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat 2220

gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 2280

cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 2340

tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 2400

gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacggg tctctctggt 2460

tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 2520

aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 2580

actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 2640

cagggacctg aaagcgaaag ggaaaccaga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga 2700

agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag 2760

cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag 2820

atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca 2880

tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac 2940

atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga 3000

agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 3060

gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac 3120

caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt 3180

ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 3240

ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 3300

tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg acgctgacgg 3360

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 3420

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 3480

gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 3540

ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 3600

tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca 3660

caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag 3720

aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc 3780

tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt 3840

ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga 3900

cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag 3960

agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtta acttttaaaa 4020

gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag 4080

acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt atcgataagc 4140

ttgggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 4200

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 4260

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 4320

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 4380

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 4440

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 4500

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 4560

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 4620

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat 4680

cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccgac tctagaggat 4740

ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc 4800

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag 4860

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc 4920

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac 4980

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag 5040

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc 5100

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc 5160

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc 5220

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc 5280

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg 5340

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag 5400

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac 5460

gagctgtaca agtaaagcgg ccgcgtcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa 5520

agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta 5580

atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa 5640

tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg 5700

tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc 5760

ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc 5820

cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg 5880

gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 5940

acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg 6000

ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 6060

ctttgggccg cctccccgcc tggaattcga gctcggtacc tttaagacca atgacttaca 6120

aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc 6180

actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga 6240

tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct 6300

tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat 6360

ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta 6420

ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta 6480

ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 6540

ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 6600

ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg 6660

actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa 6720

gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcgtc gagacgtacc caattcgccc 6780

tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa 6840

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt 6900

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa 6960

tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc 7020

gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt 7080

ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc 7140

cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt 7200

agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt 7260

aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt 7320

gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa 7380

aaatttaacg cgaattttaa gatagagcca gataagaaaa ctaaatattc cctaaaacgg 7440

ctaaagccgg ataaccaatt ttttactcga ctaaattgtt tttaaattgc gcttaaaatt 7500

caaaatatta acgtttacaa tttcc 7525

Claims

1.人c5orf39基因在制备抑制新生血管形成药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的人c5orf39基因在制备抑制新生血管形成药物中的应用，其特征在于，所述的抑制新生血管形成药物为抑制人眼底视网膜新生血管形成的药物。

3.根据权利要求1所述的人c5orf39基因在制备抑制新生血管形成药物中的应用，其特征在于，所述的抑制新生血管形成药物为抑制肿瘤新生血管形成的药物。

4.一种真核重组质粒，其特征在于，所述的真核重组质粒包含核苷酸序列SEQ ID NO.1所述的人c5orf39基因，所述的质粒为lenti载体质粒。

5.根据权利要求4所述的真核重组质粒，其特征在于，所述的真核重组质粒的制备方法包括以下步骤：

a、通过PCR合成人的c5orf39基因片段；

c、通过DNA测序筛选出正确插入的重组质粒克隆。

6.一种如权利要求4或5所述的真核重组质粒在制备抑制新生血管形成药物中的应用。

7.一种重组慢病毒载体，其特征在于，所述的重组慢病毒载体包含核苷酸序列SEQ IDNO.1所述的人c5orf39基因。

8.根据权利要求7所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述的重组慢病毒载体的制备方法包括以下步骤：将权利要求4或5所述的真核重组质粒与三种包装质粒MDL、REV、VSVG共转染人胚肾细胞293T，在细胞上清液中收获只有感染能力而无复制能力的重组慢病毒载体颗粒。

9.一种如权利要求7或8所述的重组慢病毒载体在制备抑制新生血管形成药物中的应用。

10.一种抑制新生血管形成的药物，其特征在于，所述的药物包括权利要求4或5所述的真核重组质粒，或权利要求7或8所述的重组慢病毒载体。