CN101619361A - Hgfr的高亲和力结合位点和鉴定其拮抗剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了编码或包含肝细胞生长因子受体胞外至少IPT－3和IPT－4结构域的多核苷酸或多肽用来筛选和/或开发在癌症治疗中有用的药理学上有效的药物的用途，优选肝细胞生长因子受体失调的癌症。

Description

HGFR的高亲和力结合位点和鉴定其拮抗剂的方法

发明领域

本发明涉及肝细胞生长因子受体(HGFR)蛋白质的领域。更具体地，本发明涉及鉴定HGFR与其配体即肝细胞生长因子(HGF)的高亲和力结合位点以及鉴定以HGFR的高亲和力结合位点为靶的HGFR拮抗剂的方法。

发明背景

肝细胞生长因子受体(还已知为Met)是一种酪氨酸激酶，并是c-met原癌基因的产物。它由一个50kDa的α亚基和一个145kDa的β亚基组成，它们由一个二硫键连接，α亚基完全在细胞外，而β亚基包括(从N端至C端)一个胞外区、一个跨膜区和一个胞质酪氨酸激酶区。成熟的α/β杂二聚受体是由170kDa的单链前体通过蛋白水解加工和末端糖基化而生成的。

HGF，还被称为扩散(Scatter)因子，它是具有广谱生物活性包括细胞增殖、游动、存活和形态形成的肝素结合糖蛋白。它以无活性的单链前体(原-HGF)形式合成和分泌，由于其与蛋白聚糖具有高亲和力而储存在细胞外基质中。原-HGF经过在残基R494-V495的蛋白裂解得到生物活性形式即二硫键连接的α/β杂二聚体，其中α链由N端区域和随后的四个kringle结构域组成，β链与丝氨酸蛋白酶的糜蛋白酶家族具有结构同源性。但是，由于形成丝氨酸蛋白酶的催化三联特征的三个关键残基中的两个在HGF中是非保守的，因此β链缺乏蛋白水解活性。尽管其不能产生信号，但是原-HGF仍以高亲和力与Met结合并且取代了活性HGF。

近来，许多结构-功能方面的研究已经显示HGF和Met的细胞外部分间具有相互作用。

Met胞外区具有模块化结构，包含三个功能结构域：跨越蛋白质N端的前500个残基并且具有一个七面的β螺旋桨结构的Sema结构域(还在信号素和plexins中出现)、覆盖大约50个残基并且含有四个保守的二硫键的PSI结构域(还在Plexins、信号素和整联蛋白中出现)、和连接PSI结构域和跨膜螺旋并且被四个IPT结构域(在Plexins和转录因子中出现的免疫球蛋白相关区)占据的其它400个残基。

HGF是二价配体，在α链含有一个Met的高亲和力结合位点和在β链含有一个低亲和力结合位点。HGF的生物活性需要α和β链之间的共同作用；而α链，更精确的说N端结构域和第一个kringle，对于Met的结合是足够的，β链对于Met活化是必需的。

Met的SEMA和PSI结构域与HGF的β链的复合物的晶体结构的解析(参见例如WO-A-2005/108424)揭示了HGF的低亲和力结合位点位于β螺旋桨的面2-3，并且HGF-β与Met结合的部分正是丝氨酸蛋白酶用来与其底物或抑制剂结合的相同区域。重要的是，2.53

解析度的HGF β链晶体结构的确定和特异的突变分析揭示了与Met和HGFβ链活性口袋结合有关的残基仅在原-HGF的蛋白水解转变后暴露出来，从而解释了为何原-HGF以高亲和力与Met结合而不激活它。尽管从结构上和功能上明确了HGF的β链和Met的Sema结构域之间的低亲和力的相互作用，但是此时还不清楚Met的哪个区域与HGF的α链以高亲和力结合。因此，HGF活化Met的主要机制还没有被充分了解。考虑到此途径极大的生物学和治疗学重要性，还是让人惊讶的。

HGF-Met信号传导在胚胎发生和成人生命中的组织再生中是十分重要的。重要的是，解除管制的HGF-Met的信号传导在肿瘤发生和转移中起关键作用。不同机制包括自分泌HGF刺激、受体过表达、基因扩增和点突变导致的不适当的Met活化在多种人恶性肿瘤中出现并且与预后不良有关。这些发现使人们对HGF-Met信号途径作为癌症治疗靶点的兴趣不断增长，从而导致了多种Met/HGF抑制剂的开发。包括以Met激酶活性为靶、中和抗Met或抗HGF抗体、诱饵受体和HGF衍生因子的小分子化合物。但是，这些分子是否以与HGF的高亲和力结合位点为靶和在HGF与Met以高亲和力结合基础上的精确分子机制是什么都还不清楚。这可能阻碍了分离出更有选择性、敏感性增强和更少副作用的治疗药物。Met和HGF的高亲和力结合位点的精确知识一定会有助于设计出高度特异性的Met拮抗剂。

发明内容

因此需要摸索能够鉴定具有敏感性增强和较少副作用的Met拮抗剂的改良方法来开发治疗癌症的更有效治疗策略。

本发明的目的是提供这种改良的方法。

由于该技术方案具有在随后权利要求中特定的特征而实现了本发明的目的。权利要求形成了本文中提供的与本发明有关的技术指导的整体。

因此，本发明的目的是鉴定对肝细胞生长因子受体(HGFR)具有HGF高亲和力的结合位点，即HGFR的胞外IPT-3和IPT-4结构域。本发明的另一个目的是提供鉴定HGFR拮抗剂的方法，所述的拮抗剂靶向对HGF具有高亲和力的HGFR结合位点以开发治疗癌症的新治疗策略。

在一个实施方案中，本发明提供了一种包含或编码肝细胞生长因子受体胞外至少IPT-3和IPT-4结构域的多肽或多核苷酸用来筛选和/或开发在癌症特别是肝细胞生长因子受体活性失调的癌症治疗中有用的药理学上有效的药物的用途。

在一个实施方案中，药理学上有效的药物是肝细胞生长因子受体抑制剂和/或拮抗剂，并且可以选自小分子抑制剂、适体、反义核苷酸、基于RNA的抑制剂、siRNAs、抗体、肽、显性负性因子。

在另一个实施方案中，本发明涉及检测待测药物作为肝细胞生长因子受体的拮抗剂/抑制剂在癌症优选肝细胞生长因子受体活性失调的癌症治疗中有效的能力的方法，包含以下步骤：

(a)将待测药物与肝细胞生长因子受体的至少胞外IPT-3和IPT-4结构域或至少表达肝细胞生长因子受体的胞外IPT-3和IPT-4结构域的细胞接触，

(b)检测肝细胞生长因子受体的活性、功能、稳定性和/或表达，和

(c)选择能降低肝细胞生长因子受体活性、功能、稳定性和/或表达的药物。

在另一个实施方案中，本发明涉及使用肝细胞生长因子受体的胞外IPT-3和IPT-4结构域作为治疗癌症的药物的用途。

发明详述

本发明将在一些相关优选实施方案中通过非限制性的实施例参考附图详细描述，其中：

图1显示了Met和HGF子域的基因工程和纯化。(A)本研究中使用的基因工程蛋白质的图示。左图：基因工程受体。W.T.MET，野生型Met；EXTRA，胞外部分；INTRA，胞内部分；SP，信号肽；SEMA，信号素同源结构域；PSI，plexin-信号素-整联蛋白同源结构域；IPT1-4，免疫球蛋白-plexin-转录因子同源结构域1-4；TM，跨膜区；JM，近膜区；KD，激酶结构域；CT，C末端尾部；E，FLAG或MYC表位；H，多组氨酸标签。红色三角表示在α和β链之间的蛋白裂解位点。右图：基因工程配体。W.T.HGF，野生型HGF；ND，N端结构域；K1-4，kringle 1-4；PLD，类蛋白水解酶结构域；UNCL.HGF，不可断裂的HGF。星号表示在蛋白水解位点的R494Q氨基酸置换。(B)亲和纯化的受体和配体的考马斯亮蓝染色。每个蛋白质组(Sema、Sema-PSI、诱饵Met；PSI-IPT、IPT；HGF-α、不可断裂的HGF、HGF；HGF NK1、HGF-β)都在非还原条件下通过SDS-PAGE分离并且根据牛血清清蛋白(BSA)的标准曲线来定量。MW，分子量标记；kDa，千道尔顿。

图2显示了HGF-Met相互作用的ELISA分析。(A)Met子域和活性HGF的结合。基因工程受体固定至固相上且与液相中增加浓度的活性HGF接触。使用抗HGF抗体来显示结合。非特异性结合通过在固相上使用BSA代替纯化的受体来检测。(B、C、D)诱饵Met、Sema-PSI和IPT与不同形式的HGF的结合。基因工程受体固定至固相上且与液相中增加浓度的MYC标记的活性HGF、原-HGF、HGF-α或HGF NK1接触。使用抗MYC抗体来显示结合。非特异性结合通过在液相中使用MYC标记的人血管抑素(angiostatin)(AS)来检测。

图3显示了IPT结构域3和4与HGF-α以高亲和力充分结合。(A)缺失IPT变异体的图示。颜色代码和图例同图1A。(B)IPT变异体和HGF-α之间相互作用的ELISA分析。基因工程IPTs固定至固相上且与液相中增加浓度的HGF-α接触。使用抗HGF抗体来显示结合。

图4显示了在活细胞中IPT结构域3和4与HGF的充分结合。(A)缺失MetΔ25-741受体的图示。颜色代码和图例同图1A。(B)表面生物素化分析。使用靶向于Met C末端部分的抗体免疫沉淀(IP)细胞蛋白质且通过使用辣根过氧化物酶缀合的链霉抗生物素(SA)的蛋白质免疫印迹法(WB)来分析。相同的点用抗Met抗体再次探测。W.T.，野生型；A549，A549人肺癌细胞；MDA，MDA-MB-435人黑色素瘤细胞；TOV，TOV-112D人卵巢癌细胞；Empty V.，空载体。P170条带对应于未加工的Met；p145是受体的成熟形式。(C)化学交联分析。表达Met_Δ25-741(MetΔ25-741)的TOV-112D细胞和野生型TOV-112D细胞(W.T.TOV)与HGF一起培养，然后进行化学交联。使用抗Met抗体免疫沉淀细胞裂解物并且通过使用抗HGF抗体的蛋白质免疫印迹法分析。箭头指示HGF-Met_Δ25-741复合物。(D)Met磷酸化分析。表达Met_Δ25-741的TOV-112D细胞用作为阴性对照的1％FBS和用相同量的HGF、原-HGF、HGF NK1或NK1-NK1进行刺激。受体磷酸化通过使用抗Met抗体的免疫沉淀和使用抗磷酸酪氨酸(抗pTyr)的抗体的蛋白质免疫印迹法来确定。相同的点使用抗Met抗体再次探测。箭头指示对应于Met_Δ25-741或免疫球蛋白(Ig)的条带。(E)NK1-NK1的图示。从N至C末端：SP，信号肽；ND，N端结构域；K1，kringle 1；H，多组氨酸标签。

图5显示了可溶性IPT在体外抑制HGF诱导的侵袭性生长。(A)慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞用重组HGF刺激且Met磷酸化通过使用抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹法来确定(上图)。相同的点使用抗Met抗体再次探测(下图)。Empty V.，空载体。(B)分支形态发生检测。预制备的慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞的球状体埋入胶原蛋白中然后用重组HGF刺激以形成分支小管。胶原蛋白侵袭通过从每个球状体中芽殖的小管的平均数计数来定量。EV，空载体；DM，诱饵Met；SP，Sema-PSI。(C)B中描述的实验获得代表图。放大倍数：200X。

图6显示了可溶性IPT在小鼠中显示出抗肿瘤和抗转移活性。CD-1nu-/-小鼠皮下注射慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞，随时间监测肿瘤生长。(A)肿瘤潜伏期的Kaplan-Meiler样曲线(X轴，以天为单位的时间；Y轴，无肿瘤动物的百分数)。Empty v.，空载体。(B)随时间变化的平均肿瘤体积。(C)肿瘤切片使用抗FLAG抗体的免疫组织化学分析。放大倍数：400X。(D)肿瘤血管分析。肿瘤切片用抗Von Willebrand因子抗体染色。肿瘤切片的每平方毫米的血管的数量通过显微镜检查来确定。EV，空载体；DM，诱饵Met；SP，Sema-PSI。(E)转移发生率分析。尸检后，通过显微镜检查来分析连续肺切片以确定微小转移的存在。转移发生率-即总数中具有转移的小鼠的数量-以百分数(条)和分数(条末端)两种方式显示。(F)空载体组中获得微小转移的的代表图。肺切片用苏木精和伊红染色。虚线区分了血管壁(vs)。转移的细胞(mc)可以在血管内作为栓子或在薄壁组织中发现。放大倍数：400X。

本发明中公布的数据说明HGF的α链以高亲和力结合于Met的IPT区域，并且这与配体的蛋白水解过程无关。它们还说明虽然配体的无活性和活性形式之间没有区别，但是与缺少Sema结构域的Met跨膜IPT结合的HGF足以将激活受体的信号来传递至胞质激酶结构域。最后，它们提供了来源于Met的IPT区域和Sema结构域的基因工程蛋白质能够在体外和体内均中和HGF的原侵袭(pro-invasive)活性的证据。

人们早就知道HGF是二价因子。早期蛋白质基因工程研究鉴定了HGF的N端结构域和第一个kringle上的一个高亲和力Met结合位点。随后，生物化学和生物分析结合说明HGF丝氨酸蛋白水解酶样结构域(β链)，虽然对于结合不是必需的，但是在介导受体激活上起关键作用。最近，详细的结晶和突变数据充分在结构上和功能上确定了HGF β链上的低亲和力Met结合位点以及其与Met的Sema结构域的相互作用。HGF的α链和Met间的接触面仍是未知的。小角度X射线散射和低温电子显微镜研究显示了HGF的N末端和第一个kringle区域和Met的Sema结构域之间的接触的存在。但是，等离子共振分析揭示这一相互作用具有非常低的亲和力(大约比HGF-β和Sema间低2倍，比HGF-α和完整受体间低100倍)。由于这种弱相互作用本身不能说明HGF和Met之间的紧密结合，因此Met上的高亲和力HGF结合位点仍需要鉴定。

这里出现的结果有助于弥补这个缺口并且说明这一漫长搜索的HGF结合位点位于Met的IPT区域并且更精确的说在接近细胞膜的最后两个免疫球蛋白样结构域中。本发明中提供的几个不同的实验证据说明了这一事实。首先，一个只含有四个IPT结构域(IPT)的可溶性的缺失Met受体以基本上与Met的全部胞外部分相同的亲和力与HGF结合。相反，Sema显示了对HGF非常低的亲和力。第二，IPT以不变的强度与活性HGF、原-HGF或HGF-α结合。第三，缺失IPT1和IPT2不影响IPT与任何形式的HGF的亲和力。第四，在对应于Sema结构域、PSI模块和前两个免疫球蛋白样结构域的外功能区上具有的大量缺失的基因工程Met受体(Met_Δ25-741)保持与HGF结合和转导激酶激活的信号至细胞内部的能力，尽管其不能区别活性HGF和原-HGF。最后，已知二聚形式的HGF NK1含有HGF-α的最小Met结合区，虽然不比HGF更有效，但它能够以同样效率引发MetΔ25-741的活化，，因此鉴定出IPT3-4是HGF NK1结合位点。

虽然这些数据指出了IPT在HGF结合中的关键作用，但值得注意的是两个在Met的胞外部分的前期结构/功能研究未能鉴定出在这一区域的任何配体结合位点。Met外功能区图谱的第一个图说明根据ELISA检测Sema结构域对于HGF结合是必需且足够的。第二个研究分析了Sema结构域在受体二聚体形成中的作用，并且说明在Sema结构域中含有缺失的Met胞外部分的基因工程形式不能共沉淀HGF。

本发明还证明当Met的胞外部分用作生物技术工具来抑制HGF诱导的侵袭性生长时也观测到了Sema和IPT间的协同作用。在体外分析和小鼠移植中，IPT和Sema-PSI可溶性蛋白质均显示了显著抑制作用。但是，它们均不能达到包含低亲和力和高亲和力HGF结合位点的全长Met外功能区所显示的强大抑制作用。这暗示这两种相互作用均有助于调控Met活性。虽然已确定HGF-β-Sema接触为治疗靶点，这里出现的结果揭示了一个提供药物干预机会的第二接触面。代替真正的HGF结合于IPT区域的重组蛋白质或抗体具有作为Met的高度竞争性抑制剂用来治疗HGF/Met依赖的癌症的用途。

材料和方法

蛋白质基因工程

本工作中描述的可溶性或跨膜受体和基因工程配体通过标准PCR和基因工程技术获得。所有因子在N末端保留其亲代蛋白质的前导序列。可溶性Met蛋白质的氨基酸(aa)序列(基因库编号X54559)对应aa 1-24(信号肽)加：诱饵Met，aa 25-932；Sema，aa25-515；Sema-PSI，aa 25-562；PSIIPT，aa 516-932；IPT，aa 563-932；IPTΔ1，aa 657-932；IPTΔ1-2，aa 742-932；IPT-3，aa 742-838；IPT-4，aa 839-932。在每个分子的C末端加上一个双FLAG(SDYKDDDDK-SEQ ID No.：19)或单MYC(EQKLISEEDLN-SEQ ID No.：20)表位序列和一个多组氨酸标签(HHHHHHH-SEQ ID No.：21)来进行蛋白质检测和纯化。跨膜基因工程MetΔ25-741除了缺失区域(aa 25-741)外与野生型Met是相同的。基因工程HGF蛋白质的氨基酸序列(基因库编号M73239)对应aa 1-31(信号肽)加：HGF，aa32-728；HGF-α，aa 32-473；HGF NK1，aa 32-205；HGF-β，aa 495-728。在C末端加入以上MYC或FLAG表位和多组氨酸标签。不可断裂的HGF之前已有描述(Mazzone，M.等人(2004)J Clin Invest.114(10)，1418-1432)。NK1-NK1是HGF NK1的二聚体形式，由相同的HGF N末端区域串联重复组成(aa 1-205直接与aa 32-205连接没有间隔区)。编码所有基因工程蛋白质的cDNAs亚克隆至慢病毒转移载体pRRLsin.PP T.CMV.eGFP.Wpre(SEQ ID No.：1)以代替Follenzi，A.等人(2000)Nat Genet.25(2)，217-222所公开的gfp cDNA。GFP编码序列被以下cDNAs代替：诱饵met FLAG.his(SEQ ID No.：2)、Sema FLAG.his(SEQ ID No.：3)、Sema-PSI FLAG.his(SEQ ID No.：4)、PSI-IPT FLAG.his(SEQ ID No.：5)、IPT FLAG.his(SEQ ID No.：6)、IPTΔ1 FLAG.his(SEQID No.：7)、IPTΔ1-2FLAG.his(SEQ ID No.：8)、IPT 3FLAG.his(SEQ ID No.：9)、IPT 4FLAG.his(SEQ ID No.：10)、MetΔ25-741(SEQ ID No.：11)、HGF MYC his(SEQ ID No.：12)、HGF-αMYC his(SEQ ID No.：13)、HGF-NK1 MYC his(SEQ ID No.：14)、HGF-βMYChis(SEQ ID No.：15)、不可断裂的HGF MYC his(SEQ ID No.：16)、NK1-NK1his(SEQ IDNo.：17)、血管抑素MYC his(SEQ ID No.：18)。

酶联免疫吸附实验

从无血清的慢病毒载体转导的MDA-MB-435人黑色素瘤细胞的条件培养基中收集所有基因工程受体和因子。因子纯化通过固定化金属亲和层析进行，如前描述于MichieliP.等人(2002)Nat Biotechnol.20(5)，488-495。原-HGF转变为活性HGF通过用2-10％FBS(Sigma，St.Louis，Missouri)在37℃培养纯化的原-HGF(最大浓度100ng/μl)24小时来进行。因子转变通过使用抗HGF抗体(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)的蛋白质免疫印迹法来分析。用FBS进行同样培养的不可断裂的HGF在所有检测中用作原-HGF，以比较活性HGF和未加工的HGF。基因工程配体与可溶性受体的结合通过在固相中使用FLAG-标记的可溶性受体和在液相中使用MYC标记的基因工程配体的ELISA来检测。固定浓度的纯化的可溶性受体(100ng/孔)吸附至96孔ELISA平板上。蛋白质包被的平板用增加浓度的基因工程配体孵育，用生物素化的抗HGF抗体(R&D Systems，Minneapolis，Minnesota)或抗MYC抗体(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California)显示结合。用Prism软件(Graph Pad Software，San Diego，California)分析和拟合结合数据。

细胞培养

MDA-MB-435人黑色素瘤细胞购自Georgetown University Tissue Culture SharedResource(Washington，District of Columbia)。细胞在补充10％FBS(Sigma)的DMEM中培养。TOV-112D人卵巢癌细胞获得自ATCC(Rockville，Maryland；ATCC N.CRL-11731)，使用补充15％FBS的MCDB 105培养基和199培养基的1∶1混合物(都来自Sigma)培养。A549人肺癌细胞也获得自ATCC(ATCC N.CCL-185)，使用补充10％FBS的RPMI培养。

慢病毒载体

如前描述于Follenzi，A.等人(2000)Nat Genet.25(2)，217-222中的方法通过293T细胞的瞬时转染来制备载体储存液。简言之，用于转染的质粒DNA混合物如下制备：ENV质粒(VSV-G)，9μg；包装(PACKAGING)质粒pMDLg/pRRE 16.2μg；REV质粒，6.25μg；TRANSFER载体(质粒#2-18)，37.5μg。在TE/CaCl₂溶液中稀释所述质粒，以最大速度涡旋时加入HBS溶液。DNA/CaCl₂/HBS混合物立即滴加至细胞平板然后37℃培养。14-16小时后，换新鲜的培养基。换培养液后大约36小时收集含有载体颗粒的细胞培养上清液。收集后，用0.2μm孔膜过滤上清液并在-80℃储存。病毒p24抗原浓度通过HIV-1 p24coreprofile ELISA试剂盒(NEN Life Science Products，Boston，Massachusetts)根据厂商说明书来测定。细胞使用40ng/ml p24在8μg/ml聚凝胺(Sigma)存在下如Vigna，E.和Naldini，L.(2000)J Gene Med.2(5)，308-316中所述转导至六孔板(2ml培养基中10⁵个细胞/孔)。转导后大约18小时后换培养基。细胞生长和蛋白质生成随时间监测。转导细胞系然后接种至15cm平板，长至蔓延到80％并在无血清培养基中培养。72小时后，收集含有重组可溶性蛋白质的上清液，过滤且用亲和层析纯化或-30℃保存。

免疫沉淀和蛋白质免疫印迹分析

细胞裂解、免疫沉淀和蛋白质免疫印迹分析使用提取缓冲液(EB)来进行，如Longati，P.等人(1994)Oncogene 9(1)，49-57所描述。使用ECL系统(Amersham Biosciences，Piscataway，New Jersey)根据厂商说明书来检测信号。用于免疫沉淀的抗Met抗体已在Ruco，L.P.等人(1996)J Pathol.180(3)，266-270中描述且购自UBI(Lake Placid，NewYork)。用于蛋白质免疫印迹的抗Met抗体购自Santa Cruz。抗FLAG抗体获得自Sigma。慢病毒载体转导的MDA-MB-435细胞的Met磷酸化分析如前描述于Michieli，P.等人(2004)Cancer Cell 6(1)，61-73进行。

HGF交联和Met活化分析

表达Met_Δ25-741的慢病毒载体转导的TOV-112D细胞使用ECL^TM表面生物素化模块试剂盒(Amersham Biosciences)根据厂商说明书进行表面生物素化分析。化学交联如前描述于Mazzone，M.等人(2004)J Clin Invest.114(10)，1418-1432进行。简言之，除去细胞中的血清生长因子需要3天，然后用1nM HGF孵育3小时。细胞裂解物使用靶向于Met C末端部分的抗体进行免疫沉淀，如Ruco，L.P.等人(1996)J Pathol.180(3)，266-270中所述，用3-10％聚丙烯酰胺梯度SDS-PAGE分离和用抗HGF抗体(R&D)进行蛋白质免疫印迹分析。为了进行受体激活分析，表达Met_Δ25-741的TOV-112D细胞用3天除去血清生长因子，然后用1nM HGF、不可断裂的HGF、HGF NK1或NK1-NK1刺激10分钟。使用EB裂解细胞，如Longati，P.等人(1994)Oncogene 9(1)，49-57所述。细胞蛋白质用如上所述抗Met抗体进行免疫沉淀且用抗磷酸酪氨酸抗体(UBI)进行免疫印迹分析。相同的点用抗Met抗体再次探测(Ruco，L.P.等人(1996)J Pathol.180(3)，266-270)。

生物学鉴定

使用预先制备的球状体来进行使用MDA-MB-435细胞的胶原蛋白侵袭检测，如Michieli，P.等人(2004)Cancer Cell 6(1)，61-73所述。简言之，球状体通过在非粘附的96孔平板(Greiner，Frickenhausen，Germany)上在0.24g/ml甲基纤维素(Sigma)存在下培养细胞过夜(700个细胞/孔)来得到。使用96孔平板(40球状体/孔)将球状体埋入含有1.3mg/ml来自大鼠尾部的I型胶原蛋白(BD Biosciences，Bedford，Massachusetts)和10％FBS的胶原蛋白基质中。埋入的球状体在37℃下培养24小时，然后用30ng/ml HGF(R&D)或没有因子另外刺激24小时。从每个球状体芽殖的小管的数量用显微镜计数。每个实验点至少分析12个球状体。

肿瘤发生检测

在0.2ml DMEM中的慢病毒载体转导的MDA-MB-435肿瘤细胞(3*10⁶个细胞/小鼠)皮下注射至Swiss CD-1背景的六周大免疫缺陷的nu-/-雌性小鼠(Charles RiverLaboratories，Calco，Italy)的右后侧腹。使用测径器每2天检测肿瘤大小。使用公式V＝4/3πx2y/2计算肿瘤体积，其中x是肿瘤的短轴而y是肿瘤的长轴。15mm3的质量-大约相当于注射的细胞最初占据的体积-被选为肿瘤阳性阈值。肿瘤低于这个阈值的小鼠认为是无肿瘤的。大约4周后，小鼠被处以安乐死，并取出肿瘤进行分析。对动物进行尸检。肿瘤和肺埋入石蜡中进行组织学处理。对苏木精和伊红染色的连续肺切片用显微镜检查进行微小转移分析。肿瘤切片用苏木精和伊红染色并且由独立的病理学家在不告知样品身份下进行分析。使用抗FLAG抗体(Sigma)对肿瘤切片进行免疫组织化学分析以确定转基因表达。切片用Meyer苏木精(Sigma)复染。使用抗Von Willebrand因子抗体(DAKO，Glostrup，Denmark)进行免疫组织化学分析以分析肿瘤血管发生。切片如上复染。血管密度用显微镜检查来评价。每个动物分析至少12块。所有动物操作由意大利Turin大学伦理委员会和意大利卫生部批准。

统计分析

使用双尾同方差学生T检验(列1，对照组；列2，实验组)确定统计学显著性。对所有分析的数据，假定显著性阈值p＜0.05。在所有图中，值表示为平均值±标准偏差，统计学显著性由单(p＜0.05)或双(p＜0.01)星号表示。

结果

HGF/Met功能结构域的基因工程

Met和HGF中含有的功能结构域的图示在图1A中显示。Met的胞外部分包括一个Sema结构域、一个PSI绞链区和四个IPT模块(左图)。HGF在成熟的蛋白质中由一个α链和一个β链通过一个二硫键桥连接组成。α链依次包含一个N末端结构域和四个kringle(右图)。为了分析Met和HGF间的相互作用，本发明者表达了所有这些功能结构域的单独、可溶性蛋白质。将功能结构域进行基因工程以在其N末端含有亲代蛋白质的信号肽，因此它们可以适当地分泌。在C末端，加入了一个用于抗体识别的外源表位(FLAG或MYC)和一个用于蛋白质纯化的多组氨酸标签。所有编码基因工程因子的cDNAs亚克隆至慢病毒载体pRRLsin.PPT.CMV.Wpre上，重组慢病毒颗粒如材料和方法中描述的制备。从慢病毒载体转导的MDA-MB-435人黑色素瘤细胞的条件培养基中收集重组蛋白质并通过亲和层析同种纯化。纯化的蛋白质用SDS-PAGE根据标准定量(图1B)。

Met-HGF相互作用的的ELISA分析

Met外功能区与HGF相互作用的能力通过ELISA结合检测法检测。可溶性受体(诱饵Met、Sema-PSI、Sema、PSI-IPT、IPT)固定至固相上且与增加浓度的活性HGF接触。使用生物素化的抗HGF抗体显示结合。非特异性HGF结合用牛血清清蛋白(BSA)在固相上代替可溶性Met结构域来确定。结合亲和力通过如材料和方法中所描述的非线性回归分析来确定。在这些条件下，诱饵Met以大约0.2-0.3nM的K_D与HGF结合。与前述测量一致，Sema-PSI和Sema以与诱饵Met相比至少低一个对数的亲和力与HGF结合。令人惊讶的是，PSI-IPT和IPT均与HGF高效结合，与诱饵Met具有几乎相同的亲和力(图2A)。PSI结构域的存在与否不影响Sema或IPT任一与HGF的结合亲和力。由于目前自然界中发现的几乎所有Sema结构域在其C末端都具有一个PSI模块，因此本发明人使用诱饵Met、Sema-PSI和IPT继续进行结合分析。

为了确定每个Met模块与原-HGF、HGF-α、HGF NK1和HGF-β的亲和力以及与其与活性HGF的亲和力比较，基因工程受体固定于固相上且与增加浓度的MYC标记的配体接触。使用抗MYC抗体显示结合。在液相中使用含有kringle的蛋白质血管抑素(AS)-还用MYC表位标记-来确定非特异性结合。原-HGF、HGFα链和代表HGFα链最小Met结合模块的HGF NK1分别以与活性HGF相比降低3、4和10倍亲和力与诱饵Met结合(图2B)。HGF-β与诱饵Met(或任何其它Met结构域)的结合太低以致于无法以此种检测方法检测。Sema-PSI仅与活性HGF以显著的亲和力结合，而与pro-HGF、HGF-α或HGFNK1的结合则无法与非特异性结合区分(图2C)。相反，IPT以相同高亲和力与活性HGF、pro-HGF和HGF-α结合(图2D)。HGF NK1与IPT结合紧密程度比活性HGF低10倍，即具有与诱饵Met结合时相同的亲和力。这些数据说明Met的IPT区域与HGF的α链的高亲和力结合与配体的蛋白水解过程无关。

HGF的α链与IPT结构域3和4以高亲和力结合

Met的IPT区域延伸大约400个氨基酸且含有四个IPT结构域。为了更精确地定位IPT-HGF接触面，构建一系列缺失一个或多个结构域的IPT变异体(图3A)。IPTΔ1和IPTΔ1-2是两个分别缺少前一个或前两个免疫球蛋白样结构域的IPT的N末端缺失形式。IPT-3和IPT-4对应两个表达为单个蛋白质的C末端免疫球蛋白样结构域。蛋白质制备和纯化如上所述进行。基因工程IPTs与HGFα链相互作用的能力用全长IPT区域作为对照通过ELISA结合检测法来研究。IPT、IPTΔ1、IPTΔ1-2、IPT-3和IPT-4固定在固相上且与增加浓度的HGF-α接触。使用抗HGF抗体显示结合。使用BSA如上测量非特异性结合。如图3B所示，前两个免疫球蛋白样结构域的缺失基本上不影响HGF结合。

事实上，IPTΔ1-2，它是对应Met最后两个免疫球蛋白样结构域的蛋白质，它与HGF的α链以如果不比IPT更高也是相同的力量结合。但是第三个或第四个免疫球蛋白样结构域任一的进一步缺失几乎全部损失HGF-α结合。使用活性HGF或pro-HGF代替HGF-α得到类似结果。这些数据说明Met的最后两个免疫球蛋白样结构域，位于接近真正的Met的跨膜螺旋，足以与HGF的α链以高亲和力结合。

IPT结构域3和4足以在活细胞中与HGF结合

为了确定HGF是否可以与位于膜锚定受体中的IPT3和4结合，构建了一个在胞外区带有大量缺失的Met蛋白质。对应于Sema结构域(aa 25-515)、PSI结构域(aa 516-562)和前两个IPT结构域(IPT1和2，aa 563-741)的氨基酸25-741缺失，生成含有IPT结构域3和4、跨膜螺旋和全长胞质区的重组受体(图4A)。编码基因工程受体Met_Δ25-741的cDNA亚克隆至上述的相同的慢病毒载体上。重组慢病毒颗粒用来转导人卵巢癌细胞系TOV-112D，通过RT-PCR分析确定它缺少内源性Met表达(Michieli，P.，等人(2004)CancerCell 6(1)，61-73)。表面生物素化分析显示Met_Δ25-741被适当地表达且显露在TOV-112D细胞膜上(图4B)。

为了检查Met_Δ25-741是否可以与HGF结合，慢病毒载体转导的细胞在重组HGF存在或不存在下培养，随后用交联剂BS3处理它们。细胞裂解物用靶向Met的C末端部分的抗体免疫沉淀，SDS-PAGE分离且使用抗HGF生物素化抗体进行蛋白质免疫印迹法分析。作为对照，在野生型TOV-112D细胞上进行同样的分析。免疫印迹显示一个分子量大约180kD的明显条带在对应于用HGF处理的表达Met_Δ25-741的细胞的泳道中出现而没有出现在对应于无HGF处理的相同细胞或野生型TOV-112D细胞的泳道中，无论有无配体存在(图4C)。考虑到Met_Δ25-741和HGF均具有大约90kDa的分子量，免疫沉淀的交联蛋白质与HGF加Met_Δ25-741形成的复合物是一致的。

与IPT结构域3和4结合的HGF引起活细胞中Met的激活

本发明者接下来检测了与Met_Δ25-741结合的HGF是否可以诱导Met激酶的激活。为了这个目的，慢病毒载体转导的TOV-112D细胞用原-HGF或活性HGF进行刺激，细胞裂解物用抗Met抗体如上免疫沉淀。受体激活通过使用抗磷酸酪氨酸抗体的蛋白质免疫印迹分析来确定。相同的点用抗Met抗体再次探测以标准化免疫沉淀的受体的数量。值得注意的是，原-HGF和活性HGF均能够诱导Met_Δ25-741的强磷酸化(图4D)。由于与全长Met结合的原-HGF不能诱导激酶激活，这说明Sema结构域以某种方式发挥了对Met催化活性的自身抑制作用，一旦与活性HGF结合就会产生Met催化活性。还使用HGF NK1和一种由两个串联重复的NK1片段组成的基因工程二聚配体(NK1-NK1；图4E)进行受体刺激。如图4D所示，慢病毒载体转导的TOV-112D细胞的NK1-NK1刺激引起了Met_Δ25-741的有效磷酸化，而单体NK1刺激没有效果。这些结果说明Met的两个C末端IPT结构域(IPT3和4)足以与HGF(更精确地说是代表HGF的α链上的最小Met结合模块的HGFNK1)结合和传递受体激活的信号至胞质激酶结构域，可能随后进行配体诱导的受体的二聚化。但是，它们还说明单独IPT3和4不足以区分HGF的生物活性形式和其无活性前体原-HGF。

可溶性IPT在体外抑制HGF诱导的侵袭性生长

在以前的研究中，已说明表达为可溶性蛋白质(诱饵Met)的Met的胞外部分在体外和小鼠癌症模型中均抑制HGF诱导的侵袭性生长(Michieli P.等人(2004)Cancer Cell 6(1)，61-73)。还显示重组可溶性Sema-PSI能抑制配体依赖的和配体非依赖的Met磷酸化(Kong-Beltran M.等人(2004)Cancer Cell 6(1)，75-84)。基于这些结果，已检测了可溶性IPT是否在活细胞中显示了HGF/Met拮抗活性。MDA-MB-435人黑色素瘤细胞表达Met且是已确定的分析HGF介导的侵袭性生长的模型系统，用编码可溶性诱饵Met、Sema-PSI或IPT的慢病毒载体转导。用空载体转导的细胞用作对照。分泌可比较水平的可溶性因子(大约50pmol/10⁶个细胞/24小时)的慢病毒载体转导的细胞除去血清几天，允许重组因子在培养基中蓄积，然后用重组HGF刺激。Met酪氨酸磷酸化通过使用抗磷酸酪氨酸抗体的免疫印迹如上述确定。如图5A所示，IPT和Sema-PSI两者均部分抑制了HGF诱导的Met磷酸化，而诱饵Met完全中和了HGF诱导Met激活的能力。相同的点用靶向于Met C末端尾部的抗体再次探测显示在免疫沉淀蛋白质数量上没有本质差别。

为了检测Met外功能区在更多生物学背景下的抑制作用，相同的细胞用来进行HGF依赖的分支形态形成检测。预先制备的细胞球状体接种至三维胶原蛋白基质中，然后用重组HGF刺激以形成小管结构。分支通过计数每个集落芽殖的小管的平均数来定量。如图5B所示，可溶性IPT和Sema-PSI均抑制HGF诱导的集落分支(空载体，17.5个小管集落；IPT，4.0个小管/集落；Sema-PSI，6.7个小管/集落)。但是，与获得自磷酸化实验的结果一致，诱饵Met是比它的任一亚结构域更有效的HGF抑制剂(2.5个小管/集落)。图5C显示了集落形态的代表图。

可溶性IPT在小鼠中显示了抗肿瘤和抗转移活性

以上结果提示了本发明者探索可溶性IPT在小鼠癌症模型中的治疗潜力。慢病毒载体转导的MDA-MB-435黑色素瘤细胞皮下注射至CD-1nu-/-小鼠，随时间监测肿瘤生长。大约三周后，取出肿瘤分析，对小鼠进行尸检。在Kaplan-Meier-like分析中，其中无肿瘤动物的百分比对时间作图而肿瘤潜伏期以天计算平均数来定量，所有基因工程的可溶性受体显示了实验肿瘤的出现。但是，IPT比Sema-PSI稍有效而诱饵Met比IPT或Sema-PSI均更有效(图6A)。随时间的肿瘤质量的分析显示IPT仅比诱饵Met效果稍弱，而Sema-PSI仅在实验的非常早期抑制瘤生长(图6B)。转基因表达的免疫组织化学分析显示诱饵Met、Sema-PSI和IPT在肿瘤中达到相似水平和分布(图6C)。

因为HGF是有效的前血管生成因子，已确定在肿瘤中抑制HGF/Met是否导致血管生成的减少。肿瘤切片通过使用针对Von Willebrand因子的抗体进行免疫组织化学来分析，血管密度用显微镜检查来评价(图6D)。IPT减少肿瘤血管密度1.5倍，而诱饵Met达到更强的抑制(大约4倍)；Sema-PSI没有显著影响肿瘤血管发生。根据尸检，取出上述小鼠的肺并且进行组织学处理。连续肺切片用苏木精和伊红染色，用显微镜分析以确定微小转移的存在。图6A显示了结果。在对照组中，6只小鼠中的4只(67％)出现了微小转移。在IPT和Sema-PSI组，微小转移仅在6只小鼠的1只(17％)中发现，而自诱饵Met组没有发现微小转移。转移病灶既是实质的(血管外的)又是内陷的(血管内的；参见图6F的代表图)。

本发明提供的HGFR上的高亲和力HGF结合位点的鉴别允许设计导致更特异性HGF和HGFR抑制剂/拮抗剂生成的新操作。以下是鉴定靶向HGFR的高亲和力结合位点的HGF/HGFR抑制剂/拮抗剂或使用HGFR的高亲和力结合位点作为工具制备新抑制剂/拮抗剂的方法的非限制性实施例。

与HGFR的胞外IPT-3和IPT-4结构域结合避免HGF结合的单克隆抗体的开发

由于HGF与胞外IPT-3和IPT-4结构域的相互作用对于高亲和力HGF结合是必需的，可以制备与IPT-3和IPT-4结合并与HGF竞争HGFR结合的特异性单克隆抗体。这可以通过几个策略完成。

(A)来源于IPT-3和IPT-4的重组蛋白质或肽通过标准基因工程技术或化学合成得到。将此蛋白质或肽注射至适当的实验动物(通常是小鼠或大鼠)中以产生免疫反应。然后从免疫的动物中分离脾细胞且融合至骨髓瘤细胞系，通过标准单克隆抗体技术选择生产抗体的杂交瘤。然后通过类似于本发明中描述的使用固相中的重组IPT-3和IPT-4和液相中的杂交瘤制备抗体的ELISA方法筛选靶向IPT-3和IPT-4的抗体。使用可商业获得的抗鼠免疫球蛋白抗体来显示结合。或者，根据它们从IPT-3和IPT-4(在固相中)取待重组HGF(在液相中)的能力，或它们免疫沉淀重组IPT-3和IPT-4蛋白质的能力筛选抗体。

(B)将在适当的表达载体中插入编码IPT-3和IPT-4的多核苷酸序列直接注射至实验动物中以产生针对基因产物的免疫反应。然后分离和如上述筛选靶向IPT-3和IPT-4的抗体。

(C)将在适当的表达载体中插入编码IPT-3和IPT-4的多核苷酸序列转移至不表达HGFR的哺乳动物细胞系以获得在细胞表面的IPT-3和IPT-4表达。表达IPT-3和IPT-4的细胞然后注射至实验动物中以产生免疫反应，分离和如上述筛选靶向IPT-3和IPT-4的抗体。

(D)使用重组IPT-3和IPT-4蛋白质筛选来自哺乳动物淋巴细胞(优选人，例如从浸润表达HGFR的肿瘤的淋巴细胞)通过标准基因工程技术(例如通过已知为噬菌体展示的技术)生产的天然抗体库。然后分离、扩增阳性克隆(即与IPT-3和IPT-4以高亲和力结合的那些克隆)并生物化学表征抗体。

(E)从带有表达HGFR的肿瘤的病人的外周血中分离出人记忆B细胞，公开在包括Traggiai E.等人(2004)Nat Med.10(8)，871-875的多个研究中。一旦建立起永生记忆B细胞的培养，本领域技术人员可使用如以上(A)中所述的方法筛选分泌靶向于IPT-3和IPT-4的抗体的细胞。确定了此种产生抗体的细胞后，想要的抗体可以通过聚合酶链反应和标准基因工程操作来克隆。

与HGFR的胞外IPT-3和IPT-4结构域结合抑制HGFR活性的待测化合物的鉴定

使用不同方法，可以分离不同来源的与HGFR的高亲和力HGF结合位点结合和干扰HGF诱导的HGFR激活的待测化合物。这可通过几个策略来完成。

(A)使用类似于本发明中描述的ELISA检测法，本领域技术人员可以筛选化合物库(包括但是不限于合成化学物库、天然化合物库、小分子库、肽库)得到取代与IPT-3和IPT-4相互作用的HGF的药物。在此种检测方法中，重组IPT-3和IPT-4蛋白质固定至固相中并且在液相中用固定量的HGF孵育。与库中的化合物接触后，HGF结合使用可商业获得的抗HGF抗体测量。

(B)使用表达类似于本发明中描述的(Met_Δ25-741)仅含有胞外部分的IPT-3和IPT-4结构域的基因工程形式的HGFR的细胞系，本领域技术人员可以筛选化合物库(包括但是不限于合成化学物库、天然化合物库、小分子库、肽库)得到取代与IPT-3和IPT-4相互作用的HGF或抑制HGF诱导的HGFR激活的药物。这可以通过将所述基因工程细胞与库接触，然后检测HGF诱导的HGFR磷酸化如本研究中所述或通过其它显示HGFR激活的方法实现，包括散射检测、重组基质侵袭检测、分支形态发生检测、细胞存活检测或其它体外生物学检测方法如Michieli，P.等人(2004)Cancer Cell 6(1)，61-73所述。

(C)使用上述基因工程的细胞系，本领域技术人员可以筛选基因库(包括但是不限于cDNA表达库、短发夹RNA库、反义DNA库、随机核苷酸库)得到取代与IPT-3和IPT-4相互作用的HGF或抑制HGF诱导的HGFR激活的多核苷酸或基因产物。这可以通过转染、转导或任何将核苷酸库引入所述细胞然后检测HGF激活相同细胞表达的缺失形式的HGFR的能力来完成。HGFR激活如(B)中所述进行测量。

检测与HGFR的胞外IPT-3和IPT-4结构域结合的化合物的生物学活性的功能检测方 法的举例

无论使用什么策略来制备抗IPT抗体或IPT结合化合物，最终产物(即靶向于IPT-3和IPT-4的单克隆抗体或与IPT-3和IPT-4结合的天然的或合成化合物)随后进行生物学检测以确定这些药物是否具有干扰HGFR活性的能力。这些检测可以使用培养的哺乳动物细胞在体外进行或使用实验动物在体内进行。

(A)扩散检测。在有盖培养皿中的紧密的集落中生长和表达HGFR的上皮细胞通过HGF刺激诱导至“扩散”。作为HGF刺激的结果，有盖培养皿中的细胞出现更多分离和分散。这一检测可在几个待测化合物存在下进行。在待测化合物中，HGF/HGFR抑制剂/拮抗剂可以通过对HGF刺激的应答中扩散表型的缺失来鉴别。

(B)细胞迁移检测。表达HGFR的细胞具有朝HGF梯度迁移的能力。换言之，细胞朝着较高浓度的HGF被趋药性所吸引。这一能力可用来在博伊登室检测中筛选HGF抑制剂。细胞接种至第一个小室，HGF提供在与第一个小室通过多孔膜分开的第二个小室中。细胞穿过膜迁移并到达HGF更浓缩的第二个小室。抑制这一过程的药物鉴定为HGF/HGFR抑制剂/拮抗剂。

(C)Transwell^TM迁移检测或重组基质侵袭检测。这是(B)中描述的检测法的变种，其中多孔膜用一层胶原蛋白Matrigel^TM，或其它重组有机基质覆盖。细胞必须消化有机基质以迁移穿过它。这是一种测定侵袭性而不是细胞的简单迁移的更精确的检测方法。

(D)胶原蛋白侵袭性检测或分支形态发生检测。在这个检测方法中，表达HGFR的哺乳动物细胞(优选上皮细胞或癌细胞)接种至一个胶原蛋白的三维层中，然后使其生长至每个形成大约1000个细胞的球状体。或者，球状体可以在非粘附的96孔平板上在甲基纤维素存在下过夜培养细胞之前预先形成，如Michieli，P.等人(2004)Cancer Cell 6(1)，61-73所公开的。一旦球状体埋入胶原蛋白层，用HGF刺激它们且在37℃培养。这导致了球状体上芽殖出中空小管；每个小管由几个细胞组成一个小管结构形成并且极化，以使细胞的一面看到内腔而另一个面看到外面的培养基。随着检测进行，小管成为分支且形成更复杂的结构。此检测对于HGF是高度特异性的。抑制这一过程的药物具有成为高度特异性的HGF/HGFR拮抗剂的非常高的可能性。

(E)促有丝分裂检测。HGF在某些表达HGFR的细胞里具有诱导DNA复制和细胞分裂的能力。最敏感的细胞显然是原发性肝细胞，通常是小鼠或大鼠的。为了检测HGF诱导的DNA复制，除去细胞中血清生长因子，然后用增加浓度的HGF刺激细胞。不久之后，加入放射性胸苷，细胞在37℃培养大约一天。充分洗涤和固定后，通过液体闪烁计数或其它允许放射定量的标准方法测量进入细胞DNA中的放射性胸苷。

(F)存活检测。HGF具有保护表达HGFR的细胞避免细胞凋亡或细胞程序性死亡的能力。这可用来在存活检测中测量HGFR活性。细胞用HGF和待测化合物(可能的HGFR抑制剂)预孵育，然后进行细胞凋亡刺激例如有毒药物、丧失附着、低氧、热休克、辐射或DNA损伤。适当的时间间隔后，通过标准方法包括TUNEL(末端脱氧核苷酰转移酶生物素-三磷酸去氧脲苷Nick末端标记)、核小体、DNA梯型、胱天蛋白酶活性、活体染料染色或任何它们的变种来测量细胞死亡。

(G)小鼠肿瘤发生检测。在这种检测中，可能的HGF/HGFR抑制剂的活性直接在实验动物中检测，优选小鼠或大鼠。有几个方法来获得小鼠中的肿瘤。最常用的策略是进行移植，即移植肿瘤细胞(通常是人源的)至动物受体(通常是免疫缺失的小鼠)中。细胞可皮下植入(快速简便的获得实验肿瘤的方法)或常位植入，即在肿瘤细胞分离的同样器官(例如乳癌至乳房颊脂垫、结肠癌至肠粘膜、肝癌至肝实质等等)。无论使用什么方法，注射肿瘤细胞至实验动物得到实验肿瘤。这种带有肿瘤的动物现在可用于评价待测化合物的抗肿瘤可能性。抗HGF/HGFR抗体或化合物可通过最适合的现有方法运送至带有HGF/HGFR信号途径失调的肿瘤损伤的动物，包括静脉注射、腹腔注射、渗透泵、口腔内给药、栓剂、基因疗法、局部给药等等。一个适合的治疗阶段后，该动物处以安乐死，取出它的肿瘤和器官进行分析。

(H)小鼠转移发生检测。在小鼠中实验性的转移可通过全身注射肿瘤细胞来诱导。它们陷入肺毛细血管中，随后外渗产生肺转移。这可在尸检中通过几个方法来检测，包括显微镜观察、组织学分析、免疫组织化合法、全身成像。待测化合物如(G)中所述运送。

(I)基因疗法。如果HGF/HGFR抑制剂是抗体、重组蛋白质、肽或小干扰RNA，运送至带有肿瘤的动物可通过基因疗法来完成。这包括将预计的多核苷酸引入至适合的运送载体中，载体可在慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、裸露DNA或任何它们的变异体。载体样品可根据肿瘤部位、载体或肿瘤组织分型全身或局部运送至肿瘤。基因治疗的生物学作用如(G)中描述其它化合物一样分析。

序列表

<110>梅思尔斯平移研究有限公司

<120>HGFR的高亲和力结合位点和鉴定其拮抗剂的方法

<130>BEP10941-CF

<160>21

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>7425

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>pRRLsin.PPT.CMV.eGPF.Wpre(eGFP编码序列起始于核苷酸4756并终止于核苷酸5475)

<400>1

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atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga    3000

agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga    3060

gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac    3120

caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt    3180

ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca    3240

ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt    3300

tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg acgctgacgg    3360

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta    3420

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa    3480

gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct    3540

ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc    3600

tggaacagat ttggaatcac acgacctgga tggagtggga cagagaaatt aacaattaca    3660

caagcttaat acactcctta attgaagaat cgcaaaacca gcaagaaaag aatgaacaag    3720

aattattgga attagataaa tgggcaagtt tgtggaattg gtttaacata acaaattggc    3780

tgtggtatat aaaattattc ataatgatag taggaggctt ggtaggttta agaatagttt    3840

ttgctgtact ttctatagtg aatagagtta ggcagggata ttcaccatta tcgtttcaga    3900

cccacctccc aaccccgagg ggacccgaca ggcccgaagg aatagaagaa gaaggtggag    3960

agagagacag agacagatcc attcgattag tgaacggatc tcgacggtta acttttaaaa    4020

gaaaaggggg gattgggggg tacagtgcag gggaaagaat agtagacata atagcaacag    4080

acatacaaac taaagaatta caaaaacaaa ttacaaaaat tcaaaatttt atcgataagc    4140

ttgggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga    4200

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt    4260

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt    4320

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca    4380

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt    4440

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt    4500

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca    4560

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg    4620

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat    4680

cgcctggaga cgccatccac gctgttttga cctccataga agacaccgac tctagaggat    4740

ccaccggtcg ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc    4800

ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag    4860

ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc    4920

gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac    4980

cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag    5040

gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc    5100

gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc    5160

aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc    5220

gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc    5280

agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg    5340

ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag    5400

cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac    5460

gagctgtaca agtaaagcgg ccgcgtcgac aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa    5520

agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta    5580

atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc cttgtataaa    5640

tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg    5700

tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc    5760

ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc    5820

cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg    5880

gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg    5940

acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg    6000

ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc    6060

ctttgggccg cctccccgcc tggaattcga gctcggtacc tttaagacca atgacttaca    6120

aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa gggctaattc    6180

actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg ttagaccaga    6240

tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct caataaagct    6300

tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt aactagagat    6360

ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca tgtcatctta    6420

ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta    6480

ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat    6540

ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct    6600

ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc cccatggctg    6660

actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc tattccagaa    6720

gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcgtc gagacgtacc caattcgccc    6780

tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa    6840

aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt    6900

aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa    6960

tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt tacgcgcagc    7020

gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt cccttccttt    7080

ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc tttagggttc    7140

cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga tggttcacgt    7200

agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc cacgttcttt    7260

aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt ctattctttt    7320

gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct gatttaacaa    7380

aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcc                    7425

<210>2

<211>2886

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>诱饵Met_FLAGhis的编码序列

<400>2

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag      60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag      120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat      180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag      240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac      300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta      360

gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc      420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc      480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg      540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc      600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag      660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag      720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac      780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg      840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc      900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg      960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac      1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct      1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa    1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg    1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt    1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca    1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt    1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc    1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc    1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc    1560

agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg    1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc    1680

tgtctgcctg caatctacaa ggttttccca aatagtgcac cccttgaagg agggacaagg    1740

ctgaccatat gtggctggga ctttggattt cggaggaata ataaatttga tttaaagaaa    1800

actagagttc tccttggaaa tgagagctgc accttgactt taagtgagag cacgatgaat    1860

acattgaaat gcacagttgg tcctgccatg aataagcatt tcaatatgtc cataattatt    1920

tcaaatggcc acgggacaac acaatacagt acattctcct atgtggatcc tgtaataaca    1980

agtatttcgc cgaaatacgg tcctatggct ggtggcactt tacttacttt aactggaaat    2040

tacctaaaca gtgggaattc tagacacatt tcaattggtg gaaaaacatg tactttaaaa    2100

agtgtgtcaa acagtattct tgaatgttat accccagccc aaaccatttc aactgagttt    2160

gctgttaaat tgaaaattga cttagccaac cgagagacaa gcatcttcag ttaccgtgaa    2220

gatcccattg tctatgaaat tcatccaacc aaatctttta ttagtggtgg gagcacaata    2280

acaggtgttg ggaaaaacct gaattcagtt agtgtcccga gaatggtcat aaatgtgcat    2340

gaagcaggaa ggaactttac agtggcatgt caacatcgct ctaattcaga gataatctgt    2400

tgtaccactc cttccctgca acagctgaat ctgcaactcc ccctgaaaac caaagccttt  2460

ttcatgttag atgggatcct ttccaaatac tttgatctca tttatgtaca taatcctgtg  2520

tttaagcctt ttgaaaagcc agtgatgatc tcaatgggca atgaaaatgt actggaaatt  2580

aagggaaatg atattgaccc tgaagcagtt aaaggtgaag tgttaaaagt tggaaataag  2640

agctgtgaga atatacactt acattctgaa gccgttttat gcacggtccc caatgacctg  2700

ctgaaattga acagcgagct aaatatagag tggaagcaag caatttcttc aaccgtcctt  2760

ggaaaagtaa tagttcaacc agatcagaat ttcacagcta gctctgacta caaggacgac  2820

gatgacaaga gcgattacaa agacgatgat gataagctgc agcatcacca ccatcatcac  2880

cattga                                                             2886

<210>3

<211>1590

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>Sema_FLAGhis的编码序列

<400>3

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag    60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag    120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat    180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag    240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac    300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta    360

gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc    420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc    480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg    540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc  600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag  660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag  720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac  780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg  840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc  900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg  960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac  1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct  1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa  1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg  1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt  1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca  1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt  1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc  1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc  1500

gctagctctg actacaagga cgacgatgac aagagcgatt acaaagacga tgatgataag  1560

ctgcagcatc accaccatca tcaccattag                                   1590

<210>4

<211>1779

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>Sema-PSI_FLAGhis的编码序列

<400>4

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag    60

aggagcaatg gggagtgtaa agaggcacta gcaaagtccg agatgaatgt gaatatgaag    120

tatcagcttc ccaacttcac cgcggaaaca cccatccaga atgtcattct acatgagcat    180

cacattttcc ttggtgccac taactacatt tatgttttaa atgaggaaga ccttcagaag    240

gttgctgagt acaagactgg gcctgtgctg gaacacccag attgtttccc atgtcaggac    300

tgcagcagca aagccaattt atcaggaggt gtttggaaag ataacatcaa catggctcta    360

gttgtcgaca cctactatga tgatcaactc attagctgtg gcagcgtcaa cagagggacc    420

tgccagcgac atgtctttcc ccacaatcat actgctgaca tacagtcgga ggttcactgc    480

atattctccc cacagataga agagcccagc cagtgtcctg actgtgtggt gagcgccctg    540

ggagccaaag tcctttcatc tgtaaaggac cggttcatca acttctttgt aggcaatacc    600

ataaattctt cttatttccc agatcatcca ttgcattcga tatcagtgag aaggctaaag    660

gaaacgaaag atggttttat gtttttgacg gaccagtcct acattgatgt tttacctgag    720

ttcagagatt cttaccccat taagtatgtc catgcctttg aaagcaacaa ttttatttac    780

ttcttgacgg tccaaaggga aactctagat gctcagactt ttcacacaag aataatcagg    840

ttctgttcca taaactctgg attgcattcc tacatggaaa tgcctctgga gtgtattctc    900

acagaaaaga gaaaaaagag atccacaaag aaggaagtgt ttaatatact tcaggctgcg    960

tatgtcagca agcctggggc ccagcttgct agacaaatag gagccagcct gaatgatgac    1020

attcttttcg gggtgttcgc acaaagcaag ccagattctg ccgaaccaat ggatcgatct    1080

gccatgtgtg cattccctat caaatatgtc aacgacttct tcaacaagat cgtcaacaaa    1140

aacaatgtga gatgtctcca gcatttttac ggacccaatc atgagcactg ctttaatagg    1200

acacttctga gaaattcatc aggctgtgaa gcgcgccgtg atgaatatcg aacagagttt    1260

accacagctt tgcagcgcgt tgacttattc atgggtcaat tcagcgaagt cctcttaaca    1320

tctatatcca ccttcattaa aggagacctc accatagcta atcttgggac atcagagggt  1380

cgcttcatgc aggttgtggt ttctcgatca ggaccatcaa cccctcatgt gaattttctc  1440

ctggactccc atccagtgtc tccagaagtg attgtggagc atacattaaa ccaaaatggc  1500

tacacactgg ttatcactgg gaagaagatc acgaagatcc cattgaatgg cttgggctgc  1560

agacatttcc agtcctgcag tcaatgcctc tctgccccac cctttgttca gtgtggctgg  1620

tgccacgaca aatgtgtgcg atcggaggaa tgcctgagcg ggacatggac tcaacagatc  1680

tgtctgggag ctagctctga ctacaaggac gacgatgaca agagcgatta caaagacgat  1740

gatgataagc tgcagcatca ccaccatcat caccattga                         1779

<210>5

<211>1458

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>PSI-IPT_FLAGhis的编码序列

<400>5

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag    60

aggagcaatg ggtacacact ggttatcact gggaagaaga tcacgaagat cccattgaat    120

ggcttgggct gcagacattt ccagtcctgc agtcaatgcc tctctgcccc accctttgtt    180

cagtgtggct ggtgccacga caaatgtgtg cgatcggagg aatgcctgag cgggacatgg    240

actcaacaga tctgtctgcc tgcaatctac aaggttttcc caaatagtgc accccttgaa    300

ggagggacaa ggctgaccat atgtggctgg gactttggat ttcggaggaa taataaattt    360

gatttaaaga aaactagagt tctccttgga aatgagagct gcaccttgac tttaagtgag    420

agcacgatga atacattgaa atgcacagtt ggtcctgcca tgaataagca tttcaatatg    480

tccataatta tttcaaatgg ccacgggaca acacaataca gtacattctc ctatgtggat    540

cctgtaataa caagtatttc gccgaaatac ggtcctatgg ctggtggcac tttacttact  600

ttaactggaa attacctaaa cagtgggaat tctagacaca tttcaattgg tggaaaaaca  660

tgtactttaa aaagtgtgtc aaacagtatt cttgaatgtt ataccccagc ccaaaccatt  720

tcaactgagt ttgctgttaa attgaaaatt gacttagcca accgagagac aagcatcttc  780

agttaccgtg aagatcccat tgtctatgaa attcatccaa ccaaatcttt tattagtggt  840

gggagcacaa taacaggtgt tgggaaaaac ctgaattcag ttagtgtccc gagaatggtc  900

ataaatgtgc atgaagcagg aaggaacttt acagtggcat gtcaacatcg ctctaattca  960

gagataatct gttgtaccac tccttccctg caacagctga atctgcaact ccccctgaaa  1020

accaaagcct ttttcatgtt agatgggatc ctttccaaat actttgatct catttatgta  1080

cataatcctg tgtttaagcc ttttgaaaag ccagtgatga tctcaatggg caatgaaaat  1140

gtactggaaa ttaagggaaa tgatattgac cctgaagcag ttaaaggtga agtgttaaaa  1200

gttggaaata agagctgtga gaatatacac ttacattctg aagccgtttt atgcacggtc  1260

cccaatgacc tgctgaaatt gaacagcgag ctaaatatag agtggaagca agcaatttct  1320

tcaaccgtcc ttggaaaagt aatagttcaa ccagatcaga atttcacagc tagctctgac  1380

tacaaggacg acgatgacaa gagcgattac aaagacgatg atgataagct gcagcatcac  1440

caccatcatc accattag                                                1458

<210>6

<211>1290

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>IPT_FLAGhis的编码序列

<400>6

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag    60

aggagcaatg gggagggggg cggtggatcc cctgcaatct acaaggtttt cccaaatagt    120

gcaccccttg aaggagggac aaggctgacc atatgtggct gggactttgg atttcggagg    180

aataataaat ttgatttaaa gaaaactaga gttctccttg gaaatgagag ctgcaccttg    240

actttaagtg agagcacgat gaatacattg aaatgcacag ttggtcctgc catgaataag    300

catttcaata tgtccataat tatttcaaat ggccacggga caacacaata cagtacattc    360

tcctatgtgg atcctgtaat aacaagtatt tcgccgaaat acggtcctat ggctggtggc    420

actttactta ctttaactgg aaattaccta aacagtggga attctagaca catttcaatt    480

ggtggaaaaa catgtacttt aaaaagtgtg tcaaacagta ttcttgaatg ttatacccca    540

gcccaaacca tttcaactga gtttgctgtt aaattgaaaa ttgacttagc caaccgagag    600

acaagcatct tcagttaccg tgaagatccc attgtctatg aaattcatcc aaccaaatct    660

tttattagtg gtgggagcac aataacaggt gttgggaaaa acctgaattc agttagtgtc    720

ccgagaatgg tcataaatgt gcatgaagca ggaaggaact ttacagtggc atgtcaacat    780

cgctctaatt cagagataat ctgttgtacc actccttccc tgcaacagct gaatctgcaa    840

ctccccctga aaaccaaagc ctttttcatg ttagatggga tcctttccaa atactttgat    900

ctcatttatg tacataatcc tgtgtttaag ccttttgaaa agccagtgat gatctcaatg    960

ggcaatgaaa atgtactgga aattaaggga aatgatattg accctgaagc agttaaaggt    1020

gaagtgttaa aagttggaaa taagagctgt gagaatatac acttacattc tgaagccgtt    1080

ttatgcacgg tccccaatga cctgctgaaa ttgaacagcg agctaaatat agagtggaag    1140

caagcaattt cttcaaccgt ccttggaaaa gtaatagttc aaccagatca gaatttcaca    1200

gctagctctg actacaagga cgacgatgac aagagcgatt acaaagacga tgatgataag    1260

ctgcagcatc accaccatca tcaccattga                                     1290

<210>7

<211>1008

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>IPTδ1_FLAGhis的编码序列

<400>7

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag    60

aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cctgtaataa caagtatttc gccgaaatac    120

ggtcctatgg ctggtggcac tttacttact ttaactggaa attacctaaa cagtgggaat    180

tctagacaca tttcaattgg tggaaaaaca tgtactttaa aaagtgtgtc aaacagtatt    240

cttgaatgtt ataccccagc ccaaaccatt tcaactgagt ttgctgttaa attgaaaatt    300

gacttagcca accgagagac aagcatcttc agttaccgtg aagatcccat tgtctatgaa    360

attcatccaa ccaaatcttt tattagtggt gggagcacaa taacaggtgt tgggaaaaac    420

ctgaattcag ttagtgtccc gagaatggtc ataaatgtgc atgaagcagg aaggaacttt    480

acagtggcat gtcaacatcg ctctaattca gagataatct gttgtaccac tccttccctg    540

caacagctga atctgcaact ccccctgaaa accaaagcct ttttcatgtt agatgggatc    600

ctttccaaat actttgatct catttatgta cataatcctg tgtttaagcc ttttgaaaag    660

ccagtgatga tctcaatggg caatgaaaat gtactggaaa ttaagggaaa tgatattgac    720

cctgaagcag ttaaaggtga agtgttaaaa gttggaaata agagctgtga gaatatacac    780

ttacattctg aagccgtttt atgcacggtc cccaatgacc tgctgaaatt gaacagcgag    840

ctaaatatag agtggaagca agcaatttct tcaaccgtcc ttggaaaagt aatagttcaa    900

ccagatcaga atttcacagc tagctctgac tacaaggacg acgatgacaa gagcgattac    960

aaagacgatg atgataagct gcagcatcac caccatcatc accattga                 1008

<210>8

<211>753

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>IPTδ1-2_FLAGhis的编码序列

<400>8

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag    60

aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa    120

tcttttatta gtggtgggag cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt    180

gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa    240

catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg    300

caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt    360

gatctcattt atgtacataa tcctgtgttt aagccttttg aaaagccagt gatgatctca    420

atgggcaatg aaaatgtact ggaaattaag ggaaatgata ttgaccctga agcagttaaa    480

ggtgaagtgt taaaagttgg aaataagagc tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc    540

gttttatgca cggtccccaa tgacctgctg aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg    600

aagcaagcaa tttcttcaac cgtccttgga aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc    660

acagctagct ctgactacaa ggacgacgat gacaagagcg attacaaaga cgatgatgat    720

aagctgcagc atcaccacca tcatcaccat tga                                 753

<210>9

<211>471

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>IPT3_FLAGhis的编码序列

<400>9

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag    60

aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa    120

tcttttatta gtggtgggag cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt    180

gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa    240

catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg    300

caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt    360

gatctcattt atgtacataa tgctagctct gactacaagg acgacgatga caagagcgat    420

tacaaagacg atgatgataa gctgcagcat caccaccatc atcaccattg a             471

<210>10

<211>462

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>IPT4_FLAGhis的编码序列

<400>10

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag    60

aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cctgtgttta agccttttga aaagccagtg    120

atgatctcaa tgggcaatga aaatgtactg gaaattaagg gaaatgatat tgaccctgaa    180

gcagttaaag gtgaagtgtt aaaagttgga aataagagct gtgagaatat acacttacat    240

tctgaagccg ttttatgcac ggtccccaat gacctgctga aattgaacag cgagctaaat    300

atagagtgga agcaagcaat ttcttcaacc gtccttggaa aagtaatagt tcaaccagat    360

cagaatttca cagctagctc tgactacaag gacgacgatg acaagagcga ttacaaagac    420

gatgatgata agctgcagca tcaccaccat catcaccatt ga                       462

<210>11

<211>2040

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>Met δ25-741的编码序列

<400>11

atgaaggccc ccgctgtgct tgcacctggc atcctcgtgc tcctgtttac cttggtgcag    60

aggagcaatg gggagggggg cggtggatct cccattgtct atgaaattca tccaaccaaa    120

tcttttatta gtggtgggag cacaataaca ggtgttggga aaaacctgaa ttcagttagt    180

gtcccgagaa tggtcataaa tgtgcatgaa gcaggaagga actttacagt ggcatgtcaa    240

catcgctcta attcagagat aatctgttgt accactcctt ccctgcaaca gctgaatctg    300

caactccccc tgaaaaccaa agcctttttc atgttagatg ggatcctttc caaatacttt    360

gatctcattt atgtacataa tcctgtgttt aagccttttg aaaagccagt gatgatctca    420

atgggcaatg aaaatgtact ggaaattaag ggaaatgata ttgaccctga agcagttaaa    480

ggtgaagtgt taaaagttgg aaataagagc tgtgagaata tacacttaca ttctgaagcc    540

gttttatgca cggtccccaa tgacctgctg aaattgaaca gcgagctaaa tatagagtgg    600

aagcaagcaa tttcttcaac cgtccttgga aaagtaatag ttcaaccaga tcagaatttc    660

acaggattga ttgctggtgt tgtctcaata tcaacagcac tgttattact acttgggttt    720

ttcctgtggc tgaaaaagag aaagcaaatt aaagatctgg gcagtgaatt agttcgctac    780

gatgcaagag tacacactcc tcatttggat aggcttgtaa gtgcccgaag tgtaagccca    840

actacagaaa tggtttcaaa tgaatctgta gactaccgag ctacttttcc agaagatcag    900

tttcctaatt catctcagaa cggttcatgc cgacaagtgc agtatcctct gacagacatg    960

tcccccatcc taactagtgg ggactctgat atatccagtc cattactgca aaatactgtc    1020

cacattgacc tcagtgctct aaatccagag ctggtccagg cagtgcagca tgtagtgatt    1080

gggcccagta gcctgattgt gcatttcaat gaagtcatag gaagagggca ttttggttgt    1140

gtatatcatg ggactttgtt ggacaatgat ggcaagaaaa ttcactgtgc tgtgaaatcc    1200

ttgaacagaa tcactgacat aggagaagtt tcccaatttc tgaccgaggg aatcatcatg    1260

aaagatttta gtcatcccaa tgtcctctcg ctcctgggaa tctgcctgcg aagtgaaggg  1320

tctccgctgg tggtcctacc atacatgaaa catggagatc ttcgaaattt cattcgaaat  1380

gagactcata atccaactgt aaaagatctt attggctttg gtcttcaagt agccaaaggc  1440

atgaaatatc ttgcaagcaa aaagtttgtc cacagagact tggctgcaag aaactgtatg  1500

ctggatgaaa aattcacagt caaggttgct gattttggtc ttgccagaga catgtatgat  1560

aaagaatact atagtgtaca caacaaaaca ggtgcaaagc tgccagtgaa gtggatggct  1620

ttggaaagtc tgcaaactca aaagtttacc accaagtcag atgtgtggtc ctttggcgtg  1680

ctcctctggg agctgatgac aagaggagcc ccaccttatc ctgatgtaaa cacctttgat  1740

ataactgttt acttgttgca agggagaaga ctcctacaac ccgaatactg cccagacccc  1800

ttatatgaag taatgctaaa atgctggcac cctaaagccg aaatgcgccc atccttttct  1860

gaactggtgt cccggatatc agcaatcttc tctactttca ttggggagca ctatgtccat  1920

gtgaacgcta cttatgtgaa cgtaaaatgt gtcgctccat atccttctct gttgtcatca  1980

gaagataacg ctgatgatga ggtggacaca cgaccagcct ccttctggga gacatcatag  2040

<210>12

<211>2259

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>HGF_MYChis的编码序列

<400>12

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc    60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc    300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa    360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta    420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac    480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct    540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc    600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga    660

ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca    720

caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc    780

cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg    840

gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg    900

gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt    960

tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact    1020

cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct    1080

gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt    1140

ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg    1200

ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa    1260

gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc    1320

cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct    1380

tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta    1440

gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaattgc gagttgtaaa tgggattcca    1500

acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga    1560

ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac    1620

ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa  1680

tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt  1740

ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct  1800

aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact  1860

ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag  1920

aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg  1980

gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag  2040

caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca  2100

aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt  2160

ttaacatata aggtaccaca gtcagctagc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg  2220

aatggagggc tcgagcatca ccaccatcac catcattga                         2259

<210>13

<211>1494

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>HGF-α_MYChis的编码序列

<400>13

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc    60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc    300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa    360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta    420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac  480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct  540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc  600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga  660

ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca  720

caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc  780

cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg  840

gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg  900

gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt  960

tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact  1020

cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct  1080

gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt  1140

ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg  1200

ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa  1260

gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc  1320

cgaaatccag atgatgacgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct  1380

tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgataccg ctagcgaaca aaaactcatc  1440

tcagaagagg atctgaatgg agggctcgag catcaccacc atcaccatca ttga        1494

<210>14

<211>705

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>HGF NK1_MYChis的编码序列

<400>14

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc    60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc    300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa    360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta    420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac    480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct    540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc    600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa gctagcgaac aaaaactcat ctcagaagag    660

gatctgaatg gagggctcga gcatcaccac catcaccatc attga                    705

<210>15

<211>903

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>HGF-β_MYChis的编码序列

<400>15

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc    60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcgttg taaatgggat tccaacacga acaaacatag gatggatggt tagtttgaga    180

tacagaaata aacatatctg cggaggatca ttgataaagg agagttgggt tcttactgca    240

cgacagtgtt tcccttctcg agacttgaaa gattatgaag cttggcttgg aattcatgat    300

gtccacggaa gaggagatga gaaatgcaaa caggttctca atgtttccca gctggtatat  360

ggccctgaag gatcagatct ggttttaatg aagcttgcca ggcctgctgt cctggatgat  420

tttgttagta cgattgattt acctaattat ggagccacaa ttcctgaaaa gaccagttgc  480

agtgtttatg gctggggcta cactggattg atcaactatg atggcctatt acgagtggca  540

catctctata taatgggaaa tgagaaatgc agccagcatc atcgagggaa ggtgactctg  600

aatgagtctg aaatatgtgc tggggctgaa aagattggat caggaccatg tgagggggat  660

tatggtggcc cacttgtttg tgagcaacat aaaatgagaa tggttcttgg tgtcattgtt  720

cctggtcgtg gatgtgccat tccaaatcgt cctggtattt ttgtccgagt agcatattat  780

gcaaaatgga tacacaaaat tattttaaca tataaggtac cacagtcagc tagcgaacaa  840

aaactcatct cagaagagga tctgaatgga gggctcgagc atcaccacca tcaccatcat  900

tga                                                                903

<210>16

<211>2259

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>不可断裂的HGF_MYChis的编码序列

<400>16

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc    60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc    300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa    360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta    420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac    480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct    540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc    600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa tgcatgacct gcaatgggga gagttatcga    660

ggtctcatgg atcatacaga atcaggcaag atttgtcagc gctgggatca tcagacacca    720

caccggcaca aattcttgcc tgaaagatat cccgacaagg gctttgatga taattattgc    780

cgcaatcccg atggccagcc gaggccatgg tgctatactc ttgaccctca cacccgctgg    840

gagtactgtg caattaaaac atgcgctgac aatactatga atgacactga tgttcctttg    900

gaaacaactg aatgcatcca aggtcaagga gaaggctaca ggggcactgt caataccatt    960

tggaatggaa ttccatgtca gcgttgggat tctcagtatc ctcacgagca tgacatgact    1020

cctgaaaatt tcaagtgcaa ggacctacga gaaaattact gccgaaatcc agatgggtct    1080

gaatcaccct ggtgttttac cactgatcca aacatccgag ttggctactg ctcccaaatt    1140

ccaaactgtg atatgtcaca tggacaagat tgttatcgtg ggaatggcaa aaattatatg    1200

ggcaacttat cccaaacaag atctggacta acatgttcaa tgtgggacaa gaacatggaa    1260

gacttacatc gtcatatctt ctgggaacca gatgcaagta agctgaatga gaattactgc    1320

cgaaatccag atgatgatgc tcatggaccc tggtgctaca cgggaaatcc actcattcct    1380

tgggattatt gccctatttc tcgttgtgaa ggtgatacca cacctacaat agtcaattta    1440

gaccatcccg taatatcttg tgccaaaacg aaacaactgc aggttgtaaa tgggattcca    1500

acacgaacaa acataggatg gatggttagt ttgagataca gaaataaaca tatctgcgga    1560

ggatcattga taaaggagag ttgggttctt actgcacgac agtgtttccc ttctcgagac    1620

ttgaaagatt atgaagcttg gcttggaatt catgatgtcc acggaagagg agatgagaaa    1680

tgcaaacagg ttctcaatgt ttcccagctg gtatatggcc ctgaaggatc agatctggtt    1740

ttaatgaagc ttgccaggcc tgctgtcctg gatgattttg ttagtacgat tgatttacct  1800

aattatggat gcacaattcc tgaaaagacc agttgcagtg tttatggctg gggctacact  1860

ggattgatca actatgatgg cctattacga gtggcacatc tctatataat gggaaatgag  1920

aaatgcagcc agcatcatcg agggaaggtg actctgaatg agtctgaaat atgtgctggg  1980

gctgaaaaga ttggatcagg accatgtgag ggggattatg gtggcccact tgtttgtgag  2040

caacataaaa tgagaatggt tcttggtgtc attgttcctg gtcgtggatg tgccattcca  2100

aatcgtcctg gtatttttgt ccgagtagca tattatgcaa aatggataca caaaattatt  2160

ttaacatata aggtaccaca gtcagctagc gaacaaaaac tcatctcaga agaggatctg  2220

aatggagggc tcgagcatca ccaccatcac catcattga                         2259

<210>17

<211>1197

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>NK1-NK1_his的编码序列

<400>17

atgtgggtga ccaaactcct gccagccctg ctgctgcagc atgtcctcct gcatctcctc    60

ctgctcccca tcgccatccc ctatgcagag ggacaaagga aaagaagaaa tacaattcat    120

gaattcaaaa aatcagcaaa gactacccta atcaaaatag atccagcact gaagataaaa    180

accaaaaaag tgaatactgc agaccaatgt gctaatagat gtactaggaa taaaggactt    240

ccattcactt gcaaggcttt tgtttttgat aaagcaagaa aacaatgcct ctggttcccc    300

ttcaatagca tgtcaagtgg agtgaaaaaa gaatttggcc atgaatttga cctctatgaa    360

aacaaagact acattagaaa ctgcatcatt ggtaaaggac gcagctacaa gggaacagta    420

tctatcacta agagtggcat caaatgtcag ccctggagtt ccatgatacc acacgaacac    480

agctttttgc cttcgagcta tcggggtaaa gacctacagg aaaactactg tcgaaatcct  540

cgaggggaag aagggggacc ctggtgtttc acaagcaatc cagaggtacg ctacgaagtc  600

tgtgacattc ctcagtgttc agaagttgaa gctagcgaat tcaaaaaatc agcaaagact  660

accctaatca aaatagatcc agcactgaag ataaaaacca aaaaagtgaa tactgcagac  720

caatgtgcta atagatgtac taggaataaa ggacttccat tcacttgcaa ggcttttgtt  780

tttgataaag caagaaaaca atgcctctgg ttccccttca atagcatgtc aagtggagtg  840

aaaaaagaat ttggccatga atttgacctc tatgaaaaca aagactacat tagaaactgc  900

atcattggta aaggacgcag ctacaaggga acagtatcta tcactaagag tggcatcaaa  960

tgtcagccct ggagttccat gataccacac gaacacagct ttttgccttc gagctatcgg  1020

ggtaaagacc tacaggaaaa ctactgtcga aatcctcgag gggaagaagg gggaccctgg  1080

tgtttcacaa gcaatccaga ggtacgctac gaagtctgtg acattcctca gtgttcagaa  1140

gttgaagcta gtgggggtgg tagtggagga gggcatcacc atcatcacca tcactga     1197

<210>18

<211>1218

<212>DNA

<213>人工合成

<220>

<223>hAS_MYC的编码序列

<400>18

atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagtg  60

tatctctcag agtgcaagac tgggaatgga aagaactaca gagggacgat gtccaaaaca  120

aaaaatggca tcacctgtca aaaatggagt tccacttctc cccacagacc tagattctca  180

cctgctacac acccctcaga gggactggag gagaactact gcaggaatcc agacaacgat  240

ccgcaggggc cctggtgcta tactactgat ccagaaaaga gatatgacta ctgcgacatt  300

cttgagtgtg aagaggaatg tatgcattgc agtggagaaa actatgacgg caaaatttcc  360

aagaccatgt ctggactgga atgccaggcc tgggactctc agagcccaca cgctcatgga    420

tacattcctt ccaaatttcc aaacaagaac ctgaagaaga attactgtcg taaccccgat    480

agggagctgc ggccttggtg tttcaccacc gaccccaaca agcgctggga actttgcgac    540

atcccccgct gcacaacacc tccaccatct tctggtccca cctaccagtg tctgaaggga    600

acaggtgaaa actatcgcgg gaatgtggct gttaccgttt ccgggcacac ctgtcagcac    660

tggagtgcac agacccctca cacacataac aggacaccag aaaacttccc ctgcaaaaat    720

ttggatgaaa actactgccg caatcctgac ggaaaaaggg ccccatggtg ccatacaacc    780

aacagccaag tgcggtggga gtactgtaag ataccgtcct gtgactcctc cccagtatcc    840

acggaacaat tggctcccac agcaccacct gagctaaccc ctgtggtcca ggactgctac    900

catggtgatg gacagagcta ccgaggcaca tcctccacca ccaccacagg aaagaagtgt    960

cagtcttggt catctatgac accacaccgg caccagaaga ccccagaaaa ctacccaaat    1020

gctggcctga caatgaacta ctgcaggaat ccagatgccg ataaaggccc ctggtgtttt    1080

accacagacc ccagcgtcag gtgggagtac tgcaacctga aaaaatgctc aggaacagaa    1140

gcggctagcg aacaaaaact catctcagaa gaggatctga atggagggct cgagcatcac    1200

caccatcacc atcattga                                                  1218

<210>19

<211>9

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>C末端Flag

<400>19

Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

1               5

<210>20

<211>11

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>C末端的单个Myc

<400>20

Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn

1               5                   10

<210>21

<211>7

<212>PRT

<213>人工合成

<220>

<223>多-组氨酸标签

<400>21

His His His His His His His

1               5

Claims (11)

1.编码肝细胞生长因子受体的至少胞外IPT-3和IPT-4结构域的多核苷酸用于筛选和/或开发在癌症治疗中有用的药理学上有效的药物的用途。

2.包含肝细胞生长因子受体的至少胞外IPT-3和IPT-4结构域的多肽用于筛选和/或开发在癌症治疗中有用的药理学上有效的药物的用途。

3.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述的药理学上有效的药物干扰肝细胞生长因子受体的催化活性、功能、稳定性和/或表达。

4.根据权利要求1或2所述的用途，其中所述的药理学上有效的药物下调肝细胞生长因子受体的催化活性、功能、稳定性和/或表达。

5.根据前述任一权利要求所述的用途，其中所述的药理学上有效的药物是肝细胞生长因子受体的抑制剂和/或拮抗剂。

6.根据前述任一权利要求所述的用途，其中所述的药理学上有效的药物选自小分子抑制剂、适体、反义核苷酸、基于RNA的抑制剂、siRNAs、抗体、肽、显性负性因子。

7.根据前述任一权利要求所述的用途，其中所述的癌症是一种肝细胞生长因子受体活性失调的癌症。

8.检测待测药物作为肝细胞生长因子受体的拮抗剂/抑制剂的用于治疗癌症的能力的方法，所述癌症优选为一种肝细胞生长因子受体活性失调的癌症，所述方法包括以下步骤：

(a)将待测药物与i)编码肝细胞生长因子受体的至少胞外IPT-3和IPT-4结构域的多核苷酸，ii)包含肝细胞生长因子受体的至少胞外IPT-3和IPT-4结构域的多肽，或iii)表达肝细胞生长因子受体的至少胞外IPT-3和IPT-4结构域的细胞相接触，

(b)检测肝细胞生长因子受体的活性、功能、稳定性和/或表达，和

(c)选择能降低肝细胞生长因子受体的活性、功能、稳定性和/或表达的药物。

9.根据权利要求8-11中的任意一项权利要求所述的方法，其中步骤b)中所述的检测包含检测细胞信号传导、细胞存活和细胞增殖。

10.肝细胞生长因子受体的胞外IPT-3和IPT-4结构域作为治疗癌症的药物的用途。

11.包含至少一个编码肝细胞生长因子受体的胞外IPT-3和IPT-4结构域的核苷酸的载体作为治疗癌症的药物的用途。

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