CN114835817B

CN114835817B - 一种基于天然配体制备靶向her2/egfr car-t的方法及应用

Info

Publication number: CN114835817B
Application number: CN202110139311.6A
Authority: CN
Inventors: 赵旭东; 涂秋
Original assignee: West China Hospital of Sichuan University
Current assignee: West China Hospital of Sichuan University
Priority date: 2021-02-01
Filing date: 2021-02-01
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2041-02-01
Also published as: CN114835817A

Abstract

本发明提供了基于天然配体制备靶向HER2/EGFR CAR‑T的方法及应用。具体地，本发明提供了一种基于脯氨酸肽酶(Prolidase PEPD)改造的嵌合抗原受体(CAR)，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够同时靶向HER2和EGFR。本发明的CAR对HER2或者EGFR阳性的肿瘤细胞均具有细胞毒性，能显著抑制体内肿瘤的生长。并且，在非人灵长类猴子体内验证数据表明，本发明的CAR‑T毒性低。

Description

一种基于天然配体制备靶向HER2/EGFR CAR-T的方法及应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及一种基于天然配体制备靶向HER2/EGFRCAR-T的方法及应用。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)免疫疗法是近年来发展起来的一种新兴细胞免疫疗法，自在血液肿瘤中取得巨大成功后，目前有大量的临床研究。不幸的是，尽管CAR-T细胞可以在体外杀死实体瘤细胞并在临床前小鼠模型中成功抑制肿瘤生长，但在临床试验中，它在实体瘤的治疗方面进展甚微。这可能归因于几个原因，其中最重要的两个原因是癌细胞上抗原表达的微环境和异质性。在临床前小鼠模型中观察到，肿瘤细胞的复杂且抑制性微环境可能会阻止CAR-T细胞进入肿瘤块，抑制CAR-T细胞的毒性并使CAR-T细胞耗尽。癌细胞上抗原表达的异质性使得难以通过单个特异性CAR-T根除所有肿瘤细胞，靶抗原表达的丢失使肿瘤细胞逃避了CAR-T。

HER2和EGFR均属于表皮生长因子受体家族。表皮生长因子受体家族由HER1(EGFR)至HER4组成。HER2被发现在乳腺癌、胃癌、肝胆癌、结直肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和食道癌等多种肿瘤中过表达；而在成胶质细胞瘤、肺癌、膀胱癌、乳腺癌等中，经常发现EGFR突变和过表达。它们均作为驱动基因在促进肿瘤中发挥重要作用，是靶向治疗的重要靶标。

据报道，几种靶向HER2或EGFR的CAR-T可有效杀死癌细胞，但是CAR-T都是基于HER2或EGFR抗体的部分肽段来制备的，这可能带来某些副作用，并可能引起抗原的丢失和肿瘤细胞逃逸。

基于天然配体-受体的制备的CAR比源自抗体的CAR具有优势。基于天然配体受体的EGFR CAR在小鼠模型中对体内和体外肿瘤细胞均表现出有效的作用。然而，由于缺乏众所周知的HER2配体，因此没有基于天然配体-受体的CAR靶向HER2。

因此，本领域迫切需要开发一种基于天然配体-受体的能够高效靶向EGFR和HER2的嵌合抗原受体T细胞。

发明内容

本发明的目的就是提供一种基于天然配体-受体的能够高效靶向EGFR和HER2的嵌合抗原受体T细胞。

在本发明的第一方面，提供了一种基于脯氨酸肽酶(Prolidase PEPD)改造的嵌合抗原受体(CAR)，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够同时靶向HER2和EGFR。

在另一优选例中，所述的胞外结合域具有来源于脯氨酸肽酶(Prolidase PEPD)的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的胞外结合域包括脯氨酸肽酶或其片段。

在另一优选例中，所述的脯氨酸肽酶或其片段与HER2和EGFR均具有特异性结合。

在另一优选例中，所述的脯氨酸肽酶或其片段具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或具有如SEQ ID NO:1所示序列的N端第1至250-350位(较佳地为N端第1至300-320位，更佳地第1至309位)的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的脯氨酸肽酶或其片段的氨基酸序列选自下组：

(i)如SEQ ID NO:1所示序列的第1至309位所示的序列；和

(ii)在如SEQ ID NO:1所示序列的第1至309位所示序列的基础上，进行一个或多个氨基酸残基的替换、缺失、改变或插入，或在其N端或C端添加1至30个氨基酸残基，较佳地1至10个氨基酸残基，更佳地1至5个氨基酸残基，从而获得的氨基酸序列；并且所述获得的氨基酸序列与如SEQ ID NO:1所示序列的第1至309位所示序列具有≥85％(优选地≥90％，更优选地≥95％，例如≥96％、≥97％、≥98％或≥99％)的序列同一性。

在另一优选例中，所述CAR的结构如下式I所示：

L-EB-H-TM-C-CD3ζ-RP (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L是无或信号肽序列；

EB是胞外结合域；

H是无或铰链区；

TM是跨膜结构域；

C是无或共刺激信号分子；

CD3ζ是源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

RP是无或报告蛋白。

在另一优选例中，所述的报告蛋白RP中还包括位于其N端的自剪切识别位点，优选地为T2A序列。

在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为荧光蛋白。

在另一优选例中，所述的报告蛋白RP为mKate2红色荧光蛋白。

在另一优选例中，所述的mKate2红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

在另一优选例中，所述的L是选自下组的蛋白的信号肽：CD8、CD28、GM-CSF、CD4、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述L的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

在另一优选例中，所述的H是选自下组的蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、或其组合。

在另一优选例中，所述的H是CD8来源的铰链区。

在另一优选例中，所述H的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

在另一优选例中，所述的TM是为选自下组的蛋白的跨膜区：CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

在另一优选例中，所述的TM是CD28来源的跨膜区。

在另一优选例中，所述TM的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

在另一优选例中，所述的C是选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4-1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。

在另一优选例中，所述的C是CD28来源的共刺激信号分子。

在另一优选例中，所述C的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

在另一优选例中，所述的源于CD3ζ的胞浆信号传导序列的氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。

在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

在本发明的第二方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码如本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。

在本发明的第三方面，提供了一种载体，所述的载体含有如本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体是pTomo慢病毒载体。

在另一优选例中，所述载体中还包括启动子等调控元件；优选地，所述载体包含如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子或表达如本发明第一方面所述的CAR。

在本发明的第五方面，提供了一种工程化免疫细胞，所述的免疫细胞含有如本发明第三方面所述的载体或染色体中整合有外源的如本发明第二方面所述的核酸分子或表达如本发明第一方面所述的CAR。

在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)或嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

在另一优选例中，所述的工程化免疫细胞是CAR-T细胞。

在本发明的第六方面，提供了一种制备如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的方法，包括以下步骤：将如本发明第二方面所述的核酸分子或如本发明第三方面所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

在另一优选例中，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

在本发明的第七方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有如本发明第一方面所述的CAR、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

在另一优选例中，所述制剂为液态制剂。

在另一优选例中，所述制剂的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，较佳地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在本发明的第八方面，提供了一种如本发明第一方面所述的CAR、如本发明第二方面所述的核酸分子、如本发明第三方面所述的载体、或如本发明第四方面所述的宿主细胞，和/或如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞的用途，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

在另一优选例中，所述肿瘤包括血液肿瘤和实体瘤。

在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，或其组合。

在另一优选例中，所述的实体瘤选自下组：乳腺癌、胃癌、肝胆癌、结直肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和食道癌、成胶质细胞瘤、肺癌、胰腺癌，或其组合。

在另一优选例中，所述的肿瘤是胰腺癌。

在本发明的第九方面，提供了一种如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第七方面所述的药物组合物的用途，用于预防和/或治疗癌症或肿瘤。

在本发明的第十方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用有效量的如本发明第五方面所述的工程化免疫细胞、或如本发明第七方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了HER2/EGFR配体PEPD的结构图，以及靶向HER2/EGFR的PEPD CAR和对照CD19 CAR的构建方案。

图2显示了通过红色荧光观察和流式检测PEPD CAR体外感染人T细胞的感染效率。

图3显示了PEPD CAR-T体外对胰腺癌细胞的细胞毒性检测结果。

图4显示了PEPD CAR-T体内抗肿瘤效果检测结果。

图5显示了在猴子体内验证的PEPD CAR-T的毒性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量的筛选，首次开发了一种基于天然配体-受体制备靶向HER2/EGFR CAR-T的方法及应用。实验结果表明，本发明的靶向HER2/EGFR的CAR-T具有良好的体内体外清除肿瘤细胞效果。在此基础上完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

术语“给予”是指使用本领域技术人员已知的各种方法和递送系统中的任一种将本发明的产品物理引入受试者，包括静脉内，肌内，皮下，腹膜内，脊髓或其它肠胃外给药途径，例如通过注射或输注。

本发明嵌合抗原受体(CAR)

嵌合免疫抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)由胞外抗原识别区域、跨膜区以及胞内共刺激信号区域组成。

CAR的设计经历了以下过程：第一代CAR只有一个胞内信号组份CD3ζ或者FcγRI分子，由于胞内只有一个活化结构域，因此它只能引起短暂的T细胞增殖和较少的细胞因子分泌，而并不能提供长时间的T细胞增殖信号和持续的体内抗肿瘤效应，所以并没有取得很好地临床疗效。第二代CAR在原有结构基础上引入一个共刺激分子，如CD28、4-1BB、OX40、ICOS，与一代CAR相比功能有很大提高，进一步加强CAR-T细胞的持续性和对肿瘤细胞的杀伤能力。在二代CAR基础上串联一些新的免疫共刺激分子如CD27、CD134，发展成为三代和四代CAR。

CAR的胞外段可识别一个特异的抗原，随后通过胞内结构域转导该信号，引起细胞的活化增殖、细胞溶解毒性和分泌细胞因子，进而清除靶细胞。首先分离病人自体细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR的免疫细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被免疫细胞以非MHC限制方式识别。

CAR-免疫细胞治疗在血液恶性肿瘤治疗中取得了非常高的临床反应率，这样的高反应率是以往任何一种治疗手段都无法达到的，在世界各引发了临床研究的热潮。

具体地，本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。

胞外结构域包括靶-特异性结合元件。所述的胞外结构域可以是基于抗原-抗体的特异性结合的抗体的ScFv，也可以是基于配体-受体的特异性结合的天然序列或其衍生物。

脯氨酸肽酶(Prol idase，PEPD)最近被报道为高亲和力HER2配体和低亲和力EGFR配体。在本发明中，所述嵌合抗原受体的胞外结构域是一种可特异性结合本发明CAR的双靶点的脯氨酸肽酶或其片段。更加优选地，本发明嵌合抗原受体的胞外结合域具有如SEQ IDNO:1所示序列的第1至309位的氨基酸序列。

细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0-300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与CD28信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

在本发明中，本发明CAR的胞外结合域还包括基于序列的保守性变异体，指与SEQID NO:1的第1至309位的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量，优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40％，更优选为不超过35％，更优选为1-33％，更优选为5-30％，更优选为10-25％，更优选为15-20％。

在本发明中，所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量通常是1、2、3、4或5个，较佳地为1-3个，更佳地为1-2个，最佳地为1个。

对于绞链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

本发明的CAR中的胞内结构域包括4-1BB共刺激结构域和CD3ζ的信号传导结构域。

在本发明中，所述的CAR是可以同时靶向HER2和EGFR的双特异性CAR。

嵌合抗原受体免疫细胞(CAR-免疫细胞)

在本发明中，提供了一种嵌合抗原受体免疫细胞，其包含本发明的具有同时靶向HER2和EGFR双特异性功能的嵌合抗原受体。

本发明的嵌合抗原受体免疫细胞可以是CAR-T细胞，也可以是CAR-NK细胞。优选地，本发明的嵌合抗原受体免疫细胞是CAR-T细胞。

如本文所用，术语“CAR-T细胞”、“CAR-T”、“本发明CAR-T细胞”均指本发明第五方面所述的CAR-T细胞。

CAR-T细胞较其它基于T细胞的治疗方式存在以下优势：(1)CAR-T细胞的作用过程不受MHC的限制；(2)鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤标志物，针对某一种肿瘤标志物的CAR基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；(3)CAR既可以利用肿瘤蛋白质标志物，又可利用糖脂类非蛋白质标志物，扩大了肿瘤标志物的靶点范围；(4)使用患者自体细胞降低了排异反应的风险；(5)CAR-T细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。

如本文所用，术语“CAR-NK细胞”、“CAR-NK”、“本发明CAR-NK细胞”均指本发明第五方面所述的CAR-NK细胞。本发明CAR-NK细胞可用于治疗HER2和EGFR高表达的肿瘤。

自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞的侵袭。通过工程化(基因修饰)的NK细胞可能获得新的功能，包括特异性识别肿瘤抗原的能力及具有增强的抗肿瘤细胞毒作用。

与自体CAR-T细胞相比，CAR-NK细胞还具有一下优点，例如：(1)通过释放穿孔素和颗粒酶直接杀伤肿瘤细胞，而对机体正常的细胞没有杀伤作用；(2)它们释放很少量的细胞因子从而降低了细胞因子风暴的危险；(3)体外极易扩增及发展为“现成的”产品。除此之外，与CAR-T细胞治疗类似。

载体

编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

本发明也提供了包含本发明的核酸分子的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui-Tei等，2000FEBS Letters479:79-82)。在本发明的一个实施方式中，报告基因是编码mKate2红色荧光蛋白的基因。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。

将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring HarborLaboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为慢病毒载体。

制剂

本发明提供了一种含有本发明第一方面所述的双特异性嵌合抗原受体CAR、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、或本发明第四方面的宿主细胞或本发明第五方面所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一个实施方式中，所述制剂为液态制剂。优选地，所述制剂为注射剂。优选地，所述制剂中所述CAR-T细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml，更优地1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

在一个实施方式中，所述制剂可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的制剂优选配制用于静脉内施用。

治疗性应用

本发明包括用编码本发明表达盒的慢病毒载体(LV)转导的细胞(例如，T细胞)进行的治疗性应用。转导的T细胞可靶向肿瘤细胞的标志物HER2和EGFR，协同激活T细胞，引起免疫细胞免疫应答，从而显著提高其对肿瘤细胞的杀伤效率。

因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：给哺乳动物施用本发明的CAR-细胞。

在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，分离病人自体T细胞(或者异源供体)，激活并进行基因改造产生CAR-T细胞，随后注入同一病人体内。这种方式患移植物抗宿主病概率极低，抗原被T细胞以无MHC限制方式识别。此外，一种CAR-T就可以治疗表达该抗原的所有癌症。不像抗体疗法，CAR-T细胞能够体内复制，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

在一个实施方式中，本发明的CAR-T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。另外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫疗法步骤的一部分，其中CAR-修饰T细胞诱导对CAR中的抗原结合结构域特异性的免疫应答。例如，抗HER2和EGFR的CAR-T细胞引起抗表达HER2和/或EGFR的细胞的特异性免疫应答。

尽管本文公开的数据具体公开了包括PEPD或其片段、铰链和跨膜区、和4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括对构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。

可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、肝胆癌、结直肠癌、膀胱癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和食道癌、成胶质细胞瘤、肺癌。

本发明的CAR-修饰T细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩增细胞，ii)将编码CAR的核酸引入细胞，和/或iii)冷冻保存细胞。

离体程序在本领域中是公知的，并在以下更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可为人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者为自体的。可选地，细胞可相对于接受者为同种异基因的、同基因的(syngeneic)或异种的。

除了就离体免疫而言使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。

本发明提供了治疗肿瘤的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。

本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL-2、IL-17或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

当指出“有效量”、“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选通过i.v.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤，淋巴结或感染位置。

在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其他将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的有关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：所述试剂诸如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也已知为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗治疗或对牛皮癣患者的厄法珠单抗治疗或对具体肿瘤患者的其他治疗。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂，诸如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其他免疫治疗剂。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂诸如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺结合(例如，之前、同时或之后)而施用给患者。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在一些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在一个额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。

施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。通常，每次治疗或每个疗程，可将1×10⁶个至1×10¹⁰个本发明的CAR-T细胞，通过例如静脉回输的方式，施用于患者。

本发明的主要优点包括：

1)现有的靶向HER2或者EGFR的CAR-T大多是基于抗体肽段构建的，本发明首次利用HER2/EGFR天然配体构建CAR-T，能克服以前CAR-T可能具有副作用，并可能引起抗原的丢失和肿瘤细胞逃逸的缺陷。

2)本发明的CAR-T能同时靶向HER2和EGFR，因此对只要是HER2或者EGFR阳性的细胞都适用。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

表A本发明涉及的氨基酸序列总结

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实施例1：HER2 CAR慢病毒载体构建

通过基因公司合成PEPD的不同长度的肽段(如图1所示)以及CD19的ScFv片段，然后将片段克隆到pTomo慢病毒载体，紧接着连上CD8铰链区和跨膜结构域片段，然后是4-1BB、CD3ζ结构域，最后是T2A-mKate2。mKate2红色荧光用于检测CAR慢病毒的感染效率，最后形成如图1所示的结构示意图。

实施例2：人T细胞分离培养

在本实施例中，对人T细胞的分离和培养步骤如下：

1)将病人血液转移至50mL离心管中，添加RosetteSepTM Cocktail至血液中(50ul/mL血液)；

2)充分混匀后，室温孵育20min；

3)配制稀释液：含2％FBS的1×PBS；

4)准备梯度离心管，加入15ml Ficol Lymphoprep(用之前恢复室温)；

5)将稀释液与孵育血样按1:1混合；

6)将稀释血样轻柔转移至分离液上，1200g离心20min；

7)将离心后的上清液快速全部转移至新的离心管；

8)用25ml的稀释液与上清混合均匀，300g离心10min；

9)重复操作步骤8)；

10)将细胞用T细胞冻存液(BioLife Solutions)重悬冻存或直接用1640完全培养基重悬培养。

实施例3：CAR-T细胞制备

用慢病毒感染T细胞，分四个组NTD、CD19 BBz、PEPD-BBz-1#、PEPD-BBz-2#。

其感染效率如图2所示，从图中可以看出，PEPD-BBz-1#感染效率可达到49.3，而PEPD-BBz-2#稍差一些为28.5％，这可能是因为PEPD-BBz-2#质粒较大。

将慢病毒感染的T细胞接种于96孔板中(细胞数调整在1-3×10⁶个)，37℃，5％CO₂培养并于24h后更换新鲜培养基，转移至24孔板扩大培养(收集细胞，300-500g/5min)，72h后可进行杀伤实验。

实施例4：CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养

胰酶消化培养的肿瘤细胞，用基础培养基洗涤2次并计数，1×10⁶cells/ml细胞悬液加1μl CFSE，混匀；37℃避光孵育30min；将染色后的靶细胞离心，用基础培养基洗涤2次，用T细胞完全培养基重悬靶细胞。

按T细胞与肿瘤细胞效靶比10：1，5：1和1：1接种CAR-T细胞。将相应的靶细胞和CAR-T细胞混匀并加到96孔板中(每孔总体积为200ul，不足200ul时用T细胞培养基补齐)。

在本实施例中，所用的肿瘤细胞包括：胰腺癌细胞系Bxpc-3、Panc-1及SW1990。

实施例5：共培养16小时后按下面方法进行T细胞毒性检测

1)收集细胞上清于1.5ml离心管中，做好标记；

2)PBS洗涤细胞，每孔加入50μl胰酶，37℃消化3-5min(消化时间根据细胞不同有所调整)；

3)用200μl含1×PBS+2％FBS终止消化，吹打混匀后转移至对应的上清中，再加入1ml的1×PBS+2％FBS混匀；

4)1200g，室温离心5min；

5)重复操作步骤3)、4)；

6)弃上清，每管加入200μl×PBS+2％FBS以及0.25μl 7-AAD重悬混匀；

7)避光室温孵育30min；

8)流式细胞仪检测靶细胞死亡率。

结果如图3所示，从结果可以看出，PEPD-BBz-1#和2#对胰腺癌细胞系均有很好的杀伤效果。

实施例6：B-NDG小鼠移植瘤实验和CAR-T细胞接种

用慢病毒pTomo-Luciferase-puro感染人肿瘤细胞，感染48小时后，换完全培养基，并加入3ug/ml的puromycin筛选5-7天，用小鼠活体成像仪检测细胞luciferase表达情况，然后将100ul含有1×10⁶肿瘤细胞和30％matrigel的细胞悬液接种到小鼠皮下。IVIS成像系统定期监测肿瘤的生长情况。

将上述小鼠分成四个组：生理盐水组(saline)、正常T细胞组(NTD)、CD19BBz、PEPDBBz。将1×10⁷T细胞或生理盐水通过尾静脉注射到小鼠体内，然后用IVIS成像系统定期监测肿瘤的生长情况，并记录小鼠生存曲线等。

体内抗肿瘤结果如图4所示，从结果可以看出，PEPD-BBz能很好的抑制肿瘤的体内生长。

实施例7：猴子体内安全性实验

采集四只猕猴的血液，体外分离培养T细胞，并用PEPD-BBz病毒感染猴子T细胞，并扩大培养；收集T细胞，通过静脉注射到对应的猴子体内(注射量为1x10^7/kg体重)；并在注射后0/1/3/5/7/14/21/28/35天监测猴子的情况，包括体重、体温、呼吸、食欲、精神状态、是否腹泻等，并采集猴子的血液，进行血清生化分析，各血细胞占比分析，以及血清中细胞因子浓度检测等。

结果如图5所示，从结果可以看出，注射PEPD CAR-T细胞后猴子体温、体重等保持正常；血液中细胞成分，如红细胞、血小板等也保持正常；主要器官的功能性指标，如心脏功能(CK)、肝功能(AST、ALT、GGT等)及肾功能(BUN、CRE2)等参数也保持正常；最后通过ELISA检测血清中细胞因子的变化，其中IFNγ和IL6能被检测到，并在较小的、可接受范围内波动。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 四川大学华西医院

<120> 一种基于天然配体制备靶向HER2/EGFR CAR-T的方法及应用

<130> P2020-1160

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 493

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Met Ala Ala Ala Thr Gly Pro Ser Phe Trp Leu Gly Asn Glu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Val Pro Leu Ala Leu Phe Ala Leu Asn Arg Gln Arg Leu Cys Glu

20 25 30

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35 40 45

Gln Gly Gly Glu Glu Thr Gln Arg Tyr Cys Thr Asp Thr Gly Val Leu

50 55 60

Phe Arg Gln Glu Ser Phe Phe His Trp Ala Phe Gly Val Thr Glu Pro

65 70 75 80

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Val Pro Arg Leu Pro Ala Ser His Ala Thr Trp Met Gly Lys Ile His

100 105 110

Ser Lys Glu His Phe Lys Glu Lys Tyr Ala Val Asp Asp Val Gln Tyr

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Val Asp Glu Ile Ala Ser Val Leu Thr Ser Gln Lys Pro Ser Val Leu

130 135 140

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Ala Ser Phe Asp Gly Ile Ser Lys Phe Glu Val Asn Asn Thr Ile Leu

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Glu Val Leu Arg Tyr Thr Asn Lys Ile Ser Ser Glu Ala His Arg Glu

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Val Met Lys Ala Val Lys Val Gly Met Lys Glu Tyr Glu Leu Glu Ser

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Leu Phe Glu His Tyr Cys Tyr Ser Arg Gly Gly Met Arg His Ser Ser

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Tyr Thr Cys Ile Cys Gly Ser Gly Glu Asn Ser Ala Val Leu His Tyr

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Gly Val Glu Arg Ile Asp Glu Pro Gly Leu Arg Ser Leu Arg Thr Ala

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Arg His Leu Gln Pro Gly Met Val Leu Thr Val Glu Pro Gly Ile Tyr

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Phe Ile Asp His Leu Leu Asp Glu Ala Leu Ala Asp Pro Ala Arg Ala

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Val Arg Ile Glu Glu Asp Val Val Val Thr Asp Ser Gly Ile Glu Leu

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<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 2

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<212> PRT

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

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<400> 6

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<213> 人工序列(artificial sequence)

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<212> PRT

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

Met Ala Ala Ala Thr Gly Pro Ser Phe Trp Leu Gly Asn Glu Thr Leu

1 5 10 15

Lys Val Pro Leu Ala Leu Met Ala Ala Ala Thr Gly Pro Ser Phe Trp

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Leu Gly Asn Glu Thr Leu Lys Val Pro Leu Ala Leu Phe Ala Leu Asn

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50 55 60

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Gln Lys Pro Ser Val Leu Leu Thr Leu Arg Gly Val Asn Thr Asp Ser

165 170 175

Gly Ser Val Cys Arg Glu Ala Ser Phe Asp Gly Ile Ser Lys Phe Glu

180 185 190

Val Asn Asn Thr Ile Leu His Pro Glu Ile Val Glu Cys Arg Val Phe

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Leu Glu Arg Ile Lys Glu Ala Asp Lys Glu Thr Tyr Val Glu Gln His

755 760 765

Glu Val Ala Val Ala Arg Tyr Cys Asp Leu Pro Ser Lys Leu Gly His

770 775 780

Lys Leu Asn

785

<210> 9

<211> 9055

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac 60

attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa 120

aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat 180

tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc 240

agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga 300

gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg 360

cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc 420

agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag 480

taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc 540

tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg 600

taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg 660

acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac 720

ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac 780

cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg 840

agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg 900

tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg 960

agataggtgc ctcactgatt aagcattggt aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac 1020

tttagattga tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg 1080

ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg 1140

tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc 1200

aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc 1260

tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt 1320

agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc 1380

taatcctgtt accagtggct gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact 1440

caagacgata gttaccggat aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac 1500

agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag 1560

aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg 1620

gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg 1680

tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga 1740

gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt 1800

ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct 1860

ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg 1920

aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt 1980

aatgcagctg gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcgc aacgcaatta 2040

atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta 2100

tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt 2160

acgccaagcg cgcaattaac cctcactaaa gggaacaaaa gctggagctg caagcttaat 2220

gtagtcttat gcaatactct tgtagtcttg caacatggta acgatgagtt agcaacatgc 2280

cttacaagga gagaaaaagc accgtgcatg ccgattggtg gaagtaaggt ggtacgatcg 2340

tgccttatta ggaaggcaac agacgggtct gacatggatt ggacgaacca ctgaattgcc 2400

gcattgcaga gatattgtat ttaagtgcct agctcgatac aataaacggg tctctctggt 2460

tagaccagat ctgagcctgg gagctctctg gctaactagg gaacccactg cttaagcctc 2520

aataaagctt gccttgagtg cttcaagtag tgtgtgcccg tctgttgtgt gactctggta 2580

actagagatc cctcagaccc ttttagtcag tgtggaaaat ctctagcagt ggcgcccgaa 2640

cagggacctg aaagcgaaag ggaaaccaga gctctctcga cgcaggactc ggcttgctga 2700

agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa ttttgactag 2760

cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggagaattag 2820

atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata aattaaaaca 2880

tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc tgttagaaac 2940

atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga caggatcaga 3000

agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc aaaggataga 3060

gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca aaagtaagac 3120

caccgcacag caagcggccg ctgatcttca gacctggagg aggagatatg agggacaatt 3180

ggagaagtga attatataaa tataaagtag taaaaattga accattagga gtagcaccca 3240

ccaaggcaaa gagaagagtg gtgcagagag aaaaaagagc agtgggaata ggagctttgt 3300

tccttgggtt cttgggagca gcaggaagca ctatgggcgc agcctcaatg acgctgacgg 3360

tacaggccag acaattattg tctggtatag tgcagcagca gaacaatttg ctgagggcta 3420

ttgaggcgca acagcatctg ttgcaactca cagtctgggg catcaagcag ctccaggcaa 3480

gaatcctggc tgtggaaaga tacctaaagg atcaacagct cctggggatt tggggttgct 3540

ctggaaaact catttgcacc actgctgtgc cttggaatgc tagttggagt aataaatctc 3600

tggaacagat tggaatcaca cgacctggat ggagtgggac agagaaatta acaattacac 3660

aagcttaata cactccttaa ttgaagaatc gcaaaaccag caagaaaaga atgaacaaga 3720

attattggaa ttagataaat gggcaagttt gtggaattgg tttaacataa caaattggct 3780

gtggtatata aaattattca taatgatagt aggaggcttg gtaggtttaa gaatagtttt 3840

tgctgtactt tctatagtga atagagttag gcagggatat tcaccattat cgtttcagac 3900

ccacctccca accccgaggg gacccgacag gcccgaagga atagaagaag aaggtggaga 3960

gagagacaga gacagatcca ttcgattagt gaacggatct cgacggttaa cttttaaaag 4020

aaaagggggg attggggggt acagtgcagg ggaaagaata gtagacataa tagcaacaga 4080

catacaaact aaagaattac aaaaacaaat tacaaaaatt caaaatttta tcgatctcga 4140

gaagcttggg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc 4200

aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 4260

actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 4320

caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 4380

tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 4440

ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag 4500

cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt 4560

tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa 4620

atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt 4680

cagatcgcct ggagacgcca tccacgctgt tttgacctcc atagaagaca ccgactctag 4740

agccaccatg gcggcggcca ccggaccctc gttttggctg gggaatgaaa ccctgaaggt 4800

gccgctggcg ctctttgcct tgaaccggca gcgcctgtgt gagcggctgc ggaagaaccc 4860

tgctgtgcag gccggctcca tcgtggtcct gcagggcggg gaggagactc agcgctactg 4920

caccgacacc ggggtcctct tccgccagga gtccttcttt cactgggcgt tcggtgtcac 4980

tgagccaggc tgctatggtg tcatcgatgt tgacactggg aagtcgaccc tgtttgtgcc 5040

caggcttcct gccagccatg ccacctggat gggaaagatc cattccaagg agcacttcaa 5100

ggagaagtat gccgtggacg acgtccagta cgtagatgag attgccagcg tcctgacgtc 5160

acagaagccc tctgtcctcc tcactttgcg tggcgtcaac acggacagcg gcagtgtctg 5220

cagggaggcc tcctttgacg gcatcagcaa gttcgaagtc aacaatacca ttcttcaccc 5280

agagatcgtt gagtgccgag tgtttaagac ggatatggag ctggaggttc tgcgctatac 5340

caataaaatc tccagcgagg cccaccgtga ggtaatgaag gctgtaaaag tgggaatgaa 5400

agaatatgag ttggaaagcc tcttcgagca ctactgctac tcccggggcg gcatgcgcca 5460

cagctcctac acctgcatct gcggcagtgg tgagaactca gccgtgctac actacggaca 5520

cgccggagct cccaacgacc gaacgatcca gaatggggat atgtgcctgt tcgacatggg 5580

cggtgagtat tactgcttcg cttccgacat cacctgctcc tttcccgcca acggcaagtt 5640

cactgcagac cagaaggccg tctatgaggc agtgaccacg acgccagcgc cgcgaccacc 5700

aacaccggcg cccaccatcg ctagccagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc 5760

agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg 5820

ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg 5880

caaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca 5940

aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg 6000

tgaactgaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa 6060

ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag 6120

acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct 6180

gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg 6240

cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa 6300

ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgcggcagtg gagagggcag 6360

aggaagtctg ctaacatgcg gtgacgtcga ggagaatcct ggcccaatga gcgagctgat 6420

taaggagaac atgcacatga agctgtacat ggagggcacc gtgaacaacc accacttcaa 6480

gtgcacatcc gagggcgaag gcaagcccta cgagggcacc cagaccatga gaatcaaggc 6540

ggtcgagggc ggccctctcc ccttcgcctt cgacatcctg gctaccagct tcatgtacgg 6600

cagcaaaacc ttcatcaacc acacccaggg catccccgac ttctttaagc agtccttccc 6660

cgagggcttc acatgggaga gagtcaccac atacgaagac gggggcgtgc tgaccgctac 6720

ccaggacacc agcctccagg acggctgcct catctacaac gtcaagatca gaggggtgaa 6780

cttcccatcc aacggccctg tgatgcagaa gaaaacactc ggctgggagg cctccaccga 6840

gaccctgtac cccgctgacg gcggcctgga aggcagagcc gacatggccc tgaagctcgt 6900

gggcgggggc cacctgatct gcaacttgaa gaccacatac agatccaaga aacccgctaa 6960

gaacctcaag atgcccggcg tctactatgt ggacagaaga ctggaaagaa tcaaggaggc 7020

cgacaaagag acctacgtcg agcagcacga ggtggctgtg gccagatact gcgacctccc 7080

tagcaaactg gggcacaagc ttaattagac gcgtgtcgac aatcaacctc tggattacaa 7140

aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct ccttttacgc tatgtggata 7200

cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt atggctttca ttttctcctc 7260

cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg tggcccgttg tcaggcaacg 7320

tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact ggttggggca ttgccaccac 7380

ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct attgccacgg cggaactcat 7440

cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt 7500

ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat 7560

tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc 7620

ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag 7680

tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tggaattcga gctcggtacc tttaagacca 7740

atgacttaca aggcagctgt agatcttagc cactttttaa aagaaaaggg gggactggaa 7800

gggctaattc actcccaacg aagacaagat ctgctttttg cttgtactgg gtctctctgg 7860

ttagaccaga tctgagcctg ggagctctct ggctaactag ggaacccact gcttaagcct 7920

caataaagct tgccttgagt gcttcaagta gtgtgtgccc gtctgttgtg tgactctggt 7980

aactagagat ccctcagacc cttttagtca gtgtggaaaa tctctagcag tagtagttca 8040

tgtcatctta ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg 8100

aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 8160

aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 8220

tatcatgtct ggctctagct atcccgcccc taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 8280

cccatggctg actaattttt tttatttatg cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc 8340

tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg gaggcctagg cttttgcgtc gagacgtacc 8400

caattcgccc tatagtgagt cgtattacgc gcgctcactg gccgtcgttt tacaacgtcg 8460

tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc 8520

cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct 8580

gaatggcgaa tggcgcgacg cgccctgtag cggcgcatta agcgcggcgg gtgtggtggt 8640

tacgcgcagc gtgaccgcta cacttgccag cgccctagcg cccgctcctt tcgctttctt 8700

cccttccttt ctcgccacgt tcgccggctt tccccgtcaa gctctaaatc gggggctccc 8760

tttagggttc cgatttagtg ctttacggca cctcgacccc aaaaaacttg attagggtga 8820

tggttcacgt agtgggccat cgccctgata gacggttttt cgccctttga cgttggagtc 8880

cacgttcttt aatagtggac tcttgttcca aactggaaca acactcaacc ctatctcggt 8940

ctattctttt gatttataag ggattttgcc gatttcggcc tattggttaa aaaatgagct 9000

gatttaacaa aaatttaacg cgaattttaa caaaatatta acgtttacaa tttcc 9055

Claims

1.一种基于脯氨酸肽酶(Prolidase PEPD)改造的嵌合抗原受体(CAR)，其特征在于，所述的CAR含有一胞外结合域，所述的胞外结合域能够同时靶向HER2和EGFR；

所述的胞外结合域为脯氨酸肽酶或其片段，所述的脯氨酸肽酶或其片段的氨基酸序列为如SEQ ID NO: 1所示序列的N端第1至309位；

所述的CAR含有信号肽，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO: 3所示；所述的CAR含有铰链区，所述铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 4所示；

所述的CAR含有跨膜区，所述跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5所示；

所述的CAR含有共刺激信号分子，所述共刺激信号分子的氨基酸序列如SEQ ID NO: 6所示；

并且，所述的CAR含有源于CD3ζ的胞浆信号传导序列，所述源于CD3ζ的胞浆信号传导序列的氨基酸序列如SEQ ID NO: 7所示。

2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CAR的结构如下式I所示：

L-EB-H-TM-C-CD3ζ-RP (I)

式中，

各“-”独立地为连接肽或肽键；

L是信号肽序列；

EB是胞外结合域；

H是铰链区；

TM是跨膜结构域；

C是共刺激信号分子；

CD3ζ是源于CD3ζ的胞浆信号传导序列；

RP是无或报告蛋白。

3.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的报告蛋白RP中还包括位于其N端的自剪切识别位点。

4.如权利要求3所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的自剪切识别位点为T2A序列。

5.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的报告蛋白RP为mKate2红色荧光蛋白，并且所述的mKate2红色荧光蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。

6.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的H是CD8来源的铰链区。

7.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的TM是CD28来源的跨膜区。

8.如权利要求2所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的C是选自下组的蛋白的共刺激信号分子：CD28。

9.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO: 8所示。

10.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码如权利要求1所述的嵌合抗原受体。

11.一种载体，其特征在于，所述的载体含有如权利要求10所述的核酸分子。

12.如权利要求11所述的载体，其特征在于，所述的载体是pTomo慢病毒载体。

13.如权利要求11所述的载体，其特征在于，所述载体中还包括启动子调控元件。

14.如权利要求11所述的载体，其特征在于，所述载体包含如SEQ ID NO: 9所示的核苷酸序列。

15.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有如权利要求11所述的载体或染色体中整合有外源的如权利要求10所述的核酸分子或表达如权利要求1所述的CAR。

16.一种工程化免疫细胞，其特征在于，所述的免疫细胞含有如权利要求11所述的载体或染色体中整合有外源的如权利要求10所述的核酸分子或表达如权利要求1所述的CAR。

17.如权利要求16所述的工程化免疫细胞，其特征在于，所述的工程化的免疫细胞是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)或嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)。

18.一种制备如权利要求16所述的工程化免疫细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将如权利要求10所述的核酸分子或如权利要求11所述的载体转导入免疫细胞内，从而获得所述工程化免疫细胞。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括对获得的工程化免疫细胞进行功能和有效性检测的步骤。

20.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有如权利要求1所述的CAR、如权利要求10所述的核酸分子、如权利要求11所述的载体、如权利要求15所述的宿主细胞，和/或如权利要求16所述的工程化免疫细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

21.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为液态制剂。

22.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的剂型为注射剂。

23.如权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10³-1×10⁸个细胞/ml。

24.如权利要求23所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物的制剂中所述工程化的免疫细胞的浓度为1×10⁴-1×10⁷个细胞/ml。

25.一种如权利要求1所述的CAR、如权利要求10所述的核酸分子、如权利要求11所述的载体、或如权利要求15所述的宿主细胞，和/或如权利要求16所述的工程化免疫细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗肿瘤的制剂；

其中，所述的肿瘤是胰腺癌。