CN107075490A - 用于预防和/或治疗erbb1阳性癌症的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于预防和/或治疗ErbB1阳性癌症的组合物和方法。所述组合物包括含有分离或重组或修饰的肽酶D(PEPD)蛋白质的药物制剂。所述方法包括通过具有ErbB1阳性癌症或具有发展ErbB1阳性癌症的风险的个体施用PEPD来预防和/或治疗ErbB1阳性癌症。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年8月20日提交的现在未决的美国临时申请No.62/039,497的优先权,其公开内容通过引用并入本文。
技术领域
表皮生长因子受体(EGFR)也称为ErbB1或HER-1,是在多种细胞应答中起主要作用的细胞表面受体。其为四个密切相关的受体酪氨酸激酶:ErbB1、ErbB2(HER-2)、ErbB3(HER-3)、ErbB4(HER-4)的成员。与这些受体的胞外域结合的配体导致同二聚化或异二聚化,随后是参与一系列细胞事件的受体酪氨酸磷酸化和许多信号蛋白的磷酸化/激活。ErbB受体下游的关键信号通路包括PI3K/AKT/mTOR通路、Ras/Raf/ERK通路和JAK/STAT通路。ErbB的激活导致提高的DNA合成、细胞生长、细胞增殖、细胞分化和细胞迁移,这或许在癌细胞中最清楚地显示。实际上,ErbB受体已成为癌症治疗的主要药物靶点。已知ErbB受体的激酶结构域的过表达或激活突变与多种癌症相关联。
ErbB1在其激酶结构域中的过表达或激活突变发生在许多癌症中,包括但不限于脑癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌和头颈癌。多种ErbB1靶向药物已经上市,包括帕尼单抗(penitumumab)、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼(afatinib)。帕尼珠单抗(IgG2同种型)和西妥昔单抗(IgG1同种型)是单克隆抗体,而吉非替尼、厄洛替尼和阿法替尼是低分子量酪氨酸激酶抑制剂。然而,很多患者或者固有地对这些药剂不敏感,或者发展了获得性抗性。因此,对于开发靶向癌症中的ErbB1的新治疗方法存在持续的和未满足的需要。本公开满足了这一需求。
发明内容
本公开提供可用于预防和/或治疗ErbB1阳性癌症的组合物和方法。组合物和方法部分地涉及以下发现:氨酰基脯氨酸二肽酶(prolidase)或肽酶D(本文称为PEPD)是ErbB1受体的配体。然而,与描述了PEPD与ErbB1结合刺激ErbB1和癌细胞增殖的之前的报道(Yang等人,Prolidase directly binds and activates epidermal growth factor receptorand stimulates downstream signaling,J Biol Chem.2013年1月25日;288(4):2365-75)相反,本公开证明PEPD可用于抑制ErbB1+癌细胞的生长。特别地,本公开证明了快速PEPD-ErbB1结合诱导过表达ErbB1的癌细胞生长抑制,而最初刺激表达低或中等水平的ErbB1的癌细胞的生长(24小时治疗),但随后抑制(24小时后);参见例如图5,6B)。此外,认为本公开首次描述了与两个ErbB1单体交联的任何ErbB1配体。“交联”是指两个ErbB1单体同时与单个PEPD二聚体结合,但并不意味着ErB1二聚体彼此共价结合。
氨酰基脯氨酸二肽酶也称为肽酶D(PEPD)、Xaa-Pro二肽酶或脯氨酸二肽酶或亚胺二肽酶,是水解在羧基末端具有脯氨酸或羟脯氨酸的二肽的蛋白酶。PEPD是广泛表达的胞质蛋白质,并且作为同二聚体(人PEPD的单体分子量:54kD;如下文SEQ ID NO:1所示的493个氨基酸,其提供人氨酰基脯氨酸二肽酶的氨基酸序列)存在。在一些实施方案中,用于本公开的组合物和方法的PEPD是哺乳动物PEPD。在一个实施方案中,PEPD是人PEPD。在一些实施方案中,PEPD可以是酶活性的或具有降低的或不具有可检测的酶活性。
用于本文公开的方法的组合物包含含有分离和/或纯化的PEPD或重组和/或修饰的PEPD的药物制剂,并且还可以包含另外的试剂,例如抗凝血剂。在一些实施方案中,PEPD是修饰的。在一些实施方案中,PEPD是融合蛋白的组分。在一些实施方案中,融合蛋白包含PEPD和可用于纯化重组产生的PEPD的氨基酸序列。
所述方法包括向需要预防和/或治疗ErbB1阳性癌症的个体施用包含本公开的PEPD的组合物,并且还可以包括向个体施用抗凝血剂。还提供了用于鉴定需要用PEPD制剂治疗的个体的方法以及为这些个体生成治疗方案的方法。
在一些实施方案中,本公开还提供了产品,其包含含有分离和/或纯化的PEPD或重组PEPD的药物制剂,并且还可以包含描述使用制剂预防和/或治疗ErbB1阳性癌症的印刷材料作为指示。在一些实施方案中,产品还包含抗凝血剂。在一些非限制性实施方案中,ErbB1阳性癌症包括脑癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌和肺癌。在一些实施方案中,ErbB1阳性癌细胞是相对于非癌细胞过表达ErbB1或相对于非癌细胞携带更高拷贝数的ERBB1基因的癌细胞。在一些实施方案中,ErbB1阳性癌细胞表达具有激活突变的ErbB1。
附图说明
图1.数据显示细菌产生的重组人PEPD(rhPEPD)或无酶活性的rhPEPDG278D特异性地结合ErbB1(EGFR)并交联两个ErbB1单体。(A)将rhPEPD(0.4nmol/ml)用人ErbB1胞外域和人IgG1的Fc片段的融合蛋白(ErbB1-Fc)(0.04nmol/ml)、ErbB1-Fc(0.04nmol/ml)加牛血清白蛋白(BSA;19nmol/ml),或Fc(0.04nmol/ml)在37℃下孵育1小时,然后在4℃下孵育过夜。在另一个实验中,在不存在或存在表皮生长因子(EGF;+,5pmol/ml;++,50pmol/ml)的情况下,将rhPEPD(1nmol/ml)用ErbB1-Fc(0.04nmol/ml)在37℃下孵育1小时,然后在4℃下孵育过夜。然后使rhPEPD、Fc和/或ErbB1-Fc的所有样品通过蛋白A琼脂糖凝胶珠,并且进行蛋白质印迹(western blotting)。BSA用于排除rhPEPD的非特异性结合。EGF用于确认ErbB1与rhBEP1的特异性结合。(B)通过ELISA测定hPEPD与ErbB1的结合。每个值为平均值±SD(n=3)。通过非线性回归评估Kd值(GraphPad Prism 6软件)。(C)小鼠髓细胞32D细胞不表达任何ErbB。通过基因转染和选择产生稳定表达人ErbB1的32D细胞。用载体、rhPEPD或rhPEPDG278D(5nM)处理32D/ErbB1细胞,然后用交联剂双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(BS3;2mM,30分钟)处理;通过蛋白质印迹分析ErbB1的细胞裂解物。
图2.数据显示rhPEPD或rhPEPDG278D导致ErbB1磷酸化和随后的ErbB1消耗。用rhPEPD或rhPEPDG278D(5nM)处理32D/ErbB1细胞不同时间,随后进行ErbB1和ErbB1磷酸化的蛋白质印迹。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)是加载对照。
图3.数据显示rhPEPD和rhPEPDG278D调节ErbB1和ErbB2并破坏ErbB1-ErbB2异二聚化。(A)用人ErbB1转染稳定过表达人ErbB2的CHO-K1细胞24小时,然后用rhPEPD(5nM)处理,接着进行ErbB1、磷酸化ErbB1、ErbB2和磷酸化ErbB2的蛋白质印迹。GAPDH是加载对照。(B,C)在用或不用EGF(20nM,15分钟)预处理的情况下,用人ErbB1转染稳定过表达人ErbB2的CHO-K1细胞24小时,然后用溶剂、rhPEPD或rhPEPDG278D(5nM)处理1小时。使用ErbB2抗体或ErbB1抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀,然后进行免疫印迹。对于B中所示的免疫印迹,将样品加载调整为含有等量的ErbB2。(D)具有和不具有ErbB2加载调整的免疫印迹。用rhPEPD以5nM处理稳定过表达ErbB2的CHO-K1细胞1小时。将细胞裂解物用ErbB2抗体孵育,并使免疫复合物通过蛋白G琼脂糖,然后进行ErbB2的免疫印迹。将样品加载调整为含有等量的ErbB2或不调整。
图4.曲线示出了通过rhPEPD和rhPEPDG278D的ErbB1和ErbB2调整的图。(A)同二聚体(Homodemeric)rhPEPD或rhPEPDG278D结合并交联两个ErbB1单体,这导致ErbB1磷酸化和消耗,后者由内化和降解引起。(B)ErbB1和/或ErbB2的过表达导致异二聚化和不存在配体的情况下的受体磷酸化。rhPEPD或rhPEPDG278D通过交联两个ErbB1单体和两个ErbB2单体来破坏ErbB1-ErbB2异二聚体,导致由于内化和降解引起的受体消耗。值得注意的是,尽管与ErbB1和ErbB2两者结合,但是rhPEPD和rhPEPDG278D均不与ErbB1和ErbB2交联;(C)EGF诱导ErbB1-ErbB2异二聚化,但rhPEPD和rhPEPDG278D两者通过交联两个ErbB2单体破坏这种二聚体,并通过内化和降解引起ErbB2消耗。
图5.数据显示rhPEPDG278D抑制过表达ErbB1或具有激活突变的ErbB1的癌细胞的增殖。评估的细胞系包括稳定地过表达人ErbB1的CHO-K1细胞(CHO-K1ErbB1细胞)、稳定地过表达人ErbB1和人ErbB2的CHO-K1细胞(CHO-K1ErbB1/ErbB2细胞)、过表达人ErbB1的人类表皮样癌A431细胞,以及在ErbB1酪氨酸激酶结构域(E746-A750缺失)中表达激活突变的人肺腺癌HCC827细胞。将细胞在96孔板中生长过夜,然后用溶剂或rhPEPDG278D处理24、48或72小时,然后通过MTT测定法测量细胞增殖。每个值为平均值±SD(n=3)。通过单因素ANOVA分析72h时间点的数据,接着进行Tukey多重比较检验,****P<0.0001。
图6.数据显示rhPEPDG278D不影响不表达ErbB1的细胞的增殖,而rhPEPDG278D在具有中等ErbB1表达的细胞中对细胞增殖具有两种影响(最初适度刺激,随后显著抑制)。(A)使CHO-K1细胞(无ErbB1)在96孔板中生长过夜,然后用溶剂或rhPEPDG278D处理72小时,然后通过MTT测定法测定细胞增殖。每个值为平均值±SD(n=3)。(B)使小鼠肝癌Hepa1c1c7细胞(中等水平的ErbB1)在96孔板中生长过夜,然后用溶剂或rhPEPDG278D处理24、48或72小时,然后通过MTT测定法测定细胞增殖。每个值为平均值±SD(n=3)。通过单因素ANOVA分析24h和72h时间点的数据,然后进行Tukey多重比较检验,*P<0.05,****P<0.0001。
图7.数据显示rhPEPDG278D在各种癌细胞系中沉默ErbB1和ErbB2(受体消耗和相应的受体酪氨酸磷酸化降低)。(A)CHO-K1/ErbB1细胞、CHO-K1/ErbB1+ErbB2细胞、A431细胞、HCC827细胞、Hepa1c1c7细胞和CHO-K1细胞中ErbB1和ErbB2的表达和酪氨酸磷酸化。通过蛋白质印迹分析细胞裂解物。测量代表性磷酸化位点。(B,C)用5或25nM的溶剂或hPEPDG278D处理细胞48小时,然后制备细胞裂解物以及对ErbB1、ErbB2及其磷酸化进行蛋白质印迹分析。对于A431细胞,还测量了AKT、p-AKT、ERK、p-ERK、STAT3和p-STAT3。
图8.数据显示临床使用的抗凝血剂的依诺肝素(EP)提高PEPD的血浆浓度。EP是临床使用的低分子量肝素(LMWH)。实验中使用C57BL/6小鼠(雄性,7-8周龄)。通过ELISA测量内源小鼠PEPD或总PEPD(内源小鼠PEPD加rhPEPD)的血浆水平。EP和rhPEPD在PBS中给予小鼠。(A)在接受载体或rhPEPD的单次腹膜内(i.p.)剂量后,1或24小时的内源小鼠PEPD和总PEPD的血浆浓度。误差条是SD(n=3)。对数据进行对数变换,通过双因素ANOVA分析,然后进行Tukey多重比较检验,****P<0.0001。(B)小鼠未处理或用EP每天一次腹膜内处理,持续4天;在最后EP剂量后1小时,给予EP处理小鼠载体或rhPEPD的腹膜内剂量,随后在最后给药后1或24小时测量小鼠PEPD和总PEPD的血浆水平。误差条是SD(n=3)。对数据进行对数变换,双因素ANOVA分析,然后进行Tukey多重比较检验,****P<0.0001。(C)每天一次向小鼠腹膜内施用不同剂量的EP;在第四次EP剂量1小时后,用载体或rhPEPD腹膜内注射小鼠。在给予载体或rhPEPD后1和24小时测量总PEPD的血浆浓度。每个条代表1个样本(每组2只小鼠)。
图9.数据显示用rhPEPD或rhPEPDG278D处理后肿瘤生长抑制和肿瘤组织中的分子变化。人乳腺癌BT-474细胞组成型过表达ErbB2,但也表达低水平的ErbB1和ErbB3。将BT-474细胞接种到雌性无胸腺小鼠的乳腺脂肪垫上。肿瘤大小达到230mm3后治疗小鼠。(A)用载体、EP、EP加rhPEPD或EP加rhPEPDG278D治疗后原位BT-474肿瘤的大小。在rhPEPD或rhPEPDG278D前4天开始,每天通过腹膜内注射(i.p.)以0.5mg/kg的剂量向小鼠施用EP。间隔2天,以2mg/kg向小鼠腹膜内施用rhPEPD和rhPEPDG278D两次。在最后剂量后24小时杀死小鼠。误差条是SEM(n=4-6)。比例尺:3cm。(B)在如A所示的每次治疗的最后剂量后24小时获得比较肿瘤标本中的主要细胞信号传导变化的免疫印迹。每个样品代表一个肿瘤。(C,D)在如A所示的每次治疗的最后剂量后24小时获得的肿瘤样本中的SRC激酶活性和PI3K活性。误差条为SD(n=3)。(E)在如A所示的每次治疗的最后剂量后24小时获得比较肿瘤标本中的HIF-1α信号传导变化的免疫印迹。每个样品代表一个肿瘤。上述结果表明,rhPEPDG278D对于肿瘤抑制优于rhPEPD。通过双因素ANOVA分析(A,C,D)中的数据。
图10.数据显示来自用rhPEPDG278D治疗的小鼠的肿瘤组织中肿瘤生长抑制和ErbB1信号传导的抑制,以及rhPEPDG278D的高血浆浓度。具有皮下A431肿瘤的雄性无胸腺小鼠(5-6周龄)未治疗、用EP治疗或用EP加rhPEPDG278D治疗。每天向小鼠腹膜内施用EP(0.5mg/kg),共计13个剂量;每隔一天向小鼠腹膜内施用rhPEPDG278D(4mg/kg),总共2个剂量(在EP的11次剂量后开始)或5个剂量(在EP的5次剂量后开始)。当EP和rhPEPDG278D在同一天给予相同的小鼠时,在EP后1小时给予rhPEPDG278D。从最后一次治疗后24小时的小鼠或者在同时从未治疗小鼠获得血液样品和肿瘤。通过ELISA测定内源小鼠PEPD和/或rhPEPDG278D的血浆浓度。误差条表示SD(n=3)。通过单因素ANOVA分析数据,与载体对照相比,****P<0.0001。(A)通过ELISA测定内源小鼠PEPD和/或rhPEPDG278D的血浆浓度。误差条表示SD(n=3)。通过单因素ANOVA分析数据,与未治疗对照相比,****P<0.0001。(B)对照小鼠和用EP或EP加rhPEPDG278D治疗的小鼠的肿瘤大小。每个值为平均值±SEM(n=4-10)。通过单因素ANOVA分析数据。(C)来自对照小鼠或用EP或EP加rhPEPDG278D治疗的小鼠的肿瘤中的信号分子的变化。每个泳道代表一个肿瘤。(A)治疗开始和结束时的小鼠体重(平均值±SD)。
具体实施方式
除非另有规定,否则意图是在本说明书中给出的每个最大数值限制包括每个较小数值限制,就如同这样的较小数值限制在本文中明确书面表达。在本说明书中给出的每个最小数值限制包括每个较大数值限制,就如同这样的较大数值限制在本文中明确书面表达。在本说明书中给出的每个数值范围包括落在这样更较大数值范围内的每个较小数值范围,就如同这样的较小数值范围在本文中明确书面表达。
本公开至少部分地基于我们的发现,PEPD或其无酶活性的突变体与ErbB1结合,抑制体外由ErbB1或ErbB1和ErbB2驱动的癌细胞的生长,抑制小鼠模型中ErbB1驱动的癌症的生长,并导致ErbB1(和ErbB2)的消耗和癌细胞和癌症组织中致癌信号传导的抑制。特别地,关于ErbB1,已经表明人PEPD结合ErbB1并在刺激体外表达ErbB1的细胞的增殖(Yang等人,Journal of Biological Chemistry,288,2365-2375,2013)。然而,与该观察相反并且如上所述,在本公开中证明,用PEPD治疗癌症细胞超过24小时导致细胞生长的显著和时间依赖性抑制,其与ErbB1消耗以及其他变化相关。PEPD及其无酶活性的突变体(PEPDG278D)直接结合于ErbB1的胞外域并交联两个ErbB1单体,导致ErbB1内化和降解,尽管ErbB1磷酸化瞬时增加。我们的数据还显示了PEPD及其突变体破坏ErbB1与ErbB2的异二聚化。这表明PEPD或PEPD突变体可用于针对ErbB1驱动的癌症,所述癌症对于目前的ErbB1靶向治疗表现出固有的(de nova)或获得性抗性。抗性机制包括但不限于ErbB2过表达和第二位点突变(Yonesaka等人,Science Translational Medicine 3,99ra86,2011;Lin and Bivona,Chemotherapy Research and Practice 2012,article ID 817297,2012)。PEPD和PEPDG278D可以通过靶向ErbB1和ErbB2两者并通过使用其新靶向机制即交联ErbB1或ErbB2两种单体来克服这种抗性。值得注意的是,没有已知的抗ErbB1试剂可以交联ErbB1单体。
如上所述,通过“交联(“cross-link”和“cross-linking”)”是指两个ErbB1单体(或两个ErbB2单体)同时与单个PEPD二聚体结合,但并不意味着这种二聚体彼此共价结合。图4A示出了作为同二聚体交联的ErbB1的代表性和非限制性的示例,图4B和4C示出了ErB1和ErbB2同型二聚体。我们没有发现PEPD交联ErbB1/ErbB2异二聚体的证据。
NCBI参考序列NM_005228.3和NP_005219.2中提供了ErbB1的mRNA序列和氨基酸序列。虽然ErbB1中的变体是本领域已知的,但预期本方法将适合于任何ErbB1变体,条件是ErbB1变体具有胞外域。胞外域是本领域已知的。本公开还包括用于预防和治疗表达这些序列变体的癌细胞的组合物和方法,例如具有突变或截短的C-末端但保留胞外域(ECD)的那些序列;ECD是本领域周知的。
本公开揭示了PEPD的根本不同和新的功能。PEPD已知为胞质二肽酶,但是无酶活性的PEPD突变体(PEPDG278D)在调节ErbB1中与PEPD本身一样有效。对于肿瘤抑制,PEPDG278D可能比PEPD更有效,因为如本公开证明的,rhPEPD的酶功能刺激HIF-1α信号传导(图9E),其可能减弱PEPD抗肿瘤活性。PEPDG278D也比PEPD本身更吸引人是因为前者可能不干扰正常细胞中内源PEPD的酶功能。此外,虽然之前的报道指出,通过ELISA(Yang等人,Journal ofBiological Chemistry 288,2365-2375,2013)测量,PEPD是相对低亲和力的ErbB1配体(Kd=5.3μM),但是本公开证明了更高的结合亲和力(Kd=392.6nM;参见图1B)。
PEPD和PEPDG278D对ErbB1的抑制作用与其他ErbB配体对其受体的众所周知的刺激性影响形成鲜明的对比。鉴于目前的ErbB1靶向剂的高成本,例如西妥昔单抗,每个患者治疗8周治疗费用高达30,000美元,PEPD的优势在于其可以以较低成本如下文进一步描述的大量重组生产,因此在某些实施方案中,预期是西妥昔单抗和其他目前可用的抗ErbB1试剂的重要和较便宜的替代物。
预期任何PEPD都适用于本发明的组合物和方法。在一些实施方案中,PEPD是由原核生物或真核生物产生的PEPD。在一些实施方案中,PEPD是原核来源的。在一些非限制性实施方案中,PEPD通过游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)(即,包含GenBank no.AAA99824.1下的氨基酸序列的PEPD)或激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)(即,包含GenBank no.WP_011011876.1下的氨基酸序列的PEPD)产生。许多真核PEPD氨基酸序列也是本领域已知的,包括许多哺乳动物PEPD氨基酸序列。在一些实施方案中,PEPD具有啮齿动物PEPD(即小鼠或大鼠)或非人灵长类动物PEPD(例如黑猩猩或恒河猴)的序列。小鼠氨酰基脯氨酸二肽酶的氨基酸序列在GenBank登录号NP_032846.2下提供;大鼠氨酰基脯氨酸二肽酶在NP_001009641.1下提供;恒河猴氨酰基脯氨酸二肽酶在AFJ71215.1下提供;黑猩猩氨酰基脯氨酸二肽酶在NP_001267459.1下提供。SEQ ID NO:1中的人氨酰基脯氨酸二肽酶(PEPD)的氨基酸序列是本领域已知的。SEQ ID NO:1和编码它的cDNA序列可通过GenBank登录号J04605.1获得;氨基酸序列也在GenBank登记号AAA60064下提供。在一个说明性但非限制性的实施方案中,酶活性的人PEPD具有SEQ ID NO:1的序列:
MAAATGPSFWLGNETLKVPLALFALNRQRLCERLRKNPAVQAGSIVVLQGGEETQRYCTDTGVLFLQESFFHWAFGVTEPGCYGVIDVDTGKSTLFVPRLPASHATWMGKIHSKEHFKEKYAVDDVQYVDEIASVLTSQKPSVLLTLRGVNTDSGSVCREASFDGISKFEVNNTILHPEIVESRVFKTDMELEVLRYTNKISSEAHREVMKAVKVGMKEYGLESLFEHYCYSRGGMRHSSYTCICGSGENSAVLHYGHAGAPNDRTIQNGDMCLFDMGGEYYSVASDITCSFPRNGKFTADQKAVYEAVLLSSRAVMGAMKPGDWWPDIDRLADRIHLEELAHMGILSGSVDAMVQAHLGAVFMPHGLGHFLGIDVHDVGGYPEGVERIDEPGLRSLRTARHLQPGMVLTVEPGIYFIDHLLDEALADPARASFLNREVLQRFRGFGGVRIEEDVVVIDSGIELLTCVPRTVEEIEACMAGCDKAFTPFSGPK(SEQ ID NO:1)
在SEQ ID NO:1中,278位的G用阴影、粗体和斜体表示,表示使PEPD无酶活性的G278D突变的位置。在一些实施方案中,突变是278位的甘氨酸突变成天冬氨酸以外的氨基酸。
在本公开中引用的GenBank登录号下提供的所有氨基酸和多核苷酸序列通过引用并入本文,因为这些序列在本申请提交日可以通过GenBank获得。本公开还包括编码PEPD的所有多核苷酸及其在本文中所述或者以其他方式被本领域技术人员已知的考虑本公开益处的所有变体。
啮齿类动物(小鼠和大鼠)PEPD氨基酸序列与人类序列具有大于86%相似性,而非人类灵长类动物PPED氨基酸序列(例如恒河猴)与人PEPD氨基酸序列具有大于95%相似性。在一些实施方案中,PEPD包含人PEPD氨基酸序列或由人PEPD氨基酸序列组成。在一些实施方案中,在本公开的组合物和/或方法中使用的PEPD与SEQ ID NO:1的序列具有至少85.0%和99%之间(包括其之间的第一十分位的所有数字)的相似性。在一个实施方案中,PEPD包含与SEQ ID NO:1的序列具有至少95%相似性的氨基酸序列。
在多个实施方案中,本公开包括使用包含野生型PEPD(例如,SEQ ID NO:1的PEPD)或修饰的PEPD或其组合的组合物。一般来说,适用于本发明的PEPD的修饰可以由本领域技术人员使用普通技术考虑本说明书的益处来确定。在一些实施方案中,修饰的PEPD包含SEQID NO:1的修饰。本公开包括SEQ ID NO:1的所有修饰,只要PEPD保持与细胞表面的ErbB1结合并导致其消耗的能力。在一些实施方案中,修饰的PEPD保持形成同二聚体的能力。在一些实施方案中,使ErbB1阳性细胞与本公开的修饰(或野生型)PEPD接触,接着是ErbB1结合和ErbB1的内吞,导致ErbB1消耗。维持这些功能属性中的一些或全部的修饰的PEPD可以包括氨基酸插入、缺失和取代。例如,本公开包括已经通过保守氨基酸取代修饰的PEPD,所述取代通常基于R-基取代基的相对相似性。这种取代的非限制性实例包括gly或ser取代ala;lys取代arg;gln或his取代asn;glu取代asp;ser取代cys;asn取代gln;asp取代glu;ala取代gly;asn或gln取代his;leu或val取代ile;ile或val取代leu;arg取代lys;leu或tyr取代met;thr取代ser;tyr取代trp;phe取代tyr;和ile或leu取代val。因此,包含任何单一保守氨基酸取代或保守氨基酸取代的任何组合的PEPD包括在本公开中,只要其至少能保持与ErbB1结合,随后从细胞表面消耗ErbB1的能力。如何确定任何特定的修饰的PEPD是否可以结合ErbB1对于本领域技术人员是显而易见的。在一些实施方案中,修饰的PEPD可以结合ErbB1胞外域,估计的Kd值为392.6nM,如使用ELISA测定法确定的。
野生型PEPD是酶活性的。修饰的PEPD是包含SEQ ID NO:1的变化的PEPD,并且可以是酶活性或无酶活性的。关于这一点,本领域已知PEPD的亚氨基二肽酶活性缺陷与氨酰基脯氨酸二肽酶缺陷相关,这是与胶原代谢相关的非常罕见的常染色体隐性遗传疾病并影响结缔组织。因此,已知PEPD的酶活性是重要的。然而,在一些实施方案中,在本公开的组合物和方法中使用无酶活性的PEPD。无酶活性的PEPD被认为是与包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:1的序列组成的参考蛋白质所表现的水解量相比,对于在羧基末端具有脯氨酸或羟脯氨酸的底物二肽酶表现较小水解的PEPD。在一些实施方案中,与参考PEPD相比,无酶活性的PEPD可以具有0.0%和99.9%(包含)之间,并且包含其之间的第一十分位的所有数字的较小的二肽水解活性。在一个实施方案中,无酶活性的PEPD具有参考PEPD的不超过0.6%的二肽水解活性。在一个实施方案中,参考PEPD包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ IDNO:1的序列组成。氨酰基脯氨酸二肽酶活性的一个单位可以定义为在标准测定条件下释放1μmol脯氨酸/h的酶的量。在一个实施方案中,无酶活性的PEPD不具有可检测的PEPD二肽水解活性。在一些实施方案中,本公开包括本文公开的PEPD突变中的任何一种或其任何组合,因此包括条件是可从本发明排除任何单一或任何组合的这样的突变体。
在本公开的实施方案中使用的PEPD可以包括增强其期望特征的修饰,例如结合或进入肿瘤细胞或肿瘤微环境或增强循环时间的能力、生物利用度、稳定性或与ErbB1阳性细胞靶向杀伤或ErbB1阳性细胞成像相关的用途。可用于本公开的PEPD蛋白质包括包含SEQIDNO:1的多肽或其修饰,并且在一些实施方案中还包括在较大多肽的背景中的所述PEPD多肽。对SEQ ID NO:1的修饰包括消除或减少酶活性的修饰和/或不影响修饰的PEPD结合ErbB1的能力的变化。因此,可以通过保守氨基酸取代修饰SEQ ID NO:1的PEPD,所述取代通常基于R-基取代基的相对相似性。这种取代的非限制性实例包括但不限于gly或ser取代ala;lys取代arg;gln或his取代asn;glu取代asp;ser取代cys;asn取代gln;asp取代glu;ala取代gly;asn或gln取代his;leu或val取代ile;ile或val取代leu;arg取代lys;leu或tyr取代met;thr取代ser;tyr取代trp;phe取代tyr;和ile或leu取代val。因此,包含任何单一保守氨基酸取代或保守氨基酸取代的任何组合的PEPD包括在本公开中,只要它们保持其ErbB1结合性质,并且可以抑制ErbB1阳性细胞的生长。因此,本公开包括包含SEQ ID NO:1或其修饰的多肽序列,并且可以包括进一步的修饰,包括但不一定限于另外的氨基酸,和/或通过作为与其他物质组合物的复合物的一部分提供。因此,PEPD多肽可以是较大蛋白质(例如融合蛋白)的一部分,或者其可以连接到其他部分。因此,PEPD蛋白可以与预期根据预防和/或治疗ErbB1阳性癌症改善其功能能力的任何期望部分共价或非共价结合。
通常,可以使用常规技术制备PEPD蛋白(并且如果需要的话,其被制成单个融合蛋白的多肽序列)。例如,在一些实施方案中,可以使用原核或真核表达系统制备PEPD蛋白/融合蛋白。因此,本公开提供了优于其他ErbB1结合配偶体的制造优势,例如针对ErbB1的mAb,其成本昂贵且耗时。对于包含本文所述的PEPD或由其组成的蛋白质的重组生产,通常可以在表达载体中提供编码PEPD的任何多核苷酸。“表达载体”是指包含与PEPD编码序列有效连接的蛋白质表达控制序列的载体。表达载体可以包含用于表达的顺式作用元件,包括但不限于启动子元件、增强子元件、复制起点、可选择标记、转录起始位点、编码翻译起始位点的序列,以及蛋白质表达所需的任何其他序列,这取决于所选择的表达系统。可以设计用于表达编码PEPD的任何多核苷酸序列的合适的蛋白质表达载体(PEPD编码序列中的每一种都包括在本公开中)包括本领域已知的所有表达载体,其实例包括但不限于粘粒、质粒和引入编码PEPD的重组多核苷酸的基于病毒的系统。用于表达本发明的重组PEPD蛋白的系统可以是任何合适的生物体,包括但不限于哺乳动物细胞表达系统、昆虫细胞表达系统(例如,基于杆状病毒的系统)、酵母表达系统、植物细胞表达系统和原核表达系统。在一个实施方案中,使用大肠杆菌进行PEPD表达。在一个实施方案中,使用哺乳动物表达系统重组表达PEPD嵌合蛋白,使得嵌合蛋白包含人特异性糖基化。
在一个实施方案中,PEPD蛋白可以与免疫球蛋白(Ig)或其片段缀合以提供嵌合的PEPD/Ig分子。预期这样的构建体可用于涉及个体免疫反应的多个方面,以促进靶向杀伤ErbB1+细胞。免疫球蛋白或其片段可以是任何Ig型或亚型。关于这一点,以前的研究表明抗体依赖性细胞毒性(通过Fc受体介导)在曲妥珠单抗靶向ErbB2阳性乳腺癌中起重要作用(Clynes等人,Nature Med,6,443-446,2000;Spiridon等人,Clin Cancer Res,10,3542-3551,2004)。本公开还包括PEPD-Fc嵌合蛋白和包含其的药物组合物。制备Fc嵌合蛋白的方法是本领域已知的。例如,可从InvivoGene购得的pFUSE-Fc载体可用于产生PEPD-Fc融合杂交体。因此,在一个实施方案中,本公开包括包含融合蛋白的组合物,其中PEPD在融合蛋白的组分中,并且其中所述融合蛋白包含人Ig的Fc区。在多个实施方案中,Fc区是来自IgA、IgG或IgE抗体的Fc区或其片段,尽管也可以使用来自其他抗体类型的Fc区或合成/人工Fc区。在一些实施方案中,Fc区是人IgG2a或人IgG1或这种Fc区的片段。Fc区可以包含与由哺乳动物(例如人)产生的Fc区相同的氨基酸序列或由其组成。在多个实施方案中,Fc区与由小鼠和/或人产生的Fc区可以具有80%至100%(包括其间的所有整数)的氨基酸序列相似性。Fc区可以是完整的Fc区,意味着整个Fc区,或者可以是Fc区的片段。本领域技术人员将认识到,抗体的“Fc区”是指抗体的“片段可结晶”区,其包含两个重链,根据抗体类别贡献两个或三个恒定结构域(CD)。小鼠和人免疫球蛋白的编码Fc区的核苷酸序列以及Fc区的氨基酸序列是本领域熟知的。在一个实施方案中,融合蛋白的Fc部分仅包含抗体重链。本领域技术人员将认识到,为了使用鼠动物模型证明本发明,融合蛋白的Fc部分可以是IgG2a或IgG2b Fc小鼠Ig部分,而为了治疗和/或预防人疾病,Fc部分优选为IgG1或IgG3Fc部分。在某些实施方案中,本文提供的融合蛋白的Fc部分不包含抗原识别部分(即融合蛋白的抗体部分不包含抗体可变区)。因此,融合蛋白与包含抗原结合部分的抗体不同。可以使用本领域技术人员熟知的任何常规技术制备编码Fc-PEPD融合蛋白的DNA构建体。例如,可以使用市售试剂制备Fc融合蛋白编码构建体。例如,INVIVOGEN提供了通过将编码给定蛋白质的序列融合到免疫球蛋白(Ig)的Fc区域来开发的用于促进Fc融合蛋白质构建的质粒的pFUSE-Fc家族。在该构建体中,Fc区包含IgG重链的CH2和CH3结构域和铰链区。铰链充当Fc融合蛋白的两部分之间的柔性间隔物,其允许融合蛋白的每个部分根据需要独立地起作用。
如上所述,本公开包括作为融合蛋白的组分的任何PEPD蛋白,所述融合蛋白可以包括期望在与PEPD蛋白相同的开放阅读框中表达的任何其他氨基酸序列,并且可以包括但不限于不限于涉及促进蛋白质分离和/或纯化、用于溶解度、分泌或任何其他功能的氨基酸序列。取决于待生产的特定融合蛋白,PEPD多肽可以被配置在融合的开放阅读框的N端或C端。例如,可以向PEPD蛋白质提供组氨酸标签,例如合适的多组氨酸标签。在一些实施方案中,组氨酸标签在序列中包含至少六个组氨酸。在一个实施方案中,他的标签是六组氨酸肽序列。在一个实施方案中,如果需要,可以配置PEPD表达系统,使得可以除去组氨酸标签,例如通过包括烟草蚀刻病毒(TEV)可切除的N-末端六组氨酸标签。
在一些非限制性实施方案中,PEPD多肽可与化学治疗剂或具有细胞毒活性的任何其他试剂或可用于ErbB1阳性细胞/组织的检测和/或成像的试剂组合或偶联。例如,PEPD缀合物可以包含酶活性毒素及其片段或小分子。合适的酶活性毒素和小分子包括多西紫杉醇、米托蒽醌、紫杉烷、白喉A链、白喉毒素非结合活性片段、外毒素A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、非洲蒴莲毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(alpha sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻风树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、丝林毒素(mitogellin)、局限曲霉素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和单孢霉烯族毒素(tricothecene)、微管靶向剂或任何抗血管生成剂。
可以使用任何合适的技术制备PEPD蛋白和化学治疗剂(或其它试剂,例如成像剂)的缀合物和组合。在多个实施方案中,PEPD蛋白可以与化学治疗剂分开生产,然后与其化学偶联,或者在蛋白质试剂的情况下,PEPD蛋白可以作为PEPD/蛋白质融合物产生以产生新的嵌合蛋白。对于化学偶联,可以使用各种双官能蛋白偶联剂,例如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡喃基二硫醇)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚胺基-4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸酯、亚氨基四氢噻吩(iminothiolane)(IT)、亚胺酯的双官能衍生物(如二甲基己二酰亚胺(dimethyladipimidate)盐酸盐)、活性酯(如二琥珀酰亚胺基辛二酸酯)、醛(如戊二酸)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰)己二胺))、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)可用于共价连接PEPD和化学治疗剂或其它试剂,例如成像剂。
在另一个实施方案中,PEPD可以与放射性试剂缀合。各种放射性同位素可用于与蛋白质缀合,使得可与PEPD结合的ErbB1阳性细胞或组织成像或选择性地破坏。为了选择性破坏细胞,肽可以与高度放射性的原子结合,如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。为了鉴定ErbB1阳性细胞,PEPD缀合物可以包含用于闪烁照相研究的放射性原子,例如Tc99m(亚稳态锝-99),I123或用于核磁共振和/或磁共振成像的自旋标记,例如I123、I131、In111、F19、C13、N15、O17或钆(Gadlinium)(III)或锰(II)。放射性标签可以以已知方式并入PEPD蛋白质中。
PEPD蛋白质可以通过将其与任何合适的药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂组合而提供在用于施用的药物组合物中。药学上可接受的载体、赋形剂和稳定剂的一些合适的实例可以在Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2005)第21版,Philadelphia,PA.Lippincott Williams&Wilkins中找到。此外,任何合适的递送载体可用于本发明,例如其中PEPD在一段时间内释放的控释递送制剂。如果需要,药物组合物可以包含PEPD和凝血抑制剂二者。
可以使用任何合适的施用途径来施用包含本文所述的PEPD的制剂,包括但不限于胃肠外、腹膜内、肺内、口服和肿瘤内。胃肠外输注包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内和皮下施用。
包含在组合物中和/或用于所述方法的PEPD和任何其它活性剂的量可以由本领域技术人员在考虑本公开的益处的情况下确定。因此,在一个实施方案中,施用有效量的本发明的组合物。有效量可以是抑制个体中表达ErbB1的细胞的生长的组合物量,或延长个体的存活,或减轻与个体中ErbB1的表达相关的疾病症状,或抑制过表达ErbB1细胞的恶性表型的量。
在一些实施方案中,施用本发明组合物的个体被怀疑具有任何ErbB1阳性癌症或具有任何ErbB1阳性癌症发展和/或复发的风险。在多个实施方案中,ErbB1阳性癌可以是任何癌症类型,包括实体肿瘤或血癌,和/或转移性癌症,其具体实例包括但不限于纤维肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、腹膜假粘液瘤、淋巴管内皮肉瘤(lymphangioendotheliosarcoma)、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、头颈癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、威尔斯氏肿瘤(Wilns'tumor)、宫颈癌癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤(oliodendroglioma)、脑膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胸腺瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobulinemia)和重链疾病。在一些实施方案中,ErbB1癌症是脑癌、乳腺癌、结肠癌、头颈癌和肺癌。
在一些实施方案中,施用包含如本文所公开的PEPD的组合物引起个体中癌细胞中ErbB1单体的交联,随后是ErbB1单体的内化和降解。
在某些实施方案中,根据本公开内容治疗的个体将具有ErbB1阳性癌细胞,并且可以具有或不具有ErbB2阳性癌细胞。因此,在一些实施方案中,个体可以是ErbB1+/EbrB2-或ErbB1+/ErbB2+。在一些实施方案中,根据本公开的方法治疗的个体对靶向酪氨酸激酶或特异性靶向ErbB1或ErbB2的一种或多种药物具有抗性。在一些实施方案中,个体对至少一种靶向ErbB1结构域II或III中或ErbB1激酶结构域的ErbB1配体结合位点的药剂具有抗性,包括但不限于结合激酶活性构象的药剂,或结合只有当ErbB1从其无活性状态转移到其活性状态时才被瞬时暴露的表位的药剂。在一些实施方案中,个体对至少一种靶向ErbB1和ErbB2的药剂具有抗性。在一些实施方案中,个体对西妥昔单抗、帕尼单抗、mAb 528、吉非替尼、厄洛替尼、PD153035、AG1478、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、拉帕替尼或阿法替尼中的至少一种具有抗性。
用于治疗或预防目的的合适剂量可以由本领域技术人员确定,并且将至少部分地基于个体的年龄、性别、体型大小和健康,使用的递送系统的类型,疾病的阶段和对本领域技术人员将是显而易见的其它因素。在一些实施方案中,人受试者的PEPD给药可以与西妥昔单抗相似或相同,通常为每周250-400mg/m2。
本公开的组合物可以与任何常规治疗方案结合施用,包括顺序或同时施用化学治疗剂、被动免疫疗法、疫苗、佐剂等。在一些具体实施方案中,所述方法可以与旨在治疗与ErbB1阳性细胞相关的疾病或病症的常规疗法结合进行。例如,本文所述的组合物的施用可以与治疗方式组合,所述治疗方式包括但不限于可在PEPD施用之前,同时或之后进行的化学疗法、外科手术和放射治疗。考虑到如上所述的耐药性的可能性,在一些实施方案中,本公开包括使用包含PEPD和另一种ErbB1靶向剂的组合物,例如帕尼单抗、西妥昔单抗、吉非替尼、厄洛替尼或阿法替尼。在一些实施方案中,本公开包括包含PEPD和临床使用的双重ErbB1/ErbB2激酶抑制剂拉帕替尼的组合物。在一些实施方案中,本公开包括使用包含PEPD和曲妥珠单抗或另一种ErbB2靶向剂的组合物。
在一些实施方案中,本公开包括组合物和用于使用组合物的方法,其中除了PEPD蛋白之外,所述组合物还包含抗凝血剂。在一个实施方案中,抗凝血剂是抑制体内PEPD降解的试剂,从而降低患者所需的PEPD剂量。在一个实施方案中,抗凝血剂抑制凝血酶原转化为凝血酶,或抑制凝血酶参与血块形成。在一个实施方案中,抗凝血剂干扰称为因子X和因子II的凝血促进蛋白的凝血相关功能。在一些实施方案中,抗凝血剂结合并激活抗凝血酶III,并且因此抑制凝血因子Xa和IIa。在一个实施方案中,抗凝血剂是肝素,例如未分级肝素制剂或肝素的低分子量形式。肝素的低分子量形式是本领域已知的(即Weitz JI;Weitz,Jeffrey I.(1997).“Low-molecular-weight heparins”.N Engl J Med 337(10):688–98)。在一个实施方案中,低分子量肝素是依诺肝素或其药学上可接受的盐,例如依诺肝素钠。在一个实施方案中,抑制剂是口服或非口服的直接Xa抑制剂,包括但不限于利伐沙班(rivaroxaban)、阿哌沙班(apixaban)或依度沙班(edoxaban)。在一个实施方案中,抗凝血剂是华法林或香豆素。在一个实施方案中,凝血抑制剂可以是其它凝血因子的抑制剂,所述凝血因子包括但不限于因子XII、XI、IX和VII。在一些实施方案中,使用任何合适的载体和施用途径施用低分子量肝素或其它抗凝血剂。在一些实施方案中,抗凝血剂通过皮下注射施用。在一个实施方案中,抗凝血剂经口施用。抗凝血剂的剂量可以基于个人接受者的体重和本领域技术人员在考虑本公开的益处的情况下认可的其它参数。在一些实施方案中,抗凝血剂可以在PEPD组合物之前、同时或之后给予,并且可以以与PEPD相同的次数或时间施用,或者可以根据不同于PEPD施用的方案施用。
在另一个实施方案中,本公开提供了用于鉴定个体是否是用包含PEPD的组合物治疗的候选的方法。所述方法包括从个体获得生物样品,并确定样品是否包含ErbB1阳性癌细胞(包括相对于对照的ErbB1过表达癌细胞或具有激活突变的ErbB1),其中确定生物样品包含ErbB1-阳性癌细胞表明个体是治疗的候选。因此,在一些实施方案中,本公开提供用于帮助诊断,或用于诊断需要用包含PEPD的组合物治疗的个体。在一些实施方案中,所述方法包括将生物样品中存在或不存在ErbB1阳性癌细胞的决定传达给医疗服务提供者,使得在一个实施方案中,医疗服务提供者可以推荐使用包含PEPD的组合物进行治疗。在一些实施方案中,所述方法还包括向个体施用包含PEPD的组合物。
在某些实施方案中,确定ErbB1阳性癌细胞的存在包括在个体或从个体获得的生物样品中检测ErbB1表达阳性的,或者相对于合适的参考过表达ErbB1的,或者表达包含激活突变的ErbB1的癌细胞。关于这一点,认为无论癌细胞中的ErbB1的酪氨酸激酶活性是否是配体依赖性的,或因为任何原因而组成型激活,PEPD仍然是抑制癌细胞生长的有效药剂。因此,在某些实施方案中,个体可以具有仅响应于配体结合而显示酪氨酸激酶活性的ErbB1,或者由于例如激活突变而可显示出组成型激活的酪氨酸激酶活性的ErbB1的癌细胞。这样的突变可以包括种系ErbB1基因突变或在癌细胞中特异性的突变,并且可以相应于靶向ErbB1的化学治疗和/或生物制剂而产生,因此对这样的药剂的具有抗性。这样的ErbB1激活突变是本领域已知的。(参见例如,AF Gazdar,Activating and resistancemutations of EGFR in non-small-cell lung cancer:role in clinical response toEGFR tyrosine kinase inhibitors(Review)Oncogene(2009)28,S24–S3)。通常,认为体细胞激活ErbB1突变位于受体酪氨酸激酶(TK)结构域的ATP结合口袋中。在一些实施方案中,ErbB1基因的激活突变位于TK结构域的前四个外显子(18至21)中。实例包括但不限于外显子19的框内缺失,其通常包括氨基酸残基亮氨酸-747至谷氨酸-749(ΔLRE),占所有ErbB1TK突变的约44%。主要的单点突变存在于外显子21,其导致精氨酸取代密码子858处的亮氨酸(L858R)。认为这种突变在ErbB1TK中具有任何单点激活突变具有最高普遍性,并且也被认为占所有ErbB1TK激活突变的约41%。总之,认为外显子19中的缺失和L858R的点突变占所有ErbB1激活突变的约90%,并且在本领域中有时被称为“经典”激活突变。其它激活突变包括甘氨酸-719(G719)变为丝氨酸、丙氨酸或半胱氨酸(所有ErbB1TK激活突变的4%)。其它突变包括错义突变,其被认为占ErbB1突变的另外6%。外显子20中的额外的框内重复和/或插入也是已知的,并且认为占ErbB1TK激活突变的剩余5%。此外,已经以低频描述了各种其它激活突变,包括但不一定限于外显子20中的V765A和T783A(<1%)。
在一个实施方案中,鉴定个体是否是用包含PEPD的组合物治疗的候选的方法包括从个体获得生物样品,并且通过使样品与可检测标记的PEPD接触来确定样品是否包含ErbB1阳性癌细胞和/或过表达ErbB1。检测ErbB1+和可检测标记的PEPD的复合物表明个体是用如本文所述包含PEPD的组合物治疗的候选。在一个实施方案中,在怀疑包含ErbB1阳性细胞的肿瘤的活检上检测ErbB1+和可检测标记的PEPD的复合物。在替代实施方案中,可以通过使用可检测标记的PEPD结合配偶体来检测与ErbB1阳性细胞结合的PEPD。在一些实施方案中,ErbB1阳性癌细胞表达比参考更多的ErbB1。所述参考可以是任何合适的参考,例如匹配的对照、标准化值(即曲线下面积)和/或由样品中相同组织类型的细胞表达的ErbB1量的值,其中所述ErbB1细胞不是癌细胞。通常,在某些实施方案中,使用与用于鉴定个体是其它抗ErbB1药剂(西妥昔单抗或酪氨酸激酶抑制剂)的治疗的候选相同或相似的标准进行人受试者是PEPD制剂治疗的候选的鉴定,前者基于临床建立的参数并且将是本领域技术人员已知的。
在一些实施方案中,本公开还提供了包含PEPD药物制剂的产品,例如制品。产品包含分离和/或纯化的PEPD。PEPD可以是酶活性或非活性形式的PEPD。制品包括包装和/或印刷材料。在一个实施方案中,本公开包括含有PEPD制剂的封闭或密封包装。在某些实施方案中,包装可以包括一个或多个封闭或密封的小瓶、瓶子、泡罩(泡沫)包装或用于销售、分配或使用PEPD药剂的任何其它合适的包装。印刷材料可以包括印刷信息。印刷信息可以提供在标签上或纸插入物上,或印刷在包装材料本身上。印刷信息可以包括识别包装中的PEPD剂、其它活性和/或非活性成分的量和类型的信息,以及用于服用组合物的说明书,例如在给定时间段内施用的剂量数量,和/或指向药剂师和/或其它医疗服务提供者(例如医师)或患者的信息。试剂盒可以包括并且印刷的信息可以鉴定单独提供或与PEPD试剂组合提供的另外的试剂,例如凝血抑制剂。印刷材料可以包括PEPD药物组合物和/或试剂盒提供的任何其它试剂用于治疗ErbB1阳性癌症的指示。产品可以作为试剂盒提供,其包含治疗有效量的包装在容器中的PEPD,试剂盒还包括附着于容器或与该容器一起包装的标签,该标签描述容器的内容物并提供关于使用容器内容物治疗ErbB1阳性癌症的指示和/或说明。
以下实施例旨在说明而不是限制本发明。
实施例1
该实施例证明人PEPD和PEPDG278D各自与人ErbB1的胞外结构域结合并交联两个ErbB1单体。
在存在或不存在47.5倍过量的牛血清白蛋白(BSA;19nmol/ml)下,将重组人PEPD(rhPEPD,0.4nmol/ml)与人ErbB1胞外结构域和人IgG1的Fc片段的重组嵌合体(EGFR-Fc,0.04nmol/ml)一起孵育,或者将其与作为对照的人IgG1的Fc(0.04nmol/ml)孵育,随后用蛋白A琼脂糖珠和蛋白质印迹拉开。如图1A所示,rhPEPD与ErbB1结合但不结合Fc,并且结合不受BSA影响。在存在或不存在重组人EGF(+,5pmol/ml;++,50pmol/ml)下,rhPEPD(1nmol/ml)还与EGFR-Fc(0.04nmol/ml)一起孵育。EGF是EGFR/ErbB1的高亲和力配体。然而,低浓度的EGF似乎不干扰rhPEPD与EGFR/ErbB1的结合,在高浓度下,其显著地阻断rhPEPD与EGFR/ErbB1的结合。这些结果表明rhPEPD特异性地结合ErbB1的胞外结构域。
在使用上述EGFR-Fc的ELISA中,rhPEPD以剂量依赖性方式和典型的受体-配体结合模式与之结合,估计Kd值为392.6nM(图1B)。
小鼠骨髓32D细胞不表达任何ErbB1或任何其它ErbB。通过基因转染和克隆选择产生稳定表达人ErbB1(32D/ErbB1)的32D细胞。用载体、rhPEPD或rhPEPDG278D(5nM)处理32D/ErbB1细胞,然后用交联剂BS3处理(2mM,30分钟);免疫印迹细胞裂解物用于ErbB1。如图1C所示,这些细胞中大多数ErbB1分子以单体形式存在(单体分子量为175kD),但也检测到一些ErbB1二聚体,后者可能是ErbB1过表达的结果。rhPEPD和rhPEPDG278D两者均以同源二聚体(二聚体分子量为108kD)结合ErbB1,首先形成异源三聚体(1个ErbB1单体与rhPEPD或rhPEPDG278D的1个二聚体连接),然后形成异源四聚体(2个ErbB1单体与rhPEPD或rhPEPDG278D的1个二聚体连接)(图1C)。还检测到不含PEPD的ErbB1二聚体水平的增加,这可能是由BS3蛋白质不完全交联引起的。
值得注意的是,尽管如图1B所示的Kd值为392.6nM,但是5nM的PEPD和PEPDG278D两者均快速地结合并交联ErbB1。这表明在无细胞系统体外测量的PEPD或PEPDG278D对ErbB2的结合亲和力不能完全反映其在细胞表面的相互作用。
实施例2
该实施例证明rhPEPD和rhPEPDG278D初始刺激ErbB1,但后来抑制它。
用rhPEPD或rhPEPDG278D以每种5nM处理过表达ErbB1而不是其它ErbB的32D/ErbB1细胞长达24h。然后收集细胞,通过蛋白质印迹分析细胞裂解物的ErbB1水平和磷酸化ErbB1水平(测量酪氨酸1173处的磷酸化)。这两种药物最初均引起ErbB1磷酸化,可能是由于其与ErbB1单体的交联,但随后ErbB1消耗,可能是由于配体结合受体的内化,随后降解。
实施例3
该实施例表明rhPEPD和rhPEPDG278D两者均破坏ErbB1-ErbB2异二聚体相互作用。
对于其它ErbB,ErbB2是熟知优选的异二聚体配偶体。在过表达ErbB1和ErbB2两者而不表达其它ErbB的细胞(CHO-K1/ErbB1+ErbB2)中,rhPEPD(5nM)引起ErbB1和ErbB2两者的快速酪氨酸磷酸化,随后ErbB1和ErbB2两者下调,其中ErbB2下调比ErbB1下调发生得快得多(图3A)。与ErbB2下调速度相比,ErbB1下调速度相对较慢可能与其内化和降解的差异有关。
接下来,用溶剂、rhPEPD或rhPEPDG278D(5nM)处理CHO-K1/ErbB1+ErbB2细胞1h,用或不用EGF预处理(20nM,15分钟)。使用ErbB2抗体或ErbB1抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀,然后进行免疫印迹。即使rhPEPD和rhPEPDG278D都与ErbB1和ErbB2结合,但是两种药物都会破坏ErbB1-ErbB2结合,不管异源二聚体是自发形成还是被EGF刺激(图3B,3C)。此外,这两种试剂都使EGF结合的ErbB1与ErbB2分离(图3C)。
值得注意的是,对于图3B所示的免疫印迹,将样品装载调整为含有等量的ErbB2。为了对比,在图3C中示出了进行和不进行ErbB2装载调整的免疫印迹的实例。
实施例4
本实施例说明了rhPEPD或rhPEPDG278D与ErbB1或ErbB2的相互作用。
PEPD结合并交联ErbB1,引起ErbB1的二聚化、瞬时磷酸化和降解(图4A)。ErbB1和ErbB2在过表达时形成磷酸化的异源二聚体。虽然PEPD可以与ErbB1和ErbB2两者结合,但它们不会交联ErbB1和ErbB2。相反,PEPD通过交联两个ErbB1单体和两个ErbB2单体来破坏ErbB1-ErbB2异源二聚化,导致受体内化和降解(图4B)。EGF结合ErbB1并促进ErbB1-ErbB2异源二聚化,但是PEPD通过与复合物中的ErbB2结合并迫使ErbB2二聚化、内化和降解来破坏这种异源二聚化。然而,有证据表明,PEPD可能无法与EGF竞争而与ErbB1结合。
实施例5
该实施例表明PEPDG278D抑制具有活化突变的表达ErbB1、ErbB1和ErbB2或ErbB1的多种人类癌症细胞系的生长。
所评估的细胞系包括稳定地过表达人ErbB1的CHO-K1细胞(CHO-K1ErbB1细胞)、稳定地过表达人ErbB1和人ErbB2两者的CHO-K1细胞(CHO-K1ErbB1/ErbB2细胞)、过表达人ErbB1的人表皮样癌A431细胞和表达ErbB1酪氨酸激酶结构域中的活化突变(E746-A750缺失)的人肺腺癌HCC827细胞。将细胞在96孔板中生长过夜,然后用溶剂或rhPEPDG278D处理24、48或72小时,然后通过MTT测定法测量细胞增殖。我们以rhPEPDG278D为中心,由于如前所述的这种药物比rhPEPD作为潜在的治疗剂更有吸引力。rhPEPDG278D以剂量依赖的方式抑制每种细胞系的增殖,并且在用rhPEPDG278D以250nM处理72小时后,细胞增殖抑制了85-95%(图5)。
实施例6
该实施例表明PEPDG278D不抑制不表达ErbB1的细胞,并且在表达中等水平的ErbB1的细胞中,PEPDG278D对细胞增殖产生双相作用(初始刺激,随后抑制)。
CHO-K1细胞不表达ErbB1、ErbB3和ErbB4,而是表达微量水平的ErbB2(图7)。用rhPEPDG278D处理CHO-K1细胞72小时,但没有抑制细胞生长(图6B)。
Hepa1c1c7细胞表达中等水平的ErbB1和一些ErbB2(图7)。用rhPEPDG278D处理这些细胞24、48和78小时。24小时处理后,细胞增殖增加高达21.4%,但是处理48-72小时后,细胞增殖降低至66.5%。
实施例7
该实施例表明rhPEPDG278在抑制ErbB1和ErbB2方面是非常有效的,不管癌症细胞系怎样。
CHO-K1/ErbB1细胞、CHO-K1/ErbB1+ErbB2细胞、A431细胞和HCC827细胞都过表达ErbB1,具有显著的ErbB1磷酸化,而Hepa1c1c7细胞表达中等水平的ErbB1和低ErbB1磷酸化,并且CHO-K1细胞不具有ErbB1(图7A)。
CHO-K1/ErbB1+ErbB2细胞也过表达ErbB2,具有显著的ErbB2磷酸化。HCC827细胞表达中等水平的ErbB2,具有显著的ErbB2磷酸化。CHO-K1/ErbB1细胞、A431细胞、Hepa1c1c7细胞和CHO-K1细胞显示ErbB2和ErbB2磷酸化的表达低至非常低(图7A)。
用5和25nM的rhPEPDG278D处理包括CHO-K1/ErbB1细胞、CHO-K1/ErbB1+ErbB2细胞、A431细胞、HCC827细胞和Hepa1c1c7细胞的细胞24小时,引起所检测的所有细胞系中的ErbB1和ErbB2两者明显的和剂量依赖性下调以及磷酸化的ErbB1和ErbB2损失(图7B,7C)。
在A431细胞中检查了rhPEPDG278D对ErbB1下游信号分子的作用。虽然rhPEPDG278D对AKT、胞外信号调节激酶(ERK)或信号转导及转录激活因子3(STAT3)的表达水平没有影响,但它引起了所有三种蛋白质的去磷酸化(失活)。这些改变与rhPEPDG278D对ErbB1及ErbB2的抑制一致。
实施例8
该实施例表明依诺肝素(EP)在体内抑制rhPEPD降解,并且EP与rhPEPD或rhPEPDG278D的组合明显地提高了后者的血浆浓度。
通过腹膜内给予10mg/kg的rhPEPD,可以在小鼠中实现rhPEPD的治疗相关血浆浓度(图8A)。然而,以2.5mg/kg的EP腹膜内预处理,允许rhPEPD剂量降低至少50倍,而不降低其血浆浓度(图8B)。EP是临床使用的低分子量肝素(LMWH)。EP还显著增加小鼠内源性PEPD的血浆水平(图8B)。我们后来发现,每天0.5mg/kg的EP剂量足以提高血浆PEPD水平(图8C)。已知包括EP的LMWH通过结合和活化抗凝血酶,丝氨酸蛋白酶抑制剂而抑制几种凝血蛋白酶,包括因子Xa和IIa。我们未发表的观察结果表明,EP通过新的蛋白水解途径抑制PEPD蛋白水解,其包括血浆中的凝血蛋白酶,包括因子XII、XI、IX、X、II和VII。因此,除了EP之外,抑制一种以上的上述凝血蛋白酶的其它抗凝剂也可以在体内阻断rhPEPD和rhPEPDG278D的降解。
实施例9
该实施例表明rhPEPD和rhPEPDG278D两者均能抑制小鼠的肿瘤生长,但是rhPEPDG278D显示更有利的结果。
我们使用原位BT-474乳腺癌模型评估了PEPD的抗肿瘤活性。将人乳腺癌BT-474细胞接种到雌性无胸腺小鼠的乳腺脂肪垫上。在肿瘤大小达到230mm3后开始治疗。用载体、EP、EP加rhPEPD或EP加rhPEPDG278D处理小鼠。每天给小鼠腹膜内给药EP 0.5mg/kg,持续4天之后是rhPEPD或rhPEPDG278D。两次以2mg/kg将rhPEPD或rhPEPDG278D腹膜内给药至小鼠,每次分隔2天。在每次治疗的最终剂量后24小时杀死小鼠,并且在那时获得肿瘤和血液样品。在仅仅使用两次剂量的rhPEPD或rhPEPDG278D治疗后,肿瘤分别地缩小到对照的42.2%或37.3%(图9A)。EP不仅影响肿瘤组织中的肿瘤生长而且影响ErbB信号传导,而PEPD的肿瘤抑制与ErbB2和ErbB1的明显消耗和去磷酸化以及包括SRC、AKT、胞外信号调节激酶(ERK)和信号转导及转录激活因子3(STAT3)的关键下游信号的去磷酸化(失活)有关(图9B)。BT-474肿瘤中还存在低水平的ErbB3;两种药物都减少了ErbB3酪氨酸磷酸化,但没有减少其表达(图9B),这与我们发现PEPD不是ErbB3的配体而是破坏ErbB1或ErbB2的异源二聚化是一致的。尽管在结合活化的ErbB1或ErbB2后才活化SRC,但在ErbB1-或ErbB2-过表达的癌细胞中的磷酸肌醇3-激酶(PI3K)活化和信号传导取决于其对ErbB异源二聚体中的活化ErbB3的补充。因此,两种药物均强烈地抑制肿瘤组织中的SRC激酶活性和PI3K活性(图9C,9D)。在肿瘤组织中,每种试剂还下调了抗凋亡B细胞淋巴瘤2(Bcl-2),上调了促凋亡Bcl-2相关X蛋白(BAX)和活化的caspases-3/-8/-9(图9B)。然而,在肿瘤组织中,rhPEPD而非rhPEPDG278D刺激缺氧诱导因子1α(HIF-1α)及其下游靶标,包括血管内皮生长因子(VEGF)和葡萄糖转运蛋白1(GLUT-1)。rhPEPD或HIF-1α,VEGF和GLUT-1的作用可能源于rhPEPD在其内化后对亚氨基二肽的新陈代谢以及代谢物对HIF-1a降解的抑制(Surazynski等人,International Journalof Cancer,122,1435-1440,2008)。rhPEPD和rhPEPDG278D都积聚在肿瘤组织中。
实施例10
该实施例表明rhPEPDG278D在体内强烈地抑制ErbB1过表达的肿瘤。
我们进一步评估了rhPEPDG278D在过表达ErbB1的头颈癌的小鼠皮下模型中的抗肿瘤活性。将人A341癌细胞皮下接种到雄性无胸腺小鼠的侧腹(每个位点2.7×106个细胞)。然后将小鼠随机分为三个实验组:无治疗、EP和EP加rhPEPDG278D。当肿瘤体积达到约40mm3时开始EP治疗(每天腹膜内0.5mg/kg)。五天后,肿瘤体积达到约100mm3,并且EP治疗的小鼠也开始每隔一天用溶剂或rhPEPDG278D(4mg/kg)进行治疗。当肿瘤大小达到约450mm3时,用rhPEPDG278D(每隔一天4mg/kg,总共2次)治疗一些EP治疗的小鼠。
在用4mg/kg的rhPEPDG278D与EP组合治疗的小鼠中达到高血浆浓度的rhPEPDG278D(图10A)。
如图10B所示,当EP对肿瘤生长没有影响时,rhPEPDG278D对抑制肿瘤生长非常有效。当肿瘤相对较小(约100mm3)时,rhPEPDG278D在第一次给药后完全停止了肿瘤生长,并且当肿瘤相对较大(约450mm3)时,rhPEPDG278D在第一次给药后产生了深远意义的肿瘤消退。此外,虽然EP对肿瘤组织中的ErbB1和其它信号分子没有影响,但是rhPEPDG278D将ErbB1和ErbB2两者均下调,导致肿瘤组织中的ErbB1和ErbB2两者均去磷酸化(失活),以及AKT、ERK和STAT3去磷酸化(图10C)。由rhPEPDG278D诱导的肿瘤组织中的分子变化与培养的A431细胞中的分子变化相同(图7C)。
小鼠没有表现出毒性迹象,并且EP和rhPEPDG278D均对体重增加没有任何影响(图10D)。
实施例11
本实施例提供了用于获得实施例1-10中描述的数据的材料和方法的说明。
试剂。如前所述(Yang等人,Journal of Biological Chemistry,288,2365-2375,2013)产生rhPEPD和rhPEPDG278D(标记到羧基末端的6×His)。人IgG1的重组Fc、重组EGFR-Fc(人EGFR胞外结构域(Met1-Ser645)和人IgG1的Fc片段的嵌合体)和重组EGF来自于R&DSystems。EP和甲基噻唑基二苯基四唑鎓溴化物(MTT)分别购买自赛诺菲-安万特(Sanofi-Aventis)和西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)。
使用以下抗体:抗-PEPD(Abcam)、用于检测Fc的抗-人IgG1(Santa Cruz)、抗-EGF(R&D Systems)、抗-ErbB1(Cell Signaling)、抗-p-ErbB1(Y1173)(Cell Signaling)、抗-ErbB2(Cell Signaling)、抗-p-ErbB2(Y1221/1222)(Cell Signaling)、抗-AKT(CellSignaling)、抗-ErbB3(Santa Cruz)、抗-p-AKT(Cell Signaling)、抗-ERK(CellSignaling)、抗-p-ERK(Cell Signaling)、抗-SRC(Cell Signaling)、抗-p-SRC(CellSignaling)、抗-STAT3(Cell Signaling)、抗-p-STAT3(Cell Signaling)、抗-caspase-3(Cell Signaling)、抗-切割的caspase-8(Cell Signaling)、抗-切割的caspase-9(CellSignaling)、抗-Bcl-2(Cell Signaling)、抗-Bax(Cell Signaling)、抗-VEGF(SantaCruz)、抗-GLUT-1(Santa Cruz)、抗-HIF-1α(Santa Cruz)、抗-GAPDH(Millipore)、生物素缀合的抗-His(Bethyl)、HRP缀合的链霉亲和素(Thermo Scientific)和山羊抗兔IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch)。
细胞系、细胞培养和基因转染。由美国食品和药物管理局的Gibbes R Johnson提供具有野生型人EGFR/ErbB1稳定表达的32D细胞(32D/ErbB1)。将32D/ErbB1细胞培养在补充有10%胎牛血清(FBS)、5%WEHI-3B细胞调节培养基和0.1%的2-巯基乙醇的RPMI1640培养基中。将人乳腺癌MCF-7细胞(ATCC)培养在高葡萄糖DMEM加10%FBS中。将BT-474细胞(ATCC)培养在50%高葡萄糖DMEM/50%F-12K培养基和10%FBS中。如下所述,将过表达ErbB1、ErbB2或ErbB1加ErbB2的CHO-K1细胞(ATCC)以及CHO-K1亚克隆培养在F-12K培养基加10%FBS中。将HCC827细胞(ATCC)培养在RPMI-1640培养基和10%FBS中。将A-431细胞培养在50%DMEM/50%F-12K培养基加10%FBS中。将所有细胞系培养在具有5%CO2的湿润的37℃培养箱中。
通过用pcDNA-ERBB2转染CHO-K1细胞并在G418下选择产生稳定过表达人ErbB2的CHO-K1/ErbB2细胞。为了瞬时过表达人ErbB1,用pCMV6-XL5-ERBB1转染CHO-K1细胞或CHO-K1/ErbB2细胞。使用在6孔板和FuGENE HD(Promega)中生长的细胞进行瞬时基因转染。
蛋白质印迹分析。通过胰蛋白酶处理和离心从培养物中收集细胞。用PBS洗涤两次后,在补充有2mM的苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)的1×细胞裂解缓冲液(Cell Signaling)中将细胞裂解。通过超声处理增强细胞裂解。通过在4℃下以13,000×g离心10分钟来清除样品。将肿瘤组织与来自罗氏(Roche)的补充有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液(25mM Tris-HCl,pH 7.6,150mM NaCl,1%NP-40,1%脱氧胆酸钠,0.1%SDS)混合,并在Dounce匀浆器中敲击,并且通过在4℃下以13,000×g离心15分钟来清除匀浆。通过BCA测定试剂盒(Pierce)测量所有试样的蛋白质浓度。将样品与4×装载染料混合,在95℃加热5分钟,并且通过SDS-PAGE(8-10%)溶解。将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上并用特异性抗体探测,并且使用ECL Plus试剂盒(Amersham)或SuperSignal WestPico试剂盒(Thermo Scientific)检测蛋白质条带。
为了检测rhPEPD或rhPEPDG278D与活细胞中的ErbB1的结合,用每种试剂或溶剂处理细胞,然后用冰冷的PBS洗涤或在室温下用2mM的交联剂BS3(Pierce)孵育30分钟。通过加入50mM Tris(最终,pH 7.5)终止交联反应,然后在室温下孵育15分钟。通过蛋白质印迹(3.5%SDS-PAGE)分析细胞裂解物。
免疫沉淀。为了检测rhPEPD与ErbB1的直接和特异性结合,在存在或不存在BSA(19μM)或EGF(5或50nM)下,在具有EGFR-Fc(0.04μM)或Fc(0.04μM)的M-PER缓冲液中在37℃下将rhPEPD(0.4μM)孵育1小时,然后在4℃下过夜,随后在室温下与蛋白质A-琼脂糖凝胶孵育1小时。用免疫沉淀洗涤缓冲液洗涤小珠,并进行蛋白质印迹分析。在使用细胞裂解物的实验中,在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche Applied Science)的M-PER缓冲液(ThermoScientific)中将细胞裂解。细胞裂解物(在0.5ml结合缓冲液中0.5mg总蛋白)与抗体在4℃下孵育过夜。由蛋白G-琼脂糖将免疫复合物拉开(室温下孵育1小时)。用IP洗涤缓冲液洗涤小珠,然后进行蛋白质印迹分析。
用于测量血浆PEPD浓度和PEPD与ErbB1结合亲和力的ELISA。为了测量PEPD浓度,将96孔ELISA板在4℃下用100μl/孔稀释的抗-PEPD小鼠单克隆抗体(2.5μg/ml)包被过夜。然后将板用含有吐温20的磷酸盐缓冲盐水(PBST)洗涤三次,并用200μl/孔的封闭缓冲液封闭(室温孵育至少2小时)。将板用PBST洗涤,然后用100μl/孔的适当稀释的PEPD标准品或样品在室温下孵育2小时。将板用PBST洗涤三次,然后将各孔与100μl检测抗体(抗-PEPD兔多克隆抗体)在室温下孵育2小时。将板用PBST洗涤3次后,向各孔中加入100μl的二次试剂(山羊-抗-兔IgG-HRP,1:2500稀释),然后在室温下孵育1小时。再次将板用PBST洗涤三次,然后将每个孔与100μl的HRP底物溶液(来自Cell Signaling的TMB底物,#7004)一起孵育。在适当的显色后,向每个孔中加入100μl的终止溶液(Cell Signaling,#7002),用微量滴定板读数仪记录450nm处的吸光度。将纯PEPD作为标准。
为了测量与EGFR结合的PEPD或EGF,将96孔ELISA板在4℃下用100μl/孔的山羊-抗-人IgG Fc(10μg/ml)包被过夜。用PBST洗涤三次后,用300μl/孔的测定缓冲液(1%BSA/PBS)在室温下孵育2小时使孔中残留的蛋白质结合位点饱和。除去测定缓冲液后,向每个孔中加入60μl的rhPEPD,然后向每个含rhPEPD的孔中加入60μl的EGFR-Fc(1μg/ml),并在37℃下孵育2小时。然后将板用PBST洗涤三次,向每个孔中加入100μl的生物素缀合的山羊-抗-His(1:10000稀释液),并在室温下孵育2小时。用PBST洗涤另一轮后,向每个孔中加入100μl的链霉抗生物素蛋白缀合的HRP(1:10000稀释液),并在室温下孵育45分钟。用PBST再次洗涤孔,通过加入100μl/孔的TMB溶液作为过氧化物酶底物来检测结合的HRP。通过加入100μl/孔的终止液终止反应,并通过微量滴定板读数仪记录450nm处的吸光度读数。
PI3激酶测定。使用PI3激酶活性ELISA试剂盒(Echelon,K-1000s)。简言之,使用PI3K抗体(抗PI3K p85)从全细胞裂解物(由每个样品约1×106个细胞制备)中将PI3K拉开,将免疫沉淀物与30μl KBZ反应缓冲液混合,然后将其与30μl的10μM PI(4,5)P2底物混合,随后在37℃下孵育2小时。通过向每个反应溶液中加入90μl激酶终止液终止激酶反应,并用与60μl PIP3检测剂将60μl的每种停止的激酶反应溶液一起转移到培养板中的每个孔中。在室温下孵育60分钟后,将来自培养板的100μl的每种样品转移到检测板的相应孔中,并在室温下孵育60分钟。用TBST洗涤板,然后与HRP缀合的二次检测剂一起孵育30分钟,然后用TBST洗涤,使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺作为底物,通过标准比色法测定固定化的HRP。
Src激酶测定。使用通用酪氨酸激酶测定试剂盒(TaKaRa,#MK410)测定细胞裂解物中的Src活性。简言之,在具有Src抗体的IP之前,用蛋白A-琼脂糖珠将裂解物(由每个样品约1×106个细胞制备)预清除。洗涤免疫沉淀物,并与150μl激酶反应溶液中的10mMβ-巯基乙醇孵育。将每个样品(40μl)与10μl的40mM ATP-2Na溶液混合,将其转移到包被有PTK底物的微量滴定板孔中,然后在37℃下孵育30分钟。在用TBST洗涤后,向每个孔中加入HRP-缀合的抗磷酸酪氨酸(PY20)溶液,并在37℃下孵育30分钟。用TBST洗涤另一轮后,使用3,3',5,5'-四甲基联苯胺作为底物,通过标准比色法测定固定化的HRP。
MTT细胞增殖测定。细胞在96孔板(150μl培养基/孔)中生长过夜,然后用载体orrhPEPDG278D处理长达72小时,然后在37℃下与MTT(培养基中,9.2mM)一起孵育3小时。除去培养基后,用二甲基亚砜(150μl/孔)处理细胞,并在570nm处光谱测定由MTT形成的甲(与细胞密度成正比)。
动物研究。使用不育小鼠(Harlan Laboratories)用于研究。按照罗斯维尔癌症中心(Roswell Park Cancer Institute)的实验动物护理和使用委员会(the InstitutionalAnimal Care and Use Committee)批准的方案进行所有动物实验。以原位乳腺肿瘤模型评估了rhPEPD,然而以原位乳腺肿瘤模型以及以皮下表皮腺癌模型评估了rhPEPDG278D。
为了建立原位乳腺肿瘤,我们将雌性无胸腺小鼠(6-7周龄)皮下地植入1.7mg的60天释放的17β-雌二醇丸(Innovative Research of America),并在2天后将BT-474细胞接种到于100μl的PBS-Matrigel混合物(1:1)中的每个位点2×106的乳腺脂肪垫。允许肿瘤达到约230mm3。然后用载体、EP、EP加rhPEPD、EP加rhPEPDG278D处理小鼠。我们腹膜内给予EP(0.5mg/kg)每天一次,持续7天,并且在EP治疗的第五天和第七天,我们还腹膜内给予2mg/kg的rhPEPD或rhPEPDG278D。在最终治疗后24小时使小鼠死亡。在同时给予EP和rhPEPD或rhPEPDG278D的天数内,EP始终比其它药物提前1小时给予。给予在PBS中的EP、rhPEPD和rhPEPDG278D(100μl/20g体重)。我们使用长×宽2/2计算肿瘤大小。使用Canon EOS DigitalRebel Xsi摄像机拍摄肿瘤图像。
为了建立皮下A431肿瘤,我们以每个位点100μl无血清培养基中的2.7×106个细胞,皮下地接种A431细胞至雄性无胸腺小鼠(5周龄)的侧腹。将小鼠随机分为三组:无治疗、EP或EP加rhPEPDG278D。当肿瘤体积达到约40mm3时,开始EP治疗(每天腹膜内0.5mg/kg)。五天后,当肿瘤体积达到约100mm3时,继续EP治疗,同时每隔一天还用载体或rhPEPDG278D(4mg/kg)处理小鼠。当肿瘤大小达到约450mm3时,用rhPEPDG278D(4mg/kg,每次隔一天,共两次剂量)治疗一些经EP治疗的小鼠。在将EP和rhPEPDG278D两者均给予至小鼠的天数内,EP始终比另一种药物提前1小时给予。给予在PBS中的EP和rhPEPDG278D(100μl/20g体重)。在最后一次治疗后24小时的小鼠或同时从未治疗的小鼠获得血液样品以及肿瘤。通过ELISA测定内源性小鼠PEPD和/或rhPEPDG278D的血浆浓度。
统计分析。ANOVA用于多组比较。0.05以下的P值认为是统计学显著的。
虽然已经就一个或多个特定的实施方案描述了本发明,但是应当理解,在不脱离本发明的精神和范围的情况下,可以进行本发明的其它实施方案。因此,认为仅由所附权利要求及其合理解释来限制本发明。
Claims (13)
1.一种用于预防和/或治疗个体中的ErbB1阳性癌症的方法,其包括向所述个体施用有效量的包含肽酶D(PEPD)的组合物,使得所述ErbB1阳性癌症的生长被抑制。
2.根据权利要求1所述的方法,其中与包含SEQ ID NO:1的序列的PEPD相比,所述PEPD具有较小的二肽水解活性。
3.根据权利要求1所述的方法,其还包括向所述个体施用抗凝血剂。
4.根据权利要求1-3所述的方法,其中所述PEPD是融合蛋白的组分。
5.根据权利要求1-3所述的方法,其中所述PEPD与化学治疗剂缀合。
6.根据权利要求1-3所述的方法,其中所述ErbB1阳性癌症对至少一种不是PEPD的抗癌剂具有抗性。
7.根据权利要求4或5所述的方法,其中所述ErbB1阳性癌症对至少一种不是PEPD的抗癌剂具有抗性。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述ErbB1阳性癌症对至少一种不是PEPD的抗癌剂具有抗性。
9.根据权利要求1-3所述的方法,其中所述ErbB1阳性癌症也是ErbB2阳性癌症。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述ErbB1阳性癌症和所述ErbB2阳性癌症对至少一种不是PEPD的抗癌剂具有抗性。
11.一种用于预防和/或治疗ErbB1阳性癌症的产品,其包括至少一个密封容器,所述密封容器包含含有肽酶D(PEPD)的药物制剂,其中所述产品包括印刷材料,所述印刷材料提供所述药物制剂用于预防和/或治疗个体中的ErbB1阳性癌症的指示。
12.根据权利要求11所述的产品,其中与包含SEQ ID NO:1的序列的PEPD相比,所述PEPD具有较小的二肽水解活性。
13.根据权利要求11-12所述的产品,其还包含抗凝血剂,和/或所述药物制剂与抗凝血剂一起使用的指示。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114634907A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-06-17 | 香港大学深圳医院 | 一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的体系和方法 |
CN114835817A (zh) * | 2021-02-01 | 2022-08-02 | 四川大学华西医院 | 一种基于天然配体制备靶向her2/egfr car-t的方法及应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6812339B1 (en) * | 2000-09-08 | 2004-11-02 | Applera Corporation | Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof |
WO2004104595A2 (en) * | 2003-05-22 | 2004-12-02 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with x-pro dipeptidase (pepd) |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2401873A1 (en) | 2000-03-15 | 2001-09-20 | Robert A. Copeland | Peptidase-cleavable, targeted antineoplastic drugs and their therapeutic use |
ITRM20010408A1 (it) | 2001-07-10 | 2003-01-10 | Univ Napoli Federico Ii | Mini-anticorpo umano citotossico per cellule tumorali che esprimono il recettore erbb2. |
CN1321691C (zh) | 2002-10-01 | 2007-06-20 | 保拉·阿曼纳蒂 | 用于色素性视网膜炎的酶治疗法之试剂盒形式的相关药物组合物 |
EP1537871A1 (en) * | 2003-12-04 | 2005-06-08 | Aventis Pharma S.A. | Enoxaparin for the treatment of cancer |
JP2008530123A (ja) | 2005-02-09 | 2008-08-07 | ジェネンテック・インコーポレーテッド | マトリックスメタロプロテアーゼアンタゴニストを用いたher2のシェディングの阻害 |
ITMI20060556A1 (it) | 2006-03-24 | 2007-09-25 | Univ Pavia | Medicazioni interattive per la cura di patologie dermatologiche |
US8557961B2 (en) | 2010-04-02 | 2013-10-15 | Amunix Operating Inc. | Alpha 1-antitrypsin compositions and methods of making and using same |
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6812339B1 (en) * | 2000-09-08 | 2004-11-02 | Applera Corporation | Polymorphisms in known genes associated with human disease, methods of detection and uses thereof |
WO2004104595A2 (en) * | 2003-05-22 | 2004-12-02 | Bayer Healthcare Ag | Diagnostics and therapeutics for diseases associated with x-pro dipeptidase (pepd) |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
L YANG ET AL.: "Identification of prolidase as a high affinity ligand of the ErbB2 receptor and its regulation of ErbB2 signaling and cell growth", 《CELL DEATH AND DISEASE》 * |
LU YANG ET AL.: "Prolidase Directly Binds and Activates Epidermal Growth Factor Receptor and Stimulates Downstream Signaling", 《THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY》 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114835817A (zh) * | 2021-02-01 | 2022-08-02 | 四川大学华西医院 | 一种基于天然配体制备靶向her2/egfr car-t的方法及应用 |
CN114835817B (zh) * | 2021-02-01 | 2023-10-20 | 四川大学华西医院 | 一种基于天然配体制备靶向her2/egfr car-t的方法及应用 |
CN114634907A (zh) * | 2022-04-01 | 2022-06-17 | 香港大学深圳医院 | 一种共培养巨噬细胞和肝癌细胞的体系和方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
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