KR20160045227A - Kvac１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스 - Google Patents

Abstract

본 발명은 약독화 백시니아 바이러스 주 KVAC103을 이용한 새로운 재조합 바이러스 벡터에 관한 것으로, KVAC103에 외래유전자를 삽입한 재조합 바이러스 벡터는 포유동물에 안전한 백신 전달체로 사용될 수 있다. 특히 모 바이러스에서 삭제되었던 유전자 중 일부를 복원시킨 재조합 바이러스는 배양 세포에서 증식성이 향상되어 재조합 바이러스의 생산이 용이하며 외래 항원의 발현량이 증가하여 면역유발 효능이 향상되었다. 이러한 재조합 바이러스 벡터는 질병 예방 백신, 치료용 백신 및 분자생물학적 연구에 사용될 수 있다.

Description

KVAC１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스{RECOMBINANT VACCINIA VIRUS DERIVED FROM KVAC１０３ STRAIN}

본 발명은 약독화 백시니아 바이러스 주 KVAC103을 이용한 새로운 재조합 바이러스에 관한 것이다.

백시니아 바이러스는 피막 DNA 바이러스로, 약 200개의 독립 유전자를 인코딩하는 약 120~180kb의 이중 가닥 선형 DNA 게놈을 가진다 (Hendrickson et al., 2010). 각각의 유전자는 짧은 5'-프로모터, 인트론 없이 단백질을 암호화하는 단일 ORF 및 짧은 3'-폴리아데닐레이션 자리로 이루어진다. 이 단백질들은 IE(intermediate-early), E(early) 또는 L(late)의 바이러스 감염 단계에서 프로모터에 의존적으로 발현된다. 초기 프로모터 및 후기 프로모터의 서열은 기능 실험을 통해 잘 밝혀져있다 (Rosel et al., 1986; Yuen et al., 1987; Davision et al., 1989a and 1989b; Chakrabarti et al., 1997).

백시니아 바이러스는 18세기 에드워드 제너가 최초로 두창(smallpox)에 대한 예방백신으로 사용한 이후, 백신이라는 말의 어원을 제공할 정도로 면역조절물질의 대명사가 되었다. 1977년 세계적인 두창박멸이후 일반인을 대상으로 한 예방백신은 시행하지 않게 되었지만 최근 두창 생물테러에 대한 예방백신의 필요성이 다시 대두되었다. 초기에 사용된 백시니아 바이러스는 면역효능이 우수한 백신으로 두창 박멸에 크게 기여하였지만, 백신을 맞은 사람이 전신감염이나 진행성 감염등의 심각한 부작용을 나타내는 경우가 가끔 있었다.

이에 부작용을 줄이기 위해 개발된 병독성이 약화된 백시니아 바이러스들로 MVA, NYVAC, LC16m8이 있다. 변형된 백시니아바이러스 앙카라 (MVA)는 백시니아 바이러스 CVA strain 를 닭의 배아세포(CEF)에서 500회 이상 계대하여 얻은 약독화 바이러스주로 대부분의 포유동물세포에서 증식하지 않으며, 게놈상의 6개 영역에 30kb 결실 영역을 가지고 있다. 이 바이러스는 동물모델에서 안전성이 뛰어나 덴마크의 바바리안노르딕사가 천연두 예방백신 및 백신전달체로 개발하고 있다. LC16m8은 일본 혈청연구소에서 개발된 약독화 바이러스로, 작은 플라크를 형성하고 생체에서 병독성이 줄어든 특성을 보인다. 게놈 시퀀스 상에서 B5R 유전자에 돌연변이가 확인되었다. NYVAC은 코펜하겐주를 유전공학적 방법으로 게놈상의 5개 영역에서 18개의 ORF가 삭제된 것으로 다양한 재조합 바이러스 전달체로 개발되고 있다.

바이러스는 바이러스에 외래 유전자를 삽입하고 감염 세포에서 이 외래 유전자를 과발현하여 유전자를 전달할 수 있기 때문에 유전자 전달 벡터로 이용 가능하다. 최근에는 외래항원을 삽입한 재조합 백시니아 바이러스가 백신 개발 전달체로 각광받고 있다.

이와 관련하여, 한국 등록특허공보 제10-1241423호는 바이러스를 유전자 전달 벡터로 이용하는 것을 개시하고 있으며, 한국 등록특허공보 제KR10-1041691호는 변형된 백시니아 바이러스 MVA의 게놈 내부에 외래 DNA를 삽입하고 이를 백신으로 이용한 것을 개시하고 있다.

본 발명의 목적은 약독화된 백시니아 바이러스 주인 KVAC103을 이용하여 외래 유전자를 삽입한 재조합 바이러스를 개발하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 외래 유전자를 포함할 수 있는 플라스미드 전달벡터를 제작하여 약독화된 백시니아 바이러스 KVAC103의 게놈에 삽입한 재조합 백시니아 바이러스 주를 제작하였다. 그리고, 약독화 과정에서 결실된 KVAC103 유전자의 일부를 전달벡터에 삽입하여 복원함으로써 재조합 바이러스의 증식 및 복제를 현저히 향상시켰다.

본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 약독화 백시니아 바이러스주 KVAC103을 사용하여 세포 감염시 독성이 거의 없이 외래 유전자를 숙주 내에서 발현할 수 있으며, 숙주 범위가 확장되고 복제 및 증식이 향상되었으므로 외래 유전자를 숙주 내에서 현저히 발현할 수 있어 면역유발 효과가 뛰어난 백신 조성물 또는 유전자 전달 효과가 우수한 바이러스 벡터로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 pETL-EGFP의 전체 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 pVVT1-EGFP 셔틀 플라스미드 전달벡터의 구조를 나타낸 것이다.
도 3은 KVAC103의 19.5 kb 결실 부위 및 2.5 kb 결실 부위를 검출함으로써KVAC103을 동정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 KVAC103의 19.5 kb 결실 부위를 4개로 나눈 d1, d2, d3 및 d4에 존재하는 ORF들을 나타낸 것이다.
도 5는 KVAC103의 결실 부위에서 d1, d2, d3 및 d4를 각각 구제한 바이러스들의 특성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 KVAC103의 결실 부위에서 d1 및 d3의 ORF를 각각 구제한 바이러스들의 특성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 GFP-양성 재조합 바이러스를 생산한 ORF5의 염기서열과 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 8은 GFP-양성 재조합 바이러스를 생산한 ORF16의 염기서열과 코딩하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 9는 재조합 백시니아 바이러스 주들의 다양한 숙주 포유동물 세포에서의 전파 및 복제를 나타낸 것이다.
도 10은 각각의 재조합 백시니아 바이러스 주로 감염된 세포에서의 GFP 발현 강도를 나타낸 것이다.
도 11은 재조합 백시니아 바이러스의 인터페론 감수성을 나타낸 것이다.
도 12는 토끼 피부에서의 재조합 백시니아 바이러스의 독성 정도를 나타낸 것이다.
도 13은 외래 항원유전자 (PA)를 도입하여 백신 개발을 위한 재조합 KVAC103 바이러스를 생산하는 단계를 도식화하여 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명은 다양한 형태로 변경되어 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 구현예에 한정되는 것은 아니다.

일 측면에서, 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103 (기탁번호 KCCM11574P) 유래의 재조합 백시니아(vaccinia) 바이러스에 관한 것이다.

일 구현예에서, 외래 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드는 야생형 백시니아 바이러스의 C7L 유전자이며, 상기 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드는 야생형 백시니아 바이러스의 K1L 유전자이다. 일 실시예에서, 상기 유전자를 삽입한 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103은 바이러스에 도입한 외래 항원의 발현율이 증가되는 효과가 있었다. 따라서, 상기 외래 항원 발현율이 증가되는 효과를 보이는 한도에서의 상기 유전자 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 변이체는 서열번호 2 또는 3의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 "재조합 백시니아 바이러스"는 백시니아 바이러스가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 바이러스는 상기 바이러스의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 바이러스는 천연 상태의 바이러스에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 바이러스의 유전자 내에 재도입 또는 구제(rescue)된 것이다. 본 발명의 일 실시예에서, 약독화된 백시니아 바이러스 KVAC103에서는 결실되어 있지만, 야생형 백시니아 바이러스에는 존재하는 C7L 또는 K1L 유전자를 재도입(구제)하였으며, 이로 인해 바이러스의 증식 및 외래 유전자의 발현이 증가하였다.

일 구현예에서, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 하나 이상의 마커 유전자 또는 선별 유전자를 포함한다. 선별 유전자는 세포에 특이적 내성을 형질도입하는데, 그에 따라 특정 선별방법이 가능하게 된다. 표지 유전자는 형질도입된 세포를 확인하는데 사용될 수 있는 형질도입된 세포에서 색채 반응을 유도한다. 예를 들면, β-갈락토시다아제(β-gal), β-글루코시다아제(β-gluc), 녹색 형광 단백질(GFP), 적색형광단백질 또는 청색형광단백질을 암호화하는 유전자일 수 있다.

일 구현예에서, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 서열번호 1의 플라스미드 전달벡터를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 플라스미드 전달벡터는 외래 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 플라스미드 전달벡터는 백시니아 바이러스의 tk(thymidine kinase) 유전자 내부에 SfiⅠ 제한효소절단위치(restriction site)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 재조합 바이러스의 외래유전자 삽입위치를 tk(thymidine kinse) 유전자위(locus)로 구성하였으나, 필수적인 유전자만 손상시키지만 않는다면 다른 유전자위에 치환하거나 삽입하는 재조합 바이러스도 제작이 가능하다. 예를 들면, 19.5kb 삭제영역 또는 2.5kb 삭제영역에도 가능하다.

일 구현예에서, 상기 외래 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 감염성 질병을 일으키는 바이러스, 박테리아 등의 항원 단백질을 암호화하는 유전자 또는 이의 일부인 것이 바람직하다.

본 발명의 외래 항원을 암호화하는 외래 유전자 서열은 하나 또는 수개의 전사 조절 요소에 연결된 2개 이상의 코딩 서열을 또한 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 코딩 서열은 하나 이상의 단백질, 폴리펩티드, 펩티드, 외래 항원 또는 항원성 항원 결정기, 특히 질병 치료에 관련된 유전자에 관한 상술한 것들을 암호화한다. 이종성 또는 외래 유전자 서열은 본 발명에 따라 사용된 바와 같이 백시니아 바이러스와 관련되어 일반적으로 발견되지 않는 서열이다. 외래 유전자 서열은 하나 이상의 코딩 서열을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 SfiⅠ 제한효소절단위치에 외래 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입될 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스를 함유하는 백신 조성물에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 백신 조성물은 외래 항원을 발현하는 재조합 백시니아 바이러스를 함유할 수 있다, 상기 외래 항원은 질병을 유발하는 병원성 유전자에 또는 감염성 미생물로부터 유래되거나 그와 상동인 항원을 암호화하는 유전자일 수 있다. 따라서, 본 발명에서 이러한 치료에 관련된 유전자는 특이적 면역반응에 영향을 주기 위해, 바람직하게는 면역반응을 유도하기 위해 생물의 면역계에 제공됨으로써 그 생물을 상기 미생물 또는 바이러스에 의한 감염으로부터 보호하기 위해 백신 접종된다. 상기 치료에 관련된 유전자는 감염성 바이러스, 예를 들면, 뎅기(Dengue) 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, B형 또는 C형 간염 바이러스 또는 HIV와 같은 면역결핍 바이러스의 유전자로부터 선택되지만 이들에 한정되는 것은 아니다.

백신의 제조를 위해, 본 발명에 따른 재조합 백시니아 바이러스는 생리학적으로 허용가능한 형태로 변환된다. 이는 두창에 대한 백신접종에 사용된 수두 바이러스 백신의 제조에 있어서 경험을 토대로 하여 실시될 수 있다 (Stickl, H. 등에 의해 개시됨. [1974] Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). 백신 주사의 제조를 위해 예를 들면, 바이러스 입자는 앰플 내, 바람직하게는 유리 앰플에서 1% 사람 알부민 및 2% 펩톤존재하의 100ml의 인산-완충 식염수(PBS)에서 동결건조된다. 다르게는, 백신 주사는 제제에서 바이러스의 순차적 동결-건조에 의해 생성될 수 있다. 이 제제는 만니톨, 덱스트란, 당, 글리신, 락토오스 또는 폴리비닐피롤리돈과 같은 추가 첨가제 또는 산화 방지제 또는 비활성 가스, 안정화제 또는 생체내 투여에 적합한 재조합 단백질(예를 들면, 사람 혈청 알부민)과 같은 다른 보조제를 함유할 수 있다. 이어 유리 앰플을 밀봉하고 4℃ 및 실온 사이에서 몇 개월동안 저장할 수 있다. 그러나, 다른 요구사항이 없는 한, 상기 앰플은 바람직하게는 -20℃ 미만에서 저장될 수 있다. 예방접종 또는 치료를 위해, 동결건조물은 0.1 내지 0.5ml의 수용액, 바람직하게는 생리 식염수 또는 트리스 완충액에 용해되며 전신적으로 또는 국소적으로, 즉 비경구, 피하, 근육내 또는 당업자에게 공지된 임의의 다른 투여경로에 의해 투여될 수 있다. 투여 형태, 복용량 및 투여횟수는 공지된 방식으로 당업자에 의해 최적화될 수 있다. 그러나 가장 일반적으로, 환자는 첫 번째 백신접종 약 한 달 내지 6주 후에 두 번째 백신접종을 받는다.

일 측면에서, 본 발명은 재조합 백시니아 바이러스를 함유하는 면역 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 재조합 백시니아 바이러스는 면역 치료에 관련된 항원을 암호화하는 외래 유전자는 번식 장애, 암 또한 대사성 질환에 대해 치료적 효과가 있는 질환 관련 유전자를 또한 포함할 수 있다. 예를 들면, 암과 관련하여 치료에 관련된 유전자는 특이적 항암 면역 반응을 유도하는 능력이 있는 암 항원일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 약학적 조성물의 치료적으로 유효한 양은 여러 요소, 예를 들면 투여방법, 목적부위, 개체의 상태 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 인체에 사용 시 투여량은 안전성 및 효율성을 함께 고려하여 적정량으로 결정되어야 한다. 동물실험을 통해 결정한 유효량으로부터 인간에 사용되는 양을 추정하는 것도 가능하다. 유효한 양의 결정시 고려할 이러한 사항은, 예를 들면 Hardman and Limbird, eds., Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 10th ed.(2001), Pergamon Press; 및 E.W. Martin ed., Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed.(1990), Mack Publishing Co.에 기술되어있다.

본 발명의 약학적 조성물은 또한 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 둘 이상의 이들의 조합을 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 조성물을 생체 내 전달에 적합한 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc. 에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로스 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 이용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주이용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(Mack Publishing Company, Easton PA, 18th, 1990)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 약제학적으로 허용 가능한 첨가제는 상기 조성물에 대해 0.1 중량부 내지 90 중량부 포함되는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 비 경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 투여량은 개체의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명에 따른 조성물의 일일 투여량은 0.0001 ~ 10 ㎎/㎖이며, 바람직하게는 0.0001 ~ 5 ㎎/㎖이며, 하루 일 회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

일 측면에서, 서열번호 1의 플라스미드 전달벡터를 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103에 상동성 재조합을 통해 삽입하는 것을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 제작 방법에 관한 것이다.

일 구현예에서, 상기 플라스미드 전달벡터는 백시니아 바이러스의 tk(thymidine kinase) 유전자 내부에 SfiⅠ 제한효소절단위치(restriction site)를 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 플라스미드 전달벡터는 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103의 tk 유전자 부위로 삽입될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 상기 플라스미드 전달벡터의 tk 유전자 내부의 두 SfiⅠ 제한효소절단위치 사이에 외래 유전자를 도입한 후 상동성 재조합에 의해 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103의 tk 유전자 내부로 외래 유전자를 도입하였다.

일 구현예에서, 상기 플라스미드 전달벡터는 외래 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은

a) 제 1항의 백시니아 바이러스 KVAC103를 세포에 감염시키는 단계;

b) 서열번호 1의 플라스미드 전달벡터에 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 단계;

c) 단계 b)의 플라스미드 전달벡터를 단계 a)의 세포에 트랜스펙션하는 단계;

d) 상동성 재조합에 의해 GFP가 삽입된 백시니아 바이러스를 선별하는 단계를 포함하는 복제 및 증식이 향상된 재조합 약독화 백시니아 바이러스 제작 방법에 관한 것이다. 본 발명의 일 실시예에서, 상기 유전자를 삽입한 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103은 바이러스에 도입한 외래 항원의 발현율이 증가되는 효과가 있음을 확인하였다.

일 구현예에서, 상기 단계 b)의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 플라스미드 전달벡터의 tk 유전자 내의 두 SfiⅠ 제한효소절단위치 사이 이외의 위치에 삽입할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 셔틀 플라스미드 ( pVVT1 - EGFP ) 제작

백시니아 바이러스 주 KVAC103 (KCCM11574P)의 유전체 게놈을 정제한 뒤 이를 주형으로 하여 high fidelity Phusion DNA 중합효소 (NEB)와 TK-F (서열번호 4) 및 (서열번호 5) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과물을 1% 아가로오스 젤(low gelling temperature, LGT) (Seaplaque Agarose; Cambrex #50100)에 전기영동한 뒤 분리함으로써 백시니아 바이러스의 tk(thymidine kinase) 유전자 (J2R)의 양끝이 잘린 DNA 단편 (1.7 kb)을 생성하였다. 또한, pBacPAK8 (Clontech) 플라스미드를 주형으로 하고 BP-F (서열번호 6) 및 BP-R (서열번호 7) 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 결과물을 상기와 같은 방법으로 분리함으로써 엠피실린 저항성 유전자 및 복제 원점을 포함하고 있는 2.7 kb의 DNA 단편을 얻었다. 상기 두 DNA 단편을 Cold-fusion 클로닝 키트 (System Biosciences)를 이용하여 제조사의 안내에 따라 조립하고 전체 서열을 확인하였다. 이를 통해 제조된 플라스미드를 pVVT0라고 명명하였다. early-to-late 프로모터 (pETL) 서열 (서열번호 8) (Chakrabarti et al.,1997), MCS(multiple cloning site) 서열 (ApaⅠ, RsrⅡ, SfiⅠ, BamHⅠ, XhoⅠ 및 EcoRⅠ 제한효소절단위치 포함) 및 EGFP(enhanced green fluorescent protein) 서열을 포함하는 뉴클레오티드 857 bp (도 1)를 합성 (바이오니아, 한국)한 뒤 pGEM-T easy vector에 삽입하였다. 상기 pGEM-T easy vector를 상기 pVVT0 플라스미드의 ClaⅠ/EcoRⅠ 제한효소절단위치 (도 1 참조)에 서브클로닝함으로써 서틀 플라스미드인 pVVT1-EGFP가 제조되었으며, 이의 염기서열을 확인하여 서열번호 1로 기재하였다 (도 2).

프라이머 명	프라이머 서열 (5'->3')	서열번호
TK-F	GCC GAT TCA TTA AGC TTT TGC GAT CAA TAA ATG GA	4
TK-R	GGA GAA AAT ACC GGT ATA AAT ACT TAA TAA TCT C	5
BP-F	AGT ATT TAT ACC GGT ATT TTC TCC TTA CGC ATC T	6
BP-R	TAT TGA TCG CAA AAG CTT AAT GAA TCG GCC AAC G	7
pETL	TAA AAA TTG AAA TTT TAT TTT TTT TTT TTG GAA TAT AAA TAA	8

실시예 2. 재조합 약독화 백시니아 바이러스 주 ( KVAC103 - GFP ) 제작

KVAC103 배양 조건 최적화

왼쪽에 19.57kb [C9L-F3L] 및 오른쪽에 2.57kb [A25L-A26L]의 결실 부위를 가지는 약독화된 KVAC103을 이용하여 GFP-양성 재조합 바이러스 주를 제작하려 하였으나, 바이러스가 증식하지 않았다. 이에, KVAC103으로 감염된 Vero 세포 (ATCC CCL781)를 다양한 배양 배지 및 혈청 농도에서 증식 정도를 확인함으로써 최적 배양 조건을 결정하고자 하였다. 구체적으로, Vero 세포들을 12 웰 플레이트에 분주한 뒤 FBS (Gibco #16000)가 1% 첨가된 DMEM (Gendepot #CM0027050), Advanced-DMEM (Gibco #12491), OptiMEMI (Gibco #31985), VP-SFM (Gibco #11681) 또는 OptiPro-SFM (Gibco #2309) 배양 배지로 24시간 동안 배양하였다. 그 후 세포들을 100 PFU/웰 역가의 KVAC103으로 2시간 동안 감염시켰다. 그 뒤에 각각의 배지들을 FBS가 0%, 1%, 2% 또는 5% 첨가된 동일한 배지로 바꾸고 3일 동안 배양하였다. 바이러스 용균반은 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하여 확인하였다. 그 결과, FBS를 1% 첨가한 OptiMEMI 배지에서 용균반이 가장 선명하고 컸다. 이 배양 조건에서는, 단일 KVAC103 용균반조차 큰 스캐일의 바이러스 스탁을 만들기 위해 증폭될 수 있다. 따라서, 상기 조건이 KVAC103의 복제 및 재조합 바이러스의 생산을 위한 최적 조건이다.

KVAC103 확인

재조합 바이러스 생산을 위해 사용되는 바이러스 주 KVAC103은 배양하기 어렵기 때문에 바이러스 스탁을 확인하는 방법이 필요하다. 이에, DNA 서열을 PCR로 증폭하고 결실된 부위를 시퀀싱하여 확인함으로써 KVAC103을 동정할 수 있다. KVAC103의 19.5 kb-결실 부위를 15F (서열번호 9) 및 35R (서열번호 10) 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였으며 2.5 kb-결실 부위는 140F (서열번호 11) 및 143R (서열번호 12) 프라이머 쌍을 이용하여 증폭하였다. 증폭 산물을 아가로오스 젤을 이용하여 분리한 뒤 이의 서열을 확인함으로써 KVAC103을 확인하였다 (도 3). 또한, 야생형 백시니아 바이러스 DNA는 15F (서열번호 9) 및 16R (서열번호 13) 프라이머 쌍을 이용한 PCR 증폭을 통해 확인된다.

증폭 부위	프라이머 명	프라이머 서열 (5'->3')	서열번호
19.5 kb-결실 부위	15F	AGG AAC AGG ATC ATT GTC ATT ACA	9
	35R	TGA ACT AAA TGT TCC AGA TGA GGA	10
2.5 kb-결실 부위	140F	AGT TCT GCA TTC AAT TCG GTG AGT	11
	143R	AAT TGT ACC AAC GGT TCA AGA TGT	12
야생형 백시니아 바이러스 DNA	15F	AGG AAC AGG ATC ATT GTC ATT ACA	9
	16R	TCG TTT ATC AAC ACT ACC GTT AGA	13

재조합 KVAC - GFP 제작

최적화된 배양 조건에서 Vero 세포에서의 KVAC103의 증식이 가능해졌으므로 KVAC103을 이용하여 재조합 바이러스 주를 제작하고자 하였다. 일반적으로, 백시니아 바이러스 Lister 및 다른 바이러스 주의 게놈에는 SfiⅠ 제한효소절단위치가 없다. 이에 SfiⅠ 제한효소절단위치를 가지는 상기 실시예 1.의 셔틀 플라스미드 pVVT1-EGFP를 이용하여 KVAC103의 티미딘 인산화효소 (tk) 위치에 두 개의 SfiⅠ 제한효소절단위치 (SfiⅠ(A) 및 SfiⅠ(B))를 도입하고자 종래의 상동재조합 방법 (Kan et al., 2012)을 조금 변형하였다. 구체적으로, Vero 세포들을 0.01 MOI의 KVAC103으로 감염시킨 뒤, pVVT1-EGFP 플라스미드를 트랜스펙션하였다. 그 후 FBS를 1% 첨가한 OptiMEMI 배지에서 6일 동안 배양하였다. 그 후, Vero 세포를 희석한 바이러스로 재-감염시키고 1% 아가로오스 함유 배지로 덮어주었다. 용균반 선별을 3 사이클 수행한 뒤 GFP-양성 재조합 바이러스 주 KVAC103을 얻어, 이를 KVAC-GFP 바이러스라고 명명하였다. KVAC103에 감염된 Vero 세포는 세포 용해가 지연되거나 세포용해가 없는 특성을 보이므로 바이러스 감염을 관찰하기가 힘들기 때문에 GFP 양성 재조합 바이러스 주를 이용하여 바이러스의 감염 및 전파를 쉽게 관찰할 수 있다.

실시예 3. 결실부위 유전자가 구제된 재조합 약독화 백시니아 바이러스 주 제작

백시니아 바이러스의 복제와 관련된 유전자 부위가 있는 것으로 예상되는 KVAC103의 19.57kb 결실 부위 중에서 바이러스의 복제에 최소한으로 필요한 유전자만을 구제하고자 하였다. 구체적으로, KVAC103의 19.5 kb-결실 부위를 각각 약 5kb 사이즈의 5 내지 7개의 ORF를 함유하는 네 부위 (d1, d2, d3 및 d4)로 다시 나눴다 (도 4). 각각의 부위를 PCR로 증폭하기 위하여 Lister 바이러스 주(Lancy-Vaxina smallpox vaccine) (Berna Biotech, Switzerland, Lot. #15-501)로부터 정제된 유전체 DNA를 야생형 주형으로 사용하였으며, 하기 표 3의 프라이머 쌍을 이용하여 하기 표 3의 조건으로 PCR을 수행하였다: 95 ℃에서 30 초; 45 ℃에서 30 초; 및 72 ℃에서 6 분의 조건으로 5 사이클, 그 후, 95 ℃에서 30 초; 55 ℃에서 30 초; 및 72 ℃에서 6 분. 증폭된 DNA 단편은 아가로오스 젤로 정제하였으며 EZ-Cloning kit (Enzynomics, Korea)를 이용하여 pVVT1-EGFP 플라스미드의 XhoⅠ 제한효소절단위치 (도 1 참조)에 서브클로닝하였다. 상기 PCR 수행에서 돌연변이 문제를 피하기 위해 high-fidelity Phusion DNA 중합효소 (NEB)를 사용하였으며 각각 독립적으로 선택한 두 개 이상의 클론을 사용하였다. 각각의 d1, d2, d3 및 d4를 포함하는 각각의 플라스미드 2 ug를 2 ul Lipofectamine2000을 이용하여 KVAC103-감염 Vero 세포에 OptiMEMI으로 4시간 동안 트랜스펙션하였다. 그 후 2% FBS가 첨가된 DMEM 배지에서 6일 동안 배양하였다. 트랜스펙션한지 6일 후에 5X 형광 현미경 IX71 (Olympus, Tokyo) 및 디지털 이미징 기기 DP72 (Olympus, Tokyo)를 이용하여 GFP-양성 재조합 바이러스의 용균반을 선별하였다. Vero 세포들을 상기에서 선별한 바이러스 스탁들로 재감염시켰으며 배양 3일 후에 용균반의 형광 이미지를 확인하였으며 용균반을 크리스탈 바이올렛 용액 (0.15% crystal violet, 8% formaldehyde 및 5% ethanol in distilled water)으로 상온에서 5분 동안 염색하여 재조합 바이러스의 복제 및 증식을 확인하였다. 그 결과, d1를 트렌스펙션한 웰 및 d3를 트랜스펙션한 웰에서 GFP-양성 바이러스의 용균반이 발견되었다. 또한, 재감염시킨 세포에서 GFP-양성 용균반이 거의 100%로 발견되었다 (도 5).

증폭 부위	프라이머 명	프라이머 서열 (5'->3')	서열번호
d1 (4,496 bp)	C10L-15188F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTAATGGGGTAGCTGTCTCCAA	14
	C5L-19671R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGCCTAGACACTTTGATAACTAG	15
d2 (4,819 bp)	C5L-19671F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGCTAGTTATCAAAGTGTCTAGG	16
	N1L-24489R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGGATCTATATGGTGAAAAATAA	17
d3 (5,792 bp)	N1L-24489F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTATTTTTCACCATATAGATC	18
	K4L-30282R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGCCTGAATATTCTCTTGAATAA	19
d4 (3,881 bp)	K4L-30282F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTATTCAAGAGAATATTCAGG	20
	F3L-34177R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGTGGAATATATGGGATGGTAAATAA	21

이에, d1 부위 및 d3 부위 내의 단일 ORF 클론을 제작하기 위하여 하기 표 4의 프라이머쌍을 이용하여 상기와 동일한 조건으로 PCR을 수행하였다. 그 후 PCR 증폭 결과물을 pVVT1-EGFP 플라스미드의 XhoⅠ 제한효소절단위치에 서브클로닝하였다.

증폭 부위	프라이머 명	프라이머 서열 (5'->3')	서열번호
ORF1 (319 bp)	C10L-15188F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTAATGGGGTAGCTGTCTCCAA	14
	15338R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGTCTGGAACTGGTAAAATTTAA	22
ORF2 (352 bp)	15338F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTAAATTTTACCAGTTCCAGA	23
	C9L-15690R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGTTCTCGTACGCGTTCCTATAA	24
ORF3 (C9L, 1,947 bp)	C9L-15690F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTATAGGAACGCGTACGAGAA	25
	C8L-17637R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGGCTAAATCCATACATAACTGA	26
ORF4 (C8L, 605 bp)	C8L-17637F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTCAGTTATGTATGGATTTAGC	27
	C7L-18242R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGGATTATGAGTCCATGGATTAA	28
ORF5 (C7L, 681 bp)	C7L-18242F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTAATCCATGGACTCATAATC	29
	C6L-18923R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGCGTGATGATGTAGATAGATAA	30
ORF6 (C6L, 591 bp)	C6L-18923F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTATCTATCTACATCATCACG	31
	C5L-19671R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGCCTAGACACTTTGATAACTAG	15
ORF12 (N1L, 401 bp)	N1L-24489F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTATTTTTCACCATATAGATC	18
	N2L-24890R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGGTGGAAACTAAGTATTTCTAA	32
ORF13 (N2L, 486 bp)	N2L-24890F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTAGAAATACTTAGTTTCCAC	33
	M1L-26966R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGGTATTCGATGATTATTTTTAA	34
ORF14 (M1L, 1,569 bp)	M1L-25376F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTAAAAATAATCATCGAATAC	35
	M2L-26945R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGTGGATCATGTGTGACATGTGT	36
ORF15 (M2L, 797 bp)	M2L-26766F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTACTCTCTATAACAAATATC	37
	K1L-27563F	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGGTCAATTGTGTAAAGAAAAACTAA	38
ORF16 (K1L, 1,067 bp)	K1L-27563F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGTTAGTTTTTCTTTACACAATTGAC	39
	K2L-28630R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGGAATCTCCTTAATATGGGTAC	40
ORF17 (K2L, 1,168 bp)	K2L-28630F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGGTACCCATATTAAGGAGATTC	41
	K3L-29798R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGGATGTGTAGACATCAATAATT	42
ORF18 (K3L, 484 bp)	K3L-29798F	AGAATTCTTAATTAACTCGAGAATTATTGATGTCTACACATC	43
	K4L-30282R	CGGGCCCTGCAGGCCCTCGAGCCTGAATATTCTCTTGAATAA	19

그 결과, KVAC103의 결실 부위에서 ORF5 및 ORF16을 구제한 클론이 GFP-양성 재조합 바이러스를 생산했다 (도 6). 또한, 상기 ORF5 및 ORF16 클론의 전체 서열을 시퀀싱을 통해 확인하였다. 그 결과, ORF5의 150 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 백시니아 바이러스의 C7L 유전자 서열 (서열번호 2)과 정확히 일치했으며 (도 7), ORF16의 284 아미노산을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 K1L 유전자 서열 (서열번호 3)과 일치했다 (도 8). C7L-구제 바이러스의 용균반을 정제하였으며, 이를 KVAC-GFP-C7L 바이러스라고 명명하였다. 아울러, K1L-구제 바이러스의 용균반을 정제하고 이를 KVAC-GFP-K1L 바이러스라고 명명하였다.

실시예 4. 재조합 야생형 백시니아 바이러스 제작

Vero 세포를 12-웰 플레이트에 분주한 뒤 야생형 백시니아 바이러스인 Lister 바이러스 주 0.02 MOI(multiplicity of infection)로 2 시간 동안 감염시켰다. 배지를 제거한 뒤 무혈청 OptiMEMI 0.5 ml을 첨가하였다. 세포들을 pVVT1-EGFP 1.6 ug 및 Lipofectamine2000 (Gibco) 4 ul로 4 시간 동안 형질전환시킨 뒤 배지를 2% FBS가 첨가된 DMEM으로 교체하였다. 그 후 세포들을 5일 동안 배양하였다. 아가로오스에 자란 용균반을 0.06% 뉴트랄 레드 용액 (in PBS)으로 4시간 동안 염색한 뒤 widebore 팁 (Molecular BioProduct #2069G)으로 두 사이클 선별하여 GFP-양성 재조합 바이러스 용균반(viral plaques)을 얻었다. 그 결과, Lister를 이용한 재조합 백시니아 바이러스가 제작되었고 이를 Lister-GFP바이러스로 명명하였다.

[실험예]

실험예 1. 재조합 바이러스 역가 측정 및 숙주 범위 확인

재조합 백시니아 바이러스 KVAC-GFP, KVAC-GFP-C7L, KVAC-GFP-K1L 및 Lister-GFP의 역가를 확인하기 위하여, Vero 세포를 2% FBS가 첨가된 OptiMEMI (Gibco)에서 적응시킨 뒤, Vero 세포가 4x10⁵ cell/ml로 들어있는 2% FBS가 첨가된 OptiMEMI을 1ml씩 12-웰 플레이트의 각각의 웰에 분주하였다. 분주 16 내지 26 시간 뒤에, 세포들을 10배 희석한 상기 백시니아 바이러스 주 100 ul로 각각 2시간 동안 감염시켰다. 배지를 1% FBS가 함유된 OptiMEMI로 교체하고 3일 동안 배양하였다. 바이러스 용균반은 크리스탈 바이올렛 염색 용액으로 상온에서 5분 동안 염색하여 역가를 측정하였다. 또한, C7L 및 K1L 유전자는 숙주영역(host range) 유전자로 알려져 있으므로, 구제된 바이러스의 증식 및 복제를 다양한 포유동물 세포에서 확인하였다. 재조합 백시니아 바이러스 주 KVAC-GFP, KVAC-GFP-C7L, KVAC-GFP-K1L 및 Lister-GFP의 숙주 범위를 확인하기 위하여, 포유동물 세포주인 143B (ATCC CRL-8303), Vero, BSC-40 (ATCC CRL-2761), MA-104 (ATCC CRL-2378) 및 RK-13 (ATCC CCL-37)에 감염시켰다. 구체적으로, 143B, Vero, BSC-40, MA-104 및 RK-13를 12 웰 플레이트에 각각 분주한 뒤, 0.01 MOI의 KVAC-GFP, KVAC-GFP-C7L, KVAC-GFP-K1L 또는 Lister-GFP로 각각 감염시켰다. 감염 48시간 후, GFP 양성 용균반의 크기를 5X 도립 형광현미경 IX72로 확인하였다. 바이러스 역가는 감염 3일 후(days post-infection, DPI) Vero 세포에서 배양되고 염색된 바이러스 용균반을 계수하여 측정되었으며 바이러스 복제는 바이러스 역가의 증가 배수로 측정되었다. 바이러스로 감염된 Vero, BSC-40, MA-104 및 RK-13 세포에서의 바이러스 전파를 GFP로 확인한 결과는 도 9에, 복제 정도를 확인한 결과는 표 5에 나타냈다. KVAC-GFP는 오직 낮은 혈청 농도의 MA-104 및 Vero 세포에서만 증식할 수 있었다. 그러나, C7L-구제 바이러스는 다섯 가지 세포주 중 네 가지 세포주에서 복제가 가능하였다. 또한, K1L-구제 바이러스도 네 가지 세포주에서 복제가 가능하였다. 따라서, C7L 또는 K1L 유전자가 구제된 바이러스는 숙주 범위가 확장되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 2. 재조합 바이러스의 증식 정도 측정

재조합 바이러스 주 KVAC-GFP, KVAC-GFP-C7L, KVAC-GFP-K1L 및 Lister-GFP의 GFP 발현 정도를 비교하고자 하였다. 구체적으로, Vero 세포를 1% FBS를 함유하는 OptiMEMI 배지에 분주한 뒤 0.1 MOI의 각각의 재조합 바이러스 주로 감염시키고 3일 동안 배양하였다. 세포의 형광 강도는 멀티-웰 플레이트 리더기 SpectraMax M5 (Molecular Device) (excitation wavelength: 480 nm, emission wavelength: 509 nm 및 cutoff wavelength: 495 nm)로 측정되었다. 그 결과, C7L 또는 K1L가 구제된 바이러스의 GFP 발현 정도가 KVAC-GFP에 비해 향상되었다. 특히, C7L-구제 바이러스 (KVAC-GFP-C7L)가 KVAC-GFP 보다 GFP의 강도가 약 10배 증가하였다 (도 10). 이와 같은 결과는 재조합 백신 개발에 있어 매우 중요하다. 항원 유전자들을 GFP 유전자 위치에 삽입한다면 종래에 비해 발현이 10배 증가할 것이고 이는 매우 강력한 면역 반응을 유발할 것이기 때문이다.

실험예 3. C7L - 및 K1L -구제 바이러스의 인터페론 감수성

C7L 및 K1L은 인터페론 길항제 기능을 하는 것으로 알려져 있었다 (Gillard et al.,1985 and 1986; Perkus et al., 1989 and 1990; Meng et al., 2009 and 2012; reviewed by Werden et al., 2008). 이에, KVAC103-유래 재조합 바이러스들 (KVAC-GFP, KVAC-GFP-C7L 및 KVAC-GFP-K1L) 및 Lister-GFP의 인터페론 감수성을 조사함으로써 C7L 및 K1L의 기능적 효과를 확인하고자 하였다. 구체적으로, Vero 세포를 각각의 상기의 재조합 바이러스들 0.005 MOI로 감염시켰으며, 배지를 0, 20, 200 또는 2000 units/ml 인터페론-베타1a(INF1a) (Gibco #PHC4244)가 첨가된 배지로 교체하였다. 바이러스의 전파 정도는 GFP 발현 마커를 이용하여 관찰되었다. 그 결과, 상기 네 재조합 바이러스 주가 서로 다른 인터페론 감수성을 가졌다 (도 11). KVAC-GFP가 최소 농도의 인터페론에 의해 복제가 완전히 차단되어 가장 민감함을 알 수 있었다. 또한, C7L 또는 K1L이 구제된 바이러스 주는 KVAC103에 비해 인터페론 감수성이 낮았으므로 C7L 또는 K1L 유전자의 구제로 인해 인터페론-저항성 표현형을 획득한 것으로 보인다. 이에 따른 인터페론-감수성은 KVAC-GFP < KVAC-GFP-C7L, KVAC-GFP-K1L < Lister-GFP였다.

실험예 4. 동물 피부 독성 실험

8주령 암컷 뉴질랜드 흰 토끼 (무게 ~2kg)를 이용하여 재조합 바이러스들의 피부 독성을 확인하였다. 구체적으로 토끼 피부를 면도한 뒤 KVAC-GFP, KVAC-GFP-C7L 및 KVAC-GFP-K1L를 각각 30 ul (1×10⁶ PFU/ ml)씩 난절법(scarification)으로 감염시켰다. 감염된 피부 부위를 2주 동안 매일 관찰하였으며 중증도 및 감염 부위의 크기가 기록되었다. 그 결과, Lister-GFP로 감염된 부위가 가장 중증 및 만성적이었으며, 그 다음이 KVAC-GFP-K1L으로 나타났다. KVAC-GFP-C7L 또는 KVAC-GFP로 감염된 부위가 가장 경증이었고 더 빠르게 회복되었다. 이를 통해, KVAC103 주에서 C7L 또는 K1L를 구제한 재조합 백시니아 바이러스 주가 종래의 Lister 바이러스보다 독성이 낮음을 알 수 있었다 (도 12).

실험예 5. 재조합 약독화 백시니아 바이러스를 이용한 백신 개발

본 발명의 재조합 약독화 백시니아 바이러스를 이용하여 백신을 개발하기 위하여 도 13과 같은 과정으로 재조합 백시니아 바이러스를 생산하고 이의 면역유발 효과를 확인하였다. 구체적으로 원하는 항원 유전자를 SfiⅠ 절단 효소를 이용하여 pVVT1-EGFP-C7L 벡터에 삽입한 뒤 KVAC103으로 감염된 Vero 세포에 트랜스펙션하였다. 그 후 세포를 5% 혈청-첨가된 배지에서 배양한 뒤 마우스에서 면역 유발 효과를 확인하였다.

야생형 백시니아 균주인 Lister보다 약독화된 바이러스 주 KVAC103의 증식 및 복제가 어려운 단점이 있었으나, 결실된 유전자 중에 C7L 또는 K1L 유전자를 구제한 재조합 약독화 바이러스 주는 더 다양한 숙주에서 증식 및 복제가 향상되었으며 독성은 원래의 약독화 KVAC103와 유사하였다. 따라서, 본 발명의 재조합 약독화 바이러스 주들을 외래 항원을 발현 및 전달하기 위한 바이러스 벡터(viral vector)로 이용할 수 있으며, 독성이 적어 다른 감염성 질병을 일으키는 균주 또는 바이러스의 항원을 도입하여 이를 감염성 질병의 예방용 백신으로 이용할 수 있고, 면역 치료에 관련된 항원을 암호화하는 외래 유전자의 발현을 통한 면역 치료용 백신으로 사용할 수 있다.

<110> Korea Center for Disease Control and Prevention <120> RECOMBINANT VACCINIA VIRUS DERIVED FROM KVAC 103 STRAIN <130> 53133 <160> 43 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 5311 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pVVT1-EGFP plasmid <400> 1 agcttttgcg atcaataaat ggatcacaac cagtatctct taacgatgtt cttcgcagat 60 gatgattcat tttttaagta tttggctagt caagatgatg aatcttcatt atctgatata 120 ttgcaaatca ctcaatatct agactttctg ttattattat tgatccaatc aaaaaataaa 180 ttagaagccg tgggtcattg ttatgaatct ctttcagagg aatacagaca attgacaaaa 240 ttcacagact ctcaagattt taaaaaactg tttaacaagg tccctattgt tacagatgga 300 agggtcaaac ttaataaagg atatttgttc gactttgtga ttagtttgat gcgattcaaa 360 aaagaatcct ctctagctac caccgcaata gatcctatta gatacataga tcctcgtcgt 420 gatatcgcat tttctaacgt gatggatata ttaaagtcga ataaagtgaa caataattaa 480 ttctttattg tcatcatgaa cggcggacat attcagttga taatcggccc catgttttca 540 ggtaaaagta cagaattaat tagacgagtt agacgttatc aaatagctca atataaatgc 600 gtgactataa aatattctaa cgataataga tacggaacgg gactatggac gcatgataag 660 aataattttg aagcattgga agcaactaaa ctatgcgatg tcttggaatc aattacagat 720 ttctccgtga taggtatcga ttaaaaattg aaattttatt tttttttttt ggaatataaa 780 taaggatcct aggccaccat ggccggaccg ggcccagcga tcgcaatggt gagcaagggc 840 gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc 900 cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg 960 aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg 1020 acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc 1080 aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc 1140 aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag 1200 ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac 1260 tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac 1320 ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag 1380 aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag 1440 tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg 1500 accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca agtaagcgat cgcggtccgg 1560 gccctgcagg ccctcgagtt aattaagaat tctgtgagcg tatggcaaac gaaggaaaaa 1620 tagttatagt agccgcactc gatgggacat ttcaacgtaa accgtttaat aatattttga 1680 atcttattcc attatctgaa atggtggtaa aactaactgc tgtgtgtatg aaatgcttta 1740 aggaggcttc cttttctaaa cgattgggtg aggaaaccga gatagaaata ataggaggta 1800 atgatatgta tcaatcggtg tgtagaaagt gttacatcga ctcataatat tatatttttt 1860 atctaaaaaa ctaaaaataa acattgatta aattttaata taatacttaa aaatggatgt 1920 tgtgtcgtta gataaaccgt ttatgtattt tgaggaaatt gataatgagt tagattacga 1980 accagaaagt gcaaatgagg tcgcaaaaaa actaccgtat caaggacagt taaaactatt 2040 actaggagaa ttattttttc ttagtaagtt acagcgacac ggtatattag atggtgccac 2100 cgtagtgtat ataggatcgg ctcctggtac acatatacgt tatttgagag atcatttcta 2160 taatttagga gtgatcatca aatggatgct aattgacggc cgccatcatg atcctattct 2220 aaatggattg cgtgatgtga ctctagtgac tcggttcgtt gatgaggaat atctacgatc 2280 catcaaaaaa caactgcatc cttctaagat tattttaatt tctgatgtga gatccaaacg 2340 aggaggaaat gaacctagta cggcggattt actaagtaat tacgctctac aaaatgtcat 2400 gattagtatt ttaaaccccg tggcgtctag tcttaaatgg agatgcccgt ttccagatca 2460 atggatcaag gacttttata tcccacacgg taataaaatg ttacaacctt ttgctccttc 2520 atattcagct gaaatgagat tattaagtat ttataccggt attttctcct tacgcatctg 2580 tgcggtattt cacaccgcat acgtcaaagc aaccatagta cgcgccctgt agcggcgcat 2640 taagcgcggc gggtgtggtg gttacgcgca gcgtgaccgc tacacttgcc agcgccctag 2700 cgcccgctcc tttcgctttc ttcccttcct ttctcgccac gttcgccggc tttccccgtc 2760 aagctctaaa tcgggggctc cctttagggt tccgatttag tgctttacgg cacctcgacc 2820 ccaaaaaact tgatttgggt gatggttcac gtagtgggcc atcgccctga tagacggttt 2880 ttcgcccttt gacgttggag tccacgttct ttaatagtgg actcttgttc caaactggaa 2940 caacactcaa ccctatctcg ggctattctt ttgatttata agggattttg ccgatttcgg 3000 cctattggtt aaaaaatgag ctgatttaac aaaaatttaa cgcgaatttt aacaaaatat 3060 taacgtttac aattttatgg tgcactctca gtacaatctg ctctgatgcc gcatagttaa 3120 gccagccccg acacccgcca acacccgctg acgcgccctg acgggcttgt ctgctcccgg 3180 catccgctta cagacaagct gtgaccgtct ccgggagctg catgtgtcag aggttttcac 3240 cgtcatcacc gaaacgcgcg agacgaaagg gcctcgtgat acgcctattt ttataggtta 3300 atgtcatgat aataatggtt tcttagacgt caggtggcac ttttcgggga aatgtgcgcg 3360 gaacccctat ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat 3420 aaccctgata aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc 3480 gtgtcgccct tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa 3540 cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac 3600 tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga 3660 tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac gccgggcaag 3720 agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca 3780 cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca 3840 tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa 3900 ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc 3960 tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca atggcaacaa 4020 cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag 4080 actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct 4140 ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac 4200 tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg agtcaggcaa 4260 ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt aagcattggt 4320 aactgtcaga ccaagtttac tcatatatac tttagattga tttaaaactt catttttaat 4380 ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat gaccaaaatc ccttaacgtg 4440 agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct tcttgagatc 4500 ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta ccagcggtgg 4560 tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc ttcagcagag 4620 cgcagatacc aaatactgtt cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac ttcaagaact 4680 ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct gctgccagtg 4740 gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat aaggcgcagc 4800 ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg acctacaccg 4860 aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa gggagaaagg 4920 cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggaga gcgcacgagg gagcttccag 4980 ggggaaacgc ctggtatctt tatagtcctg tcgggtttcg ccacctctga cttgagcgtc 5040 gatttttgtg atgctcgtca ggggggcgga gcctatggaa aaacgccagc aacgcggcct 5100 ttttacggtt cctggccttt tgctggcctt ttgctcacat gttctttcct gcgttatccc 5160 ctgattctgt ggataaccgt attaccgcct ttgagtgagc tgataccgct cgccgcagcc 5220 gaacgaccga gcgcagcgag tcagtgagcg aggaagcgga agagcgccca atacgcaaac 5280 cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt a 5311 <210> 2 <211> 714 <212> DNA <213> Vaccinia virus Lister <400> 2 ctcgagcgtg atgatgtaga tagataattt tttttcctaa actgatttct ctgtttaaat 60 tcgtagcgat atatataaaa caacatgtaa ttaattaata aactttaaga catgtgtggt 120 atactaagat ggttggctta ttccatagta gcttgtggaa tttataaact tatgatagta 180 aaactagtac ccaatatgta aagatgaaaa agtaaattac tattaacgcc gtcggtattc 240 gttcatccat tcagtatggg tatacagcac gaattcgaca tcattattaa tggagatatc 300 gcgttgagaa atttacagtt acataaaggg gataactacg gatgcaaact aaaaattatt 360 tcgaatgatt acaagaaatt aaagtttaga ttcattatac gcccagattg gtcggaaatc 420 gacgaggtca aaggattaac cgtatttgca aacaactatg cggtgaaagt taataaggta 480 gatgacacgt tctattacgt aatatatgag gctgtaatac atctgtataa caaaaaaaca 540 gagatattga tttattctga tgatgagaac gagctcttca aacactatta cccatacatc 600 agtctaaata tgattagtaa aaagtataaa gttaaagaag agaactactc atccccgtat 660 atagaacatc cgttaatccc gtatagagat tatgagtcca tggattaact cgag 714 <210> 3 <211> 1100 <212> DNA <213> Vaccinia virus Lister <400> 3 ctcgaggaat ctccttaata tgggtacggt gtaaggaatc attattttat ttatattgat 60 gggtacgtga aatctgaatt ttcttaataa atattatttt tattaaatgt gtatatgttg 120 ttttgcgata gccatgtatc tactaatcag atctattaga gatattatta attctggtgc 180 aatatgacaa aattataaaa aatgaaaaaa tatacactaa ttagcgtctc gtttcagaca 240 tggatctgtc acgaattaat acttggaagt ctaagcagct gaaaagcttt ctctctagta 300 aagatacatt taaggcggat gtccatggac atagtgcctt gtattatgca atagctgata 360 ataacgtgcg tctagtatgt acgttgttga acgctggagc attgaaaaat cttctagaga 420 atgaatttcc attacatcag gcagccacat tggaagatac caaaatagta aagattttgc 480 tattcagtgg actggatgat tcacaatttg atgacaaggg aaacactgca ttgtattatg 540 cggttgatag tggtaacatg caaacggtaa aactgtttgt taagaaaaat tggagactga 600 tgttctatgg gaaaactgga tggaaaactt cattttatca tgccgtcatg cttaatgatg 660 taagtattgt ttcctacttt ctttcagaga taccatctac ttttgatctg gctattctcc 720 ttagttgtat tcacatcact ataaaaaatg gacacgtgga tatgatgatt ctcttgctcg 780 actatatgac gtcgacaaac accaataatt cccttctctt cattccggac attaaattgg 840 ctatagataa taaagacatt gagatgttac aggctctgtt caaatacgac attaatatct 900 attctgctaa tctggaaaat gtactattgg atgatgccga aatagctaaa atgattatag 960 aaaagcatgt tgaatacaag tctaactcct atacaaaaga tctcgatatc gtcaagaata 1020 ataaattgga tgaaataatt agcaaaaaca aggaactcag actcatgtac gtcaattgtg 1080 taaagaaaaa ctaactcgag 1100 <210> 4 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK-F primer <400> 4 gccgattcat taagcttttg cgatcaataa atgga 35 <210> 5 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TK-R primer <400> 5 ggagaaaata ccggtataaa tacttaataa tctc 34 <210> 6 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BP-F primer <400> 6 agtatttata ccggtatttt ctccttacgc atct 34 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BP-R primer <400> 7 tattgatcgc aaaagcttaa tgaatcggcc aacg 34 <210> 8 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pETL promoter <400> 8 taaaaattga aattttattt tttttttttg gaatataaat aa 42 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15F primer <400> 9 aggaacagga tcattgtcat taca 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 35R primer <400> 10 tgaactaaat gttccagatg agga 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 140F primer <400> 11 agttctgcat tcaattcggt gagt 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 143R primer <400> 12 aattgtacca acggttcaag atgt 24 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16R primer <400> 13 tcgtttatca acactaccgt taga 24 <210> 14 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C10L-15188F primer <400> 14 agaattctta attaactcga gtaatggggt agctgtctcc aa 42 <210> 15 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5L-19671R primer <400> 15 cgggccctgc aggccctcga gcctagacac tttgataact ag 42 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5L-19671F primer <400> 16 agaattctta attaactcga gctagttatc aaagtgtcta gg 42 <210> 17 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N1L-24489R primer <400> 17 cgggccctgc aggccctcga ggatctatat ggtgaaaaat aa 42 <210> 18 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N1L-24489F primer <400> 18 agaattctta attaactcga gttatttttc accatataga tc 42 <210> 19 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K4L-30282R primer <400> 19 cgggccctgc aggccctcga gcctgaatat tctcttgaat aa 42 <210> 20 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K4L-30282F primer <400> 20 agaattctta attaactcga gttattcaag agaatattca gg 42 <210> 21 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3L-34177R primer <400> 21 cgggccctgc aggccctcga gtggaatata tgggatggta aataa 45 <210> 22 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15338R primer <400> 22 cgggccctgc aggccctcga gtctggaact ggtaaaattt aa 42 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 15338F primer <400> 23 agaattctta attaactcga gttaaatttt accagttcca ga 42 <210> 24 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C9L-15690R primer <400> 24 cgggccctgc aggccctcga gttctcgtac gcgttcctat aa 42 <210> 25 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C9L-15690F primer <400> 25 agaattctta attaactcga gttataggaa cgcgtacgag aa 42 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C8L-17637R primer <400> 26 cgggccctgc aggccctcga ggctaaatcc atacataact ga 42 <210> 27 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C8L-17637F primer <400> 27 agaattctta attaactcga gtcagttatg tatggattta gc 42 <210> 28 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7L-18242R primer <400> 28 cgggccctgc aggccctcga ggattatgag tccatggatt aa 42 <210> 29 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C7L-18242F primer <400> 29 agaattctta attaactcga gttaatccat ggactcataa tc 42 <210> 30 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C6L-18923R primer <400> 30 cgggccctgc aggccctcga gcgtgatgat gtagatagat aa 42 <210> 31 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C6L-18923F primer <400> 31 agaattctta attaactcga gttatctatc tacatcatca cg 42 <210> 32 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2L-24890R primer <400> 32 cgggccctgc aggccctcga ggtggaaact aagtatttct aa 42 <210> 33 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> N2L-24890F primer <400> 33 agaattctta attaactcga gttagaaata cttagtttcc ac 42 <210> 34 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1L-26966R primer <400> 34 cgggccctgc aggccctcga ggtattcgat gattattttt aa 42 <210> 35 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M1L-25376F primer <400> 35 agaattctta attaactcga gttaaaaata atcatcgaat ac 42 <210> 36 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2L-26945R primer <400> 36 cgggccctgc aggccctcga gtggatcatg tgtgacatgt gt 42 <210> 37 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> M2L-26766F primer <400> 37 agaattctta attaactcga gttactctct ataacaaata tc 42 <210> 38 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K1L-27563F primer <400> 38 cgggccctgc aggccctcga ggtcaattgt gtaaagaaaa actaa 45 <210> 39 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K1L-27563F primer <400> 39 agaattctta attaactcga gttagttttt ctttacacaa ttgac 45 <210> 40 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K2L-28630R primer <400> 40 cgggccctgc aggccctcga ggaatctcct taatatgggt ac 42 <210> 41 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K2L-28630F primer <400> 41 agaattctta attaactcga ggtacccata ttaaggagat tc 42 <210> 42 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3L-29798R primer <400> 42 cgggccctgc aggccctcga ggatgtgtag acatcaataa tt 42 <210> 43 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> K3L-29798F primer <400> 43 agaattctta attaactcga gaattattga tgtctacaca tc 42

Claims (14)

1. 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103 (기탁번호 KCCM11574P) 유래의 재조합 백시니아(vaccinia) 바이러스.
2. 제 1항에 있어서, 외래 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 백시니아 바이러스.
3. 제 1항에 있어서, 서열번호 1의 플라스미드 전달벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 백시니아 바이러스.
4. 제 3항에 있어서, 상기 플라스미드 전달벡터는 외래 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 백시니아 바이러스.
5. 제 3항에 있어서, 상기 플라스미드 전달벡터는 백시니아 바이러스의 tk(thymidine kinase) 유전자 내부에 SfiⅠ 제한효소절단위치(restriction site)를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 백시니아 바이러스.
6. 제 5항에 있어서, 상기 SfiⅠ 제한효소절단위치에 외래 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 것을 특징으로 하는 재조합 백시니아 바이러스.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 재조합 백시니아 바이러스를 함유하는 백신 조성물.
8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항의 재조합 백시니아 바이러스를 함유하는 면역 치료용 약학적 조성물.
9. 서열번호 1의 플라스미드 전달벡터를 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103에 상동성 재조합을 통해 삽입하는 것을 포함하는 재조합 백시니아 바이러스 제작 방법.
10. 제 9항에 있어서, 상기 플라스미드 전달벡터는 백시니아 바이러스의 tk(thymidine kinase) 유전자 내부에 SfiⅠ 제한효소절단위치(restriction site)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 9항에 있어서, 상기 플라스미드 전달벡터는 약독화 백시니아 바이러스 KVAC103의 tk 유전자 부위로 삽입되는 것을 특징으로 하는 재조합 백시니아 바이러스 제작 방법.
12. 제 9항에 있어서, 상기 플라스미드 전달벡터는 외래 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. a) 제 1항의 백시니아 바이러스 KVAC103를 세포에 감염시키는 단계;
    b) 서열번호 1의 플라스미드 전달벡터에 서열번호 2로 표시되는 폴리뉴클레오티드 또는 서열번호 3으로 표시되는 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 단계;
    c) 단계 b)의 플라스미드 전달벡터를 단계 a)의 세포에 트랜스펙션하는 단계;
    d) 상동성 재조합에 의해 GFP가 삽입된 백시니아 바이러스를 선별하는 단계를 포함하는 복제 및 증식이 향상된 재조합 약독화 백시니아 바이러스 제작 방법.
14. 제 13항에 있어서, 상기 단계 b)의 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 플라스미드 전달벡터의 tk 유전자 내의 두 SfiⅠ 제한효소절단위치 사이 이외의 위치에 삽입하는 것을 특징으로 하는 방법.
    

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