CN102056617A - 血管生成的抑制 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用蝎氯毒素试剂抑制血管生成的新颖方法。在一些实施例中,本发明方法包括静脉内、眼内、玻璃体内、结膜下注射和/或局部投予经过标记或未经标记的蝎氯毒素试剂。在一些实施例中,本发明方法允许治疗和/或改善以新血管生成为特征的眼病,如湿性黄斑变性。在一些实施例中,新血管生成得到抑制和/或使新形成的血管退化。
Description
相关申请案信息
本申请案主张2008年3月20日申请的美国临时申请案第61/038,383号以及2008年5月15日申请的第61/053,651号的优先权和权益,所述申请案的完整内容按全文引用并入本文中。
背景技术
血管生成,即新血管的形成过程,是在正常发育、繁殖和创伤修复过程中发生。异常的血管生成会引起多种病理病况,包括肿瘤生长、眼部新血管生成和关节炎。
蝎氯毒素(Chlorotoxin)是一种在巨型以色列黄蝎(Giant Yellow Israeli scorpion)以色列杀人蝎(Leiurus Quinqestriatus)的毒液中发现的肽,已经过研究,在临床前用作靶向神经胶质瘤的候选物。根据蝎氯毒素结合肿瘤细胞的能力,已经开发出诊断和治疗肿瘤的组合物和方法(参看美国专利第5,905,027号;第6,028,174号;第6,319,891号;和第6,429,187号,各专利的内容都按全文引用并入本文中)。
发明内容
因为血管生成在如癌症等病理病况中的作用,其成为潜在治疗的值得关注的目标。不过,血管生成的抑制因调控血管生成的多个路径而复杂化。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)受缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)的诱导,并且是主要的促血管生成因子。数种抗血管生成治疗法特异性靶向VEGF。
肿瘤细胞能够转换信号传导路径,这可能使其对某些血管生成抑制剂产生抗性。例如,用HIF路径抑制剂(例如VEGF抑制剂)治疗细胞可能会导致选择出能使用不依赖HIF的路径刺激血管生成并继续生长和/或转移的肿瘤。此外,本发明认识到,在FDA批准的任一血管生成抑制剂中都未观察到的广谱血管生成抑制(也就是说,跨多个信号传导路径)将是有益的。
本文公开抑制血管生成的新颖策略。本发明发现,蝎氯毒素试剂能抑制新血管生成,和/或使现有的新形成的血管退化。本发明者已经发现,蝎氯毒素试剂可以抑制由广谱促血管生成因子刺激的新血管生成,这是截至目前上市销售的血管生成抑制剂都未曾报导过的。此外,当通过不同投药途径(包括静脉内、眼内和局部)递送蝎氯毒素试剂时,其都能发挥抗血管生成作用。数种示范性投药途径可以将蝎氯毒素试剂递送到眼睛。
在一些方面中,本发明提供一种方法,其包含对受检者投予一定量蝎氯毒素试剂的步骤,其中蝎氯毒素的量能有效地使血管生成的程度相比于未投予蝎氯毒素的对照受检者所观察或预期的程度有所降低。在一些实施例中,相对于正常细胞,蝎氯毒素试剂选择性靶向癌细胞。受检者可能具有肿瘤,例如转移性肿瘤。受检者可能例如具有至少一处转移。在一些实施例中,肿瘤和/或转移的尺寸减小。
在某些实施例中,受检者患有或易患以异常血管生成为特征的病况或疾病。例如,病况或疾病可以脉络膜新血管生成为特征。此类病况或疾病的实例包括(但不限于)黄斑变性(包括湿性黄斑变性、年龄相关性黄斑变性等)、近视、眼外伤、弹性纤维假黄瘤(pseudoxanthoma elasticum)和其组合。
在一些实施例中,血管生成受选自由以下组成的群组的因子刺激:血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、血小板源性生长因子(platelet-derived growth factor,PDGF)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNFα)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)和其组合。
在一些实施例中,通过选自由以下组成的群组的投药途径投予蝎氯毒素试剂:静脉内、颅内、肌肉内、肿瘤内、皮下、眼内、眼周局部用药和其组合。在一些实施例中,经玻璃体内、通过结膜下注射等来投予蝎氯毒素。
在某些实施例中,将蝎氯毒素试剂递送到眼睛。投药可例如使用本文提到的眼内和/或眼周途径。或者或另外,可以使用滴眼液将蝎氯毒素试剂递送到眼睛。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂与细胞毒性部分缔合。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂与细胞毒性部分融合,形成融合蛋白。细胞毒性部分可以例如选自由以下组成的群组:毒素、生物活性蛋白、化疗用抗生素、溶核酶、放射性同位素和其组合。毒素的实例包括(但不限于)白树素(gelonin)、蓖麻毒素(ricin)、皂素(saponin)、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、白喉毒素(diphtheria toxin)、补体蛋白和其组合。在一些实施例中,细胞毒性部分包含放射性同位素。举个例子,放射性同位素包含碘-131(131I)。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂与标记部分缔合。标记部分可例如包含选自由以下组成的群组的部分:荧光团、放射性同位素、顺磁性金属离子和其组合。在一些实施例中,标记部分包含放射性同位素,例如碘-131(131I)、碘-125(125I)、其组合等。在一些实施例中,放射性同位素包含99mTc。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂共价连接至聚合物。聚合物可以例如为聚乙二醇(PEG)。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂在受检者体内的半衰期为至少约10小时。在一些实施例中,半衰期为至少约16小时。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂一周投予不到5次。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂一周投予不到2次。
在一些实施例中,与对照受检者相比较,血管生成的程度降低至少50%。
在一些实施例中,蝎氯毒素试剂使现有的新血管系统退化。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂防止新血管萌芽(sprouting)。
本发明还认识到,膜联蛋白A2(Annexin A2)是药物研发的理想目标。在一些实施例中,如本文所述投予的蝎氯毒素试剂结合于膜联蛋白A2。此蝎氯毒素试剂与膜联蛋白A2之间的结合可以是直接或间接的。
在一些方面中,本发明提供鉴别结合于膜联蛋白A2的试剂的方法,其包含:提供包含表达膜联蛋白A2的细胞的样品;使样品与测试剂接触;确定测试剂是否结合于膜联蛋白A2;及根据确定结果,鉴别测试剂为结合于膜联蛋白A2的试剂。在一些实施例中,所述方法另包含确定试剂是否调节膜联蛋白A2的功能。
在一些方面中,本发明提供调节表达膜联蛋白A2的细胞中膜联蛋白A2的活性的方法,其包含使细胞与调节膜联蛋白A2的试剂接触,由此改变膜联蛋白A2的活性。
在某些实施例中,本发明提供一种治疗策略,其包含对受检者投予蝎氯毒素试剂,且还包含投予第二治疗剂。第二治疗剂可以为例如抗癌剂、血管生成抑制剂等。在一些实施例中,血管生成抑制剂选自由贝伐单抗(bevacizumab)、来尼珠单抗(ranibizumab)和其组合组成的群组。蝎氯毒素试剂和第二治疗剂可同时投予。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂是在投予第二治疗剂之前投予。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂是在投予第二治疗剂之后投予。蝎氯毒素试剂可以与第二治疗剂缔合。在某些实施例中,蝎氯毒素试剂是与至少一种结合于和/或调节膜联蛋白A2的另一药剂组合投予。在某些实施例中,蝎氯毒素试剂是与至少一种另一治疗剂组合投予,或与至少一种针对眼部新血管生成病症(如黄斑变性)的另一疗法结合投予。所述治疗剂可包括血管生成抑制剂,如LuctentisTM和MacugenTM;所述疗法可包括光凝术(photocoagulation),例如用激光治疗。
附图说明
图1是显示在鸡胚绒毛尿囊膜(chick chorioallantoic,CAM)分析中VEGF对血管生成的刺激的照片。所拍摄的未经处理(A)和经VEGF处理(B)的CAM照片显示,血管分支点响应于VEGF局部施用于CAM而增加。
图2是显示合成蝎氯毒素(TM-601)以剂量相关的方式抑制VEGF刺激的血管生成的照片。随着TM-601剂量的增加,血管分支点的数量减少。
图3是显示TM-601对由多种促血管生成因子(VEGF、bFGF、LPS、EGF、IL-6、PDGF、TNFα和HGF)刺激的血管生成的抑制作用的曲线。对于各因子,将分支点的抑制百分比关于TM-601的浓度作图。
图4显示来自经不同剂量TM-601处理的小鼠的基质胶塞中的平均微血管计数。每周3次给予10mg/kg静脉内注射液的动物组显示血管生成的显著减少(p<0.01)。
图5显示基质胶塞的CD31免疫染色。(A)对照基质胶塞。(B)来自经每周3次静脉内注射10mg/kg TM-601处理的动物的基质胶塞。
图6显示在整个研究过程中小鼠的体重曲线。
图7显示来自经不同剂量TM-601处理的小鼠的基质胶塞中的平均微血管计数。每周3次给予10或50mg/kg静脉内注射液的动物组显示血管生成的显著减少(*,p<0.05)。
图8显示每周3次经静脉内注射给予的TM-601以剂量相关的方式抑制血管生成。仅10mg/kg和50mg/kg剂量显著不同于对照组。不过,在所有剂量组中,都表现出剂量相关作用。
图9显示基质胶塞的CD31免疫染色。(A)对照基质胶塞。(B)来自经每周3次静脉内注射50mg/kg TM-601处理的动物的基质胶塞。(C)来自经每周3次静脉内注射0.4mg/kg TM-601处理的动物的基质胶塞。
图10显示在整个研究过程中小鼠的体重曲线。
图11显示在给予最后一剂后小鼠血浆中TM-601的药物动力学。对于不同TM-601剂量,将血浆中TM-601的浓度对时间作图。
图12说明10μg TM-601对肿瘤-CAM中肿瘤生长的影响。TM-601明显减慢在CAM上生长的PC-3和U87肿瘤的肿瘤生长。
图13说明不经进一步处理(A、B、C)或经10ug TM-601处理后(D、E、F)在CAM上生长的代表性肿瘤的显微照片。
图14显示TM-601在体外不影响U87肿瘤细胞的增殖。在存在或不存在TM-601的情况下,使U87细胞于培养基中生长72小时。浓度高达100μM的TM-601对U87细胞的增殖或细胞死亡无影响。
图15显示10μgTM-601对肿瘤-CAM中的肿瘤生长的影响。TM-601明显减慢在CAM上生长的SKMel28、PC-3、U87和胰腺癌瘤的肿瘤生长。
图16显示在CAM上生长的肿瘤中血红蛋白的量受TM-601抑制。在基质胶中,将人肿瘤细胞(A):87神经胶质瘤,(B):D54神经胶质瘤,或(C):胰腺癌瘤)施加于CAM的表面。细胞含有生理盐水或400ng TM-601。施加单独基质胶作为对照。7天后,取出植入区,并测量血红蛋白含量。*经TM601处理的肿瘤中血红蛋白含量显著低于未经处理的细胞(p<0.05)。
图17显示在CAM分析中TM-601对正常的发育中血管系统的抑制作用。3种最大量的TM-601(1、10和100μg)实现了血管密度的统计学显著降低。
图18显示TM-601以剂量相关的方式抑制VEGF、bFGF和LPS刺激的血管生成。高于100%抑制指示抑制水平高于未经刺激的生理盐水对照值,表明TM-601不仅抑制受促抗血管生成因子刺激的新血管生成的量,而且还抑制由鸡发育固有的血管生成引起的新血管生成。
图19显示经促血管生成因子(左图)或促血管生成因子加100μg TM-601处理的代表性鸡蛋的CAM的照片。血管密度指数是通过计算与覆盖在照片上的圆圈相交的血管的数量测定。
图20显示静脉内TM-601对VEGF刺激的血管生成的抑制作用。向鸡蛋中可见的大静脉中单次注射所示剂量的TM601。观察到抑制性剂量反应。
图21显示TM-601、Avastin和Lucentis对VEGF刺激的血管生成的抑制。如所示,以质量计,TM-601和Lucentis是最有效的血管生成抑制剂。
图22显示TM-601、Avastin和Lucentis对VEGF刺激的血管生成的抑制。如所示,以摩尔浓度计,TM-601不如Avastin和Lucentis有效。
图23显示TM-601和Avastin(A)或TM-601和Lucentis(B)对VEGF刺激的血管生成的组合作用。
图24显示TM-601与Avastin(A)或Lucentis(B)对VEGF刺激的血管生成的作用。
图25说明由在小鼠脉络膜新血管生成(choroidal neovascularization,CNV)模型中测试TM-601抑制血管形成的能力的实验得到的结果。显示接收TM-601或生理盐水媒剂的动物体内新血管(NV)的总面积(mm2×10-3)。在布鲁赫氏膜(Bruch′s membrane)破裂当天和第7天,于眼内注射50μgTM-601的动物中观察到统计学显著的脉络膜新血管生成减少(*p<0.05)。第14天,分析脉络膜损伤。
图26说明由在小鼠CNV模型中测试TM-601引起现有新血管退化的能力的实验得到的结果。显示接收TM-601或生理盐水媒剂的动物体内新血管(NV)的总面积(mm2×10-3)。“基线”是指在布鲁赫氏膜破裂后(即,用TM-601处理前)第7天时取得的测量值。第7天,在眼内注射50μgTM-601的动物中观察到脉络膜新血管生成的统计学显著的退化(*p<0.05))。对于“对照”和“TM-601”值,在第14天分析脉络膜损伤。
图27是在小鼠脉络膜新血管生成模型中显示玻璃体内注射TM-601引起在激光诱导产生的血管位点处血管减少的代表性显微图像。当在激光诱导当天投予TM-601时,新血管生成受到抑制(顶图)。当在激光诱导后7天投予TM-601时,现有的新血管系统退化(底图)。第14天,对所有小鼠灌注经荧光素标记的葡聚糖,制备脉络膜平片并利用荧光显微镜检查。
图28显示在经过静脉内注射的非癌小鼠中聚乙二醇化蝎氯毒素(TM-601-PEG)与未经修饰的TM-601的半衰期的比较。聚乙二醇化使TM601的半衰期增加至约32倍。
图29显示在小鼠CNV模型中,聚乙二醇化TM-601可以比未经修饰的TM-601低的给药频率实现抗血管生成作用。绘制在CNV模型中对于未经修饰的TM-601或聚乙二醇化TM-601的不同给药方案的微血管密度的图。
图30显示在小鼠CNV模型中经结膜下注射投予的TM-601的剂量反应曲线。
图31显示在小鼠CNV模型中当通过局部施用滴眼液来投予TM-601时对新血管生成的结果。
图32显示敲低膜联蛋白A2表达的siRNA导致丧失TM-601与Panc-1肿瘤细胞(一种胰腺肿瘤细胞系)表面的结合。
具体实施方式
定义
以下段落中将定义本说明书通篇使用的数种术语。
除非另作说明,或另外从上下文中可显而易见,否则本文提到数字时使用的术语“约(about)”和“大约(approximately)”在本文中包括在所述数字的任一方向(大于或小于所述数字)的20%、10%、5%或1%范围内的数字(除所述数字超过可能值的100%的情形外)。
本文使用的术语“膜联蛋白A2”是指在Entrez基因库清单(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中官方代号为ANXA2(在智人(Homo sapiens)中)且官方全名为“膜联蛋白A2”的基因的蛋白质产物(ANXA2转录物的多种序列可例如见于基因库入藏登记号M62899、NM_001002857、NM_001002858、NM_004039下。)。其中,膜联蛋白A2也称为“膜联蛋白II”和脂皮素2(lipocortin 2)。
术语“生物活性”当在本文中用于表征多肽时,是指一种分子与母本多肽共有足够的氨基酸序列一致性,由此展现与所述多肽类似或相同的特性(例如,特异性结合癌细胞,和/或内化进入癌细胞,和/或杀死癌细胞的能力)。
本文使用的术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常以不受调控的细胞生长为特征的生理学病况。癌症的实例包括(但不限于)癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体点说,所述癌症的实例包括肺癌、骨癌、肝癌、胰腺癌、皮肤癌、头或颈癌、皮肤或眼内黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、肛门癌、胃癌、结肠癌、乳癌、子宫癌、性器官和生殖器官癌瘤、霍奇金氏病(Hodgkin′s Disease)、食道癌、小肠癌、内分泌系统癌症、甲状腺癌、副甲状腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、膀胱癌、肾癌、肾细胞癌瘤、肾盂癌瘤、中枢神经系统(central nervous system,CNS)瘤、神经外胚层癌、脊柱肿瘤、神经胶质瘤、脑脊膜瘤和垂体腺瘤。
本文使用的术语“癌细胞”是指哺乳动物(例如人类)体内经历不合需要和不受调控的细胞生长或者异常存留或异常组织侵入的细胞。在体外,此术语也指给予适宜的新鲜培养基和空间时会以不受调控的方式无限制增殖的细胞系,其是一种永久永生化的所建立的细胞培养物。
本文使用的术语“癌症患者”是指患有或易患癌症的个体。癌症患者可经确诊或可未经确诊患有癌症。此术语还包括先前经历癌症疗法的个体。
术语“化疗剂”与“抗癌剂或抗癌药”在本文中可互换使用。这些术语是指用于治疗癌症或癌性病况的药剂。抗癌药通常归为以下群组中的一者中:烷化剂类、嘌呤拮抗剂类、嘧啶拮抗剂类、植物碱类、插入性抗生素类(intercalating antibiotics)、芳香酶抑制剂类、抗代谢物类、有丝分裂抑制剂类、生长因子抑制剂类、细胞周期抑制剂类、酶类、拓扑异构酶抑制剂类、生物反应调节剂类、抗激素类和抗雄性激素类。所述抗癌剂的实例包括(但不限于)BCNU、顺铂(cisplatin)、吉西他宾(gemcitabine)、羟基脲(hydroxyurea)、紫杉醇(paclitaxel)、替莫唑胺(temozolomide)、拓扑替康(topotecan)、氟尿嘧啶(fluorouracil)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、丙卡巴肼(procarbazine)、达卡巴嗪(decarbazine)、六甲密胺(altretamine)、甲氨喋呤(methotrexate)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)、克拉屈滨(cladribine)、喷司他丁(pentostatin)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、伊立替康(irinotecan)、多烯紫杉醇(docetaxel)、多柔比星(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、更生霉素(dactinomycin)、依达比星(idarubicin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素(mitomycin)、博来霉素(bleomycin)、他莫昔芬(tamoxifen)、氟他胺(flutamide)、亮丙立德(leuprolide)、戈舍瑞林(goserelin)、氨鲁米特(aminogluthimide)、阿那曲唑(anastrozole)、安吖啶(amsacrine)、天冬酰胺酶(asparaginase)、米托蒽醌(mitoxantrone)、米托坦(mitotane)和氨磷汀(amifostine)。
本文使用的术语“组合疗法”是指两种或两种以上不同药剂以重叠的方案投予,以致受检者同时暴露于所有药剂的情形。
术语“细胞毒性”当在本文中用于表征一种部分、化合物、药物或试剂时,指一种部分、化合物、药物或试剂可抑制或阻止细胞的功能和/或引起细胞破坏。
术语“给药方案”当用于本文中时,指经一段时间分开而独立投予一组单位剂量(通常一个以上剂量)。特定药剂的一组推荐剂量(即,投药量、时程、途径等)构成其给药方案。
本文使用的术语“有效量”和“有效剂量”是指足以在可接受的效益/风险比下实现预定目的(即,组织或受检者中所需的生物或医学反应)的化合物或组合物的任何量或剂量。举个例子,在本发明某些实施例中,所述目的可以是:抑制血管生成、使新血管系统退化、干扰如膜联蛋白A2等另一生物活性分子的活性等。相关预定目的可以是客观的(即,可通过一些测试或标记物测量)或主观的(即,受检者给出疗效的指征或感觉到疗效)。一般按可包含多个单位剂量的给药方案来投予治疗有效量。对于任何特定药剂,治疗有效量(和/或在有效给药方案内的适宜单位剂量)可例如取决于投药途径、与其它药剂的组合而变化。在一些实施例中,任何特定患者的具体治疗有效量(和/或单位剂量)将取决于多种因素,包括所治疗的病症和病症的严重程度;所用的特定药剂的活性;所用特定组合物;患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食;投药时间;投药途径;和/或所用特定药剂的排泄或代谢速率;治疗持续的时间;以及医学领域中众所周知的类似因素。
本文使用的术语“荧光团”、“发荧光部分”“荧光标记”、“荧光染料”与“荧光标记部分”在本文中可互换使用。这些术语是指在溶液中并且在用适宜波长的光激发后发射回光的分子。具有多种结构和特征的许多荧光染料适用于实践本发明。类似地,已知用于荧光标记核酸的方法和材料(参看例如R.P.霍格兰(R.P.Haugland),“分子探针:荧光探针和研究化学手册1992-1994(Molecular Probes:Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals 1992-1994)”,第5版,1994,分子探针公司(Molecular Probes,Inc.))。在选择荧光团时,通常需要荧光分子高效地吸收光并发射荧光(即,分别以高摩尔吸收系数和荧光量子产率),而且是耐光的(即,经光激发后,所述荧光分子在进行分析必需的时间内不会发生明显降解)。
本文使用的术语“融合蛋白”是指包含两种或两种以上蛋白质或其片段并利用共价键经各自肽主链连接的分子,所述蛋白质或其片段通常是通过基因表达编码这些蛋白质的多聚核苷酸分子而产生。
本文使用的术语“同源”(或“同源性”)是指两个多肽分子之间或两个核酸分子之间的一致性程度。当两个比较序列中的一个位置由相同碱基或氨基酸单体亚基占据时,则个别分子在这个位置同源。两个序列之间的同源性百分比等于两个序列共有的匹配或同源位置的数量除以所比较的位置的数量,并乘以100。一般说来,当对准两个序列达到最大同源性时,进行比较。同源氨基酸序列共有一致或类似的氨基酸残基。类似残基是参照序列中相应氨基酸残基的保守性取代,或“容许的点突变”。参照序列中残基的“保守性取代”是物理上或功能上类似于相应参照残基的取代,例如,其具有类似尺寸、形状、电荷、化学特性,包括形成共价键或氢键的能力等。在一些实施例中,本发明所用的保守性取代是满足戴霍夫(Dayhoff)等人为“可接受的点突变”定义的标准的取代(“蛋白质序列和结构图册(Atlas of Protein Sequence and Structure)”,1978,自然-生物医学研究基础(Nat.Biomed.Res.Foundation),华盛顿(Washington,DC),第3增补版,22:354-352)。
本文使用的术语“同系物”是指与另一多肽或基因具有指定的序列一致性(和/或相似性)程度的多肽或基因。例如,与另一多肽具有至少约30-40%、通常高于约50%、60%、70%或80%的整体序列一致性,且另外通常在一个或多个高度保守的区域中包括至少一个与另一多肽具有更高,通常高于90%或甚至95%、96%、97%、98%或99%一致性的区域(通常涵盖至少3到4个且通常多达20个或20个以上氨基酸)的任何多肽都是所述多肽的同系物。在许多实施例中,多肽的同系物还与所述多肽共有序列相似性和/或至少一种功能属性或活性。对于基因或核苷酸序列,(i)与另一基因或核苷酸序列共有至少约60%整体序列一致性;和或(ii)编码由另一基因或核苷酸序列所编码的多肽的同系物的任何基因或核苷酸序列都是所述基因或核苷酸序列的同系物。如一般技术人员所了解的,已知多种策略及可用工具可进行氨基酸或核苷酸序列比较以便评估一致性和/或相似性程度。这些策略包括例如人工比对(manual alignment)、计算机辅助的序列比对和其组合。多种进行序列比对的算法(一般利用计算机执行)广泛可用,或者可由所属领域技术人员做出来。代表性算法包括例如史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)的局部同源性算法(应用数学进展(Adv.Appl.Math.),1981,2:482);尼德曼(Needleman)和伍思齐(Wunsch)的同源性比对算法(homology alignment algorithm)(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.),1970,48:443);皮尔森(Pearson)和李普曼(Lipman)的相似性方法研究(美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)),1988,85:2444);和/或这些算法的计算机实施(例如GAP、BESTFIT、FASTA,和TFASTA,威斯康星遗传学软件包7.0版(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0),遗传学计算机公司(Genetics Computer Group),575科技园区(575Science Dr.),威斯康星州麦迪逊(Madison,Wis.))。并入所述算法的易于得到的计算机程序包括例如BLASTN、BLASTP、Gapped BLAST、PILEUP、CLUSTALW等。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时,可使用各自程序的默认参数。或者,从业人员可以根据其实验和/或其它要求而使用非默认参数(参看例如网页URL www.ncbi.nlm.nih.gov)。
术语“个体”和“受检者”在本文中可以互换使用。这些术语是指患有疾病或病症(例如癌症、黄斑变性等),或者易患但可能已具有或不具有所述疾病或病症的人类或另一哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、狗、猫、牛、猪、绵羊、马或灵长类动物)。在许多实施例中,受检者为人类。在许多实施例中,受检者为患者。除非另作说明,否则术语“个体”和“受检者”不是指特定年龄,由此涵盖成人、儿童和新生儿。
本文使用的术语“抑制”是指预防某事发生、延缓某事发生的出现和/或降低某事发生的程度或可能性。因此,“抑制血管生成”与“抑制新血管系统的形成”意在涵盖预防、延缓血管生成的发生和/或降低血管生成发生的可能性,以及降低新血管的数量、生长速率、尺寸等。
术语“经标记”与“经可检测试剂或部分标记”在本文中可互换使用,特指一种实体(例如蝎氯毒素或蝎氯毒素连结物)例如在结合于另一实体(例如赘生性肿瘤组织)后可以目测观察。可检测试剂或部分可经过选择,使得其产生能被测量的信号,而且信号强度与所结合的实体的量相关(例如成比例)。此项技术中已知多种用于标记和/或检测蛋白质和肽的系统。通过并入或连结至可利用分光镜、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或其它方式检测的标记,可以制得经标记的蛋白质和肽。标记或标记部分可以是直接检测(即,其不需要任何其它反应或操作来使其可检测,例如,荧光团是可以直接检测的),或其可以是间接检测(即,通过与另一可检测实体反应或结合,来使其可检测,例如,半抗原在与包含如荧光团等报告者的适宜抗体反应后,可以通过免疫染色检测)。适合的可检测试剂包括(但不限于)放射性核素、荧光团、化学发光试剂、微粒、酶、色度标记、磁性标记、半抗原、分子信标(Molecular Beacon)、适体信标等。
本文使用的术语“黄斑变性”是指因视网膜损伤而导致视野中心(黄斑)视力丧失的医学病况。已知存在数种形式的黄斑变性,而且除非具体说明,否则术语“黄斑变性”包括所有形式。“湿性黄斑变性”(也称为新血管性或渗出性形式)是指涉及视网膜后脉络膜血管生长的黄斑变性。在湿性黄斑变性中,视网膜有时变得脱落。在“干性黄斑变性”(也称为非渗出性形式)中,叫做玻璃膜疣(drusen)的细胞碎片积累在视网膜与脉络膜之间,但不发生血管形成。“年龄相关性黄斑变性”(ARMD)是指最常见形式的黄斑变性,其通常在老年发生,在黄斑中具有特征性黄色沉积物。ARMD可以是湿性或干性形式的黄斑变性。
本文使用的术语“转移”(有时缩写为“mets”)是指肿瘤细胞从一个器官或组织扩散至另一位置。此术语也指因转移而在新位置形成的肿瘤组织。“转移性癌症”是从初始位置或原发位置扩散的癌症,并且也可称为“继发癌症”或“继发肿瘤”。一般说来,转移性肿瘤是以起始原发肿瘤的组织命名。因此,转移到肺部的乳癌即使一些癌细胞处在肺中,也可称为“转移性乳癌”。
本文使用的术语“新血管系统”是指尚未完全成熟的新形成的血管,即,其不具有完全形成的细胞连接紧密的内皮细胞内衬或完整的周围平滑肌细胞层。本文使用的术语“新血管”用于指新血管系统中的血管。
术语“正常”和“健康”在本文中可以互换使用。这些术语是指不具有肿瘤的一个个体或一组个体。术语“正常”在本文中也用于限定从健康个体分离的组织样品。
术语“药剂”、“治疗剂”与“药物”在本文中可互换使用。这些术语是指有效治疗、抑制和/或检测疾病、病症或临床病况的物质、分子、化合物、试剂、因子或组合物。
“药物组合物”在本文中定义为包含有效量的至少一种活性成分(例如,可经标记或可未经标记的蝎氯毒素或蝎氯毒素连结物)和至少一种药学上可接受的载剂的组合物。
本文中使用的术语“药学上可接受的载剂”是指不会干扰活性成分的生物活性的效力且投药时的浓度不会对宿主产生过度毒性的载剂介质。此术语包括溶剂、分散介质、涂层、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂、吸收延迟剂等。此项技术中众所周知适于药物活性物质的此类介质和试剂的使用(参看例如“雷明顿氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences)”,E.W.马丁(E.W.Martin),第18版,1990,默克出版公司(Mack Publishing Co.):宾夕法尼亚州伊斯顿(Easton,PA),其按全文引用并入本文中)。
本文使用的术语“预防”当用于指一种试剂对一个过程(例如血管生成)的作用时, 指当在出现一种或多种与所述过程相关的症状或属性之前投予所述试剂(例如治疗剂) 时,将降低所述过程的程度和/或延缓其发作。
本文使用的术语“原发肿瘤”是指在肿瘤最初产生的初始位点的肿瘤,即,与已经扩散到别处者相对。
术语“蛋白质”、“多肽”与“肽”在本文中可互换使用,并且指各种长度的氨基酸序列,其可以是天然(未改变)形式或盐形式,且未经修饰或经糖基化、侧链氧化或磷酸化修饰。在某些实施例中,氨基酸序列是全长天然蛋白质。在其它实施例中,氨基酸序列是全长蛋白质的较小片段。在其它实施例中,氨基酸序列由连接至氨基酸侧链的额外取代基(例如糖基单元、脂质或无机离子如磷酸根)以及涉及链的化学转化(例如,巯基氧化)的修饰加以修饰。因此,术语“蛋白质”(或其相当的术语)打算包括经历过不改变其特定特性的修饰的全长天然蛋白质的氨基酸序列。具体地说,术语“蛋白质”涵盖蛋白质的同功异型物,即,由相同基因编码,但pI或MW或二者不同的变异体。此类同功异型物的氨基酸序列可不同(例如由替代性剪接或限制性蛋白水解产生),或者所述同功异型物可源自于不同的翻译后修饰(例如糖基化、酰基化或磷酸化)。
本文使用的术语“蛋白质类似物”是指功能与母体多肽相似或一致但未必包含与母体多肽相似或一致的氨基酸序列,或者结构与母体多肽相似或一致的多肽。在本发明上下文中,蛋白质类似物可具有与母体多肽的氨基酸序列至少30%(在一些实施例中,至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或至少99%)一致的氨基酸序列。此外,所属领域技术人员应理解,蛋白质序列一般容许不破坏活性的某些取代。因此,术语“蛋白质类似物”中涵盖保持母体多肽的活性且与母体多肽共有至少约30-40%、通常高于约50%、60%、70%或80%的整体序列一致性,且另外通常在一个或多个高度保守的区域中包括至少一个与母体多肽具有更高,通常高于90%或甚至90%、96%、97%、98%或99%一致性的区域(通常涵盖至少3到4个且通常多达20个或20个以上氨基酸)的任何多肽。
本文使用的术语“蛋白质片段”是指包含第二多肽的氨基酸序列中的至少5个氨基酸残基的氨基酸序列的多肽。蛋白质的片段可具有或可不具有母体多肽的功能活性。
术语“退化”在本文中当用于指血管和/或血管系统(包括新血管系统和/或新血管)时,用于指收缩、缩小等。
本文使用的术语“小分子”包括可用于影响生物过程的任何化学或其它部分。小分子可包括当前已知和使用的许多治疗剂,或者可以是出于筛选生物功能的目的而以分子文库形式合成的小分子。小分子在尺寸上与大分子加以区别。适用于本发明中的小分子的分子量通常小于约5,000Da(dalton,道尔顿)、小于约2,500Da、小于1,000Da或小于约500Da。
本文使用的术语“易患”是指对于某些事物(即,疾病、病症或病况,例如转移性癌症)的风险和/或倾向性(通常是基于遗传诱因、环境因素、个体病史或其组合)高于在一般群体中所观察到的结果。此术语考虑到“易患”某种病况的个体可能从未确诊患有这种病况。
本文使用的术语“全身投药”是指药剂的投予使得大量所述药剂在体内广泛分布,而且在血液中具有生物作用(例如其预定作用)和/或通过血管系统到达其预定作用位点。典型的全身投药途径包括通过(1)将药剂直接引入血管系统或(2)经口、肺或肌肉内投予来投药,在(2)的情况下,所述药剂被吸收,进入血管系统并且经由血液载运至一个或多个预定作用位点。
术语“组织”在本文中以其广义使用。组织可以是可(但非必需)包含肿瘤细胞的任何生物实体。在本发明的情况下,考虑体外、体内和离体组织。因此,组织可以是个体的一部分,或者可以从个体获得(例如借助活组织检查)。组织还可以包括组织切片,如出于组织学目的获取的冷冻切片;或者已知诊断、治疗和/或结果病史的存档样品。术语组织还涵盖通过处理组织样品衍生出的任何材料。衍生的材料包括(但不限于)从组织分离的细胞(或其子代)。组织样品的处理可涉及以下一种或多种:过滤、蒸馏、萃取、浓缩、干扰性组分的灭活、试剂的添加等。
术语“治疗”在本文中用于表征针对以下目的方法或过程:(1)延缓或预防疾病、病症或病况的发作;(2)减慢或停止疾病、病症或病况的一种或多种症状的进展、加重或恶化;(3)使疾病、病症或病况的症状缓解;(4)降低疾病、病症或病况的严重程度或发病率;或(5)治愈疾病、病症或病况。治疗可以在疾病、病症或病况发作前投予,实现预防作用。或者或另外,治疗可以在疾病、病症或病况起始之后投予,实现治疗作用。
本发明特别针对抑制和/或减少血管生成的方法。本文提供的方法通常包含投予蝎氯毒素试剂,所述蝎氯毒素试剂可与或可不与细胞毒性部分、第二治疗剂、标记部分和/或其组合缔合。蝎氯毒素试剂可共价连接至聚合物,例如聚乙二醇。在某些实施例中,新血管的形成得以抑制和/或现有的新血管系统退化。
根据本发明,可以使用此项技术中的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中都已完整说明。参看例如曼妮提斯(Maniatis),弗雷齐(Fritsch)和萨布鲁克(Sambrook),“分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)”,1982;“DNA克隆:实践方法(DNA Cloning:A Practical Approach),”第I和第II卷,D.N.格劳馥(D.N.Glover)(编),1985;“低聚核苷酸的合成(Oligonucleotide Synthesis)”,M.J.盖特(M.J.Gait)(编),1984;“核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)”,B.D.海姆斯(B.D.Hames)和S.J.海吉斯(S.J.Higgins)(编),1985;“转录和翻译(Transcription and Translation)”,B.D.海姆斯和S.J.海吉斯(编),1984;“动物细胞培养(Animal Cell Culture)”,R.I.弗雷西丽(R.I.Freshney)(编),1986;“固定的细胞和酶(Immobilized Cells And Enzymes)”,IRL出版社(IRL Press),1986;B.佩宝(B.Perbal),“分子克隆实践指南(A Practical Guide To Molecular Cloning)”,1984。
I.试剂和部分
本发明方法可涉及对受检者(例如患有、曾患以异常血管生成为特征的病况或疾病或者有发展所述病况或疾病的风险的受检者)投予有效量的蝎氯毒素试剂,以使血管生成相比对照组有所减少。
A.蝎氯毒素试剂
本文使用的术语“蝎氯毒素试剂”是指包含至少一个蝎氯毒素部分的化合物。在某些实施例中,蝎氯毒素试剂与第二治疗剂(例如抗癌剂)缔合。蝎氯毒素试剂(和/或治疗剂)可与至少一个标记部分缔合。
本文使用的术语“蝎氯毒素部分”是指蝎氯毒素、生物活性蝎氯毒素亚基或蝎氯毒素衍生物。
在某些实施例中,术语“蝎氯毒素”是指来源于以色列杀人蝎毒液的36个氨基酸的全长天然多肽(德宾(DeBin)等人,美国生理学杂志(Am.J.Physiol),1993,264:C361-369),其包含如国际申请案第WO 2003/101474号SEQ ID NO.1中所述的天然蝎氯毒素的氨基酸序列,所述申请案的内容按引用并入本文中。术语“蝎氯毒素”包括包含SEQ ID NO.1的多肽,其为合成或重组产生的,例如美国专利第6,319,891号(其全文按引用并入本文中)中公开的序列。
“生物活性蝎氯毒素亚基”是包含蝎氯毒素中不到36个氨基酸且保留蝎氯毒素至少一种特性或功能的肽。本文使用的蝎氯毒素的“特性或功能”包括(但不限于)抑制新血管形成和/或使新血管退化的能力;干扰其结合搭配物(例如可包括膜联蛋白A2)的活性的能力;阻滞异常细胞生长的能力;相比正常细胞,特异性结合肿瘤/癌细胞的能力;相比正常细胞,特异性结合正在转移的肿瘤/癌细胞或者转移癌中的肿瘤/癌细胞的能力;内化至肿瘤/癌细胞中的能力;杀死肿瘤/癌细胞的能力。所述肿瘤/癌细胞可以是在体外、离体、体外、转移癌的一部分、来自个体的原代分离物、培养的细胞,或细胞系。
本文使用的术语“生物活性蝎氯毒素衍生物”是指蝎氯毒素和相关肽的多种衍生物、类似物、变异体、多肽片段和模拟物中的任一种,其保留蝎氯毒素的至少一种特性或功能(如上文所述)。蝎氯毒素衍生物的实例包括(但不限于)蝎氯毒素的肽变异体;蝎氯毒素的肽片段,例如包含国际申请案第2003/101474号中所述SEQ ID No.1、2、3、4、5、6或7中相邻10聚体(10-mer)肽或由其组成,或包含国际申请案第WO 2003/101474号中所述SEQ ID No.1的残基10-18或21-30的片段;核心结合序列;和肽模拟物。
蝎氯毒素衍生物的实例包括具有国际申请案第WO 2003/101474号的SEQ ID No.1中所述氨基酸序列的片段、具有至少约7、约8、约9、约10、约15、约20、约25、约30或约35个与蝎氯毒素活性相关的相邻氨基酸残基的肽。所述片段可含有蝎氯毒素肽的功能区,其被鉴别为对应于已知肽结构域的氨基酸序列区;以及具有明显亲水性的区域。所述片段还可以包括两个彼此以任何次序连接的核心序列,其中插入氨基酸已被去除或经连接剂置换。
蝎氯毒素衍生物包括当在最大限度上对准衍生物序列与蝎氯毒素序列时包含至少一个氨基酸残基的保守或非保守性取代的多肽。所述取代可以增强蝎氯毒素的至少一种特性或功能;抑制蝎氯毒素的至少一种特性或功能;或对蝎氯毒素的至少一种特性或功能中立。
适用于实践本发明的蝎氯毒素衍生物的实例描述于国际申请案第WO 2003/101474号中(其全文按引用并入本文中)。特定实例包括包含此国际申请案中所述的SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.13或由所述序列组成的多肽,以及其变异体、类似物和衍生物。
蝎氯毒素衍生物的其它实例包括含有借助于例如同源重组、定点诱变或PCR诱变引起的预定突变,及肽家族的等位基因或其它天然存在的变异体的多肽;以及所述肽已利用非天然存在氨基酸的部分(例如可检测部分,如酶或放射性同位素)通过取代、化学、酶或其它适宜的方式共价修饰的衍生物。
蝎氯毒素和其肽衍生物可以使用此项技术中已知的多种方法中的任一种制备,包括标准固相(或溶液相)肽合成方法。此外,编码这些肽的核酸可以使用市售的低聚核苷酸合成仪器合成,并且所述蛋白质可以使用标准重组制造系统重组产生。
其它适合的蝎氯毒素衍生物包括模拟蝎氯毒素的三维结构的肽模拟物。所述肽模拟物的益处可明显优于天然存在的肽,包括例如制造更为经济、化学稳定性更高、药理特性(半衰期、吸收、效力、功效等)增强、特异性改变(例如广谱生物活性、抗原性降低等)。
在某些实施例中,模拟物是模拟蝎氯毒素肽二级结构的元件的分子。蛋白质的肽主链主要用于以一定方式定向氨基酸侧链,以促进分子的相互作用,例如抗体与抗原的相互作用。预期肽模拟物将允许与天然分子类似的分子相互作用。肽类似物普遍用于制药工业,如特性类似于模板肽的非肽药物。这些类型的化合物也称为肽模拟物(peptide mimetics)或拟肽类(peptidomimetics)(参看例如法切尔(Fauchere),药物研究进展(Adv.Drug Res.),1986,15:29-69;韦伯(Veber)和弗雷迪杰(Freidinger),1985,神经科学趋势(Trends Neurosci.),1985,8:392-396;伊万斯(Evans)等人,医药化学杂志(J.Med.Chem.),1987,30:1229-1239),并且通常借助于计算机分子模拟进行开发。
一般说来,肽模拟物的结构类似于范例多肽(paradigm polypeptide)(即,具有生化特性或药理活性的多肽),但其中一个或多个肽键联任选经非肽键联置换。通过使用组合化学来产生药物库,可以增强肽模拟物的使用。通过鉴别增加或减少肽与例如肿瘤细胞的结合的氨基酸突变,可以辅助肽模拟物的设计。可用方法包括酵母双杂交法(yeast two hybrid method)(参看例如奇恩(Chien)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1991,88:9578-9582)以及使用噬菌体呈现法。所述双杂交法可检测酵母中的蛋白质-蛋白质相互作用(菲尔德(Field)等人,自然(Nature),1989,340:245-246)。噬菌体呈现法可检测固定蛋白质与如λ和M13等噬菌体表面上所表达的蛋白质之间的相互作用(安伯格(Amberg)等人,策略(Strategies),1993,6:2-4;霍格费(Hogrefe)等人,基因(Gene),1993,128:119-126)。这些方法允许正选择和负选择肽-蛋白质相互作用和鉴别可以测定这些相互作用的序列。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂包含呈现与上述蝎氯毒素类似或相关的活性的另一种蝎子的多肽毒素。本文使用的术语“与蝎氯毒素类似或相关的活性”特指与肿瘤/癌细胞的选择性/特异性结合。适合的相关蝎子毒素的实例包括(但不限于)与蝎氯毒素具有氨基酸和/或核苷酸序列一致性的蝎子来源的毒素或相关肽。相关蝎子毒素的实例包括(但不限于)来自四川蝎(Mesobuthus martenssi)的CT神经毒素(基因库(GenBank)入藏登记号AAD473730)、来自东亚钳蝎(卡希)(Buthus martensii karsch)的神经毒素BmK 41-2(基因库入藏登记号A59356)、来自东亚钳蝎(Buthus martensii)的神经毒素Bm12-b(基因库入藏登记号AAK16444)、来自以色列黄蝎(Leiurus quinquestriatus hebraeu)的可能毒素(Probable Toxin)LGH 8/6(基因库入藏登记号P55966)和来自印度红蝎(Mesubutus tamulus sindicus)的小毒素(Small toxin)(基因库入藏登记号P15229)。
适用于本发明中的相关蝎子毒素包含氨基酸序列与国际申请案第WO 2003/101474号(其全文按引用并入本文中)SEQ ID No.1中所述的完整蝎氯毒素序列具有至少约75%、至少约85%、至少约90%、至少约95%或至少约99%序列一致性的多肽。在某些实施例中,相关蝎子毒素包括序列与国际申请案第WO 2003/101474号中所述蝎氯毒素的SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.13同源的蝎子毒素。
修饰
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂未经标记。在某些实施例中,蝎氯毒素试剂经过标记。标记方法和标记部分的实例如本文中所述。
在某些实施例中,通过将蝎氯毒素试剂共价连接至大分子(如聚合物)来进行修饰。不希望受任何特定理论束缚,例如聚合物的共价连接可以掩蔽蝎氯毒素试剂的抗原性,以致动物体中此试剂的生物利用率和/或耐受性得到改进。此类聚合物的实例是聚乙二醇(PEG),其通常共价连接至肽和/或多肽的N和/或C末端和/或半胱氨酸。“聚乙二醇化(PEGylation)”是指PEG共价加成至一分子。
在一些实施例中,蝎氯毒素试剂的任何位点都未经修饰。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂中每一分子有一个位点经修饰(例如聚乙二醇化)。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂中每一分子有一个以上位点经修饰(例如聚乙二醇化)。
在一些实施例中,所述修饰增加蝎氯毒素试剂的体内半衰期。举个例子,半衰期可以为至少约10小时、至少约16小时等(参看例如实例7)。在一些实施例中,所述生物利用率的改进有利于涉及较低给药频率的给药方案。(给药方案如本文所论述。)
蝎氯毒素试剂与细胞的结合
蝎氯毒素试剂例如可经由细胞膜外表面上存在的抗原结合于细胞。
本文提供和论述的数据表明,膜联蛋白A2是一种潜在的蝎氯毒素结合搭配物。在一些实施例中,抗原为膜联蛋白A2或相关家族成员。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂直接结合膜联蛋白A2。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂例如经由与其它分子缔合而间接结合膜联蛋白A2。蝎氯毒素试剂和膜联蛋白A2可例如存在于包含其它分子的复合物中。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂结合于癌细胞;在一些这样的实施例中,相对于正常细胞,蝎氯毒素试剂选择性靶向癌细胞。
B.第二治疗剂
如上文曾提到的,在某些实施例中,蝎氯毒素试剂可与第二治疗剂缔合,和/或所述方法可另包含包括投予第二治疗剂在内的步骤。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂与第二治疗剂是同时投予。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂是在投予第二治疗剂之前和/或之后投予。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂与第二治疗剂在一时窗内投予,以致其在体内的活性和/或功效期重叠。在不希望受特定理论束缚的情况下,在一些实施例中,与蝎氯毒素试剂组合投予第二治疗剂对抑制和/或预防血管生成提供相加和/或协同作用。
适合的治疗剂包括多种有效治疗疾病或临床病况的物质、分子、化合物、试剂或因子中的任一种。在某些实施例中,第二治疗剂是化疗剂(即抗癌药)。适合的抗癌药包括多种对癌细胞直接或间接有毒或有害的物质、分子、化合物、试剂或因子中的任一种。
一般技术人员将了解,治疗剂可以是合成或天然化合物:单一分子、不同分子的混合物或不同分子的复合物。适合的治疗部分可属于多类化合物中任一类,包括(但不限于)小分子类、肽类、蛋白质类、糖类、类固醇类、抗体类(包括其片段和变异体)、融合蛋白类、反义多聚核苷酸类、核糖酶类、小干扰RNA类、拟肽类、放射性核素类等。
当第二治疗剂包含抗癌药时,抗癌药可见于例如以下数类抗癌药之中:烷化剂类、抗代谢药物类、抗有丝分裂抗生素类、血管生成抑制剂类、生物碱抗肿瘤剂类、激素类和抗激素类、干扰素类、非类固醇消炎药类,以及各种其它抗肿瘤剂类,例如激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂和NF-κB抑制剂。
抗癌药的实例包括(但不限于)例如烷化剂类药物(例如,氮芥(mechlorethamine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、美法仑(melphalan)、异环磷酰胺(ifosfamide)、替莫唑胺等)、抗代谢物类(例如,甲氨喋呤等)、嘌呤拮抗剂类和嘧啶拮抗剂类(例如,6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷(cytraribine)、吉西他宾等)、纺锤体毒素类(例如,长春花碱、长春新碱、长春瑞宾(vinorelbine)、紫杉醇等)、鬼臼毒素类(例如,依托泊苷、伊立替康、拓扑替康等)、抗生素类(例如,多柔比星、博来霉素、丝裂霉素等)、硝基脲类(例如,卡莫司汀(carmustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nomustine)等)、无机离子类(例如,顺铂、卡铂(carboplatin)等)、酶类(例如,天冬酰胺酶等)和激素类(例如,他莫昔芬、亮丙立德、氟他胺、甲地孕酮(megestrol)等)。有关最新癌症疗法更为详尽的论述,参看http://www.cancer.gov/;FDA批准的肿瘤药物清单http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm;以及默克诊疗手册(The Merck Manual),第17版,1999,所述参考的完整内容都按引用并入本文中。
一些抗癌药是通过阻滞癌细胞生长和/或复制起作用。此类药物一般归为“细胞生长抑制剂类”。在某些实施例中,治疗剂包含细胞生长抑制剂。细胞生长抑制剂类的实例包括烷化剂类、抗代谢物类、植物碱类和类萜(包括长春生物碱(vinca alkaloid)、鬼臼毒素(podophyllotoxin)、紫杉烷(taxane)等;VP-16是植物碱的实例)、拓扑异构酶抑制剂类、抗肿瘤抗体类、激素类等。
在某些实施例中,第二治疗剂包含血管生成抑制剂。适合的血管生成抑制剂可包括(但不限于)αVβ3(整合素)拮抗剂、AG3340、AGM-1470(烟曲霉素(fumagillin)类似物)、促血管生成素-2(angiopoietin-2)、血管新生阻断剂(angiostatin)、血管新生阻断剂-内皮细胞阻断剂(angiostatin-endostatin)融合蛋白、ANGIOZYMETM、抗Flk/KDR、抗侵袭因子(anti-Invasive Factor)、抗VE钙粘附素(anti-VE cadherin)、抗VEGF、BMS-275291、VEGF的适体拮抗剂、巴马司他(batimastat)、贝伐单抗(AvastinTM)、癌抑素(canstatin)、卡托普利(captopril)、羧胺三唑(CAI)、软骨源性抑制剂(cartilage-derived inhibitor,CDI)、CM101、COL-3、微管抑制剂A4(combretastin A4)、EMD-121974、内皮细胞阻断剂(endostatin)、尔洛替尼(erlotinib)(TarcevaTM)、雌二醇衍生物、flt-1、烟曲霉素、吉非替尼(gefitinib)(IressaTM)、金雀异黄素(genistein)、IM862、干扰素-α、白细胞介素-12、K5、薰草菌素(lavendustin)来那度胺(Alenalidomide)、LM609(抗αVβ3抗体)、马立马斯他(marimastat)、马斯平(maspin)、美他司他(metastat)、2-甲氧基-雌二醇、新瑞塔(neoretna)、新伐司他(neovastat)、NX 1838、哌加他尼(pegaptanib)(MacugenTM)、PD-173074、PI-88、羟吲哚(oxindole)衍生物、紫杉醇、普斯瓦卡(psovascar)、PTK787/ZK 22584、来尼珠单抗(LucentisTM)、视黄酸类、RG8803、角鲨胺(squalamine)、S-836、SC-68448、SU5416、SU6668、SU11248(舒尼替尼(sunitinib))、TBC-1635、TBC-2653、TBC-3685、沙立度胺(thalidomide)、噻唑并嘧啶衍生物、凝血酶敏感蛋白2(thrombospondin 2)、TNP470(烟曲霉素类似物)、肌钙蛋白I(troponin I)、脉管抑素(vasculostatin)、维他辛(vitaxin)、ZD0101等(此清单并不详尽)。
VEGF抑制剂包括抗VEGF的抗体和抗体片段(例如AvastinTM(贝伐单抗)和LucentisTM(来尼珠单抗))、抗VEGF核糖酶、VEGF的适体抑制剂等。
在一些实施例中,第二治疗剂是一种广谱抑制剂。在一些实施例中,第二治疗剂抑制由一种或多种选自由以下组成的群组的因子刺激的血管生成:VEGF、bFGF、LPS、EGF、IL-6、PDGF、TNFα和HPF。在一些实施例中,第二治疗剂不抑制由VEGF、bFGF、LPS、EGF、IL-6、PDGF、TNFα或HPF刺激的血管生成。
在一些实施例中,第二治疗剂是AvastinTM(贝伐单抗)、LucentisTM(来尼珠单抗)或其组合。
在某些实施例中,第二治疗剂包含细胞毒性剂。细胞毒性剂的实例包括毒素、其它生物活性蛋白、常规化疗剂、酶和放射性同位素。
适合的细胞毒性剂的实例包括(但不限于)细菌和植物毒素,例如白树素、蓖麻毒素、皂素、绿脓杆菌外毒素、美洲商陆抗病毒蛋白、白喉毒素等。
适合的细胞毒性生物活性蛋白的实例包括(但不限于)补体系统的蛋白质(或补体蛋白)。补体系统是有助于清除生物体中的病原体并促进愈合的复杂生化级联(B.P.莫根(B.P.Morgan),临床实验室科学鉴定性评论(Crit.Rev.Clin.Lab.Sci.),1995,32:265)。补体系统是由35种以上可溶性细胞结合蛋白组成,其中12种直接涉及补体路径。
适合的细胞毒性化疗剂的实例包括(但不限于)紫杉烷类(例如多烯紫杉醇、紫杉醇等)、美登素(maytansine)类、度卡霉素(duocarmycin)类、CC-1065、奥瑞他汀(auristatin)类、加里刹霉素(calicheamincin)类和其它烯二炔抗肿瘤抗生素类。其它实例包括抗叶酸类(例如氨基喋呤(aminopterin)、甲氨喋呤、培美曲塞(pemetrexed)、雷替曲赛(raltitrexed)等)、长春生物碱类(例如长春新碱、长春花碱、依托泊苷、长春地辛、长春瑞宾等)和蒽环霉素类(例如道诺霉素、多柔比星、表柔比星、依达比星、米托蒽醌、伐柔比星(valrubicin)等)。
适合的细胞毒性酶的实例包括(但不限于)溶核酶。
适合的细胞毒性放射性同位素的实例包括当处于肿瘤部位时引起细胞破坏的任何α、β或γ发射体(S.E.沃德(S.E.Order),“放射性标记的抗体在癌症疗法中的治疗应用的分析、结果和未来前景(Analysis,Results,and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy)”,用于癌症检测和疗法的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy),R.W.博文(R.W.Baldwin)等人(编),学术出版社(Academic Press),1985)。此类放射性同位素的实例包括(但不限于)碘-131(131I)、碘-125(125I)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)、砹-211(211At)、铼-186(186Re)、铼-186(188Re)、磷-32(32P)、钇-90(90Y)、钐-153(153Sm)和镥-177(117Lu)。
或者或另外,适用于本发明中的治疗剂可以是2007年8月7日申请的题为“作为药物载体的蝎氯毒素(Chlorotoxins as Drug Carriers)”(USSN 60/954,409)和2007年10月12日申请的题为“蝎氯毒素试剂全身投药用于诊断和治疗肿瘤(Systemic Administration of Chlorotoxin Agents for the Diagnosis and Treatment of Tumors)”(USSN60/979,714)的共有临时申请案中所述的任何治疗部分,所述申请案的完整内容按全文引用并入本文中。所述治疗剂类别的实例包括(但不限于)弱水溶性抗癌剂、与耐药性有关的抗癌剂、反义核酸、核糖酶、三联体试剂(triplex agent)、短干扰RNA(siRNA)、光敏剂、放射增敏剂、超抗原、前药活化酶和抗血管生成剂。
在某些实施例中,与蝎氯毒素试剂缔合的治疗剂(例如抗癌剂、抗血管生成剂等)是核酸试剂。
已经证实,多种癌症和肿瘤与不同程度的遗传损伤有关,例如点突变、基因缺失或重复(duplication)。已经开发出许多治疗癌症的新策略,如“反义”、“反基因”和“RNA干扰”,来调节基因的表达(A.卡洛塔(A.Kalota)等人,肿瘤生物学与治疗(Cancer Biol.Ther.),2004,3:4-12;Y.中田(Y.Nakata)等人,真核基因表达评论综述(Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.),2005,15:163-182;V.瓦奇克(V.Wacheck)和U.泽美斯特-维柯(U.Zangmeister-Wittke),肿瘤学与血液学评论(Crit.Rev.Oncol.Hematol.),2006,59:65-73;A.柯洛塔(A.Kolata)等人,药理学实验手册(Handb.Exp.Pharmacol.),2006,173:173-196)。这些方法例如利用反义核酸、核糖酶、三联体试剂或短干扰RNA(siRNA),以通过用反义核酸掩蔽目标基因的特定mRNA或用三联体试剂掩蔽其DNA,通过用核糖酶裂解核苷酸序列,或通过涉及RNA干扰的复杂机制破坏mRNA,来阻断所述mRNA或DNA的转录或翻译。在所有这些策略中,低聚核苷酸主要用作活性剂,但也曾经应用小分子和其它结构。尽管基于低聚核苷酸的基因表达调节策略对于某些癌症的治疗具有巨大潜力,但低聚核苷酸的药理学应用的主要阻碍在于,无法将这些化合物有效递送到其在癌细胞内的作用位点。(P.赫德威金(P.Herdewijn)等人,反义核酸药物的开发(Antisense NucleicAcids Drug Dev.),2000,10:297-310;Y.庄司(Y.Shoji)和H.中岛(H.Nakashima),当代药物设计(Curr.Charm.Des.),2004,10:785-796;A.W.童(A.W Tong)等人,分子疗法新进展(Curr.Opin.Mol.Ther.),2005,7:114-124)。
在一些实施例中,药剂与第二治疗剂组合投予和/或包含第二治疗剂,所述第二治疗剂包含可用作治疗(例如,抗癌)剂的核酸分子。多种化学类型和结构形式的核酸可以适用于此类策略。其包括(作为非限制性实例)DNA,包括单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA);RNA,包括(但不限于)ssRNA、dsRNA、tRNA、mRNA、rRNA、酶RNA;RNA:DNA杂交体、三联体DNA(例如dsDNA与短低聚核苷酸缔合)等。
在本发明一些实施例中,核酸试剂的长度介于约5个与2000个核苷酸之间。在一些实施例中,核酸试剂为至少约6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、1920、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、4041、42、43、44、45、46、47、48、49、50个或50个以上核苷酸长。在一些实施例中,核酸试剂的长度小于约2000、1900、1800、1700、1600、1500、1400、1300、1200、1100、1000、900、800、700、600、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50、45、40、35、30、25、20或20个以下核苷酸。
在一些实施例中,核酸试剂包含启动子和/或其它调控转录的序列。在一些实施例中,核酸试剂包含复制起点和/或其它调控复制的序列。在一些实施例中,核酸试剂不包括启动子和/或复制起点。
适用于实践本发明的核酸抗癌剂包括靶向以下基因的药剂:与肿瘤发生和细胞生长或细胞转化有关的基因(例如原癌基因,其编码刺激细胞分裂的蛋白质)、血管生成/抗血管生成的基因、肿瘤抑制基因(其编码抑制细胞分裂的蛋白质)、编码与肿瘤生长和/或肿瘤迁移有关的蛋白质的基因,和诱导细胞凋亡或其它形式细胞死亡的自杀基因(suicide gene),尤其是在迅速分裂的细胞中活性最强的自杀基因。
与肿瘤发生和/或细胞转化有关的基因序列的实例包括MLL融合基因、BCR-ABL、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、Bcl-2、AML1-ETO、AML1-MTG8、Ras、Fos PDGF、RET、APC、NF-1、Rb、p53、MDM2等;过度表达的序列,如多药耐药性基因;细胞周期素;β-连环素蛋白(beta-Catenin);端粒酶基因;c-myc、n-myc、Bcl-2、Erb-B1和Erb-B2;和突变序列,如Ras、Mos、Raf和Met。肿瘤抑制基因的实例包括(但不限于)p53、p21、RB1、WT1、NF1、VHL、APC、DAP激酶、p16、ARF、神经纤维瘤蛋白(Neurofibromin)和PTEN。可由适用于抗癌疗法中的核酸分子靶向的基因的实例包括编码与肿瘤迁移有关的蛋白质(如整合素、选择素(selectin)和金属蛋白酶)的基因;编码促进新血管形成的蛋白质(如血管内皮生长因子(VEGF)或VEGFr)的抗血管生成基因;编码抑制新血管生成的蛋白质(如内皮细胞阻断剂、血管新生阻断剂和VEGF-R2)的抗血管生成基因;和编码例如以下蛋白质的基因:白细胞介素、干扰素、成纤维细胞生长因子(α-FGF和β-FGF)、类胰岛素生长因子(例如IGF-1和IGF-2)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNF)、转化生长因子(例如TNF-α和TNF-β)、表皮生长因子(EGF)、角化细胞生长因子(KGF)、干细胞因子和其受体c-Kit(SCF/c-Kit)配体、CD40L/CD40、VLA-4 VCAM-1、ICAM-1/LFA-1、透明质酸(hyalurin)/CD44等。所属领域技术人员将认识到,前述实例是不详尽的。
适用于本发明中的核酸可具有多种活性中的任一种,包括例如作为抗癌剂或其它治疗剂、探针、引物等。核酸可具有酶活性(例如核糖酶活性)、基因表达抑制活性(例如作为反义试剂或siRNA试剂等)和/或其它活性。核酸本身可以具有活性,或者可以作为载体递送活性核酸试剂(例如,通过所递送核酸的复制和/或转录)。出于本说明书的目的,如果此类载体核酸编码或以其它方式递送治疗活性剂,那么即使其本身不具有治疗活性,也可将其视为“治疗剂”。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂与包含或编码反义化合物的核酸治疗剂组合投予,和/或包含所述核酸治疗剂。术语“反义化合物或试剂”、“反义低聚物”、“反义低聚核苷酸”与“反义低聚核苷酸类似物”在本文中可互换使用,并且指核苷酸碱基和亚基至亚基主链的序列,其允许反义化合物通过沃特森-克里克(Watson-Crick)碱基配对与RNA中的目标序列杂交,由此在目标序列内形成RNA低聚物杂化双链(heteroduplex)。所述低聚物可以在目标序列内具有精确的序列互补性或接近的互补性。所述反义低聚物可阻断或抑制含有目标序列的mRNA的翻译,或抑制基因转录。反义低聚物可结合于双链或单链序列。
适用于实践本发明的反义低聚核苷酸的实例包括例如以下综述中提到者:R.A斯戴尔(R.A Stahel)等人,肺癌(Lung Cancer),2003,41:S81-S88;K.F.派尔洛(K.F.Pirollo)等人,药理学与治疗学(Pharmacol.Ther.),2003,99:55-77;A.C.史蒂芬斯(A.C.Stephens)和R.P.瑞文斯(R.P.Rivers),分子治疗新进展(Curr.Opin.Mol.Ther.),2003,5:118-122;N.M.狄恩(N.M.Dean)和C.F.本纳特(C.F.Bennett),致癌基因(Oncogene),2003,22:9087-9096;N.斯奇翁(N.Schiavone)等人,当代药物设计(Curr.Pharm.Des.),2004,10:769-784;L.维德尔(L.Vidal)等人,欧洲癌症杂志(Eur.J.Cancer),2005,41:2812-2818;T.埃波-法德尔(T.Aboul-Fadl),当代药物化学(Curr.Med.Chem.),2005,12:2193-2214;M.E.格里夫(M.E.Gleave)和B.P.蒙娜(B.P.Monia),癌症自然评论(Nat.Rev.Cancer),2005,5:468-479;Y.S.卓中(Y.S.Cho-Chung),当代药物设计,2005,11:2811-2823;E.雷伯恩(E.Rayburn)等人,药物设计与发现通讯(Lett.Drug Design & Discov.),2005,2:1-18;E.R.雷伯恩(E.R.Rayburn)等人,新兴药物的专家观点(Expert Opin.Emerg.Drugs),2006,11:337-352;I.泰姆(I.Tamm)和M.瓦格纳(M.Wagner),分子生物技术(Mol.Biotechnol.),2006,33:221-238(各按全文引用并入本文中)。
适合的反义低聚核苷酸的实例包括例如奥利默森钠(olimerson sodium)(也称为GenasenseTM或G31239,吉特纳公司(Genta,Inc.)开发,新泽西州伯克利海茨(Berkeley Heights,NJ)),即一种靶向bcl-2mRNA的起始密码子区的硫代磷酸酯(phosphorothioate)低聚物,所述bcl-2 mRNA是一种有效的细胞凋亡抑制剂,并且在包括滤泡性淋巴瘤、乳癌、结肠癌和前列腺癌以及中度/高度淋巴瘤在内的许多癌症中过度表达(C.A.斯塔恩(C.A.Stein)等人,肿瘤学论文集(Semin.Oncol),2005,32:563-573;S.R.弗兰克尔(S.R.Frankel),肿瘤学论文集,2003,30:300-304)。其它适合的反义低聚核苷酸包括GEM-231(HYB0165,海伯顿公司(Hybridon,Inc.),马萨诸塞州剑桥(Cambridge,MA)),其为针对cAMP依赖性蛋白激酶A(PKA)的混合主链低聚核苷酸(S.高尔(S.Goel)等人,临床癌症研究(Clin.Cancer Res.),203,9:4069-4076);Affinitak(ISIS 3521或阿皮诺卡森(aprinocarsen),ISIS制药公司(ISIS pharmaceuticals,Inc.),加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,CA)),一种PKC-α的反义抑制剂;OGX-011(Isis 112989,Isis制药公司(Isis Pharmaceuticals、Inc.)),一种2′-甲氧基乙基修饰过的针对丛生蛋白(clusterin)的反义低聚核苷酸,所述丛生蛋白是涉及细胞周期调控、组织重建、脂质运输和细胞死亡的糖蛋白,并且在乳癌、前列腺癌和结肠癌中过度表达;ISIS 5132(Isis 112989,Isis制药公司),一种与c-raf-1mRNA的3′-非翻译区序列互补的硫代磷酸酯低聚核苷酸(S.P.汉瑞(S.P.Henry)等人,抗癌药物设计(Anticancer Drug Des.),1997,12:409-420;B.P.莫尼亚(B.P.Monia)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),1996,93:15481-15484;C.M.鲁丁(C.M.Rudin)等人,临床癌症研究(Clin.Cancer Res.),2001,7:1214-1220);ISIS 2503(Isis制药公司),一种人H-ras mRNA表达的硫代磷酸酯低聚核苷酸反义抑制剂(J.库雷克(J.Kurreck),欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.),2003,270:1628-1644);靶向细胞凋亡蛋白的X连锁抑制剂(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP;其阻断大部分的细胞凋亡路径)的低聚核苷酸,如GEM 640(AEG 35156,艾吉纳治疗剂公司(Aegera Therapeutics Inc.)和海伯顿公司(Hybridon、Inc.))或靶向生存素(survivin,一种细胞凋亡蛋白抑制剂(IAP))的低聚核苷酸,如ISIS 23722(Isis制药公司),一种2′-O-甲氧基乙基嵌合低聚核苷酸;MG98,其靶向DNA甲基转移酶;以及GTI-2040(罗鲁斯治疗剂公司(Lorus Therapeutics,Inc.),加拿大多伦多(Toronto,Canada)),一种20聚体低聚核苷酸,其与人核糖核苷酸还原酶R2小亚基组分的mRNA中的编码区互补。
其它适合的反义低聚核苷酸包括针对Her-2/neu、c-Myb、c-Myc和c-Raf正开发的反义低聚核苷酸(参看例如A.比罗西(A.Biroccio)等人,致癌基因(Oncogene),2003,22:6579-6588;Y.李(Y.Lee)等人,癌症研究(Cancer Res.),2003,63:2802-2811;B.卢(B.Lu)等人,癌症研究,2004、64:2840-2845;K.F.皮埃罗(K.F.Pirollo)等人,药物学与治疗学(Pharmacol.Ther.),2003,99:55-77;和A.瑞特(A.Rait)等人,纽约科学院年鉴(Ann.N.Y.Acad.Sci.),2003,1002:78-89)。
在某些实施例中,适用于本发明中的核酸抗癌剂包含或编码干扰RNA分子。术语“干扰RNA”与“干扰RNA分子”在本文中可互换使用,并且指可以例如通过介导RNA干扰(RNAi)抑制或下调基因表达,或者以序列特异性方式使基因沉默的RNA分子。RNA干扰(RNAi)是一种由双链RNA(dsRNA)触发的在进化中保守的序列特异性机制,其诱导互补目标单链mRNA的降解以及对应翻译序列的“沉默”(麦克曼斯(McManus)和夏普(Sharp),2002,遗传学自然评论(Nature Rev.Genet.),2002,3:737)。RNAi通过将较长的dsRNA链酶法裂解成约21到23个核苷酸长的生物活性“短干扰RNA”(siRNA)序列来起作用(埃尔巴萨(Elbashir)等人,基因研究(Genes Dev.),2001,15:188)。RNA干扰已成为一种颇具前景的癌症治疗途径。
适用于实践本发明的干扰RNA可以按数种形式中的任一种提供。例如,所提供的干扰RNA可以是经分离的短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微小RNA(miRNA)或短发夹RNA(shRNA)中的一种或多种。
适用于本发明中的干扰RNA分子的实例包括例如以下综述中所提到的iRNA:O.米尔哈维(O.Milhavet)等人,药理学研究(Pharmacol.Rev.),2003,55:629-648;F.比利(F.Bi)等人,当代基因治疗(Curr.Gene.Ther.),2003,3:411-417;P.Y.卢(P.Y.Lu)等人,分子治疗新进展(Curr.Opin.Mol.Ther.),2003,5:225-234;I.弗雷德里奇(I.Friedrich)等人,癌症生物学研究文辑(Semin.Cancer Biol),2004,14:223-230;M.埃兹奎托(M.Izquierdo),癌症基因疗法(Cancer Gene Ther.),2005,12:217-227;P.Y.卢(P.Y.Lu)等人,遗传学进展(Adv.Genet.),2005,54:117-142;G.R.戴维(G.R.Devi),癌症基因疗法,2006,13:819-829;M.A.贝霍克(M.A.Behlke,)分子治疗(Mol.Ther.),2006,13:644-670;和L.N.普托尔(L.N.Putral)等人,药物新闻与展望(Drug News Perspect),2006,19:317-324(各文献都按全文引用并入本文中)。
适合的干扰RNA分子的其它实例包括(但不限于)p53干扰RNA(例如,T.R.布鲁蒙坎普(T.R.Brummelkamp)等人,科学(Science),2002,296:550-553;M.T.赫曼(M.T.Hemman)等人,自然遗传学(Nat.Genet.),2003,33:396-400);靶向bcr-abl融合基因的干扰RNA,所述bcr-abl融合基因与慢性骨髓性白血病和急性淋巴细胞性白血病的发展有关(例如,M.斯奇尔(M.Scherr)等人,血液学(Blood),2003,101:1566-1569;M.J.李(M.J.Li)等人,低聚核苷酸(Oligonucleotides),2003,13:401-409);抑制NPM-ALK的表达的干扰RNA,所述NPM-ALK是一种在75%的间变性大细胞淋巴瘤中发现的蛋白质,其会引起与肿瘤形成有关的组成性活性激酶的表达(U.瑞特(U.Ritter)等人,低聚核苷酸,2003,13:365-373);靶向致癌基因的干扰RNA,所述致癌基因如Raf-1(T.F.楼(T.F.Lou)等人,低聚核苷酸,2003,13:313-324)、K-Ras(T.R.布鲁蒙坎普等人,癌细胞(Cancer Cell),2002,2:243-247)、erbB-2(G.杨(G.Yang)等人,生物化学杂志(J.Biol.Chem.),2004,279:4339-4345);靶向b-连环素蛋白的干扰RNA,所述b-连环素蛋白的过度表达将引起T细胞因子目标基因的转活化(transactivation),而这一转活化被认为是结肠直肠癌中的主要转化事件(M.范德维特灵(M.van de Wetering)等人,EMBO报告,2003,4:609-615)。
在一些实施例中,本文所述的蝎氯毒素试剂与推荐用于治疗血管生成相关性疾病、病症或病况的一种或多种治疗方案组合投予,或作为利用一种或多种推荐用于治疗血管生成相关性疾病、病症或病况的治疗方案的治疗方案的一部分投予。举例来说,推荐用于治疗癌症的方案可参见美国癌症研究会(National Cancer Institute)的网页URL:www.cancer.gov。推荐用于治疗黄斑变性的方案可参见网页URL:www.mayoclinic.org/macular-degeneration/treatment.html。治疗方案可以包括化疗、手术和/或放射疗法。
C.标记部分
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂经至少一个标记部分标记。例如,可以用标记部分标记一个或多个蝎氯毒素部分和/或一个或多个治疗部分。
标记部分可以便利蝎氯毒素试剂在结合于待测试组织后的检测。标记部分可经选择,使得其产生能被测量的信号并且信号强度与结合于组织的诊断剂的量相关(例如成比例)。
在一些实施例中,标记不会实质上干扰蝎氯毒素试剂的预定生物或药物活性。在某些实施例中,标记涉及将一个或多个标记部分连接至或并入至蝎氯毒素部分,例如至蝎氯毒素部分的肽序列上的非干扰位置。所述非干扰位置是不参与蝎氯毒素部分与肿瘤细胞的特异性结合的位置。
标记部分可以是允许在蝎氯毒素试剂结合于相关组织或系统后进行检测的任何实体。多种可检测试剂中任一者都可用作本发明蝎氯毒素试剂中的标记部分。标记部分可以直接检测或间接检测。标记部分的实例包括(但不限于):各种配体、放射性核素(例如,3H、14C、18F、19F、32P、35S、135I、125I、123I、64Cu、187Re、111In、90Y、99mTc、177Lu等)、荧光染料(有关具体的例示性荧光染料,参看下文)、化学发光试剂(例如吖啶酯(acridinum ester)、稳定化的二氧杂环丁烷(stabilized dioxetane)等)、生物发光试剂、光谱上可分辨的无机荧光半导体纳米晶体(即,量子点)、金属纳米粒子(例如,金、银、铜、铂等)纳米团簇、顺磁性金属离子、酶类(有关酶类的具体实例,参见下文)、色度标记(例如染料、胶体金等)、生物素、地高辛(dioxigenin)、半抗原以及有抗血清或单克隆抗体可用的蛋白质。
在某些实施例中,标记部分包含荧光标记。许多已知的具有多种化学结构和物理特征的荧光标记部分适用于实践本发明的诊断方法。适合的荧光染料包括(但不限于)荧光素(fluorescein)和荧光素染料(例如,异硫氰酸荧光素或FITC、萘并荧光素(naphthofluorescein)、4′,5′-二氯-2′,7′-二甲氧基荧光素、6-羧基荧光素或FAM等)、羰花青(carbocyanine)、部花青(merocyanine)、苯乙烯基染料、氧杂菁(oxonol)染料、藻红蛋白(phycoerythrin)、赤藓红(erythrosin)、伊红(eosin)、罗丹明(rhodamine)染料(例如,羧基四甲基罗丹明或TAMRA、羧基罗丹明6G、羧基-X-罗丹明(ROX)、丽丝胺罗丹明B(lissamine rhodamine B)、罗丹明6G、罗丹明绿、罗丹明红、四甲基罗丹明(TMR)等)、香豆素(coumarin)和香豆素染料(例如,甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素、氨甲基香豆素(AMCA)等)、俄勒冈绿(Oregon Green)染料(例如,俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514等)、德州(Texas)红、德州红-X、Spectrum RedTM、Spectrum GreenTM、菁(cyanine)类染料(例如,Cy-3TM、Cy-5TM、Cy-3.5TM、Cy-5.5TM等)、Alexa Fluor系列染料(例如,Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680等)、BODIPY染料(例如,BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665等)、IRD染料(例如,IRD40、IRD 700、IRD 800等)等。有关适合的荧光染料以及将荧光染料与如蛋白质和肽等其它化学实体偶联的方法的更多实例,参看例如“荧光探针和研究产物手册(The Handbook of Fluorescent Probes and Research Products)”,第9版,分子探针公司(Molecular Probes,Inc.),俄勒冈州尤金(Eugene,OR)。荧光标记试剂的有利特性包括高摩尔吸收系数、高荧光量子产率和耐光性。在某些实施例中,标记荧光团合意地展现在光谱的可见光范围(即,介于400nm与750nm之间)而非在紫外光范围(即,低于400nm)内的吸收和发射波长。
在某些实施例中,标记部分包含酶。适合的酶的实例包括(但不限于)ELISA中所用的酶,例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等。其它实例包括β-葡糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等。可以使用连接基,如碳化二亚胺、二异氰酸酯、戊二醛等,将酶连结至蝎氯毒素部分。
在某些实施例中,标记部分包含可利用单光子发射计算机体层成像(Single Photon Emission Computed Tomography,SPECT)或正电子发射计算机体层成像(Position Emission Tomography,PET)检测的放射性同位素。此类放射性核素的实例包括(但不限于)碘-131(131I)、碘-125(125I)、铋-212(212Bi)、铋-213(213Bi)、砹-221(211At)、铜-67(67Cu)、铜-64(64Cu)、铼-186(186Re)、铼-186(188Re)、磷-32(32P)、钐-153(153Sm)、镥-177(117Lu)、锝-99m(99mTc)、镓-67(67Ga)、铟-111(111In)和铊-201(201T1)。
在某些实施例中,标记部分包含可利用γ照相机检测的放射性同位素。此类放射性同位素的实例包括(但不限于)碘-131(131I)和锝-99m(99mTc)。
在某些实施例中,标记部分包含顺磁性金属离子,其是磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)中良好的对比增强剂。此类顺磁性金属离子的实例包括(但不限于)钆III(Gd3+)、铬III(Cr3+)、镝III(Dy3+)、铁III(Fe3+)、锰II(Mn2+)和镱III(Yb3+)。在某些实施例中,标记部分包含钆III(Gd3+)。钆是FDA批准用于MRI的对比剂,其可积累于异常组织中,使这些异常区域在磁共振图像上变得很亮(变强)。已知钆可使身体不同区域中,尤其是脑中的正常组织与异常组织之间产生强对比。
在某些实施例中,标记部分包含可利用核磁共振波谱(nuclear magnetic resonance spectroscopy,MRS)检测的稳定顺磁性同位素。适合的稳定顺磁性同位素的实例包括(但不限于)碳-13(13C)和氟-19(19F)。
D.蝎氯毒素试剂治疗剂和/或标记部分之间的缔合
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂是与至少一种第二治疗剂和/或标记部分缔合的部分。
蝎氯毒素试剂与治疗剂和/或标记部分之间的缔合可以是共价或非共价的。不管蝎氯毒素试剂与治疗剂之间的结合、相互作用或偶联的性质如何,在一些实施例中,二者之间的缔合具有选择性、特异性,而且足够强,以致第二治疗剂不会在运输/递送到并进入肿瘤中之前或期间与蝎氯毒素试剂解离。蝎氯毒素试剂与第二治疗剂之间的缔合可以使用所属领域技术人员已知的任何化学、生物化学、酶或基因偶联方法实现。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂与治疗剂和/或标记部分之间的缔合是非共价的。非共价相互作用的实例包括(但不限于)疏水相互作用、静电相互作用、偶极相互作用、范德华相互作用(van der Waals interaction)和氢键。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂与治疗剂和/或标记部分之间的缔合是共价的。所属领域技术人员将了解,所述部分可彼此直接或间接(例如通过连接子,下文将予以描述)连接。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂与治疗剂和/或标记部分彼此直接共价连接。直接共价结合可以通过如酰胺、酯、碳-碳、二硫键、氨基甲酸酯、醚、硫醚、脲、胺或碳酸酯键联等键联实现。共价结合可以利用蝎氯毒素试剂和/或治疗剂上存在的官能团实现。或者,可以用能引入适于偶联目的的有用基团(氨基、羧基或巯基)的另一氨基酸置换非关键氨基酸。或者,可以将额外氨基酸添加到蝎氯毒素试剂中,以引入适于偶联目的的有用基团(氨基、羧基或巯基)。适用于将各部分连接在一起的官能团包括(但不限于)胺、酸酐、羟基、羧基、硫醇等。可以使用如碳化二亚胺等活化剂形成直接键联。多种活化剂在此项技术中已知并且适用于连接治疗剂与蝎氯毒素部分。
在其它实施例中,蝎氯毒素试剂与治疗剂和/或标记部分经由连接基彼此间接共价连接。这可以使用此项技术中众所周知的许多稳定双官能试剂(包括同官能(homofunctional)试剂和杂官能(heterofunctional)试剂;有关所述试剂的实例,参看例如皮尔斯目录和手册(Pierce Catalog and Handbook))实现。使用双官能连接剂与使用活化剂的不同之处在于,前者使得连接部分存在于所得蝎氯毒素试剂中,而后者使得反应涉及的两个部分直接偶联。双官能连接剂的作用可以是允许两个否则呈惰性的部分之间发生反应。或者或另外,可以选择成为反应产物的一部分的双官能连接剂,以致其赋予蝎氯毒素试剂某种程度的构象灵活性(例如,所述双官能连接剂包含含有数个原子的直链烷基,例如所述直链烷基含有2到10个碳原子)。或者或另外,双官能连接剂可经选择,使得蝎氯毒素试剂与治疗剂之间形成的键联是可裂解的,例如可水解(有关此类连接剂的实例,参看例如美国专利第5,773,001号、第5,739,116号和第5,877,296号,各专利按全文引用并入本文中)。例如,当蝎氯毒素试剂与治疗剂的连结物水解后,观察到蝎氯毒素试剂和/或治疗剂的较高活性时,可以使用此类连接剂。用于将治疗剂从蝎氯毒素试剂裂解的例示性机制包括在溶酶体(腙、缩醛和类顺乌头酸酯的酰胺(cis-aconitate-like amide))的酸性pH下水解、利用溶酶体酶的肽裂解(组织蛋白酶和其它溶酶体酶类)和二硫键还原。另一用于将治疗剂从蝎氯毒素试剂裂解的机制包括在生理pH下进行细胞外或细胞内水解。此机制适用于所用来将治疗剂与蝎氯毒素部分偶联的交联剂是如葡聚糖凝胶(polydextran)等可生物降解/可生物消化实体的情形。
例如,可以利用所引入的提供预定释放特性的羰基,制备出含腙的蝎氯毒素试剂。利用包含一端具有二硫基而另一端具有肼衍生物的烷基链的连接剂,也可以制备出蝎氯毒素试剂。含有除腙外的官能团的连接剂也能够在溶酶体的酸性环境中被裂解。例如,可以由硫醇反应性连接剂制备蝎氯毒素试剂,所述硫醇反应性连接剂含有除腙外其它可以在细胞内裂解的基团,如酯、酰胺和缩醛/缩酮。
另一类pH敏感性连接剂的实例是顺乌头酸酯类,其羧酸基团与酰胺基相邻。羧酸可以加速酰胺在酸性溶酶体中水解。也可以使用能实现类似类型的水解速率加速且具有其它数种结构的连接剂。
蝎氯毒素试剂的另一潜在的释放方法是利用溶酶体酶进行肽的酶促水解。在一个实例中,肽毒素经由酰胺键连接至对氨基苯甲醇,随后苯甲醇与治疗剂之间形成氨基甲酸酯或碳酸酯。肽裂解会使氨基苯甲基氨基甲酸酯或碳酸酯断裂,并释放出治疗剂。在另一实例中,酚可通过连接剂而非氨基甲酸酯的断裂而裂解。在另一变化形式中,使用二硫键还原来起始对巯基苯甲基氨基甲酸酯或碳酸酯的断裂。
在治疗剂和/或标记部分是蛋白质、多肽或肽的实施例中,蝎氯毒素试剂与治疗剂可一起形成融合蛋白。如上文曾定义过的,融合蛋白是一种包含两种或两种以上蛋白质或肽并利用共价键经个别肽主链连接的分子。本发明方法中所用的融合蛋白可以借助此项技术中已知的任何适合的方法制备。例如,其可以使用多肽合成仪,利用直接蛋白质合成方法制备。或者,可以使用锚定引物(anchor primer)进行基因片段的PCR扩增,这些锚定引物在两个连续的基因片段之间产生互补的突出端,其随后可退火并再扩增,由此产生嵌合基因序列。融合蛋白可以借助标准重组方法得到(参看例如曼妮提斯(Maniatis)等人,“分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)”,第2版,1989,冷泉港实验室(Cold Spring Harbor Laboratory),纽约冷泉市(Cold Spring,N.Y.))。这些方法一般包含(1)构建编码预定融合蛋白的核酸分子;(2)将所述核酸分子插入重组表达载体中;(3)用所述表达载体转化适合的宿主细胞;和(4)在宿主细胞中表达所述融合蛋白。如所属领域中所知,由所述方法制备的融合蛋白可以直接从培养基回收和分离,或通过细胞的溶解来回收和分离。此项技术中众所周知许多用于纯化由经过转化的宿主细胞产生的蛋白质的方法。这些方法包括(但不限于)沉淀、离心、凝胶过滤和(离子交换、反相和亲和)柱色谱法。其它纯化方法也有所描述(参看例如德切尔(Deutscher)等人,“蛋白质纯化指南(Guide to Protein Purification)”,酶学方法(Methods in Enzymology),1990,第182卷,学术出版社(Academic Press))。
所属领域技术人员易于了解,本发明方法中所用的蝎氯毒素试剂可包含诸多蝎氯毒素部分,并且可以利用诸多不同方式与诸多治疗剂和/或标记部分彼此缔合。连结物的设计将受其预定目的以及特定应用环境中所需的特性影响。使蝎氯毒素部分与治疗剂缔合或结合形成蝎氯毒素试剂的方法的选择处在所属领域技术人员的技能范围内,而且一般取决于各部分间预定相互作用的性质(即,共价对非共价和/或可裂解对不可裂解)、治疗剂的性质、所涉及的部分上化学官能团的存在和性质等。
对于经过标记的蝎氯毒素试剂,蝎氯毒素试剂(或治疗剂)与标记部分之间的缔合可以是共价或非共价的。在共价缔合的情况下,蝎氯毒素(或治疗剂)与标记部分可如上文所述彼此直接或间接连接。
在某些实施例中,蝎氯毒素部分(或治疗剂)与标记部分之间的缔合是非共价的。非共价缔合的实例包括(但不限于)疏水相互作用、静电相互作用、偶极相互作用、范德华相互作用和氢键。例如,标记部分可通过螯合作用非共价连接至蝎氯毒素试剂(或治疗剂)(例如,金属同位素可与连接(例如融合)至蝎氯毒素部分的多聚组氨酸区(polyHis region)螯合)。
在某些实施例中,蝎氯毒素试剂(或治疗剂)经同位素标记(即,其中一个或多个原子经原子质量或质量数不同于通常在自然界发现的原子质量或质量数的原子置换)。或者或另外,同位素可以连接至蝎氯毒素试剂和/或治疗剂。
所属领域技术人员易于了解,本发明某些方法中使用的经过标记的蝎氯毒素试剂可包含诸多标记部分,并且可与诸多治疗剂缔合。所述试剂和标记部分可通过诸多不同方式彼此缔合。经过标记的蝎氯毒素试剂的设计将受其预定目的、其应用环境中所需的特性以及所选检测方法影响。
II.减少血管生成的方法
本发明减少血管生成的方法通常包含对受检者投予一定量蝎氯毒素试剂,其中所述蝎氯毒素的量能有效地使血管生成的程度相比于未投予蝎氯毒素试剂的对照受检者所观察或预期的程度有所降低。
A.适应症
本发明方法适用于改善和/或治疗涉及异常血管生成的疾病或病况。本文使用的“异常血管生成”是指不会发生在如发育、繁殖、创伤愈合等正常生物过程中的血管生成。在一些实施例中,可以使用本发明方法减少的血管生成受选自由以下组成的群组的因子刺激:血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脂多糖(LPS)、表皮生长因子(EGF)、白细胞介素-6(IL-6)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNFα)、肝细胞生长因子(HGF)和其组合。
由于血管生成涉及多种病理过程,故本发明方法可用于治疗和/或改善如癌症(包括转移性癌症)、眼部新血管生成(例如黄斑变性)、发炎性疾病(例如关节炎)等疾病。
肿瘤的发生通常依赖于新血管的形成以便继续生长和/或发展转移。因此,本发明方法可用于改善和/或治疗肿瘤。可投予蝎氯毒素试剂的受检者可能具有开始转移或已经转移的肿瘤。受检者可能具有一处或多处转移。在一些实施例中,肿瘤和/或转移的尺寸减小。
在一些实施例中,受检者患有以脉络膜新血管生成为特征的病况或疾病,或有患此病况或疾病的风险。此类病况包括(但不限于)黄斑变性、近视、眼外伤、弹性纤维假黄瘤和其组合。
黄斑变性是美国65岁及以上人群视力丧失和失明的主导原因。黄斑变性通常以年龄相关的形式发生(常称为AMD或ARMD),但也会出现青少年型黄斑变性。在AMD/ARMD中,黄斑(视网膜中负责敏锐、中心视力的部分)发生变性。黄斑变性常被诊断为干性(非新生血管性)或湿性(新生血管性)。
在干性黄斑变性中,称为玻璃膜疣的淡黄色斑点开始由主要分布在黄斑周围的退化组织的沉积物或碎片积累。中心视力一般会逐渐降低,但视力丧失的程度没有湿性黄斑变性那么严重。
湿性黄斑变性指明为“新生血管性”表明,其是以例如黄斑上新血管异常生长为特征。所述新血管可在视网膜之下生长,渗漏血液和流体。此渗漏会引起感光性视网膜细胞永久损伤,从而引起细胞死亡并在中心视力中产生盲点。湿性黄斑变性可再分为两类。在隐性形式(occult form)的湿性黄斑变性中,新血管在视网膜下的生长不显著,而且渗漏也不太明显,通常引起不太严重的视力下降。在经典形式(classic form)的湿性黄斑变性中,血管生长和瘢痕形成很明显,可以在视网膜下观察到所勾勒出的轮廓。经典湿性黄斑变性也称为经典脉络膜新血管生成,并且通常引起较为严重的视力丧失。
在已知血管生成在湿性黄斑变性(包含许多AMD/ARMD情形)中的作用下,本发明方法可用于治疗和/或改善这些病症。当前湿性黄斑变性的疗法涉及血管生成抑制剂,例如LucentisTM、MacugenTM和/或VisudyneTM,任选组合使药物靶向特定细胞的光动力疗法(photodynamic therapy,PDT)。使用高能激光束在视网膜区的异常血管中产生小烧伤的光凝术,也可用于治疗湿性黄斑变性。
在一些实施例中,受检者患有湿性黄斑变性和/或年龄相关性黄斑变性。在患有湿性黄斑变性的受检者中,受检者可以患有隐性或经典形式的湿性黄斑变性。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂使现有的新血管系统退化。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂防止新血管萌芽。在某些实施例中,蝎氯毒素试剂与如光凝术、用其它血管生成抑制剂治疗、光动力疗法等其它湿性黄斑变性治疗组合。
B.剂量和投药
在本发明方法中,蝎氯毒素试剂或其药物组合物一般会以必需或足以实现至少一个预定结果的量和时间投予。例如,所投予蝎氯毒素试剂的量和时间应使其减慢或抑制血管的形成,和/或使现有的新血管系统退化。所述作用可以得到能例如以其它方式检测的临床益处。例如,减少癌症患者体内的血管生成可减小肿瘤尺寸、减少转移数量、防止形成转移等。类似地,减少黄斑变性患者体内的血管生成可以提高视力。在另一实例中,在关节炎患者中减少血管生成可减少炎症并缓解症状。
本发明的给药方案可由单剂或历经一段时间的多剂组成。投药可以每日、每周(或其它数天的间隔)一次或多次或根据间歇性时程进行。投予的蝎氯毒素试剂或其药物组合物的确切量将随受检者不同而变化,而且取决于数个因素(参看下文)。如实例7中所论述,例如通过聚乙二醇化修饰蝎氯毒素试剂,可在保持针对血管生成的功效的同时,降低投药频率。在本发明一些实施例中,蝎氯毒素试剂每周投予不到5次。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂每周投予不到2次。
蝎氯毒素试剂或其药物组合物可以使用有效实现预定治疗作用的任何投药途径投予。在本发明某些实施例中,蝎氯毒素试剂(或其药物组合物)是全身递送。典型的全身投药途径包括(但不限于)肌肉内、静脉内、肺部和口服途径。也可以例如通过输注或推注,或通过表皮或皮肤粘膜内层吸收(例如口服、粘膜、直肠和肠粘膜等),进行全身投药。在某些实施例中,蝎氯毒素试剂经静脉内投予。
也可以使用其它投药途径。在某些实施例中,蝎氯毒素试剂通过选自由以下组成的群组的途径投予:静脉内、颅内、肌肉内、肿瘤内、皮下、眼内、眼周、局部用药或其组合。
可能需要降低眼部新血管生成疾病中血管生成的程度。在一些实施例中,蝎氯毒素试剂可递送到眼睛。例如,使用眼内和/或眼周途径,如玻璃体内注射、结膜下注射等,实现到眼睛的递送。还可以例如使用滴眼液将蝎氯毒素试剂局部施用至眼睛。
眼部投药途径特别适用于治疗眼部新血管生成疾病,如黄斑变性。
视投药途径而定,可以根据体重;体表面积;原发器官/肿瘤尺寸;和/或待治疗受检者体内转移的数量、尺寸和/或类型,计算有效剂量。所属领域技术人员根据在人临床试验中观察的药物动力学数据可易于优化适宜剂量。最终剂量方案将由主治医师根据各种改良药物作用的因素决定,如药物的具体活性;患者的损伤的严重程度和反应性;患者的年龄、健康情况、体重、性别和饮食;任何存在的感染的严重程度;投药时间;其它疗法的使用(或不使用);以及其它临床因素。当使用蝎氯毒素试剂进行研究时,将出现其它关于适宜剂量水平和治疗持续时间的信息。
典型剂量包含每公斤体重1.0pg到每公斤体重100mg。例如,对于全身投药,剂量可以是每公斤体重100.0ng到每公斤体重10.0mg。
更具体点说,在经静脉内投予蝎氯毒素试剂的某些实施例中,所述试剂的给药可包含投予一剂或多剂,其包含约0.005mg/kg到约5mg/kg,例如,约0.005mg/kg到约5mg/kg、约0.01mg/kg到约4mg/kg、约0.02mg/kg到约3mg/kg、约0.03mg/kg到约2mg/kg,或约0.03mg/kg到约1.5mg/kg蝎氯毒素。例如,在某些实施例中,所投予的一剂或多剂蝎氯毒素试剂各含有约0.03mg/kg、约0.04mg/kg、约0.05mg/kg、约0.06mg/kg、约0.07mg/kg、约0.09mg/kg、约1.0mg/kg或超过1.0mg/kg蝎氯毒素。在其它实施例中,投予的一剂或多剂蝎氯毒素试剂各含有约0.05mg/kg、约0.10mg/kg、约0.15mg/kg、约0.20mg/kg、约0.25mg/kg、约0.30mg/kg、约0.35mg/kg、约0.40mg/kg、约0.45mg/kg、约0.50mg/kg、约0.55mg/kg、约0.60mg/kg、约0.65mg/kg、约0.70mg/kg、约0.75mg/kg、约0.80mg/kg、约0.85mg/kg、约0.90mg/kg、约0.95mg/kg、约1.0mg/kg或超过约1mg/kg蝎氯毒素。在其它实施例中,投予的一剂或多剂蝎氯毒素试剂各含有1.0mg/kg、约1.05mg/kg、约1.10mg/kg、约1.15mg/kg、约1.20mg/kg、约1.25mg/kg、约1.3mg/kg、约1.35mg/kg、约1.40mg/kg、约1.45mg/kg、约1.50mg/kg或超过约1.50mg/kg蝎氯毒素。在所述实施例中,治疗可包含投予一剂蝎氯毒素试剂,或投予2剂、3剂、4剂、5剂、6剂或超过6剂。连续的两剂可间隔1天、间隔2天、间隔3天、间隔4天、间隔5天、间隔6天、间隔7天或间隔超过7天(例如10天、2周或超过2周)投予。
C.血管生成的程度
在本发明减少血管生成的方法中,可以通过与对照组比较来确定血管生成的程度。所属领域技术人员可理解,对照水平可按多种方式获得和/或评估。从类似于所投药的受检者的对照受检者得到的数据可以用于比较。或者或另外,标准值可以用作对照值。所述标准值可以由从例如临床记录、档案、文献等得到的已知数据、值、参数等计算和/或推断。
血管生成的程度可按多种方式测量。例如,血红蛋白含量、新血管生成的面积、指定视野中计出的分支点数量等,都可用作血管生成程度的指标。如转移数量(例如在癌症患者体内)、视力评分(例如在患有眼部新血管生成疾病的受检者中)等临床读数也可用于衡量血管生成程度。
在一些实施例中,与对照受检者相比较,血管生成的程度降低至少50%。
D.组合疗法
应了解,本发明方法可与额外疗法组合使用(即,本发明的治疗可与一种或多种所需治疗剂或医学程序同时、在所述治疗剂或医学程序之前或之后投予)。用于所述组合方案中的疗法(治疗剂或程序)的特定组合应考虑所需治疗剂和/或程序的相容性以及打算实现的预定治疗作用。
例如,为了减少癌症中的血管生成,本发明方法可与其它程序一起使用,取决于待治疗的肿瘤,所述其它程序包括手术、放射疗法(例如γ辐射、中子束放射疗法、电子束放射疗法、质子疗法、近距离疗法(brachytherapy)、系统性放射性同位素)、内分泌疗法、高温(hyperthermia)和冷冻疗法。
在许多转移性脑肿瘤情形中,本发明方法通常会在手术去除原发肿瘤后投予。在治疗脑肿瘤时,手术的主要目标是实现完全手术切除(gross-total resection),即,去除所有可见的原发性肿瘤。实现此目标的一个难点在于,这些肿瘤是浸润性的,即,其倾向于在正常脑结构之间进进出出。此外,可以安全从患者的脑部去除的肿瘤的量存在极大变化。如果全部或一部分肿瘤位于脑部控制关键功能的区域,那么一般不可能去除。而且,仅用手术去除和/或破坏远端部位的转移不太可能或不太实际。
在许多转移性脑肿瘤情形中,本发明的治疗通常会与放射疗法组合(即,与其同时、在其之前或之后)投予。在常规治疗中,放射疗法一般是在手术后进行。辐射一般是以历时数周的一系列每日治疗(称为分割(fraction))给予。这种投予辐射的“分割式”方法对于最大限度地破坏肿瘤细胞和最小化对相邻正常脑的副作用很重要。被投予辐射的区域(称为辐射场)应小心计算,以尽可能避免包括较多的正常脑。
或者或另外,本发明方法可与其它治疗剂(如削弱任何不良作用的药剂,例如止吐剂等)和/或其它获批准的化疗药物组合投予。化疗剂的实例包括(但不限于)烷化剂类药物(例如,氮芥、苯丁酸氮芥、环磷酰胺、美法仑、异环磷酰胺等)、抗代谢物类(例如,甲氨喋呤等)、嘌呤拮抗剂类和嘧啶拮抗剂类(例如,6-巯基嘌呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、吉西他宾等)、纺锤体毒素类(例如,长春花碱、长春新碱、长春瑞宾、紫杉醇等)、鬼臼毒素类(例如,依托泊苷、伊立替康、拓扑替康等)、抗生素类(例如,多柔比星、博来霉素、丝裂霉素等)、硝基脲类(例如,卡莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀等)、无机离子类(例如,顺铂、卡铂等)、酶类(例如,天冬酰胺酶等)和激素类(例如,他莫昔芬、亮丙立德、氟他胺、甲地孕酮等)等。有关最新癌症疗法更为详尽的论述,参看http://www.cancer.gov/;FDA 批准的肿瘤药物清单,http://www.fda.gov/cder/cancer/druglistframe.htm;以及默克诊疗手册,第17版,1999,所述参考的完整内容都按引用并入本文中。
本发明方法也可与作为治疗方案的一部分的一种或多种其它的细胞毒性剂组合一起使用,其中所述其它的细胞毒性剂组合选自:CHOPP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、强的松(prednisone)和丙卡巴肼);CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和强的松);COP(环磷酰胺、长春新碱和强的松);CAP-BOP(环磷酰胺、多柔比星、丙卡巴肼、博来霉素、长春新碱和强的松);m-BACOD(甲氨喋呤、博来霉素、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、德沙美松(dexamethasone)和亚叶酸(leucovorin));ProMACE-MOPP(强的松、甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、氮芥(mechloethamine)、长春新碱、强的松和丙卡巴肼);ProMACE-CytaBOM(强的松、甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、依托泊苷、亚叶酸、阿糖胞苷、博来霉素和长春新碱);MACOP-B(甲氨喋呤、多柔比星、环磷酰胺、长春新碱、强的松、博来霉素和亚叶酸);MOPP(氮芥、长春新碱、强的松和丙卡巴肼);ABVD(阿霉素(adriamycin)/多柔比星、博来霉素、长春花碱和达卡巴嗪);MOPP(氮芥、长春新碱、强的松和丙卡巴肼)与ABV(阿霉素/多柔比星、博来霉素和长春花碱)交替;MOPP(氮芥、长春新碱、强的松和丙卡巴肼)与ABVD(阿霉素/多柔比星、博来霉素、长春花碱和达卡巴嗪)交替;ChlVPP(苯丁酸氮芥、长春花碱、丙卡巴肼和强的松);IMVP-16(异环磷酰胺、甲氨喋呤和依托泊苷);MIME(丙脒腙(methyl-gag)、异环磷酰胺、甲氨喋呤和依托泊苷);DHAP(德沙美松、高剂量阿糖胞苷和顺铂);ESHAP(依托泊苷、甲基泼尼松龙(methylpredisolone)、高剂量阿糖胞苷和顺铂);CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、强的松和博来霉素);CAMP(洛莫司汀、米托蒽醌、阿糖胞苷和强的松);CVP-1(环磷酰胺、长春新碱和强的松)、ESHOP(依托泊苷、甲基泼尼松龙、高剂量阿糖胞苷、长春新碱和顺铂);EPOCH(依托泊苷、长春新碱和多柔比星持续96小时,以及推注剂量环磷酰胺和口服强的松)、ICE(异环磷酰胺、环磷酰胺和依托泊苷)、CEPP(B)(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼、强的松和博来霉素)、CHOP-B(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱、强的松和博来霉素)、CEPP-B(环磷酰胺、依托泊苷、丙卡巴肼和博来霉素),和P/DOCE(表柔比星或多柔比星、长春新碱、环磷酰胺和强的松)。
所属领域技术人员将了解,拟与本发明治疗方法组合投予的一种或多种治疗剂的选择将取决于待治疗的转移性肿瘤。
例如,用于脑肿瘤处方中的化疗药包括(但不限于)替莫唑胺()、丙卡巴肼()和洛莫司汀(CCNU),这些药物为口服的;长春新碱(或Vincasar)、顺铂()、卡莫司汀(BCNU、BiCNU)和卡铂(),这些是静脉内投药的;以及甲氨蝶呤(或),这种药物可经口、静脉内或鞘内(即,直接注射到脊髓液中)投予。BCNU还可以在手术期间以聚合物圆片植入物(圆片)形式给予。对于脑肿瘤的一种最常用处方组合疗法是PCV(丙卡巴肼、CCNU和长春新碱),其通常每6周给予一次。
在欲治疗的肿瘤是神经外胚层起源的脑肿瘤的实施例中,本发明方法可与处理如痉挛和脑水肿等症状的药剂组合使用。投药后成功控制与脑肿瘤有关的痉挛的抗痉挛剂的实例包括(但不限于)苯妥英(phenytoin)()、卡马西平(Carbamazepine)()和双丙戊酸钠(divalproex sodium)()。脑肿胀可以用类固醇(如德沙美松())治疗。
D.药物组合物
如上文所提到的,本发明降低血管生成程度的方法包括投予蝎氯毒素试剂本身或其药物组合物。药物组合物一般包含有效量的至少一种蝎氯毒素试剂和至少一种药学上可接受的载剂或赋形剂。
药物组合物可以使用此项技术中众所周知的常规方法配制。最佳的药物制剂可视投药途径和所需剂量而变化。所述制剂可能影响所投予的化合物的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。配制可产生固体、液体或半液体药物组合物。
为便利投药和剂量均匀,药物组合物可配制成剂量单位形式。本文使用的表述“单位剂型”是指适于欲治疗的患者的蝎氯毒素试剂物理离散单元。各单元含有经过计算会产生所需治疗效果的预定量的活性物质。然而,应了解,组合物的总剂量将由主治医师在合理医学判断的范围内确定。
如上文所提到的,在某些实施例中,蝎氯毒素试剂通过注射或输注经静脉内投予。适于通过注射或输注投予的药物组合物可以根据已知技术,使用适合的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制。药物组合物也可以是于无毒稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液,例如于2,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的媒剂和溶剂有水、林格氏溶液(Ringer′s solution)、U.S.P.和等渗氯化钠溶液。此外,通常将无菌非挥发性油用作溶剂或悬浮介质。为此,可以使用任何温和的非挥发性油,包括合成单酸甘油酯或二酸甘油酯。如油酸等脂肪酸也可用于可注射制剂的制备中。
可对可注射制剂进行灭菌,例如,通过滤过细菌截留过滤器,或通过并入可在使用前溶解或分散于无菌水或其它无菌可注射介质中的无菌固体组合物形式的灭菌剂。
为延长药物的作用,通常需要减慢注射的药物的吸收。这可以通过将活性成分溶解或悬浮于油媒剂中实现。通过以生物可降解聚合物(如聚丙交酯-聚乙交酯)形成药物的微胶囊基质来制得可注射积存形式。取决于药物对聚合物的比率以及所用特定聚合物的性质,可以控制药物释放的速率。积存式可注射制剂也可通过将药物包嵌在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备。
如本文所论述的,可以利用对蝎氯毒素试剂的修饰(例如,共价键接于聚合物)来增加蝎氯毒素试剂的生物利用率。
III.膜联蛋白A2的结合剂和调节剂
据悉,膜联蛋白A2(也称为膜联蛋白II、ANX2、脂皮素等)可定位于上皮细胞的细胞膜表面。膜联蛋白A2已牵涉多种作用,包括细胞生长调控、信号转导路径和纤溶酶的产生。已显示,癌细胞中过度表达膜联蛋白A2。
本文提供的数据支持膜联蛋白A2作为蝎氯毒素结合搭配物的作用。在已知蝎氯毒素具有抗血管生成和抗肿瘤作用(本文中和此项技术中已经确定)下,其与膜联蛋白A2的潜在相互作用就特别值得关注。膜联蛋白A2促进在内皮细胞上产生纤溶酶(丝氨酸蛋白酶)。此作用可以由膜联蛋白A2结合于tPA(组织纤溶酶原活化剂)和结合于纤溶酶原介导。过量产生纤溶酶与血管生成和转移有关。同时,已经观察到纤溶酶裂解的β-2-糖蛋白1可抑制血管生成。
本文提供的数据显示,所观察到的蝎氯毒素对血管生成的作用与其潜在结合搭配物之间存在值得关注的联系。
鉴别出膜联蛋白A2为蝎氯毒素的潜在相互作用搭配物,可证实膜联蛋白A2是开发新颖疗法的目标。如蝎氯毒素可能做到的一般,结合和/或调节膜联蛋白A2的试剂都可用作有用的治疗剂。此类调节剂的筛选将揭露出新的疗法,其中有一些可能具有不同于蝎氯毒素的特征。这些新疗法可以例如允许治疗和/或改善范围更广的疾病,靶向不同细胞类型、经由不同方案和投药途径给药等。
在某些实施例中,提供鉴别可结合于膜联蛋白A2的试剂的方法。所述试剂可用于开发额外疗法,例如针对血管生成相关性病症的疗法。所述方法通常包含以下步骤:提供包含表达膜联蛋白A2的细胞的样品;使所述样品与测试剂接触;确定所述测试剂是否结合于膜联蛋白A2;以及根据确定结果,鉴别出所述测试剂为结合于膜联蛋白A2的试剂。在一些实施例中,进行另一步骤来确定所述测试剂是否调节膜联蛋白A2的功能。
在某些实施例中,提供调节表达膜联蛋白A2的细胞中膜联蛋白A2的活性的方法,其包含使所述细胞与调节膜联蛋白A2的试剂接触,由此改变膜联蛋白A2的活性。
根据本发明方法,可以使用多种测试剂中任一种。可以利用平行分析筛选小分子(例如,可以在化合物库中发现的小分子),并且鉴别出结合于膜联蛋白A2和/或调节膜联蛋白A2活性的小分子。化合物库(如来自历史上化合物集合的库和/或由定向多样性合成得到的库)适用于本发明方法中。
或者或另外,可以使用本发明方法筛选蝎氯毒素片段、衍生物和/或变异体,以鉴别出具有某些新颖和/或所需特征的蝎氯毒素片段、衍生物和/或变异体。在另一实例中,还可以测试其它毒素以及其片段、衍生物和变异体结合于和/或调节膜联蛋白A2的能力。相关蝎子毒素已于本文中论述。
在一些实施例中,可以调节的膜联蛋白A2的活性可涉及对纤溶酶原/纤溶酶活化系统的调控。例如,膜联蛋白A2与纤溶酶原和tPA(组织纤溶酶原活化剂)相互作用,并且涉及于纤溶酶的产生。
在一些实施例中,膜联蛋白A2活性包含结合于某些结合搭配物。已知的膜联蛋白A2的结合搭配物包括(但不限于)纤溶酶原、tPA(组织纤溶酶原活化剂)、S100A10(S100钙结合蛋白A10,也称为依钙蛋白(calpactin)轻链和膜联蛋白II轻链)、F-肌动蛋白、β2-糖蛋白I、磷酸酯酶A2和含Rac-1的复合物。
在一些实施例中,膜联蛋白A2的活性包含定位至细胞膜表面、定位至内皮细胞、定位至钙依赖性磷脂膜、定位于内皮细胞的粘附连接(adherens junction)处、定位于上皮细胞的粘附连接处、定位于F-肌动蛋白的组装平台和/或定位至内体(endosome)。
在一些实施例中,膜联蛋白A2的活性包含细胞生长调控、信号转导。在一些实施例中,膜联蛋白A2的活性包含抑制磷脂酶A2。
膜联蛋白A2也被认为涉及细胞内部的某些功能。在一些实施例中,膜联蛋白A2的活性包含涉及肌动蛋白组装、分选内体、使膜结构域稳定或其组合。
还怀疑或已知膜联蛋白A2在细胞外部也具有某些功能。此类活性包括涉及抗凝血反应(可能通过其作为纤溶酶/纤溶酶原活化系统的介体实现)以及充当参与破骨细胞形成和骨吸收的自分泌因子(autocrine factor)。
实例
以下实例将描述形成和实践本发明的一些模式。然而,应了解,这些实例只是出于说明的目的,而不打算限制本发明的范围。此外,除非实例部分中的描述以过去式提供,否则文本如本说明书其余部分一样,不意在暗示实验是实际进行的或数据是实际获得的。
实例1:蝎氯毒素在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)分析中的抗血管生成活性
本实例说明,TM-601(合成型蝎氯毒素)对血管生成具有剂量相关性抑制作用。在鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)分析中,与TM-601组合测试了促血管生成因子(血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脂多糖(LPS)、表皮生长因子(EGF)、IL-6、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNFα)和肝细胞生长因子(HGF))。TM-601以剂量相关性方式抑制了由所述各因子刺激的血管生成。
材料与方法
按先前所公开的进行CAM分析。(参看例如S.S.莫萨(Mousa S.S.)等人,在鸡胚绒毛尿囊膜模型中白藜芦醇对血管生成和血小板/纤维蛋白加速的肿瘤生长的影响(Effect of resveratrol on angiogenesis and platelet/fibrin-accelerated tumor growth in the chick chorioallantoic membrane model.),营养学与癌症(Nutrition and Cancer.)2005;52(1):59-65,各文献的内容都按全文引用并入本文中。)在37℃和55%湿度下,培育已受精的鸡蛋。受精后10天,用皮下注射针刺入隐藏气室的外壳区域,产生小孔。在胚膜的无血管部分正上方,刺穿鸡蛋宽面(broadside)上的外壳,产生第二个孔。向第一个孔施加负压,在第二个孔之下产生人工气室(false air sac),使膜与外壳分开。使用小砂轮,在下降的CAM的上方切入外壳,产生一个面积为约1.0cm2的窗口,由此允许直接接近下层的CAM。将滤片浸入3mg/mL的乙酸可的松(cortisone acetate)中,随后在无菌条件下风干。
每一实验都包括负对照组(PBS)、正对照组(促血管生成因子)以及利用促血管生成因子和不同剂量TM-601的处理组。将含有VEGF(2μg/mL)、bFGF(1μg/mL)、LPS(5μg/mL)、EGF(100μg/mL)、IL-6(10μg/mL)、PDGF(10μg/mL)、TNFα(10μg/mL)或HGF(10μg/ml)的滤片放到正在生长的CAM上。24小时时,将TM-601(0.001-100μg)或对照媒剂局部添加到CAM。刺激后第3天,采集CAM。从胚胎取出在滤片正下方的CAM组织,并用PBS洗涤组织3次。在30x放大倍率下,计出5mm滤片面积中血管分支点的数量作为血管萌芽操作人员的定量指标,并报告平均读数。使用以下等式计算在VEGF刺激下平均血管生成抑制百分比:
各实验设计成每组具有8个鸡蛋。然而,出于技术原因,在大多数实验组中都剩余更少的可估值的鸡蛋。此外,bFGF实验按两个独立的实验进行,各具有自己的生理盐水对照组和bFGF正对照组。汇集这些数据,显示出在TM-601的浓度范围内的剂量相关性抑制作用。
结果
在CAM分析中,促血管生成因子均强烈刺激血管生成(图1)。使用血管分支点数量的定量测量值来评估血管生成性萌芽。计算在各测试品剂量下新血管生成的抑制百分比。对于所测试的各促血管生成化合物(VEGF、bFGF、LPS、EGF、IL-6、PDGF、TNFα和HGF),TM-601是以剂量相关方式抑制血管生成的有效抑制剂(图2和图3)。这种广谱的血管生成抑制不同于许多其它的血管生成抑制剂。已知的血管生成抑制剂通常只抑制一部分或一小组涉及血管生成的路径,而且不能有效针对可适应和/或使用其它信号传导路径的肿瘤。
对于所测试的剂量范围,所观察的TM-601对bFGF、LPS或EGF刺激的血管生成的最大抑制作用为约75%到85%。对于所测试的剂量范围,所观察的TM-601对IL-6、PDGF、TNFα或HGF刺激的血管生成的最大抑制作用为约65%到75%。不希望受任何特定理论的束缚,本发明者推测,利用更高的TM-601剂量,将观察到更高的TM-601抑制作用。
讨论/结论
已经使用了CAM分析来测试TM-601是否具有抗血管生成活性。经显示,TM-601对用不同促血管生成化合物刺激的血管生成具有有效的抑制作用。对于VEGF刺激和EGF刺激的血管生成的抑制作用似乎最强,在最高测试剂量下,抑制作用超过90%。即使剂量低至0.001μg,对于VEGF刺激的血管生成的抑制作用也达到了50%抑制以上。
测试了TM-601对LPS刺激的血管生成的抑制作用。LPS是革兰氏阴性(Gram-negative)细菌外膜的主要组分。LPS可诱导强免疫反应并且还直接诱导血管生成。(参看例如泊里特(Pollet)等人,细菌脂多糖通过TRAF6介导的NF-κB和c-Jun N末端激酶活化直接诱导血管生成(Bacterial lipopolysaccharide directly induces angiogenesis through TRAF6-mediated activation of NF-KB and c-Jun N-terminal kinase.),血液学(Blood.),2003.102(5):1740-2,此案的完整内容按全文引用并入本文中。)也发现了TM-601可阻断由LPS刺激的血管生成。
尽管测试的各促血管生成化合物结合于不同的受体,但有一些共用下游信号传导路径。例如,VEGF、bFGF和LPS都通过p38MAPK和ERK1/2路径传导信号。
实例2:通过体内基质胶塞分析测量的TM-601的抗血管生成活性
本实例所述的实验测试了在体内基质胶塞分析中通过不同投药途径递送的TM-601抑制小鼠体内血管生成的能力。全身递送(每周3次静脉内注射10mg/kg TM-601)的TM-601明显减少新血管的形成,而局部(即,通过将TM-601混入基质胶中)或经由皮下注射(每日注射10mg/kg TM-601)递送的TM-601不能。各实验组中的受检者都未观察到任何体重减轻,这与TM-601处理不会产生严重毒性的观点相符。不希望受任何特定理论的束缚,本发明者提出,这些实验的结果表明,蝎氯毒素的投药途径可能会影响抗血管生成能力。
材料与方法
4℃下,将高浓度型基质胶基质(Matrigel Matrix High Concentration;BD生物科技公司(BD Biosciences))与100ng/mL VEGF、100ng/mL bFGF和3ng/mL肝素混合。将8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分成5组,每组5只小鼠。本研究的实验设计显示于表1中。
表1:小鼠基质胶塞实验的实验设计
组别 | 动物数量 | 处理 | 途径 | 剂量 | 途径/时程 |
1 | 5 | 无 | --- | --- | --- |
2 | 5 | TM-601 | 基质胶中 | 500ug/塞子 | --- |
3 | 5 | TM-601 | 基质胶中 | 5ug/塞子 | --- |
4 | 5 | TM-601 | i.v. | 10mg/kg | 每周3次 |
5 | 5 | TM-601 | s.c. | 10mg/kg | 每周7次 |
i.v.=静脉内;s.c.=皮下
如上文所述,将基质胶植入一组小鼠,用作正对照组。将植入前已添加了TM-601的基质胶植入第2和第3组小鼠中。第2组中的小鼠各植入含有500μgTM-601/塞子的塞子;第3组小鼠各植入含有5μgTM-601/塞子的塞子。将基质胶(未添加TM-601)植入第4组和第5组小鼠,并在整个研究过程中,使其接收每周3次静脉内给予或每日皮下给予的TM-601,每次注射剂量为10mg/kg。各小鼠接收2份500μL基质胶塞,经双侧注射到皮下组织中。为了形成圆形的塞子,在常规皮下插入程序后,左右移动针尖,形成一个宽的皮下囊袋。利用21-25G针迅速进行注射,以确保整个内含物被递送到塞子中。研究第0天植入基质胶塞,并在第1天开始处理。处理阶段期间,第1、4、8、11和14天称取动物的重量。
14天后,收集塞子。对小鼠实施安乐死,并将塞子上方的皮肤向后拉。切下塞子,固定,并包埋于石蜡中,以供组织学分析。利用CD31抗体对来自各可估值塞子的3个5μm厚的切片进行免疫染色,并用苏木素和伊红(H&E)进行复染色。在显微镜下测量塞子横截面面积中血管的数量,由此分析各基质胶塞。对于各处理组,分析至少6个基质胶塞,以便计算出平均微血管数量。
结果
皮下投予补充有VEGF、bFGF和肝素的基质胶塞,刺激了血管生成。为了评价在此小鼠模型中TM-601是否具有抗血管生成作用,在向动物植入或全身给予基质胶之前,将TM-601与其混合。14天后,各组的平均微血管数量表明,一个处理组显示向基质胶塞中的血管生长明显减少(图4)。每周3次静脉内注射(每次注射10mg/kg)使血管数量减少至对照组的1/1.9(p<0.01)。经皮下更频繁的全身递送相同剂量的TM-601未有效阻断血管生成。在研究开始时将5或500μg TM-601局部递送到基质胶塞中,未明显减少血管生成。微血管染色结果的例子显示于图5中。
在整个研究中,对于所有小鼠组都未观察到体重减轻,表明利用TM-601处理无严重毒性(图6)。
讨论/结论
在基质胶塞分析中,每周3次静脉内给予10mg/kg剂量的TM-601明显减少了新血管的形成。另一方面,更频繁的皮下注射10mg/kg未展现类似的作用,表明TM-601的抗血管生成活性可能对投药途径敏感。在先前测量小鼠中TM-601的药物动力学的实验中,显示了静脉内途径所产生的TM-601循环浓度高于皮下注射。即使利用更为频繁的给药时程,在本模型中,皮下递送10mg/kg也未减少血管生成。在实例1所述的实验中,使用了CAM分析来测量TM-601的抗血管生成活性。在CAM分析中,将TM-601直接施用于已经促血管生成化合物(VEGF、bFGF、LPS、EGF、IL-6、PDGF、TNFα或HGF)饱和的滤纸。TM-601对所述各促血管生成化合物显示出剂量相关性抑制,其中在100μg的最高测试剂量下观察到最大抑制(图3)。为了试图类似地通过将TM-601局部递送到血管生成部位来重现这些结果,在植入时,将5μg或500μgTM-601直接添加至基质胶塞。相比在这些特定实验中利用CAM分析所观察的结果,在基质胶塞分析中,此局部药物递送模式未阻断血管生成。不希望受任何特定理论的束缚,本发明者推测,在两个实验模型中TM-601在吸收、分布、代谢和/或排泄方面的差异可能解释所述不同结果。
实例3:在体内基质胶塞分析中投药剂量、途径和频率对TM-601的抗血管生成活性的影响
本实例中描述的实验是用于检查通过不同投药途径和不同频率以不同剂量递送的TM-601的抗血管生成活性。测量各种条件下植入小鼠中的基质胶塞中血管的生长。测试0.4、2、10和50mg/kg的剂量,以及静脉内和皮下投药途径及每周3次、每周2次和每周1次的给药时程。经由每周3次静脉内注射递送10mg/kg或50mg/kg TM-601明显减少了基质胶塞中新血管的形成。对于其它测试的给药参数(即,更低剂量、经由皮下注射和更小给药频率),没有观察到TM-601对血管生成的抑制作用。
材料与方法
4℃下,将高浓度型基质胶基质(BD生物科技公司)与100ng/mL VEGF、100ng/mLbFGF和3ng/mL肝素混合。将8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分成9组,每组6只小鼠。各小鼠接收2份500μL基质胶塞,经双侧注射到皮下组织中。为了形成圆形的塞子,在常规皮下插入程序后,左右移动针尖,形成一个宽的皮下囊袋。利用21-25G针迅速进行注射,以确保整个内含物被递送到塞子中。研究第0天植入基质胶塞,并在第1天开始处理。本研究的实验设计显示于表2中。
表2:利用不同参数的小鼠基质胶塞实验的实验设计
组别 | 动物数量 | 处理 | 途径 | 剂量 | 途径/时程 |
1 | 6 | 无 | --- | --- | --- |
2 | 6 | TM-601 | i.v. | 50mg/kg | 每周3次 |
3 | 6 | TM-601 | i.v. | 10mg/kg | 每周3次 |
4 | 6 | TM-601 | i.v. | 2mg/kg | 每周3次 |
5 | 6 | TM-601 | i.v. | 0.4mg/kg | 每周3次 |
6 | 6 | TM-601 | s.c. | 50mg/kg | 每周7次 |
7 | 6 | TM-601 | s.c. | 10mg/kg | 每周7次 |
8 | 6 | TM-601 | i.v. | 10mg/kg | 每周2次 |
9 | 6 | TM-601 | i.v. | 10mg/kg | 每周1次 |
将如上述制备的基质胶植入一组小鼠,用作正对照组。其它动物在整个研究期间全身给予TM601。处理阶段期间,第1、5、8、12和14天称取动物的重量。
第14天结束时,在取出塞子之前,在最后一次给药后1分钟和30分钟(每组1到3只动物)以及最后一次给药后15分钟和60分钟(每组4到6只动物),从第2到第7组中的小鼠收集血液。在CO2/O2麻醉下,使用未经涂布的红细胞压积测定管,经由后眼窝穿刺将血液收集到肝素锂管中。在1,500xg下离心血液15分钟,并将血浆转移到新管中。在-70℃下储存样品,并送到不同实验室以供分析。
14天后,收集塞子。对小鼠实施安乐死,并将塞子上方的皮肤向后拉。切下塞子,固定,并包埋于石蜡中,以供组织学分析。利用CD31抗体对来自各可估值塞子的3个5μm厚的切片进行免疫染色,并用H&E进行复染色。在显微镜下测量塞子横截面面积中血管的数量,由此分析各基质胶塞。对于各处理组,分析7到10个基质胶塞,以便计算出平均微血管数量。
如下所述对血液进行酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。使用兔抗TM-701抗体开展ELISA法。TM-701与TM-601有一个氨基酸不同,即在残基29存在酪氨酸取代。经显示,兔抗TM-701抗血清可与TM-601交叉反应。在4℃下用含200ng抗TM-701抗体的PBS涂布96孔板的每一孔,过夜。使用全自动洗板机(automated plate washer)洗涤板。所有洗涤都是用300μL洗涤缓冲液(含有0.1%吐温-20(Tween-20)的PBS)洗涤5次作为一个周期来进行。在所述周期的后4次洗涤中,每次洗涤之间包括一个20秒的浸泡期。在稀释剂(含有1%牛血清白蛋白的洗涤缓冲液)中稀释样品或标准品,并取100μL分析。室温下,伴随轻微摇动培育板75到90分钟,随后如前文所述洗涤板。将使用标准程序生物素化的抗TM-701抗体添加到各孔中100μL体积稀释剂中。各孔含有85ng生物素化的抗体(2.7mg/ml储备液的1/3200稀释)。伴随轻微摇动将板培育60分钟,并如前述进行洗涤。在稀释剂中以1/500稀释辣根过氧化物酶抗生蛋白链菌素(streptavidin)(维克特实验室(Vector Laboratories))并取100μL添加到各孔。伴随轻微摇动培育板45到60分钟。随后如前述洗涤板,但是不移出最后一次的洗涤液,而是使此溶液在板上保留5分钟。随后用200μl PBS漂洗各孔,并将100μl ABTS(卡尔生物化学公司(Calbiochem))添加到各孔中。每5分钟混合一次板,20分钟后,使用拜尔雷德(BioRad)500型酶标仪在415nm读取吸光度。使用软件包“Microplate Manager 5.2.1版”计算未知的样品浓度。
结果
皮下投予补充有VEGF、bFGF和肝素的基质胶塞,刺激了血管生成。为了评价在本小鼠模型中TM-601是否具有抗血管生成作用,全身注射TM601。14天后,各组的平均微血管数量表明,2个处理组显示向基质胶塞中的血管生长明显减少:每周3次静脉内注射10mg/kg或50mg/kg剂量组(图7)。尽管每周3次静脉内投予更低剂量的TM601未以统计学显著的方式影响血管生成,但似乎存在剂量相关性影响(图8)。
有趣的是,每日皮下注射5倍于10mg/kg剂量(此剂量经静脉内投药途径时减少了血管生成)的TM601引起血管生成略微而统计学上不显著的减少。此外,将每周3次的给药频率减少到每周2次或1次导致抗血管生成活性的丧失。微血管染色结果的例子显示于图9中。
在整个研究中,在任一处理组中都未观察到体重减轻,表明利用TM-601处理无严重毒性(图10)。
最后一次给药后收集血样,并分析血浆TM601含量(图11)。TM601含量和半衰期类似于先前研究中发现的结果。
讨论/结论
在基质胶塞分析中,每周3次静脉内给予10或50mg/kg剂量的TM-601明显减少了新血管的形成。不过,更频繁的皮下注射多达50mg/kg未展现类似的作用,表明TM-601的抗血管生成活性可能对投药途径敏感。在实验过程期间,每日皮下给予50m/kg提供增加到10倍以上的累积剂量(50mg/kg×14次皮下注射对10mg/kg×6次静脉内注射)。因此,即使利用更为频繁的给药时程和明显更高的总累积剂量,皮下递送50mg/kg也只引起血管生成略微而统计学上不显著的减少。实例2中描述了类似发现。在测量小鼠中TM601的药物动力学的实验(包括本实验)中,显示了静脉内途径所产生的TM601峰值循环浓度高于皮下注射。(参看例如图11)。
在本研究中,另一有趣发现是,静脉内递送的频率对于TM-601的抗血管生成作用至关重要。在本模型中,每周3次的给药时程引起血管生成的显著抑制,而每周2次或1次给药不影响血管生成。
在小鼠中,对于TM-601的所有投药途径、剂量和时程(包括每周3次静脉内递送多达50mg/kg TM601)都耐受性良好。在整个14天研究期间,所有动物组的体重都增加。
实例4:TM-601对在绒毛尿囊膜上生长的人类肿瘤的抗肿瘤活性
如实例1中所说明的,在CAM分析中,TM-601可抑制由VEGF、bFGF、LPS、EGF、IL-6、PDGF、TNFα和HGF所刺激的血管生成。本实例中所述的实验是用于确定TM-601是否能经此抗血管生成活性减慢肿瘤生长。
植到鸡蛋CAM表面上的肿瘤细胞可刺激血管生长。在针对多种人肿瘤细胞系的CAM分析中显示,TM-601减慢了肿瘤生长。然而,TM-601在体外不减慢肿瘤细胞的增殖,表明TM-601间接影响肿瘤生长。不希望受任何特定理论的束缚,假定TM-601通过其对血管系统的作用来影响肿瘤生长。为测试此假说,用TM-601或生理盐水处理在CAM上生长的肿瘤,随后分析血红蛋白含量。发现了TM-601使肿瘤中血红蛋白的量明显减少,并大概因此使肿瘤中的血管形成减少。
材料与方法
细胞培养
人肿瘤细胞系由ATCC提供,并根据供应商的建议生长。但D54-MG细胞系(由杜克大学(Duke University)的比格纳博士(Dr.Bigner)提供)和胰腺癌瘤的原代分离物除外。在添加到CAM之前,用胰蛋白酶处理未长满(subconfluent)的培养物,并悬浮于30μL中达到1×106个细胞的浓度。表3中列出在肿瘤-CAM实验中使用的肿瘤细胞系。
表3:肿瘤-CAM实验中使用的细胞系
细胞系 | 特性 |
U87-MG | 人成胶质细胞瘤(III期) |
D54-MG | 人成胶质细胞瘤(III-IV期) |
HS683 | 人非侵袭性神经胶质瘤(I期) |
H1299 | 人非小细胞癌瘤 |
PC-3 | 人前列腺腺癌 |
SK-Mel-28 | 人恶性黑素瘤 |
胰腺癌瘤 | 原代细胞培养物 |
细胞增殖研究
根据ATCC的建议培养U87和PC-3细胞。对于U87增殖研究,将约200个细胞涂于96孔盘的每个孔中,并在37℃和5%CO2下培育过夜。随后,从各孔中抽出培养基,并用含有约100、33、10、3.3、1.0、0.33、0.1、0.03、0.01、0.03或0μM TM-601的新鲜培养基更换,培育72小时。为了测定此阶段结束时细胞的数量,使用磺基罗丹明法(sulforhodamine method)(西格玛公司(Sigma),目录号TOX-6)。首先,将25μL 50%TCA添加到各孔中,并在4℃下培育板1小时。随后用水洗涤各孔4次,并风干。接着,将50μL4%磺基罗丹明溶液添加到各孔中,并对细胞染色30分钟。随后用1%乙酸洗涤各孔3次,并风干。最后,将100μL 10mM Tris添加到各孔中,5分钟后,混合盘,随后在酶标仪中,在565nm下读取吸光度。在PC-3增殖研究中,将细胞以每孔约1×104个细胞涂于24孔盘中,并在37℃下,于5%CO2中培育过夜。从各孔中抽出培养基,并一式两份,用不含添加剂、含20nM或含1μM TM-601的新鲜培养基更换。随后,再培育细胞72小时,并且在胰蛋白酶处理后,于血球计中计出细胞数量。
肿瘤CAM
在37℃和55%湿度下,培育已受精的鸡蛋。受精后10天,用皮下注射针刺入隐藏气室的外壳区域,产生小孔。在胚膜的无血管部分正上方,刺穿鸡蛋宽面上的外壳,产生第二个孔。向第一个孔施加负压,在第二个孔之下产生人工气室,使膜与外壳分开。使用小砂轮,在下降的CAM的上方切入外壳,产生一个面积为约1.0cm2的窗口,由此允许直接接近下层的CAM。干燥CAM的表面,并将30μL细胞(1×106个细胞)施用于CAM。同时,将10μgTM-601直接添加到肿瘤的表面。肿瘤继续生长7天,此时取出肿瘤块并称重。
使用类似方法测量肿瘤内的血红蛋白。将1×106个细胞与基质胶(BD生物科技公司的简化的生长因子)混合,并在研究第10天施用于CAM。将单独基质胶施用于CAM作为对照。将细胞与0.9μL 100μM TM-601储备液(360ng TM-601)混合,由此用TM-601处理细胞。此外,将0.1μL 100μM储备液施用于基质胶(40ng TM-601)周围。7天后采集肿瘤,并切离任何下层血管系统。在0.5mL双蒸水中将肿瘤匀化,并以4,000rpm离心样品10分钟。随后收集上清液,并将50μL上清液与50μL崔金氏试剂(Drabkin′s reagent;西格玛公司)混合。室温下15到30分钟后,将此混合物涂于96孔板中。在545nm下测量光学密度,并与已知血红蛋白浓度的标准曲线相比较。
结果
肿瘤-CAM实验是在三种不同情形下进行。在第一个小规模实验中,测试3种肿瘤细胞系(PC-3、U87和Sk-Mel-28)。对植到CAM表面上的肿瘤不加处理,或用10μgTM-601处理。生长7天后,称取肿瘤重量(表4)并比较各肿瘤的平均肿瘤值。对于PC-3和U87肿瘤,TM-601处理肿瘤引起肿瘤生长的显著减少(p<0.05;图12)。
表4:肿瘤重量的原始数据
在移植肿瘤时拍摄了肿瘤的照片,肿瘤的血管形成看起来有所减少(图13)。对于此观察结果,有两种解释:TM-601使肿瘤生长减少,因此引起血管生成刺激的减少;或TM-601减少血管生成,由此减慢肿瘤生长。为了辨别这两种可能性,在不同量的TM-601存在下,生长PC-3和U87的体外培养物。生长72小时后,在两种不同浓度TM-601存在下生长的PC-3细胞的数量与在无TM-601存在下生长的细胞没有明显不同。相比对照组中存在平均740,000个细胞,利用20nM TM601存在712,500个细胞,而利用1μM TM601存在708,500个细胞。类似地,在较宽的TM-601浓度范围内,U87细胞的数量没有显著减少(图14)。因此,TM-601对培养物中PC-3或U87细胞的增殖没有影响,表明TM-601不直接作用于肿瘤细胞。如先前在实例1中所描述的,在CAM模型中,TM-601可抑制血管生成,表明TM-601的主要作用是作为抗血管生成化合物。
第二个肿瘤-CAM实验是用于确定起初的发现并扩大所测试的肿瘤细胞系的数量。除先前测试的三种细胞系外,还检查了HS683、D54MG、H1299和原代胰腺癌瘤(表5)。这些结果确定了所发现的针对U87和PC-3肿瘤的肿瘤生长的作用,而且还显示,在第一个实验中统计学上不显著的SK-Mel28肿瘤生长减少在第二个实验中是显著的。TM-601也减少原代胰腺癌瘤分离物的肿瘤生长。在本实验中对TM-601无反应的肿瘤细胞系包括HS683、D54和H1299。关于此发现的一个可能的原因是,这些肿瘤的生长更慢,因此可能还没有达到肿瘤迅速生长必需要血管支持的阶段。如果情况正是如此,那么减少肿瘤血管系统的抗血管生成化合物将不如预期的有效。
表5:肿瘤生长的原始数据
为了进一步支持TM-601减少肿瘤-CAM模型中新血管生成的理论,测量在CAM上生长的肿瘤中的总血红蛋白。图16显示,TM-601处理显著降低了所测试的全部三种肿瘤(U87、D54和胰腺癌瘤)中的血红蛋白含量。有趣的是,在一个实验中,D54肿瘤生长不受TM-601处理的影响(图15),但在另一实验中血红蛋白测量值显示,D54肿瘤血液含量降低。
讨论/结论
从绒毛尿囊膜分析(CAM分析)得到的数据表明,TM-601可抑制由VEGF、bFGF、脂多糖、EGF、IL-6、PDGF、TNFα或HGF刺激的血管生成。为了确定TM-601是否能经此抗血管生成作用减慢肿瘤生长,进行实验来评估TM-601对在CAM表面上生长的人类肿瘤的影响。在CAM上生长的肿瘤细胞形成实体块,其刺激血液供应并需要血液供应来持续生长。本报告中提供的数据可支持TM-601经抗血管生成作用抑制肿瘤生长的假说。TM-601使植到CAM上的许多人类肿瘤的生长减少。这包括PC-3、U87、SK-Mel-28和胰腺癌瘤细胞。不过,不是所有的肿瘤都起反应,一些肿瘤在一些实验中起反应而在其它实验中不起反应。不希望受任何特定理论的束缚,我们提出,对于这些观察结果的一个解释可以是,肿瘤对血管支持的依赖性需要肿瘤生长到氧和养分变得有限的点。如果在实验开始时植入的细胞较少,这可能不会发生。注意到,对TM-601无反应的肿瘤平均起来倾向于小于起反应的其它较大肿瘤(参看图15),所以这可能是引起不一致的原因。图14和图16中显示了TM-601是作用于血管系统而不是直接作用于肿瘤细胞增殖的证据,表明在体外肿瘤细胞生长对TM-601不敏感,而且以TM-601处理在CAM上生长的肿瘤使肿瘤内的血红蛋白减少。因此,使用CAM分析已经证实,TM-601可抑制由特定促血管生成因子(例如VEGF、bFGF、脂多糖、EGF、IL-6、PDGF、TNFα和HGF)刺激的新血管生成以及由人肿瘤细胞刺激的血管生成。
实例5:蝎氯毒素的协同抗血管生成作用
先前使用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)分析的实验已经显示,合成蝎氯毒素(TM-601)对VEGF、bFGF、脂多糖(LPS)、EGF、IL-6、PDGF、TNFα或HGF刺激的血管生成具有剂量相关性抑制作用。在本实例中,由另一合同实验室进行实验,独立地验证此作用。此外,类似浓度的TM-601与抗VEGF抗体试剂Avastin和Lucentis都出现抗血管生成作用。当将TM-601与Avastin或Lucentis一起给予时,所述作用是相加的或协同的。最后,在CAM分析中显示,当静脉内注射TM-601时,可抑制血管生成。
使用鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)分析的实验是用于进一步评价TM-601的抗血管生成特性。实例1中已经描述了在CAM分析中针对新血管生成的作用。本实验中再进行CAM实验,是为了检查TM-601对非刺激性新血管生成的作用;重复实例1中所述的条件,证实对于VEGF、bFGF和LPS刺激的血管生成的抑制;研究静脉内注射的TM-601的抗血管生成作用;比较TM-601与已知抗血管生成抑制剂(Avastin和Lucentis)的效力;和测试TM-601与Avastin或Lucentis的组合。(关于组合Avastin或Lucentis的实验进行至少2次)。
在上文略述的各实验中显示,TM-601以剂量相关方式抑制血管生成。利用类似浓度的Avastin和Lucentis(两种抗VEGF抗体试剂)观察到所述作用。结果也表明,TM-601与两种抗VEGF抗体之间存在相加或协同作用。
材料与方法
根据进行分析的合同实验室,使用两种不同的方法进行CAM分析。在一个合同实验室中,在37℃和55%湿度下,培育已受精的鸡蛋。受精后10天,用皮下注射针刺入隐藏气室的外壳区域,产生小孔。在胚膜的无血管部分正上方,刺穿鸡蛋宽面上的外壳,产生第二个孔。向第一个孔施加负压,在第二个孔之下产生人工气室,使膜与外壳分开。使用小砂轮,在下降的CAM的上方切入外壳,产生一个面积为约1.0cm2的窗口,由此允许直接接近下层的CAM。将滤片浸入3mg/mL乙酸可的松中,随后在无菌条件下风干。每个实验都包括对照组(PBS)、正对照组(促血管生成因子)以及利用促血管生成因子和不同剂量TM-601的处理组。将含2μg/mL VEGF的无菌滤片放到正在生长的CAM上。24小时时,将TM-601(0.001-100μg)或对照媒剂局部添加到CAM。刺激后第3天,采集CAM。从胚胎取出在滤片正下方的CAM组织,并用PBS洗涤组织3次。在30x放大倍率下,计出5m滤片面积中血管分支点的数量作为血管对促血管生成化合物反应而萌芽的定量指标。由两名不同的操作人员分析每个鸡蛋,并报告平均读数。使用以下等式计算在VEGF刺激下的平均血管生成抑制百分比:
在另一合同实验室,如下进行CAM分析。在利用强制空气循环的湿润孵化机中,在37.5℃下培育已受精的鸡蛋。在胚胎期第3天,将鸡蛋敲破,并将胚胎小心地转移到100mm3皮氏培养板(Petri plate)中,在37.5℃下使其在细胞培养箱中继续发育。在胚胎期第5天,将直径为约2mm的预制的甲基纤维素片小心地植到胚绒毛尿囊膜顶部上,并将单独测试剂或血管生成刺激剂(VEGF、bFGF、LPS、对照溶液)添加到甲基纤维素片顶部上。VEGF的添加量为40ng/片,bFGF为20ng/片,而LPS为100ng/片。在细胞培养箱中,再培育胚胎2天。胚胎期第7天,在注射了染色的脱脂奶粉溶液后,检查CAM膜并定量分析新血管的形成。只利用能成活的鸡胚胎,通过测定CAM上的血管密度指数(VDI),来评价处理对血管生成的作用。各CAM的VDI值代表由血管形成的交点的数量,其中使用Image Pro Plus软件显示出在甲基纤维素片所覆盖的区域上的三个中心等距的圆。根据各组(N>5)的定量分析得到的平均VDI值列于表6和表7中,表示为生理盐水对照的百分比。为了使两个实验室产生的数据内部一致以及进行比较,使用与上文所列的PRI奥尔巴尼(PRI Albany)所用相同的等式,评价含有抑制曲线的图。图1例外,因为未施加任何血管生成刺激,不能使用同一等式。
两种CAM方法之间有两处关键不同。在第二个合同实验室中,将鸡蛋敲破,而在第一个实验室中,CAM分析是在蛋壳内执行的。而且,在第二个实验室中,分析执行2天,但在第一个实验室中,从添加药物开始到血管生成分析时止,分析进行了3天。所述方法中还可能存在其它更多微小的差异。
结果
在第一个实验室中,发现TM-601以剂量相关的方式阻断非刺激性血管生成。将对照非刺激性鸡蛋与用不同量TM-610处理过的非刺激性鸡蛋相比较。以此方式,测试TM-601对鸡蛋中正常血管生成过程的影响。原始数据显示于表6中,而曲线图显示于图17中。
表6:由TM-601介导的新血管生成显著减少
组别 | 胚胎数 | 处理 | 剂量(μg) | VDI | SEM | P值 |
1 | 10 | - | - | 33 | 1.2 | |
6 | 5 | TM-601 | 0.01 | 32 | 1.7 | NS |
5 | 7 | TM-601 | 0.1 | 29 | 0.9 | NS |
4 | 9 | TM-601 | 1 | 27 | 1.0 | 0.01 |
3 | 8 | TM-601 | 10 | 24 | 2.6 | 0.01 |
2 | 7 | TM-601 | 100 | 27 | 2.5 | 0.05 |
VDI=血管密度指数
SEM=测量的标准误差
NS=统计学上不显著
第二个实验室也重现了实例1中描述的结果,显示出TM-601可抑制VEGF、bFGF和LPS刺激的血管生成。如前述,此作用是剂量相关的(表7和图18)。与只用刺激剂的对照组相比较,除用0.001μgTM-601处理的经VEGF刺激的胚胎组外,所有值都统计学显著降低。图19中所示的照片是具代表性的,而且显示出用TM-601处理的CAM与只用血管生成刺激剂处理的CAM的比较。
表7:TM-601介导的血管生成抑制
组别 | 刺激剂 | 处理 | 剂量(μg) | 抑制%(相对于对照组) | P值* |
1 | 无 | 无 | 无 | - | - |
2 | VEGF | 无 | 无 | 100 | - |
3 | VEGF | TM-601 | 0.001 | 88 | NS |
4 | VEGF | TM-601 | 0.01 | 70 | <0.05 |
5 | VEGF | TM-601 | 0.1 | 68 | <0.05 |
6 | VEGF | TM-601 | 1 | 75 | <0.05 |
7 | VEGF | TM-601 | 10 | 65 | <0.05 |
8 | VEGF | TM-601 | 100 | 67 | <0.05 |
1 | 无 | 无 | 无 | - | - |
2 | bFGF | 无 | 无 | 100 | - |
3 | bFGF | TM-601 | 0.001 | 83 | <0.05 |
4 | bFGF | TM-601 | 0.01 | 82 | <0.01 |
5 | bFGF | TM-601 | 0.1 | 80 | <0.01 |
6 | bFGF | TM-601 | 1 | 69 | <0.001 |
7 | bFGF | TM-601 | 10 | 64 | <0.01 |
8 | bFGF | TM-601 | 100 | 60 | <0.05 |
1 | 无 | 无 | 无 | - | - |
2 | LPS | 无 | 无 | 100 | - |
3 | LPS | TM-601 | 0.001 | 87 | <0.05 |
4 | LPS | TM-601 | 0.01 | 67 | <0.001 |
5 | LPS | TM-601 | 0.1 | 65 | <0.001 |
6 | LPS | TM-601 | 1 | 56 | <0.001 |
7 | LPS | TM-601 | 10 | 61 | <0.001 |
8 | LPS | TM-601 | 100 | 52 | <0.05 |
NS=统计学上不显著。
*相对于刺激剂对照组(第2组)
到此为止,这些发现显示TM-601对血管形成具有抑制作用。然而,为了确定所述效力与其它抗血管生成治疗剂比较如何,进行一个CAM实验,其中测量TM-601以及两种获批准的抗血管生成治疗剂Avastin和Lucentis对VEGF刺激的血管生成的抑制作用。Avastin和Lucentis都是重组人化抗VEGF抗体。其不同之处在于,Lucentis是分子量较小的抗体片段,被设计成增加其渗透性。比较基于添加到CAM的抑制剂重量的抑制曲线,Lucentis和TM-601是最有效的(最低抑制剂质量具有最大抑制作用,图21)。当就抑制剂的摩尔量绘图时,因Avastin抗体的尺寸相对较大,而TM-601的尺寸较小,曲线偏移(图22)。以摩尔量计,TM-601不如Avastin或Lucentis有效。
在已知TM-601抑制由多种受体路径(VEGF、bFGF、LPS、EGF、IL-6、PDGF、TNFα和HGF)刺激的血管生成且Avastin/Lucentis只对VEGF路径起作用下,我们接下来测试了TM-601是否能与Avastin或Lucentis一起作用,从而增加抗血管生成作用的效力。倘若如此,那么所述作用可以是相加的(各单独抑制剂的总和)或协同的(比相加作用大)。此实验进行2次。如图23和图24所示,施用TM-601和Avastin或Lucentis都产生比任一单独药物强的抗血管生成活性。此作用是否由相加活性产生,或是否发生协同作用,仍不清楚。
讨论/结论
在两个独立实验室中都重现了TM-601对新血管生成的剂量相关性抑制作用。一个实验室的数据显示,与对正常发育中鸡血管系统的抑制作用(图24)相比较,当使用促血管生成因子刺激血管生成(图25)时的抑制水平更为明显。局部施用TM-601(图18)以及在单次静脉内注射(图20)后,观察到对于VEGF刺激的血管生成的抑制。
为了确定由TM-601处理引起的血管生成抑制的水平是否类似于其它抗血管生成化合物,在与TM-601相同的实验中,独立添加两种抗VEGF抗体(Avastin和Lucentis)。以质量计,TM-601和Lucentis是最有效的,但当以摩尔量计时,Avastin和Lucentis比TM-601有效。用以进一步比较TM-601与其它抗血管生成药物的未来实验可能涉及体内模型,如眼部黄斑变性模型。此类模型将允许考虑清除速率和不良作用,这可能有助于确定TM-601是否与Avastin和Lucentis同样有效。
在另一组实验中,将TM-601与Avastin或Lucentis一起给予。利用本实例中的实验不太可能确证TM-601与这两种抗VEGF抗体是起相加作用还是协同作用。分开给予的各药物的抑制作用的总和大致等于当同时给予两种药物时观察到的抑制作用,表明作用是相加的。
不过,以不同方式分析所述组合作用,可能显示协同作用。当将Avastin剂量增加9倍(0.067pmol对0.67pmol)时,血管生成的抑制水平仅增加47%,而当将仅0.25pmolTM-601添加到0.067pmol Avastin中时,引起158%的增加(图23A)。当将Lucentis与TM-601组合时,也观察到此反应(图23B)。因此,以摩尔量计,将TM-601添加到Avastin或Lucentis中相比于增加任一单独抗体药物的浓度,对于抑制血管生成显著更有效。
实例6:蝎氯毒素对脉络膜新血管生成的抑制和使之退化
新血管的形成(血管生成)以及这些血管的维持被认为是转移的重要要素。在本实例中,使用脉络膜新血管生成分析,来评价蝎氯毒素抑制血管生成和/或引起现有的新形成的血管退化的能力。在诱导血管形成的时间左右开始投予蝎氯毒素时,蝎氯毒素使新血管形成显著减少。在诱导血管形成开始后数天投予蝎氯毒素的实验范例中,蝎氯毒素使脉络膜新生血管显著退化。
材料与方法
借助于光凝术,利用530nm激光,诱导脉络膜新血管生成(CNV)。在各视网膜后极部9点、12点和3点位置产生3处烧伤。如果在激光诱导时产生气泡,那么可以判定布鲁赫氏膜成功破裂。本研究中只包括观察到气泡的烧伤。
在第一个实验中,在激光光凝术后,于一只眼中经玻璃体内注射1μL 50mg/mLTM-601溶解于生理盐水中得到的溶液(n=17只动物,49处可以计量的烧伤),且在对侧眼中注射1μL生理盐水(n=17只动物,44处可以计量的烧伤)。7天后,重复注射。研究第14天,对小鼠灌注经荧光素标记的葡聚糖(平均分子量为2×106,西格玛公司),制备脉络膜平片并利用荧光显微镜检查。
在第二个实验中,于第1天执行激光光凝术。对于处理开始前CNV的基线测量值,在第7天,对一组10只小鼠(30处可以计量的烧伤)灌注经荧光素标记的葡聚糖。剩余小鼠一只眼接收眼内注射的1μL 50mg/mLTM-601溶液(n=12只动物,34处可以计量的烧伤),而对侧眼接收生理盐水(n=13只动物,32处可以计量的烧伤)。第14天,对所有剩余小鼠灌注经荧光素标记的葡聚糖,制备脉络膜平片并利用荧光显微镜检查。
测量脉络膜平片中脉络膜新血管生成损伤的尺寸。灌注经荧光素标记的葡聚糖后,取出眼睛,并在10%福尔马林(formalin)缓冲液中固定1小时。去除角膜和晶状体,并从眼窝中切下整个视网膜。在脉络膜中从边缘到中纬线(equator)作出径向切口,并平铺眼窝。利用荧光显微镜检查平片,并将图像数字化。使用Image-Pro Plus软件(麦登赛博尼克公司(Media Cybernetics))测量与各烧伤有关的脉络膜新血管生成的总面积。
结果
在小鼠中用激光光凝术破裂布鲁赫氏膜引起脉络膜新血管生成(CNV),其模拟在患有新血管性年龄相关性黄斑变性的患者中所发生的CNV的许多情况。为了确定TM-601在本模型中是否影响新血管的形成,在执行激光光凝术当天(第1天)和第7天,经玻璃体内注射50μgTM-601。在相同时间点,将生理盐水注入对照眼。布鲁赫氏膜破裂后14天,分析各眼的脉络膜平片。发现利用眼内50μg剂量TM-601时,TM-601处理可显著减少新血管的形成(图32和图34)。
为了评估TM-601对本模型中预先存在的新血管系统的作用,延迟通过眼内注射50μgTM-601的处理,直到布鲁赫氏膜破裂后7天。此时,已经存在较大的新血管生成部位(参看图26中的基线)。第14天测量时,在第7天单次注射生理盐水对新血管的形成无影响(图33中的对照组),而单次注射TM-601使CNV显著退化(图26和图27)。
讨论/结论
本实例表明,局部投予的TM-601可显著抑制CNV,并使CNV退化。经显示,新血管的退化是经由CNV损伤内的细胞凋亡而发生。(参看例如R.利玛(Lima R.)等人,2006.a2(IV)胶原蛋白的重组非胶原结构域通过诱导细胞凋亡引起脉络膜新血管生成退化(Recombinant non-collagenous domain of a2(IV)collagen causes involution of choroidal neovascularization byinducing apoptosis.),细胞生理学杂志(Journal of Cellular Physiology)208:161-166,所述文献的完整内容按全文引用并入本文中。)CNV小鼠模型模拟湿性形式的黄斑变性的疾病状态。本研究中使用的玻璃体内投药途径为临床上相关的,因为它是用于投予(临床上批准用于黄斑变性的疗法)的途径。
实例7:聚乙二醇化蝎氯毒素的生物利用率和抗血管生成作用
在本实例中,研究聚乙二醇化蝎氯毒素,以确定蝎氯毒素的体内半衰期是否增加。还检查了聚乙二醇化蝎氯毒素的抗血管生成作用。
材料与方法
聚乙二醇化
使用多分散性、线性40kDa PEG-丙醛(道尔制药公司(DowPharma)),经由还原氨化将TM-601肽的N末端聚乙二醇化。
TM-601半衰期的测量
通过单次尾静脉注射,将TM-601(剂量为约2mg/kg)经静脉内注射到无肿瘤C57BL/6小鼠中。在不同时间点取得血样,并借助ELISA,使用抗TM-601抗体测定TM-601的含量。
小鼠基质胶塞
4℃下,将高浓度型基质胶基质(BD生物科技公司)与100ng/mL VEGF、100ng/mLbFGF和3ng/mL肝素混合。将8周龄的雌性C57BL/6小鼠随机分配到各组中,每组6只小鼠。各小鼠接收2份500μL基质胶塞,经双侧注射到皮下组织中。为了形成圆形的塞子,在常规皮下插入程序后,左右移动针尖,形成一个宽的皮下囊袋。利用21-25G针迅速进行注射,以确保整个内含物被递送到塞子中。研究第0天植入基质胶塞,并在第1天开始处理。对动物静脉内注射媒剂(生理盐水)、TM-601或聚乙二醇化TM-601。使用三种给药方案:每周1次,持续两周(第1天1次和第8天1次;“Q7Dx2”);每周2次,持续2周(第1天、第4天、第8天和第11天;“Q3Dx2/2”);和每周5次,持续2周(第1天、第2天、第3天、第4天、第5天、第8天、第9天、第10天、第11天和第12天;“Q1Dx5/2”)。14天后收集塞子。对小鼠实施安乐死,并将塞子上方的皮肤向后拉。切下塞子,固定,并包埋于石蜡中,以供组织学分析。利用CD31抗体对来自各可估值塞子的3个5μm厚的切片进行免疫染色,并用苏木素和伊红进行复染色。在显微镜下,分析各基质胶塞的横截面面积中血管的数量。
结果/讨论
如图28所示,与未经修饰的TM-601比较,聚乙二醇化TM-601的体内半衰期增加。聚乙二醇化使TM-601的半衰期增加约32倍,即,约25分钟(TM-601)对约16小时(TM-601-PEG)。
半衰期增加在血管生成模型中转化成以更低频率对动物给药的能力。在小鼠基质胶塞分析中,根据多种时程,给予动物TM-601或聚乙二醇化TM-601(TM-601-PEG)。测量微血管密度,并解释所述密度的降低以表示抗血管生成作用。
利用所测试的两个频率最高的给药时程(每周2次,持续2周,“Q3DX2/2”;和每周5次,持续2周,“Q1Dx5/2”)时,TM-601和TM-601-PEG都具有抗血管生成作用(图29)。利用所测试的频率最低的给药时程(每周1次,持续2周,“Q7DX2”)时,TM-601不显示任何抗血管生成作用,而利用此给药时程时,用TM-601-PEG的处理引起微血管密度显著降低(图29)。
不希望受任何特定理论的束缚,以更低频率对动物给药的能力可能是因为TM-601-PEG的可利用时间比TM-601长。这一利用率增加可能使暴露于新血管形成部位的时间变长,从而允许更为持久的作用。
实例8:利用结膜下注射递送的蝎氯毒素的抗血管生成作用
一些眼部病症(如湿性形式的黄斑变性)涉及异常血管生成。在本实例中,测试动物眼睛血管生成模型(具体地说,小鼠脉络膜新血管生成模型)中TM-601的抗血管生成作用。利用结膜下注射(一种常用于对眼睛投药的途径)递送TM-601,并检查其针对血管生成的功效。
材料与方法
小鼠脉络膜新血管生成模型
借助于利用530nm激光的光凝术,诱导小鼠中脉络膜新血管生成(CNV)。在各视网膜后极部9点、12点和3点位置产生3处烧伤。如果在激光诱导时产生气泡,那么布鲁赫氏膜明显成功破裂。本研究中只包括观察到气泡的烧伤。
结膜下注射
第1天和第8天,在一只眼中眼周(结膜下)注射5μLTM-601溶解于生理盐水中的溶液。制备出浓度为约2、10、50和200mg/ml的TM-601,由此总剂量分别为约10、50、250和1000μg。对一组动物注射相同体积的生理盐水。研究第14天,对小鼠灌注经荧光素标记的葡聚糖(平均分子量为2×106,西格玛公司),制备脉络膜平片并利用荧光显微镜检查。对侧眼(未经处理的眼)用作对照,不接收注射。
测量脉络膜新血管生成
测量脉络膜平片中脉络膜新血管生成损伤的尺寸。灌注经荧光素标记的葡聚糖后,取出眼睛,并在10%福尔马林缓冲液中固定1小时。去除角膜和晶状体,并从眼窝中切下整个视网膜。在脉络膜中从边缘到中纬线作出径向切口,并平铺眼窝。利用荧光显微镜检查平片,并将图像数字化。使用Image-Pro Plus软件(麦登赛博尼克公司)测量与各烧伤有关的脉络膜新血管生成的总面积。
结果与讨论
在小鼠眼睛中诱导脉络膜新血管生成,并通过在一只眼中结膜下注射TM-601来处理小鼠。未经处理的眼睛用作对照。如图30所示,用TM-601的处理引起新生血管总面积的剂量相关性减小。结膜下递送的TM-601的抗血管生成作用看起来在60μg TM-601左右(大致等于约20-30mg/kg)最大。当与注射生理盐水的对照组相比较时,这些减少显著不同(p<0.05)。有趣的是,未经注射的对照眼(“对侧眼”)中新生血管的总面积似乎也以剂量相关的方式减小,但减小程度不如关于经注射眼所观察的高。不希望受任何特定理论的束缚,所述观察的作用可能是由TM-601从注射部位扩散到另一眼中所引起。不过,在未经注射的对侧眼中所观察的作用可能是人为的。
这些结果表明,TM-601当通过结膜下注射递送时,以剂量相关的方式发挥抗血管生成作用。
实例9:局部施用含TM-601的滴眼液
实例8说明,TM-601可递送到眼睛,并阻断眼睛中新血管的形成。在实例8中,TM-601是利用结膜下注射递送。所测试的递送TM-601的其它投药途径包括眼内(参看实例6)、玻璃体内(参看实例6)和静脉内(参看实例2),所有这些途径都曾成功用于递送有效抗血管生成的TM-601。
在本实例中,研究另一种对眼睛投药的途径。局部递送滴眼液形式的TM-601,并测试其抗血管生成作用。局部投药具有非侵袭性的优势。滴眼液将是将TM-601递送至眼睛以治疗如血管生成相关性病症(例如湿性黄斑变性)等病症的替代性方法。
材料与方法
本实例中使用的小鼠脉络膜新血管生成模型和测量CNV的程序如实例8中所述。
在整个研究中,每日3次经由局部滴眼液给予TM-601。将TM-601溶解于含70%葡聚糖和0.3%羟丙基甲基纤维素(hypromellose)(活性成分)的溶液中,达到约1、5或25mg/mL的浓度。因此,在每滴约为10μL的情况下,剂量为约10、50或250μg。与实例8中一样,第14天,对所有小鼠灌注经荧光素标记的葡聚糖,制备脉络膜平片并利用荧光显微镜检查。
结果与讨论
经由滴眼液对已经诱导脉络膜新血管生成的小鼠递送总计约0、0.03mg、0.15mg或0.75mg TM-601。如图31所示,在最高测试剂量(750μg;约25-40mg/kg)下,局部递送的TM-601是有效的。对于任何测试剂量未观察到毒性。这些结果表明,TM-601当经由滴眼液递送时,可阻断血管的形成。
实例10:蝎氯毒素结合搭配物
为了更好地了解蝎氯毒素发挥其抗血管生成作用的机制,本发明者进行了一系列用以鉴别蝎氯毒素结合搭配物的实验。先前的实验表明,蝎氯毒素特异性结合肿瘤细胞表面上的一种(或多种)抗原。本发明者已经设计了实验来阐明所述一种或多种抗原的特性。
不希望受任何特定理论的束缚,本发明者提出,与蝎氯毒素特异性相互作用的蛋白质或抗原的相关特性包括以下一者或多者:1)在下拉分析(pull-down assay)中与蝎氯毒素共沉淀;2)不与不结合蝎氯毒素的细胞系结合;3)存在于质膜中;4)不与如珠粒和/或非蝎氯毒素衍生肽等对照试剂相互作用;5)与可由TM-601肽以竞争方式破坏的细胞系相互作用;6)当在细胞中敲除和/或敲低所述蛋白质/抗原时,蝎氯毒素与所述细胞的结合减少;和/或7)当再添加所述蛋白质/抗原的表达时,蝎氯毒素与所述经敲除和/或敲低的细胞的结合恢复。
正使用蛋白质交联实验来鉴别可结合于蝎氯毒素的蛋白质。TM-601将被允许结合于U87神经胶质瘤细胞。用不可透过膜的试剂处理细胞,以交联细胞表面可结合于蝎氯毒素的蛋白质。在聚丙烯酰胺凝胶上,借助于电泳分离总细胞溶解产物(其中将包括蛋白质-蝎氯毒素复合物)。在蛋白免疫印迹(Western blot)上,使用亲和纯化的抗TM-601抗体探查交联的复合物。使用蛋白免疫印迹上的谱带鉴别蝎氯毒素的潜在结合物。
还使用TM-602(合成生物素化形式的蝎氯毒素)进行下拉实验。与蛋白质交联实验类似,TM-602被允许结合于U87神经胶质瘤细胞。对细胞进行处理,以使表面蛋白与蝎氯毒素交联。使用与抗TM-601抗体连接的珠粒,从总细胞溶解产物中下拉出复合物。(抗TM-601抗体也识别TM-602。)接着在聚丙烯酰胺凝胶上,借助于电泳分离出下拉的复合物。凝胶上的蛋白质代表对蝎氯毒素的潜在结合物。从凝胶上切下一些蛋白质谱带,并利用气相色谱法/质谱法测序。
初始的下拉实验鉴别出数种作为蝎氯毒素潜在结合物的蛋白质。膜联蛋白A2(一种与细胞膜缔合的蛋白质)是蝎氯毒素的潜在结合搭配物之一。利用抗TM-601抗体下拉出复合物中的膜联蛋白A2,并在蛋白免疫印迹上使用抗膜联蛋白A2抗体加以检测。
为了检查膜联蛋白A2结合蝎氯毒素的可能性,进行敲低实验,其中使用针对膜联蛋白A2表达的siRNA。随后评价蝎氯毒素与敲低膜联蛋白A2的细胞的结合。
在4℃下,使痕量的经放射标记的TM-601与细胞表面结合。此外,添加递增量的未经标记的TM-601以显示对表面受体的竞争。进行与未经处理的Panc-1细胞或经一组减少细胞中膜联蛋白A2的siRNA转染的Panc-1细胞的结合。如图32中所示,发现敲低膜联蛋白A2的siRNA显著减少TM-601与细胞表面的表面结合。
膜联蛋白A2表达在内皮细胞的表面上,并且在某些肿瘤类型中过度表达。膜联蛋白A2已经被表征为调控促血管生成蛋白和/或抗血管生成蛋白(例如纤溶酶原和纤溶酶)的转化的对接台(docking station)。
看起来,膜联蛋白A2与蝎氯毒素之间在体内存在特异性相互作用。正在进行额外实验来阐明膜联蛋白A2在体内是否结合于蝎氯毒素。不希望受任何特定理论的束缚,提出蝎氯毒素可能通过结合于膜联蛋白A2,借此改变膜联蛋白A2对于血管生成所涉及因子的调控,来介导其部分抗血管生成作用。
膜联蛋白A2已牵涉多种作用。考虑到所提出的膜联蛋白A2调控纤溶酶/纤溶酶原活化系统的作用,蝎氯毒素的抗血管生成作用以及与膜联蛋白A2的潜在相互作用值得关注。膜联蛋白A2促进在内皮细胞上产生纤溶酶(丝氨酸蛋白酶)。此作用可以由膜联蛋白A2结合于tPA(组织纤溶酶原活化剂)和结合于纤溶酶原介导。过量产生纤溶酶与血管生成和转移有关。同时,已经观察到纤溶酶裂解的β-2-糖蛋白1可抑制血管生成。尽管有关蝎氯毒素、膜联蛋白A2和下游调控蛋白(如纤溶酶)的确切机制细节仍有待阐明,但本文提供的数据显示,所观察的蝎氯毒素对血管生成的作用与其潜在结合搭配物之间存在值得关注的关联。
在已知蝎氯毒素是多种疾病和病况的有效疗法(如本文和此项技术中所确定)下,本发明的发现确定,膜联蛋白A2作为蝎氯毒素的潜在相互作用搭配物,是鉴别新药剂的理想目标。如蝎氯毒素可能做到的一般,结合和/或调节膜联蛋白A2的试剂都可用作有用的治疗剂。此类调节剂的筛选将揭露出新的疗法,其中有一些可能具有不同于蝎氯毒素的特征。这些新疗法可以例如允许治疗和/或改善范围更广的疾病,靶向不同细胞类型、经由不同方案和投药途径给药等。
蝎氯毒素的其它潜在结合物(例如通过初始下拉实验鉴别的)也可以在额外实验中加以研究。
其它实施例
考虑到本文所揭露的发明的说明或实践,本发明其它实施例对所属领域技术人员来说是很明显的。所述说明和实例应仅视为例示性的,而本发明的真实范围将由随附权利要求书说明。
Claims (51)
1.一种方法,其包含对受检者投予一定量蝎氯毒素试剂的步骤,其中所述蝎氯毒素的量有效地使血管生成的程度相比于未投予蝎氯毒素试剂的对照受检者所观察或预期的程度有所降低。
2.根据权利要求1所述的方法,其中相对于正常细胞,所述蝎氯毒素试剂选择性靶向癌细胞。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述受检者具有肿瘤。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述肿瘤为转移性肿瘤。
5.根据权利要求3所述的方法,其中所述受检者具有至少一处转移。
6.根据权利要求3至5中任一权利要求所述的方法,其中所述肿瘤和/或转移的尺寸减小。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述血管生成受选自由以下组成的群组的因子刺激:血管内皮生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、脂多糖(LPS)、表皮生长因子(EGF)、白细胞介素-6(IL-6)、血小板源性生长因子(PDGF)、肿瘤坏死因子(TNFα)、肝细胞生长因子(HGF)和其组合。
8.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂结合于膜联蛋白A2(AnnexinA2)。
9.根据权利要求7所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂间接结合于膜联蛋白A2。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂直接结合于膜联蛋白A2。
11.根据权利要求1所述的方法,其另包含投予第二治疗剂。
12.根据权利要求11所述的方法,其中所述第二治疗剂为抗癌剂。
13.根据权利要求11所述的方法,其中所述第二试剂是血管生成抑制剂。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述血管生成抑制剂选自由贝伐单抗(bevacizumab)、来尼珠单抗(ranibizumab)和其组合组成的群组。
15.根据权利要求11所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂与所述第二治疗剂是同时投予。
16.根据权利要求11所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂是在投予所述第二治疗剂之前投予。
17.根据权利要求11所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂是在投予所述第二治疗剂之后投予。
18.根据权利要求11所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂与所述第二治疗剂缔合。
19.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂是通过选自由以下组成的群组的投药途径投予:静脉内、颅内、肌肉内、肿瘤内、皮下、眼内、眼周、局部用药和其组合。
20.根据权利要求19所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂是通过选自由以下组成的群组的投药途径投予:玻璃体内、结膜下注射和其组合。
21.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂是递送到眼睛。
22.根据权利要求21所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂是使用滴眼液投予。
23.根据权利要求1所述的方法,其中所述受检者患有或易患以异常血管生成为特征的病况或疾病。
24.根据权利要求23所述的方法,其中所述病况或疾病是以脉络膜新血管生成为特征。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述病况或疾病选自由以下组成的群组:黄斑变性、近视、眼外伤、弹性纤维假黄瘤和其组合。
26.根据权利要求25所述的方法,其中所述病况或疾病为黄斑变性。
27.根据权利要求26所述的方法,其中所述黄斑变性选自由湿性黄斑变性、年龄相关性黄斑变性和其组合组成的群组。
28.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂与细胞毒性部分缔合。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂与所述细胞毒性部分融合形成融合蛋白。
30.根据权利要求28所述的方法,其中所述细胞毒性部分选自由以下组成的群组:毒素、生物活性蛋白、化疗用抗生素、溶核酶、放射性同位素和其组合。
31.根据权利要求29所述的方法,其中所述毒素包含由以下组成的群组的成员:白树素(gelonin)、蓖麻毒素(ricin)、皂素(saponin)、绿脓杆菌外毒素(Pseudomonas exotoxin)、美洲商陆抗病毒蛋白(pokeweed antiviral protein)、白喉毒素(diphtheria toxin)和补体蛋白。
32.根据权利要求31所述的方法,其中所述细胞毒性部分包含放射性同位素。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述放射性同位素包含碘-131(131I)。
34.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂与标记部分缔合。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述标记部分包含选自由以下组成的群组的部分:荧光团、放射性同位素、顺磁性金属离子和其组合。
36.根据权利要求35所述的方法,其中所述标记部分包含放射性同位素。
37.根据权利要求36所述的方法,其中所述标记部分包含碘-131(131I)、碘-125(125I)或其组合。
38.根据权利要求37所述的方法,其中所述放射性同位素包含99mTc。
39.根据权利要求1所述的方法,其中与所述对照受检者相比较,所述血管生成程度降低至少50%。
40.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂共价连接至聚合物。
41.根据权利要求40所述的方法,其中所述聚合物是聚乙二醇(PEG)。
42.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂在所述受检者体内的半衰期为至少约10小时。
43.根据权利要求42所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂在所述受检者体内的所述半衰期为至少约16小时。
44.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂是每周投予不到5次。
45.根据权利要求44所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂是每周投予不到2次。
46.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂使现有的新血管系统退化。
47.根据权利要求1所述的方法,其中所述蝎氯毒素试剂防止新血管萌芽。
48.一种鉴别结合于膜联蛋白A2的试剂的方法,其包含:
a)提供一种样品,其包含表达膜联蛋白A2的细胞;
b)使所述样品与测试剂接触;
c)确定所述测试剂是否结合于膜联蛋白A2;及
d)根据所述确定结果,鉴别所述测试剂为结合于膜联蛋白A2的试剂。
49.根据权利要求48所述的方法,其另包含确定所述测试剂是否调节膜联蛋白A2的功能。
50.一种调节表达膜联蛋白A2的细胞中膜联蛋白A2的活性的方法,其包含使所述细胞与调节膜联蛋白A2的试剂接触,由此改变膜联蛋白A2的活性。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述膜联蛋白A2的活性是纤溶酶原调控。
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C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
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