JP5586576B2 - 血管新生の阻害 - Google Patents

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関連出願の情報
この出願は、２００８年３月２０日に出願された米国仮出願第６１／０３８，３８３号および２００８年５月１５日に出願された同第６１／０５３，６５１号（これらの両方の全体の内容は、それらの全体において参考として本明細書に援用される）に対する優先権およびその利益を主張する。
血管新生は、新たな血管が形成されるプロセスであり、正常な発生、再生、および創傷修復の間に起こる。異常な血管新生は、腫瘍増殖、眼の新生血管形成、および関節炎を含む、各種の病的状態の一因である。
クロロトキシンは、神経膠腫を標的とする候補として前臨床的に研究されているジャイアント・イエロー・イスラエル・スコーピオンＬｅｉｕｒｕｓ Ｑｕｉｎｑｅｓｔｒｉａｔｕｓ由来の毒で発見されたペプチドである。腫瘍を診断および処置するための組成物および方法（特許文献１；特許文献２；特許文献３；および特許文献４を参照、そのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている）は、クロロトキシンが腫瘍細胞に結合する能力に基づいて開発された。
米国特許第５，９０５，０２７号明細書 米国特許第６，０２８，１７４号明細書 米国特許第６，３１９，８９１号明細書 米国特許第６，４２９，１８７号明細書
癌などの病的状態におけるその役割のために、血管新生は潜在的な治療薬にとって魅力的な標的である。それにもかかわらず、血管新生の阻害は、血管新生を制御する複数の経路によって複雑になっている。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ）によって誘導され、重要な血管新生促進因子である。複数の抗血管新生治療薬は、ＶＥＧＦを特異的に標的とする。
腫瘍細胞は、シグナル伝達経路を切換えることが可能であり、これにより腫瘍細胞をある血管新生阻害薬に耐性とすることができる。たとえば、ＨＩＦ経路阻害薬（たとえばＶＥＧＦ阻害薬）による細胞の処置によって、ＨＩＦ非依存性経路を使用して血管新生を刺激し、増殖および／または転移を続けることができる腫瘍の選択に至ることがある。とりわけ本発明には、ＦＤＡが承認したいずれの血管新生阻害薬にも見られない、広範囲に及ぶ（すなわち複数のシグナル伝達経路にわたる）血管新生の阻害が好都合であろうという認識が含まれる。
本明細書では血管新生を阻害する新規方法が開示される。本発明は、クロロトキシン剤が新生血管形成を阻害できるおよび／または既存の新たに形成された血管の退行を引き起こすことができるという発見を含む。発明者らは、クロロトキシン剤が広範囲の血管新生促進因子によって刺激された新生血管形成を阻害可能であることを発見し、このことは現在市販されている血管新生阻害薬ではこれまで報告されていない。さらにクロロトキシン剤は、静脈内、眼内、および局所を含む各種の投与経路を介して送達されるときに、抗血管新生効果を及ぼすことができる。複数の例示的な投与経路によって、クロロトキシン剤の眼への送達が行われる。
いくつかの態様において、本発明は、ある量のクロロトキシン剤を被験体に投与するステップを含む方法を提供し、ここでクロロトキシンの量は、クロロトキシン剤が投与されない対照被験体で観察または予想されるものと比較して、血管新生の程度が低下されるように有効である。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、正常細胞よりも癌細胞を選択的に標的とする。被験体は、たとえば転移性腫瘍などの腫瘍を有し得る。被験体は、たとえば少なくとも１つの転移を有し得る。いくつかの実施形態において、腫瘍および／または転移のサイズが縮小される。
ある実施形態において、被験体は異常な血管新生を特徴とする状態または疾患に罹患している、または罹りやすい。たとえば、状態または疾患は、脈絡膜新生血管形成を特徴とし得る。このような状態または疾患の例は、これに限定されるわけではないが、黄斑変性症（滲出型黄斑変性症（ｗｅｔ ｍａｃｕｌａｒ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）、加齢性黄斑変性症などを含む）、近視、眼球外傷（ｏｃｕｌａｒ ｔｒａｕｍａ）、弾性線維性仮性黄色腫、およびその組合せを含む。
いくつかの実施形態において、血管新生は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、およびその組合せからなる群より選択される因子によって刺激される。
いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、静脈内、頭蓋内、筋肉内、腫瘍内、皮下、眼内、眼周囲 局所適用、およびその組合せからなる群より選択される投与経路によって投与される。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、結膜下注射などによって硝子体内に投与される。
ある実施形態において、クロロトキシン剤は眼に送達される。投与は、たとえば本明細書で言及するような眼内および／または眼周囲経路を使用し得る。代わりにまたはさらに、クロロトキシン剤を眼に送達するために点眼薬が使用され得る。
ある実施形態において、クロロトキシン剤は、細胞傷害性部分と会合されている。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、細胞傷害性部分と融合して融合タンパク質を形成する。細胞傷害性部分は、たとえば毒素、生物活性タンパク質、化学療法抗生物質、核酸分解酵素、放射性同位体、およびその組合せからなる群より選択され得る。毒素の例は、これに限定されるわけではないが、ゲロニン、リシン、サポニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリア毒素、補体タンパク質、およびその組合せを含む。いくつかの実施形態において、細胞傷害性部分は放射性同位体を含む。たとえば放射性同位体は、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）を含み得る。
ある実施形態において、クロロトキシン剤は、標識部分と会合されている。標識部分は、たとえばフルオロフォア、放射性同位体、常磁性金属イオン、およびその組合せからなる群より選択される部分を含み得る。いくつかの実施形態において、標識部分は放射性同位体、たとえばヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、その組合せなどを含む。いくつかの実施形態において、放射性同位体は９９ｍＴｃを含む。
ある実施形態において、クロロトキシン剤はポリマーに共有結合される。ポリマーは、たとえばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る。
ある実施形態において、被験体でのクロロトキシン剤の半減期は、少なくとも約１０時間である。いくつかの実施形態において、半減期は少なくとも約１６時間である。
ある実施形態において、クロロトキシン剤は、週に５回未満投与される。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、週に２回未満投与される。
いくつかの実施形態において、血管新生の程度は、対照被験体と比較して少なくとも５０％低下される。
いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、既存の新生血管系の退行を引き起こす。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は新しい血管の出芽を防止する。
本発明は、アネキシンＡ２が薬物開発にとって所望の標的であるという認識をさらに含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載するように投与されたクロロトキシン剤は、アネキシンＡ２に結合する。クロロトキシン剤とアネキシンＡ２との間の結合は、直接的または間接的であり得る。
いくつかの態様において、本発明は、アネキシンＡ２を発現する細胞を含む試料を提供することと；試料と試験剤とを接触させることと；試験剤がアネキシンＡ２に結合するか否かを決定することと；決定に基づいて、試験剤をアネキシンＡ２に結合する薬剤として同定することと；を含む、アネキシンＡ２に結合する薬剤を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態において、このような方法は、薬剤がアネキシンＡ２機能を調節するか否かを決定することをさらに含む。
いくつかの態様において、本発明は、細胞にアネキシンＡ２活性が変化されるようにアネキシンＡ２を調節する薬剤を接触させることを含む、アネキシンＡ２を発現する細胞においてアネキシンＡ２活性を調節する方法を提供する。
ある実施形態において、本発明は、クロロトキシン剤を被験体に投与することを含み、第２の治療剤を投与することをさらに含む治療方法を提供する。第２の治療剤は、たとえば抗ガン剤、血管新生阻害薬などであり得る。いくつかの実施形態において、血管新生阻害薬は、ベバシズマブ、ラニビズマブ、およびその組合せからなる群より選択される。クロロトキシン剤および第２の治療剤は、同時に投与され得る。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、第２の治療剤が投与される前に投与される。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、第２の治療剤が投与された後に投与される。クロロトキシン剤は、第２の治療剤と会合され得る。ある実施形態において、クロロトキシン剤は、アネキシンＡ２に結合する、および／またはアネキシンＡ２を調節する少なくとも１つの他の薬剤と組合せて投与される。ある実施形態において、クロロトキシン剤は、少なくとも１つの他の治療剤と組合せて投与されるか、または黄斑変性症などの眼の新生血管形成障害のための少なくとも１つの他の療法と併せて投与される。このような治療剤は、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）およびＭａｃｕｇｅｎ（商標）などの血管新生阻害薬を含み得る；このような療法は、光凝固、たとえばレーザによる処置を含み得る。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
ある量のクロロトキシン剤を被験体に投与するステップを含む方法であって、該量のクロロトキシンは、クロロトキシン剤が投与されない対照被験体で観察または予想されるものと比較して、血管新生の程度が低下されるように有効である、方法。
（項目２）
前記クロロトキシン剤が正常細胞よりも癌細胞を選択的に標的とする、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記被験体が腫瘍を有する、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記腫瘍が転移性腫瘍である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記被験体が少なくとも１つの転移を有する、項目３に記載の方法。
（項目６）
前記腫瘍および／または転移のサイズが縮小される、項目３〜５のいずれかに記載の方法。
（項目７）
前記血管新生が血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、およびその組合せからなる群より選択される因子によって刺激される、項目１に記載の方法。
（項目８）
前記クロロトキシン剤がアネキシンＡ２を結合する、項目１に記載の方法。
（項目９）
前記クロロトキシン剤がアネキシンＡ２を間接的に結合する、項目７に記載の方法。
（項目１０）
前記クロロトキシン剤がアネキシンＡ２を直接結合する、項目９に記載の方法。
（項目１１）
第２の治療剤を投与することをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１２）
前記第２の治療剤が抗癌剤である、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
前記第２の治療剤が血管新生阻害薬である、項目１１に記載の方法。
（項目１４）
前記血管新生阻害薬が、ベバシズマブ、ラニビズマブ、およびその組合せからなる群より選択される、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記クロロトキシン剤および前記第２の治療剤が同時に投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１６）
前記クロロトキシン剤が、前記第２の治療剤が投与される前に投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１７）
前記クロロトキシン剤が、前記第２の治療剤が投与された後に投与される、項目１１に記載の方法。
（項目１８）
前記クロロトキシン剤が前記第２の治療剤と会合される、項目１１に記載の方法。
（項目１９）
前記クロロトキシン剤が静脈内、頭蓋内、筋肉内、腫瘍内、皮下、眼内、眼周囲、局所適用、およびその組合せからなる群より選択される投与経路によって投与される、項目１に記載の方法。
（項目２０）
前記クロロトキシン剤が硝子体内、結膜下注射、およびその組合せからなる群より選択される投与経路によって投与される、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記クロロトキシン剤が眼に送達される、項目１に記載の方法。
（項目２２）
前記クロロトキシン剤が点眼薬を使用して投与される、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記被験体が異常な血管新生を特徴とする状態または疾患に罹患している、または罹りやすい、項目１に記載の方法。
（項目２４）
前記状態または疾患が脈絡膜新生血管形成を特徴とする、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
前記状態または疾患が黄斑変性症、近視、眼球外傷、弾性線維性仮性黄色腫、およびその組合せからなる群より選択される、項目２４に記載の方法。
（項目２６）
前記状態または疾患が黄斑変性症である、項目２５に記載の方法。
（項目２７）
黄斑変性症が滲出型黄斑変性症、加齢性黄斑変性症、およびその組合せからなる群より選択される、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
前記クロロトキシン剤が細胞傷害性部分と会合される、項目１に記載の方法。
（項目２９）
前記クロロトキシン剤が細胞傷害性部分と融合して融合タンパク質を形成する、項目２８に記載の方法。
（項目３０）
前記細胞傷害性部分が毒素、生物活性タンパク質、化学療法抗生物質、核酸分解酵素、放射性同位体、およびその組合せからなる群より選択される、項目２８に記載の方法。
（項目３１）
前記毒素がゲロニン、リシン、サポニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリア毒素、および補体タンパク質から成る群のメンバを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞傷害性部分が放射性同位体を含む、項目３１に記載の方法。
（項目３３）
前記放射性同位体がヨウ素−１３１（ １３１ Ｉ）を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記クロロトキシン剤が標識部分と会合される、項目１に記載の方法。
（項目３５）
前記標識部分がフルオロフォア、放射性同位体、常磁性金属イオン、およびその組合せからなる群より選択される部分を含む、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
前記標識部分が放射性同位体を含む、項目３５に記載の方法。
（項目３７）
前記標識部分がヨウ素−１３１（ １３１ Ｉ）、ヨウ素−１２５（ １２５ Ｉ）、またはその組合せを含む、項目３６に記載の方法。
（項目３８）
前記放射性同位体が ９９ｍ Ｔｃを含む、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記血管新生の程度が前記対照被験体と比較して少なくとも５０％低下される、項目１に記載の方法。
（項目４０）
前記クロロトキシン剤がポリマーに共有結合される、項目１に記載の方法。
（項目４１）
ポリマーがポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、項目４０に記載の方法。
（項目４２）
前記被験体での前記クロロトキシン剤の半減期が少なくとも約１０時間である、項目１に記載の方法。
（項目４３）
前記被験体での前記クロロトキシン剤の半減期が少なくとも約１６時間である、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記クロロトキシン剤が週５回未満投与される、項目１に記載の方法。
（項目４５）
前記クロロトキシン剤が週２回未満投与される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記クロロトキシン剤が既存の新生血管系の退行を引き起こす、項目１に記載の方法。
（項目４７）
前記クロロトキシン剤が新たな血管の出芽を防止する、項目１に記載の方法。
（項目４８）
アネキシンＡ２に結合する薬剤を同定する方法であって、
ａ）アネキシンＡ２を発現する細胞を含む試料を提供するステップと；
ｂ）該試料と試験剤とを接触させるステップと；
ｃ）該試験剤がアネキシンＡ２に結合するか否かを決定するステップと；
ｄ）該決定に基づいて、該試験剤をアネキシンＡ２に結合する薬剤として同定するステップと；
を含む、方法。
（項目４９）
前記試験剤がアネキシンＡ２機能を調節するか否かを決定するステップをさらに含む、項目４８に記載の方法。
（項目５０）
アネキシンＡ２を発現する細胞においてアネキシンＡ２活性を調節する方法であって、アネキシンＡ２活性が変化されるように該細胞とアネキシンＡ２を調節する薬剤とを接触させるステップを含む、方法。
（項目５１）
前記アネキシンＡ２活性がプラスミノーゲン制御である、項目５０に記載の方法。
図１は、ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおけるＶＥＧＦによる血管新生の刺激を表す写真を示す。ＣＡＭへのＶＥＧＦの局所適用に応答した血管分枝点の増加を示すために、未処置（Ａ）およびＶＥＧＦ処置（Ｂ）ＣＡＭを写真撮影した。 図２は、合成クロロトキシン（ＴＭ−６０１）がＶＥＧＦ刺激血管新生を用量依存方式で阻害することを表す写真を示す。血管分枝点の数は、ＴＭ−６０１の用量が増加するにつれて減少した。 図３は、各種の血管新生促進因子（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＰＳ、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、およびＨＧＦ）によって刺激された血管新生に対するＴＭ−６０１の阻害効果を表すプロットを示す。分枝点の阻害パーセントを、各因子でのＴＭ−６０１の濃度に対してプロットした。 図４は、各種用量のＴＭ−６０１によって処置したマウスからのマトリゲルプラグ中の平均微細血管数を示す。１０ｍｇ／ｋｇ静脈内注射を週３回投与した動物の群は、血管新生の有意な減少を示した（ｐ＜０．０１）。 図５は、マトリゲルプラグのＣＤ３１免疫染色を示す。（Ａ）対照マトリゲルプラグ。（Ｂ）１０ｍｇ／ｋｇ ＴＭ−６０１の静脈内注射によって週３回処置された動物からのマトリゲルプラグ。 図６は、試験経過中のマウスの体重のプロットを示す。 図７は、各種用量のＴＭ−６０１によって処置したマウスからのマトリゲルプラグ中の平均微細血管数を示す。１０または５０ｍｇ／ｋｇ静脈内注射を週３回投与した動物の群は、血管新生の有意な減少を示した（＊，ｐ＜０．０５）。 図８は、静脈内注射によって週３回投与したＴＭ−６０１による血管新生の用量依存性阻害を示す。１０および５０ｍｇ／ｋｇの用量のみが対照群と有意に異なる。それにもかかわらず、全用量群を通じて用量依存性効果があるように見える。 図９は、マトリゲルプラグのＣＤ３１免疫染色を示す。（Ａ）対照マトリゲルプラグ。（Ｂ）５０ｍｇ／ｋｇ ＴＭ−６０１の静脈内注射によって週３回処置した動物からのマトリゲルプラグ。（Ｃ）０．４ｍｇ／ｋｇ ＴＭ−６０１の静脈内注射によって週３回処置した動物からのマトリゲルプラグ。 図１０は、試験経過中のマウスの体重のプロットを示す。 図１１は、最終用量後のマウス血漿中のＴＭ−６０１の薬物動態を示す。ＴＭ−６０１の各種用量について、血漿中のＴＭ−６０１の濃度を時間に対してプロットする。 図１２は、腫瘍−ＣＡＭでの腫瘍増殖に対するＴＭ−６０１ １０μｇの効果を示す。ＴＭ−６０１は、ＣＡＭで増殖したＰＣ−３およびＵ８７腫瘍の腫瘍増殖を有意に低速化した。 図１３は、さらなる処置を行わない（Ａ、Ｂ、Ｃ）またはＴＭ−６０１ １０μｇによる処置後（Ｄ、Ｅ、Ｆ）の、ＣＡＭで増殖した代表的な腫瘍の顕微鏡写真を示す。 図１４は、ＴＭ−６０１がインビトロでＵ８７腫瘍細胞の増殖に影響しないことを示す。Ｕ８７細胞は、培地中でＴＭ−６０１の存在下または非存在下で７２時間増殖させた。ＴＭ−６０１は１００μＭまでの濃度では、Ｕ８７細胞増殖または細胞死に何ら効果がなかった。 図１５は、腫瘍−ＣＡＭでの腫瘍増殖に対するＴＭ−６０１ １０μｇの効果を示す。ＴＭ−６０１は、ＣＡＭで増殖したＳＫＭｅｌ２８、ＰＣ−３、Ｕ８７、および膵臓癌腫瘍の腫瘍増殖を有意に低速化した。 図１６は、ＣＡＭで増殖した腫瘍のヘモグロビンの量がＴＭ−６０１によって阻害されることを示す。ヒト腫瘍細胞（Ａ）：８７神経膠腫、（Ｂ）：Ｄ５４神経膠腫または（Ｃ）：膵臓癌）をマトリゲル中のＣＡＭの表面に適用した。細胞は、生理食塩水またはＴＭ−６０１ ４００ｎｇのどちらかを含有していた。対照として、マトリゲルのみを適用した。７日後、移植範囲を除去して、ヘモグロビンレベルを測定した。＊ＴＭ６０１で処置した腫瘍中のヘモグロビンレベルは、無処置細胞より統計的に低い（ｐ＜０．０５）。 図１７は、ＣＡＭアッセイにおける血管系の正常な発生に対するＴＭ−６０１の阻害効果を示す。ＴＭ−６０１の最も多い３つの量（１、１０および１００μｇ）によって、血管密度の統計的に有意な低下が生じた。 図１８は、ＴＭ−６０１がＶＥＧＦ−、ｂＦＧＦ−およびＬＰＳ−刺激血管新生を用量依存性方式で阻害することを示す。１００％を超える阻害は、阻害のレベルが無刺激生理食塩水対照値より大きいことを示し、ＴＭ−６０１が抗血管新生促進因子によって刺激された新生血管形成の量だけでなく、発生中のニワトリ胚に固有の血管新生から生じる新生血管形成も阻害することを示す。 図１９は、血管新生促進因子（左）またはＴＭ−６０１ １００μｇを加えた血管新生促進因子によって処置した代表的なニワトリ卵のＣＡＭの写真を示す。血管指数密度は、写真の上に重ねた円と交差する血管の数をカウントすることによって決定する。 図２０は、ＶＥＧＦによって刺激された血管新生に対する静脈内ＴＭ−６０１に対する阻害効果を示す。ＴＭ−６０１の表示した用量での１回注射をニワトリ卵の目に見える大静脈に行った。阻害用量応答が観察された。 図２１は、ＴＭ−６０１、ＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓによるＶＥＧＦ刺激血管新生の阻害を示す。ＴＭ−６０１およびＬｕｃｅｎｔｉｓは、質量基準で示したときに、最も強力な血管新生阻害薬である。 図２２は、ＴＭ−６０１、ＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓによるＶＥＧＦ刺激血管新生の阻害を示す。ＴＭ−６０１は、モル基準で示したときに、ＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓよりも効力が低い。 図２３は、ＴＭ−６０１およびＡｖａｓｔｉｎ（Ａ）またはＴＭ−６０１およびＬｕｃｅｎｔｉｓ（Ｂ）のＶＥＧＦ刺激血管新生に対する併用効果を示す。 図２４は、ＴＭ−６０１およびＡｖａｓｔｉｎ（Ａ）またはＬｕｃｅｎｔｉｓ（Ｂ）のどちらかのＶＥＧＦ刺激血管新生に対する効果を示す。 図２５は、脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）のマウスモデルにおけるＴＭ−６０１が血管形成を阻害する能力を試験する実験からの結果を表す。ＴＭ−６０１または食塩水ビヒクルを投与された動物の新生血管形成（ＮＶ）の総面積（ｍｍ２×１０−３）を示す。脈絡膜新生血管形成の統計的に有意な減少は、ブルッフ膜の破壊の日および第７日にＴＭ−６０１ ５０μｇの眼内注射を投与した動物で観察された（＊ｐ＜０．０５）。脈絡膜病変を第１４日に分析した。 図２６は、ＣＮＶのマウスモデルにおいてＴＭ−６０１が既存の新生血管の退行を引き起こす能力を試験する実験からの結果を表す。ＴＭ−６０１または食塩水ビヒクルを投与された動物の新生血管形成（ＮＶ）の総面積（ｍｍ２×１０−３）を示す。「ベースライン」は、ブルッフ膜の破壊後（すなわちＴＭ−６０１による処置前）の第７日に行われた測定値を指す。脈絡膜新生血管形成の統計的に有意な退行は、第７日にＴＭ−６０１ ５０μｇの眼内注射を投与した動物で観察された（＊ｐ＜０．０５）。「対照」および「ＴＭ−６０１」値について、脈絡膜病変を第１４日に分析した。 図２７は、ＴＭ−６０１の硝子体内注射によって、脈絡膜新生血管形成のマウスモデルにおけるレーザ誘起血管部位の血管の減少が引き起こされたことを示す代表的な顕微鏡画像を表す。新生血管形成は、ＴＭ−６０１をレーザ誘起と同じ日に投与したときに阻害された（上パネル）。既存の新生血管系は、ＴＭ−６０１をレーザ誘起の７日後に投与したときに退行した（下パネル）。第１４日に、すべてのマウスにフルオレセイン標識デキストランを灌流させ、脈絡膜フラットマウントを作製して、蛍光顕微鏡法で検査した。 図２８は、静脈内注射した非癌性マウスでの未修飾ＴＭ−６０１と比較した、ＰＥＧ化クロロトキシン（ＴＭ−６０１−ＰＥＧ）の半減期を示す。ＰＥＧ化によって、ＴＭ６０１の半減期は約３２倍延長された。 図２９は、マウスＣＮＶモデルにおいて、ＰＥＧ化ＴＭ−６０１が未修飾ＴＭ−６０１よりも低頻度の投薬で抗血管新生効果を達成することができることを示す。ＣＮＶモデルの微細血管密度を未修飾ＴＭ−６０１またはＰＥＧ化ＴＭ−６０１の各種の投薬計画に対してプロットした。 図３０は、マウスＣＮＶモデルにおいて結膜下注射によって投与されたＴＭ−６０１の用量応答曲線を示す。 図３１は、ＴＭ−６０１を点眼薬の局所適用によって投与したときのマウスＣＮＶモデルにおける新生血管形成の結果を示す。 図３２は、アネキシンＡ２発現のｓｉＲＮＡノックダウンが膵臓腫瘍細胞株であるＰａｎｃ−１腫瘍細胞の表面へのＴＭ−６０１結合の消失を引き起こすことを示す。
定義
明細書を通して、以下の段落で定義される複数の用語が利用される。
本明細書で使用するように、「約（ａｂｏｕｔ）」および「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」は数に関連して、別途示さない限り、または状況から別途明らかでない限り、その数の両方向で（より大きいまたはより小さい）２０％、１０％、５％、または１％の範囲内に入る数を含むために本明細書で使用される（このような数が考えられる値の１００％を超える場合を除く）。
本明細書で使用するように、「アネキシンＡ２」という用語は、その正式な記号が（ヒトで）ＡＮＸＡ２であり、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのＥｎｔｒｅｚ Ｇｅｎｅリスティングでのその正式名称が「アネキシンＡ２」である、遺伝子のタンパク質生成物である（ＡＮＸＡ２転写産物の多様な配列は、たとえばＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ６２８９９、ＮＭ＿００１００２８５７、ＮＭ＿００１００２８５８、ＮＭ＿００４０３９で見出される）。アネキシンＡ２はとりわけ、「アネキシンＩＩ」、および「リポコルチン２」としても公知である。
「生物活性」という用語は、ポリペプチドを特徴付けるために本明細書で使用するとき、親ポリペプチドとの十分なアミノ酸配列相同性を共有して、そのポリペプチドよりも同様または同一の特性（たとえば癌細胞に特異的に結合するおよび／または癌細胞中に内部移行するおよび／または癌細胞を死滅させる能力）を呈する分子を示す。
本明細書で使用するように、「癌」という用語は、制御されない細胞増殖を通例特徴とする哺乳類の生理的状態を指す、または説明する。癌の例は、これに限定されるわけではないが癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含む。さらに詳細には、このような癌の例は、肺癌、骨癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸がん、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、性生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫を含む。
本明細書で使用するように、「癌細胞」という用語は、望ましくない制御されない細胞増殖または組織の異常な存続もしくは異常な浸潤を受けるインビボの哺乳類（たとえばヒト）の細胞を指す。インビトロでは、この用語は、適切な新鮮培地および空間が与えられれば、制御されない方式で無限に増殖するであろう、永久に不死化された樹立細胞培養物である細胞株も指す。
本明細書で使用するように、「癌患者」という用語は、癌に罹患している、または罹患しやすい個人を指すことができる。癌患者は、癌と診断されていることも、または診断されていないこともある。この用語は、癌療法を以前に受けた個人も含む。
「化学療法薬」および「抗癌剤または薬」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは癌または癌性状態を処置するために使用される薬物を指す。抗癌薬は、慣例的に以下の群の１つに分類される：アルキル化剤、プリン拮抗薬、ピリミジン拮抗薬、植物アルカロイド、インターカレーティング抗生物質、アロマターゼ阻害薬、代謝拮抗物質、有糸分裂阻害薬、増殖因子阻害薬、細胞周期阻害薬、酵素、トポイソメラーゼ阻害薬、生物応答修飾薬、抗ホルモンおよび抗アンドロゲン。このような抗癌剤の例は、これに限定されるわけではないが、ＢＣＮＵ、シスプラチン、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、パクリタキセル、テモゾロミド、トポテカン、フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、プロカバジン、デカルバジン、アルトレタミン、メトトレキセート、メルカプトプリン、チオグアニン、リン酸フルダラビン、クラドリビン、ペントスタチン、シタラビン、アザシチジン、エトポシド、テニポシド、イリノテカン、ドセタキセル、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、イダルビシン、プリカマイシン、マイトマイシン、ブレオマイシン、タモキシフェン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルチミド、アナストロゾール、アムサクリン、アスパラギナーゼ、ミトキサントロン、ミトタンおよびアミフォスチンを含む。
「併用療法」という用語は本明細書で使用するように、被験体が両方の薬剤に同時に暴露されるように、２つ以上の医薬品が重複した計画で投与される状況を指す。
「細胞傷害性」という用語は、部分、化合物、薬物または薬剤を特徴付けるために本明細書で使用するときに、細胞の機能を阻害もしくは防止するおよび／または細胞の破壊を引き起こす部分、化合物、薬物または薬剤を指す。
「投薬計画」は、この用語が本明細書で使用されるように、時間的期間によって隔てられて個別に投与される（通例は１つ以上の）単位用量のセットを指す。特定の医薬品に推奨される用量のセット（すなわち量、タイミング、投与経路など）は、その投薬計画を構成する。
本明細書で使用するように「有効量」および「有効用量」という用語は、許容されるベネフィット／リスク比でその所期の目的、すなわち組織または被験体における所望の生物学的または医薬的応答を満足するのに十分である化合物または組成物の任意の量または用量を指す。たとえば、本発明のある実施形態において、目的は：血管新生を阻害すること、新生血管系の退行を引き起こすこと、アネキシンＡ２などの別の生物活性分子の活性を妨害することなどであり得る。関連する所期の目的は、客観的（すなわちある試験またはマーカーによって測定可能）または主観的（すなわち被験体が効果の指摘を与える、または効果を感じる）であり得る。治療的有効量は、複数の単位用量を含み得る投薬計画で普通に投与される。任意の特定の医薬品では、治療的有効量（および／または有効な投薬計画内での適切な単位用量）は、たとえば投与経路に、他の医薬品との併用に応じて変化し得る。いくつかの実施形態において、任意の特定の患者に対する具体的な治療的有効量（および／または単位用量）は、処置される障害および障害の重症度；利用される具体的な医薬品の活性；利用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および／または利用した特定の医薬品の排出もしくは代謝速度；処置期間；ならびに医療分野で周知であるような同様の因子を含む多様な因子に依存し得る。
本明細書で使用するように、「フルオロフォア」、「蛍光部分」、「蛍光標識」、「蛍光染料」および「蛍光標識部分」は、本明細書では互換的に使用される。これらは、溶解して適切な波長の光によって励起されたときに、光を再び放出する分子を指す。多種多様の構造および特徴の多くの蛍光染料が本発明の実施で使用されるのに好適である。同様に、核酸を蛍光標識するための方法および物質が公知である（たとえばＲ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ：Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ １９９２−１９９４”，５ｔｈＥｄ．，１９９４，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．を参照）。フルオロフォアを選択するにあたって、蛍光分子が高い効率で光を吸収して、蛍光を放出し（すなわちそれぞれ高いモル吸収係数および蛍光量子収率）、光安定性である（すなわちフルオロフォアが、分析を実施するために必要な時間に光励起で著しい分解を受けない）ことがしばしば所望である。
本明細書で使用するように「融合タンパク質」という用語は、その個々のペプチド主鎖を介して共有結合によって結合された２つ以上のタンパク質またはその断片を含む分子を指し、これらのタンパク質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現によって生成されることが多い。
本明細書で使用するように、「相同の」（または「相同性」）という用語は、２つのポリペプチド分子間のまたは２つの核酸分子間の同一性の程度を指す。両方の比較された配列内の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占有されているとき、ここで各分子はその位置において相同である。２つの配列間の相同性のパーセンテージは、２つの配列によって共有される一致または相同位置の数を比較した位置の数で割り、１００を掛けたものに相当する。一般に、２つの配列が整列されて最大の相同性を得られるときに比較が行われる。相同性アミノ酸配列は同一または同様のアミノ酸残基を共有する。同様の残基は、参照配列内の対応するアミノ酸残基に対する保存的置換であるか、またはアミノ酸残基の「許容された点突然変異」である。参照配列内の残基の「保存的置換」は、たとえば同じサイズ、形状、電荷、共有または水素結合を形成する能力を含む化学的特性などを有する、対応する参照残基に物理的または機能的に類似した置換である。いくつかの実施形態において、本発明によって利用される保存的置換は、Ｄａｙｈｏｆｆらによって「認められた点突然変異」について定義された基準を満足する保存的置換である（“Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”，１９７８，Ｎａｔ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ，Ｓｕｐｐｌ．３，２２：３５４−３５２）。
本明細書で使用するように、「相同体」という用語は、別のポリペプチドまたは遺伝子との指定された程度の配列同一性（および／または類似性）を示すポリペプチドまたは遺伝子を指す。たとえば少なくとも約３０〜４０％の、しばしば約５０％、６０％、７０％、または８０％を超える、別のポリペプチドとの配列全体の同一性を示し、通常は少なくとも３〜４個の、しばしば２０個以上までのアミノ酸を含む、１つ以上の高度に保存された領域においてしばしば９０％またはなお９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える、別のポリペプチドとの同一性がはるかに高い少なくとも１つの領域をさらに含む任意のポリペプチドが、そのポリペプチドの相同体である。多くの実施形態において、ポリペプチドの相同体は、ポリペプチドとの配列類似性および／またはポリペプチドの少なくとも１つの機能的属性または活性をさらに共有する。遺伝子またはヌクレオチド配列に関して、（ｉ）別の遺伝子もしくはヌクレオチド配列との少なくとも６０％の配列全体の同一性を示す；およびまたは（ｉｉ）他方の遺伝子もしくはヌクレオチド配列によってコードされたポリペプチドの相同体をコードする、任意の遺伝子またはヌクレオチド配列は、その遺伝子またはヌクレオチド配列の相同体である。当業者に公知であるように、同一性および／または類似性の程度を評価する目的でアミノ酸またはヌクレオチド配列の比較を実施するために、多様な方法が公知であり、ツールが利用できる。これらの方法は、たとえば手動アラインメント、コンピュータ支援配列アラインメントおよびその組合せを含む。配列アラインメントを実施するための（一般にコンピュータで実行される）いくつかのアルゴリズムは、幅広く利用可能であり、または当業者によって作成することができる。代表的なアルゴリズムは、たとえばＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２：４８２）；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７０，４８：４４３）；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索法（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ），１９８８，８５：２４４４）；ならびに／またはこれらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（たとえばＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＦＡＳＴＡ，ａｎｄ ＴＦＡＳＴＡ ｉｎ ｔｈｅ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ Ｒｅｌｅａｓｅ ７．０，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）を含む。このようなアルゴリズムを含む、ただちに入手可能なコンピュータプログラムは、たとえばＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、ＰＩＬＥＵＰ、ＣＬＵＳＴＡＬＷなどを含む。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用するときに、各プログラムのデフォルトパラメータが使用され得る。代わりに実施者は、その実験的および／または他の要件に応じた非デフォルトパラメータを使用し得る（たとえばＵＲＬ ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖを有するウェブサイトを参照）。
「個人」および「被験体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害（たとえば癌、黄斑変性症など）に罹患し得るまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有することも有さないこともある、ヒトまたは別の哺乳動物（たとえばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を指す。多くの実施形態において、被験体はヒトである。多くの実施形態において、被験体は患者である。別途指摘しない限り、「個人」および「被験体」という用語は、特定の年齢を示さず、それゆえ成人、小児、および新生児を含む。
本明細書で使用するように、「阻害する」という用語は、何かが起きるのを防止すること、起きていることの発生を遅延すること、および／または起きていることの程度および尤度を低下させることを意味する。それゆえ「血管新生を阻害すること」および「新生血管系の形成を阻害すること」は、血管新生の発生を防止、遅延する、および／または血管新生の発生の尤度を低下させるのはもちろんのこと、新生血管の数、増殖速度、サイズなどを低減することも含むことを意図する。
「標識した」および「検出可能な薬剤または部分によって標識した」という用語は、実体（たとえばクロロトキシンまたはクロロトキシンコンジュゲート）が、たとえば別の実体（たとえば新生腫瘍組織）に結合された後に描出できることを規定するために、本明細書で互換的に使用される。検出可能な薬剤または部分は、薬剤または部分が測定可能であるシグナルを発生する、およびその強度が結合された実体の量に関連付けられる（たとえば比例する）ように選択され得る。タンパク質およびペプチドを標識および／または検出する多種多様なシステムが当分野で公知である。標識タンパク質およびペプチドは、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的、化学的または他の手段によって検出できる標識の包含、または標識へのコンジュゲーションによって調製できる。標識もしくは標識部分は、直接検出可能であり得る（すなわち標識もしくは標識部分は、任意のさらなる反応もしくは操作が検出される必要がない、たとえばフルオロフォアは直接検出可能である）、または標識もしくは標識部分は、間接的に検出され得る（すなわち標識もしくは標識部分は、検出可能である別の実体との反応または結合によって検出可能とされ、たとえばハプテンは、フルオロフォアなどのレポータを含む適切な抗体との反応後に免疫染色することによって検出可能である）。好適な検出可能な薬剤は、これに限定されるわけではないが、放射性核種、フルオロフォア、化学発光剤、微粒子、酵素、比色標識、磁性標識、ハプテン、分子ビーコン、アプタマービーコンなどを含む。
本明細書で使用するように、「黄斑変性症」という用語は、網膜への損傷のために視野中心（黄斑）で失明を生じる病状を指す。黄斑変性症には複数の形が存在することが公知であり、別途規定しない限り、「黄斑変性症」という用語はすべての形を含む。「滲出型黄斑変性症」（新生血管または滲出型としても公知）は、網膜後ろの脈絡膜からの血管の増殖を含む黄斑変性症を指す。滲出型黄斑変性症において、網膜は時々、剥離することがある。「乾性黄斑変性症」において（非滲出型としても公知）、ドルーゼンと呼ばれる細胞残屑は、網膜と脈絡膜との間に蓄積するが、血管形成は発生しない。「加齢性黄斑変性症」（ＡＲＭＤ）は、黄斑変性症の最も一般的な形を指し、通例、高齢期に開始して、網膜の黄色沈着物を特徴とする。ＡＲＭＤは、黄斑変性の湿性または乾性のどちらかの形で発生し得る。
本明細書で使用するように、「転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）」（時々、「ｍｅｔｓ」と省略され、複数形「ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ」）は、１つの器官または組織から別の位置への腫瘍細胞の広がりを指す。この用語は、転移の結果として新たな位置に生成する腫瘍組織も指す。「転移癌」は、元の、すなわち原発性位置から広がる癌であり、「続発性癌」または「続発性腫瘍」とも呼ばれ得る。一般に、転移性腫瘍は、腫瘍が発生する原発性腫瘍の組織にちなんで命名される。それゆえ、肺に転移した乳癌は、いくつかの癌細胞が肺に位置しても、「転移性乳癌」と呼ばれ得る。
本明細書で使用するように、「新生血管系」という用語は、まだ完全に成熟していない、すなわち密着細胞接合部を備える完全に形成された内皮内層または周囲平滑筋細胞の完全な層を有さない、新たに形成された血管を指す。本明細書で使用するように、「新生血管」という用語は、新生血管系の血管を指すために使用される。
「正常な」または「健康な」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、腫瘍を有さない個人または個人の群を指す。「正常な」という用語は、本明細書では、健康な個人から単離された組織試料を限定するためにも使用される。
「医薬品」、「治療剤」および「薬物」は、本明細書では互換的に使用される。これらは疾患、障害、または臨床状態の処置、抑制、および／または検出に有効な物質、分子、化合物、薬剤、因子または組成物を指す。
「製薬組成物」は本明細書では、少なくとも１つの活性成分（たとえば標識され得るまたは標識され得ないクロロトキシンまたはクロロトキシンコンジュゲート）の有効量、および少なくとも１つの製薬的に許容される担体を含む組成物として定義される。
本明細書で使用するように、「製薬的に許容される担体」という用語は、活性成分の生物活性の有効性を妨害しない、およびそれが投与される濃度で宿主に対して過度に毒性でない担体媒体を指す。この用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤、吸収遅延剤などを含む。製薬活性物質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当分野で周知である（たとえば参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，１８ｔｈＥｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．：Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡを参照）。
本明細書で使用するように、「予防すること」という用語は、薬剤のプロセス（たとえば血管新生）に対する作用を指すために使用するとき、薬剤（たとえば治療剤）がそのプロセスと関連する１つ以上の症状または属性の発症前に投与される場合に、このようなプロセスの程度を低下させることおよび／またはこのようなプロセスの開始を遅延させることを意味する。
本明細書で使用するように、「原発性腫瘍」という用語は、最初に発生した元の部位にあり、すなわちその部位に広がったのとは対照的である腫瘍を指す。
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用され、中性（非荷電）形でまたは塩としてのどちらかで、および未修飾のまたはグリコシル化、側鎖酸化、もしくはホスホリル化によって修飾されているかのどちらかの、多様な長さのアミノ酸配列を指す。ある実施形態において、アミノ酸配列は、全長未変性タンパク質である。他の実施形態において、アミノ酸配列は、全長タンパク質のより短い断片である。なお他の実施形態において、アミノ酸配列は、アミノ酸側鎖に結合されたさらなる置換基、たとえばグリコシル単位、脂質、またはホスフェートなどの無機イオンによってはもちろんのこと、鎖の化学変換に関連する修飾、たとえばスルフヒドリル基の酸化によっても修飾される。それゆえ、「タンパク質」（またはその同等語）は、その特異的な特性は変化させないこのような修飾を受ける、全長未変性タンパク質のアミノ酸配列を含むことを意図する。特に、「タンパク質」という用語は、タンパク質アイソフォーム、すなわち同じ遺伝子によってコードされるが、そのｐＩもしくはＭＷ、または両方が異なるバリアントを含む。このようなアイソフォームは、そのアミノ酸配列が異なることが可能であり（たとえば代わりのスライシングまたは制限タンパク質分解の結果として）、または代わりに、翻訳後修飾の違い（たとえばグリコシル化、アシル化またはホスホリル化）から発生し得る。
「タンパク質類似体」という用語は、本明細書で使用するように、親ポリペプチドと同様または同一の機能を有するが、親ポリペプチドのアミノ酸配列と同様もしくは同一であるアミノ酸配列を必ずしも含む必要がない、または親ポリペプチドの構造と同様もしくは同一である構造を有するポリペプチドを指す。本発明の状況において、タンパク質類似体は、親ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも３０％（いくつかの実施形態において、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％）同一であるアミノ酸配列を有し得る。さらに、当業者は、タンパク質配列が活性を破壊することなく、ある置換に一般に耐えることを理解するであろう。それゆえ、活性を保持して、少なくとも約３０〜４０％の、しばしば約５０％、６０％、７０％、または８０％を超える、親ポリペプチドとの配列全体の同一性を共有し、通常は少なくとも３〜４個の、しばしば２０個以上までのアミノ酸を含む、１つ以上の高度に保存された領域においてしばしば９０％、９６％、９７％、９８％または９９％を超える、親ポリペプチドとの同一性がはるかに高い少なくとも１つの領域を通常さらに含む任意のポリペプチドが、「タンパク質類似体）という用語に含まれる。
本明細書で使用するように、「タンパク質断片」という用語は、第２のポリペプチドのアミノ酸配列の少なくとも５アミノ酸残基のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。タンパク質の断片は、親ポリペプチドの機能活性を所有し得るか、または所有し得ない。
「退行する」という用語は、血管および／または血管系（新生血管系および／または新生血管を含む）を指すために使用するとき、本明細書では縮退すること、収縮することなどを意味するために使用される。
本明細書で使用するように、「小型分子」という用語は、生物プロセスに影響を及ぼすように作用できる任意の化学的または他の部分を含む。小型分子は、現在公知であり使用されている任意の数の治療剤を含むことができるか、または生物機能をスクリーニングする目的のこのような分子のライブラリで合成された小型分子であることが可能である。小型分子は、サイズによって巨大分子と区別される。本発明での使用に好適な小型分子は通常、約５，０００ダルトン（Ｄａ）未満の、約２，５００Ｄａ未満の、約１，０００Ｄａ未満の、または約５００Ｄａ未満の分子量を有する。
本明細書で使用するように、「罹患しやすい」という用語は、（通例、遺伝的素因、環境因子、個人歴、またはその組合せに基づいて）何かに、すなわち疾患、障害、または状態、たとえば転移癌に対して、一般集団で見られるよりも高いリスクおよび／または傾向を有することを意味する。この用語は、状態に「罹患しやすい」個人がその状態と診断され得ないことを考慮する。
本明細書で使用するように、「全身投与」という用語は、薬剤が有意な量で体内に広く分布して、血中で生物効果、たとえばその所望の効果を有し、および／または血管系を介して所望の作用部位に到達するような、薬剤の投与を指す。代表的な全身投与経路は、（１）薬剤を血管系に直接導入すること、または（２）薬剤が吸収され、血管系に入り、血液を介して１つ以上の所望の作用部位に輸送される、経口、経肺、もしくは筋肉内投与による投与を含む。
「組織」という用語は、本明細書ではその最も広い意味で使用される。組織は、腫瘍細胞を含むことができる（しかし必ずしも含まない）任意の生物的実体であり得る。本発明の状況において、インビトロ、インビボおよびエクスビボ組織が考慮される。それゆえ組織は、個人の一部であり得るか、または個人から（たとえば生検によって）採取され得る。組織は、組織の切片、たとえば組織学的目的で採取した冷凍切片または公知の診断、処置および／もしくは成績履歴を有するアーカイブ試料も含み得る。組織という用語は、組織試料を処理することによって得た任意の物質も含む。得られた物質は、これに限定されるわけではないが、組織から単離した細胞（またはその子孫）を含む。組織試料の処理は：濾過、蒸留、抽出、濃縮、妨害成分の不活性化、試薬の添加などの１つ以上を含み得る。
「処置」という用語は、本明細書では、（１）疾患、障害、もしくは状態の開始を遅延または防止すること；（２）疾患、障害、もしくは状態の症状の１つ以上の進行、増悪、または悪化を低速化または停止すること；（３）疾患、障害、もしくは状態の症状の改善を引き起こすこと；（４）疾患、障害、もしくは状態の重症度もしくは発生率を低下させること；または（５）疾患、障害、もしくは状態を治癒することを目的とする方法またはプロセスを特徴付けるために使用される。処置は、予防または防止作用のために疾患、障害、または状態の開始前に投与され得る。代わりにまたはさらに、処置は、治療的作用のために疾患、障害、または状態の開始後に投与され得る。
ある実施形態の詳細な説明
本発明は、とりわけ、血管新生を阻害する、および／または減少させる方法に関する。本明細書で提供する方法は、細胞傷害性部分、第２の治療剤、標識部分および／またはその組合せと会合され得るまたは会合され得ないクロロトキシン剤の投与を含むことが多い。クロロトキシン剤は、たとえばポリエチレングリコールなどのポリマーに共有結合され得る。ある実施形態において、新しい血管の形成が阻害される、および／または既存の新生血管系が退行する。
本発明により、当分野の技能の範囲内で慣例的な分子生物学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技法が使用され得る。このような技法は、文献で十分に説明されている。たとえばＭａｎｉａｔｉｓ，Ｆｒｉｔｓｃｈ＆Ｓａｍｂｒｏｏｋ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，１９８２；“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，” Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ（Ｅｄ．），１９８５；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（Ｅｄ．），１９８４；“Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄｓ．），１９８５；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ（Ｅｄｓ．），１９８４；“Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ”，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（Ｅｄ．），１９８６；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ”，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ”，１９８４を参照。
Ｉ．試薬および部分
本発明の方法は、被験体（異常な血管新生を特徴とする状態または疾患を有する、有した、または発症するリスクに瀕した被験体など）への、血管新生を対照と比較して減少させるのに有効な量のクロロトキシン剤の投与を含み得る。
Ａ．クロロトキシン剤
本明細書で使用するように、「クロロトキシン剤」という用語は、少なくとも１つのクロロトキシン部分を含む化合物を指す。ある実施形態において、クロロトキシン剤は、第２の治療剤（たとえば抗癌剤）と会合されている。クロロトキシン剤（および／または治療剤）は、少なくとも１つの標識部分と会合され得る。
本明細書で使用するように、「クロロトキシン部分」という用語は、クロロトキシン、生物活性クロロトキシンサブユニットまたはクロロトキシン誘導体を指す。
ある実施形態において、「クロロトキシン」という用語は、Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓサソリ毒に天然由来の全長の３６アミノ酸ポリペプチドを指し（ＤｅＢｉｎら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９３，２６４：Ｃ３６１−３６９）、この毒は、その内容が参照により本明細書に組み入れられている国際出願番号ＷＯ ２００３／１０１４７４の配列番号１に示すような未変性クロロトキシンのアミノ酸配列を含む。「クロロトキシン」という用語は、（その全体が参照により本明細書に組み入れられている）米国特許第６，３１９，８９１号に開示されたものなどの、合成または組み換えにより産生された配列番号１を含むポリペプチドを含む。
「生物活性クロロトキシンサブユニット」は、クロロトキシンの３６未満のアミノ酸を含み、クロロトキシンの少なくとも１つの特性または機能を保持するペプチドである。本明細書で使用するように、クロロトキシンの「特性または機能」は、これに限定されるわけではないが、新生血管の形成を阻害する、および／または新生血管の退行を引き起こすその能力；（たとえばアネキシンＡ２を含み得る）その結合パートナーの活性を妨害する能力；異常な細胞増殖を停止させる能力；正常細胞と比較して、腫瘍／癌細胞に特異的に結合する能力；正常細胞と比較して、転移性腫瘍／癌細胞または転移した腫瘍／癌細胞に結合する能力；腫瘍／癌細胞に内部移行する能力；腫瘍／癌細胞を死滅させる能力を含む。腫瘍／癌細胞は、インビトロ、エクスビボ、インビトロで、被験体、培養細胞、または細胞株からの転移、原発性単離物の部分であり得る。
本明細書で使用するように、「生物活性クロロトキシン誘導体」という用語は、（上述のような）クロロトキシンの少なくとも１つの特性または機能を保持する、クロロトキシンおよび関連ペプチドの多種多様の誘導体、類似体、バリアント、ポリペプチド断片およびミメティックのいずれも指す。クロロトキシン誘導体の例は、これに限定されるわけではないが、クロロトキシンのペプチドバリアント、クロロトキシンのペプチド断片、たとえば国際出願番号ＷＯ ２００３／１０１４７４に示すような配列番号１、２、３、４、５、６、もしくは７の連続１０マーペプチドを含むもしくは１０マーペプチドから成る、または国際出願番号ＷＯ ２００３／１０１４７４に示すような配列番号１の残基１０−１８または２１−３０を含む断片、コア結合配列、およびペプチドミメティックを含む。
クロロトキシン誘導体の例は、クロロトキシンの活性と関連する、少なくとも約７の、約８の、約９の、約１０の、約１５の、約２０の、約２５の、約３０または約３５の連続アミノ酸残基を有する、国際出願番号ＷＯ ２００３／１０１４７４の配列番号１で示すアミノ酸配列の断片を有するペプチドを含む。このような断片は、顕著な親水性の領域と同様に、公知のペプチドドメインに相当するアミノ酸配列の領域として同定される、クロロトキシンペプチドの機能性領域を含有し得る。このような断片は、任意の順序で相互に連結された２つのコア配列も含むことがあり、介在アミノ酸は除去されるか、またはリンカーによって置換されている。
クロロトキシンの誘導体は、誘導体配列およびクロロトキシン配列を最大限に整列させたときに、少なくとも１つのアミノ酸残基の保存的または非保存的置換を含むポリペプチドを含む。置換は、クロロトキシンの少なくとも１つの特性もしくは機能を向上させる、クロロトキシンの少なくとも１つの特性もしくは機能を阻害する、またはクロロトキシンの少なくとも１つの特性もしくは機能に対して中立である、置換であり得る。
本発明の実施での使用に好適なクロロトキシンの誘導体の例は、国際出願番号ＷＯ ２００３／１０１４７４（その全体が参照により本明細書に組み入れられている）に記載されている。詳細な例は、この国際出願に示されるような配列番号８もしくは配列番号１３を含む、または配列番号８もしくは配列番号１３から成るポリペプチドはもちろんのこと、そのバリアント、類似体、および誘導体も含む。
クロロトキシン誘導体の他の例は、たとえば相同組換え、部位特異的またはＰＣＲ変異誘発による所定の突然変異を含むこれらのポリペプチド、およびペプチドのファミリーの対立遺伝子または他の天然型バリアント；ならびにペプチドが置換、化学的、酵素的または他の適切な手段によって、天然型アミノ酸以外の部分（たとえば酵素または放射性同位体などの検出可能な部分）で共有結合的に修飾されている誘導体を含む。
クロロトキシンおよびそのペプチド誘導体は、当分野で公知であるような標準固相（または液相）ペプチド合成法を含む、多種多様の方法のいずれを使用しても調製できる。さらに、これらのペプチドをコードする核酸は、市販のオリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成することができ、タンパク質は、標準組換え産生システムを使用して組換え産生され得る。
他の好適なクロロトキシン誘導体は、クロロトキシンの３次元構造を模倣するペプチドミメティックを含む。このようなペプチドミメティックは、たとえば、より経済的な産生、より高い化学安定性、薬理学的特性の向上（半減期、吸収、効力、有効性など）、改変された特異性（たとえば広範囲の生物活性、抗原性の低下およびその他）を含む、天然型ペプチドを超える著しい利点を有し得る。
ある実施形態において、ミメティックは、クロロトキシンペプチド２次構造の要素を模倣する分子である。タンパク質のペプチド主鎖は主に、抗体および抗原の分子間相互作用などの、分子間相互作用を促進するような方法でアミノ酸側鎖を配向させるために存在する。ペプチドミメティックは、天然分子に類似した分子間相互作用を可能にすることが予想される。ペプチド類似体は、テンプレートペプチドの特性に類似した特性を備えた非ペプチド薬として、製薬業界で一般に使用される。このような種類の化合物は、ペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｅ ｍｉｍｅｔｉｃ）またはペプチドミメティック（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）とも呼ばれ（たとえばＦａｕｃｈｅｒｅ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．，１９８６，１５：２９−６９；Ｖｅｂｅｒ＆Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ，１９８５，Ｔｒｅｎｄｓ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１９８５，８：３９２−３９６；Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，１９８７，３０：１２２９−１２３９を参照）、通常はコンピュータによる分子モデル化を用いて開発される。
一般に、ペプチドミメティックは、パラダイムポリペプチド（すなわち生化学特性または薬理活性を有するポリペプチド）に構造的に類似しているが、非ペプチド結合によって場合により置換される１つ以上のペプチド結合を有する。ペプチドミメティックの使用は、薬物ライブラリを作製するためのコンビナトリアルケミストリの使用によって強化することができる。ペプチドミメティックの設計は、ペプチドの、たとえば腫瘍細胞への結合を増強または低減するアミノ酸突然変異を同定することによって補助できる。使用可能な手法は、酵母２ハイブリッド法（たとえばＣｈｉｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９１，８８：９５７８−９５８２を参照）およびファージ提示法の使用を含む。２ハイブリッド法は、酵母中のタンパク質間相互作法を検出する（Ｆｉｅｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４０：２４５−２４６）。ファージ提示法は、固定化タンパク質と、ラムダおよびＭ１３などのファージ表面で発現されるタンパク質との間の相互作用を検出する（Ａｍｂｅｒｇら、Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，１９９３，６：２−４；Ｈｏｇｒｅｆｅら、Ｇｅｎｅ，１９９３，１２８：１１９−１２６）。これらの方法によって、ペプチド−タンパク質相互作用の正および負の選択ならびにこれらの相互作用を判定する配列の同定が可能となる。
ある実施形態において、クロロトキシン剤は、上述のクロロトキシンに類似または関連した活性を提示する別のサソリ種のポリペプチド毒素を含む。本明細書で使用するように、「クロロトキシンに類似または関連した」という用語は、特に、腫瘍／癌細胞への選択的／特異的結合を指す。好適な関連するサソリ毒の例は、これに限定されるわけではないが、クロロトキシンに対するアミノ酸および／またはヌクレオチド配列同一性を提示するサソリ起源の毒素または関連するペプチドを含む。関連するサソリ毒の例は、これに限定されるわけではないが、Ｍｅｓｏｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｓｉによるＣＴ神経毒（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＤ４７３７３０）、Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉｉ ｋａｒｓｃｈによる神経毒ＢｍＫ ４１−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ａ５９３５６）、Ｂｕｔｈｕｓ ｍａｒｔｅｎｓｉｉによる神経毒Ｂｍ１２−ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＫ１６４４４）、Ｌｅｉｕｒｕｓ ｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ ｈｅｂｒａｅｕによるＰｒｏｂａｂｌｅ Ｔｏｘｉｎ ＬＧＨ ８／６（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｐ５５９６６）、およびＭｅｓｕｂｕｔｕｓ ｔａｍｕｌｕｓ ｓｉｎｄｉｃｕｓによるＳｍａｌｌ ｔｏｘｉｎ（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｐ１５２２９）を含む。
本発明での使用に好適な関連するサソリ毒は、国際出願番号ＷＯ ２００３／１０１４７４（その全体が参照により本明細書に組み入れられている）の配列番号１で示すようなクロロトキシン配列全体との配列同一性が少なくとも約７５％の、少なくとも約８５％の、少なくとも約９０％の、少なくとも約９５％の、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。ある実施形態において、関連するサソリ毒は、国際出願番号ＷＯ ２００３／１０１４７４に示すようなクロロトキシンの配列番号８または配列番号１３と相同の配列を有するこのようなサソリ毒を含む。
修飾
ある実施形態において、クロロトキシン剤は未標識である。ある実施形態において、クロロトキシン剤は標識されている。標識方法および標識部分の例は、本明細書に記載されている。
ある実施形態において、クロロトキシン剤は、ポリマーなどの巨大分子への共有結合によって修飾される。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、たとえばポリマーの共有結合は、動物の体内でのクロロトキシン剤の生物学的利用能および／または耐性が改善されるように、クロロトキシン剤を抗原的にマスキングし得る。このようなポリマーの例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり、ペプチドおよび／もしくはポリペプチドのＮおよび／もしくはＣ末端にならびに／またはシステインに共有結合可能であることが多い。「ＰＥＧ化」は、ＰＥＧの分子への共有結合的付加を指す。
いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤はいずれの部位でも修飾されない。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、分子１個につき１つの部位で修飾される（たとえばＰＥＧ化による）。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、分子１個につき１つを超える部位で修飾される（たとえばＰＥＧ化による）。
いくつかの実施形態において、このような修飾によって、インビボでのクロロトキシン剤の半減期が延長される。たとえば半減期は、少なくとも約１０時間、少なくとも約１６時間などであり得る（たとえば実施例７を参照）。このように改善された生物学的利用能によって、いくつかの実施形態において、より低い投薬頻度を含む投薬計画が促進される（投薬計画は本明細書で議論する）。
クロロトキシン剤の細胞への結合
クロロトキシン剤はたとえば、細胞膜の外面に存在する抗原を介して細胞に結合し得る。
本明細書で紹介および議論するデータによって、アネキシンＡ２がクロロトキシンの潜在的な結合パートナーであることが示される。いくつかの実施形態において、抗原は、アネキシンＡ２または関連するファミリーメンバである。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤はアネキシンＡ２を直接結合する。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤はアネキシンＡ２を間接的に、たとえば他の分子との結合を介して結合する。クロロトキシン剤およびアネキシンＡ２はたとえば、他の分子を含む複合体として存在し得る。
ある実施形態において、クロロトキシン剤は癌細胞に結合する；いくつかのこのような実施形態において、クロロトキシン剤は、正常細胞よりも癌細胞を選択的に標的とする。
Ｂ．第２の治療剤
すでに上述したように、ある実施形態において、クロロトキシン剤は第２の治療剤と会合され得るか、および／または方法は、第２の治療剤を投与することを含むさらなるステップを含み得る。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤および第２の治療剤は、同時に投与される。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、第２の治療剤を投与する前および／または後に投与される。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤および第２の治療剤は、体内でのその活性および／または有効性の期間が重複するような時間ウィンドウ内に投与される。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤と組合せて第２の治療剤を投与することによって、血管新生の阻害および／または防止に対する相加および／または相乗効果が提供され得る。
好適な治療剤は、疾患または臨床状態の処置に有効である多種多様の物質、分子、化合物、薬剤または因子のいずれも含む。ある実施形態において、第２の治療剤は化学療法薬（すなわち抗癌薬）である。好適な抗癌薬は、癌細胞に直接または間接的に毒性または有害である多種多様の物質、分子、化合物、薬剤または因子のいずれも含む。
当業者によって認識されるように、治療剤は、合成または天然化合物：単一分子、異なる分子の混合物または異なる分子の複合体であり得る。好適な治療部分は、これに限定されるわけではないが、小型分子、ペプチド、タンパク質、サッカライド、ステロイド、抗体（その断片およびバリアントを含む）、融合タンパク質、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、低分子干渉ＲＮＡ、ペプチドミメティック、放射性核種などを含む、各種の化合物のクラスのいずれかに属することができる。
第２の治療剤が抗癌薬を含むとき、抗癌薬はたとえば抗癌薬の以下のクラス：アルキル化剤、代謝拮抗薬、抗有糸分裂抗生物質、血管新生阻害薬、アルカロイド抗腫瘍剤、ホルモンおよび抗ホルモン、インターフェロン、非ステロイド性抗炎症薬、ならびに各種の他の抗腫瘍剤、たとえばキナーゼ阻害薬、プロテアソーム阻害薬およびＮＦ−κＢ阻害薬に見出すことができる。
抗癌薬の例は、これに限定されるわけではないが、いくつか挙げると、アルキル化薬（たとえばメクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミドなど）、代謝拮抗薬（たとえばメトトレキセートなど）、プリン拮抗薬およびピリミジン拮抗薬（たとえば６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、シタラビン（ｃｙｔｒａｒｉｂｉｎｅ）、ゲムシタビンなど）、紡錘体毒（たとえばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセルなど）、ポドフィロトキシン（たとえばエトポシド、イリノテカン、トポテカンなど）、抗生物質（たとえばドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンなど）、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（たとえばカルムスチン、ロムスチン、ノムスチンなど）、無機イオン（たとえばシスプラチン、カルボプラチンなど）、酵素（たとえばアスパラギナーゼなど）、およびホルモン（たとえばタモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、メゲストロールなど）を含む。最新の癌療法のさらなる包括的な議論については、その内容が参照により本明細書に組み入れられている、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／、ＦＤＡ承認腫瘍薬のリストｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｍｅ．ｈｔｍ、およびＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ．１９９９を参照。
いくつかの抗癌薬は、癌細胞の増殖および／または複製を停止させることによって作用する。このような薬物は一般に、「細胞増殖抑制性」として分類される。ある実施形態において、治療剤は細胞増殖抑制剤を含む。細胞増殖抑制剤の例は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、植物アルカロイド（ａｋｌｙｌｏｉｄ）およびテルペノイド（ビンカアルカロイド、ポドフィロトキシン、タキサンなどを含む；ＶＰ−１６は植物アルカロイドの例である）、トポイソメラーゼ阻害薬、抗腫瘍抗体、ホルモンなどを含む。
ある実施形態において、第２の治療剤は血管新生阻害薬を含む。好適な血管新生阻害薬は、これに限定されるわけではないが、αＶβ３（インテグリン）拮抗薬、ＡＧ３３４０、ＡＧＭ−１４７０（フマギリン類似体）、アンギオポエチン−２、アンギオスタチン、アンギオスタチン−エンドスタチン融合タンパク質、アンギオザイム（商標）、抗Ｆｌｋ／ＫＤＲ、抗浸潤因子、抗ＶＥカドヘリン、抗ＶＥＧＦ、ＢＭＳ−２７５２９１、ＶＥＧＦのアプタマー拮抗薬、バチマスタット、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））、カンスタチン、カプトプリル、カルボキシアミドトリアゾール（ＣＡＩ）、軟骨由来阻害薬（ＣＤＩ）、ＣＭ１０１、ＣＯＬ−３、コンブレスタチンＡ４、ＥＭＤ−１２１９７４、エンドスタチン、エルロチニブ（タルセバ（商標））、エストラジオール誘導体、ｆｌｔ−１、フマギリン、ゲフィニチブ（イレッサ（商標））、ゲニステイン、ＩＭ８６２、インターフェロン−アルファ、インターロイキン−１２、Ｋ５、ラベンダスチン、レナリドマイド（Ａｌｅｎａｌｉｄｏｍｉｄｅ）、ＬＭ６０９（αＶβ３に対する抗体）、マリマスタット、マスピン、メタスタット、２−メトキシ−エストラジオール、ｎｅｏｒｅｔｎａ、ネオバスタット、ＮＸ１８３８、ペガプタニブ（Ｍａｃｕｇｅｎ（商標））、ＰＤ−１７３０７４、ＰＩ−８８、オキシインドール誘導体、パクリタキセル、ｐｓｏｖａｓｃａｒ、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２５８４、ラニビズマブ（ｒａｎａｂｉｚｕｍａｂ）（Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標））、レチノイン酸、ＲＧ８８０３、スクアラミン、Ｓ−８３６、ＳＣ−６８４４８、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＳＵ１１２４８（スニチニブ）、ＴＢＣ−１６３５、ＴＢＣ−２６５３、ＴＢＣ−３６８５、サリドマイド、チアゾロピリミジン誘導体、トロンボスポンジン２、ＴＮＰ４７０（フマギリン類似体）、トロポニンＩ、バスキュロスタチン、ビタキシン、ＺＤ０１０１などを含み得る（本リストは包括的ではない）。
ＶＥＧＦ阻害薬は、ＶＥＧＦに対する抗体および抗体断片（たとえばＡｖａｓｔｉｎ（商標）（ベバシズマブ）およびＬｕｃｅｎｔｉｓ（商標）（ラニビズマブ（ｒａｎａｂｉｚｕｍａｂ））など）、抗ＶＥＧＦリボザイム、ＶＥＧＦのアプタマー阻害薬などを含む。
いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、広範囲の阻害薬である。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＰＳ、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、およびＨＰＦからなる群より選択される１つ以上の因子によって刺激された血管新生を阻害する。いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＰＳ、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、またはＨＰＦによって刺激された血管新生を阻害しない。
いくつかの実施形態において、第２の治療剤は、Ａｖａｓｔｉｎ（商標）（ベバシズマブ）、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）（ラニビズマブ（ｒａｎａｂｉｚｕｍａｂ））、またはその組合せである。
ある実施形態において、第２の治療剤は、細胞傷害剤を含む。細胞傷害剤の例は、毒素、他の生物活性タンパク質、通常の化学療法剤、酵素、および放射性同位体を含む。
好適な細胞傷害性毒素の例は、これに限定されるわけではないが、細菌毒素および植物毒素、たとえばゲロニン、リシン、サポニン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ体外毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質、ジフテリア毒素などを含む。
好適な細胞傷害性生物活性タンパク質の例は、これに限定されるわけではないが、補体系のタンパク質（または補体タンパク質）を含む。補体系は、生物からの病原体の除去を補助して、治癒を促進する複雑な生化学的カスケードである（Ｂ．Ｐ．Ｍｏｒｇａｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｓｃｉ．，１９９５，３２：２６５）。補体系は、３５を超える溶解性および細胞結合タンパク質から成り、そのうち１２は補体経路に直接関与している。
好適な細胞傷害性化学療法剤の例は、これに限定されるわけではないが、タキサン（たとえばドセタキセル、パクリタキセルなど）、メイタンシン、デュオカルマイシン、ＣＣ−１０６５、オーリスタチン、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｎｃｉｎ）および他のエンジイン抗腫瘍抗生物質を含む。他の例は、葉酸拮抗薬（たとえばアミノプテリン、メトトレキセート、ペメトレキセド、ラルチトレキセドなど）、ビンカアルカロイド（たとえばビンクリスチン、ビンブラスチン、エトポシド、ビンデシン、ビノレルビンなど）、およびアントラサイクリン（たとえばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシンなど）を含む。
好適な細胞傷害性酵素の例は、これに限定されるわけではないが、核酸分解酵素を含む。
好適な細胞傷害性放射性同位体の例は、腫瘍部位に局在しているときに、細胞破壊を引き起こす任意のα−、β−またはγ−エミッタを含む（Ｓ．Ｅ．Ｏｒｄｅｒ，“Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎら（Ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９８５）。このような放射性同位体の例は、これに限定されるわけではないが、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、ビスマス−２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス−２１３（２１３Ｂｉ）、アスタチン−２１１（２１１Ａｔ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム−１８６（１８８Ｒｅ）、リン−３２（３２Ｐ）、イットリウム−９０（９０Ｙ）、サマリウム−１５３（１５３Ｓｍ）、およびルテチウム−１７７（１１７Ｌｕ）を含む。
代わりにまたはさらに、本発明の使用に好適な治療剤は、その内容全体は参照によりその全体が本明細書に組み入れられている、２００７年８月７日に出願された“Ｃｈｌｏｒｏｔｏｘｉｎｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒｓ”という名称の共有仮出願（ＵＳＳＮ ６０／９５４，４０９）、２００７年１０月１２日に出願された“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｏｔｏｘｉｎ Ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｔｕｍｏｒｓ”（ＵＳＳＮ ６０／９７９，７１４）に記載されている治療部分のいずれでもよい。このような治療剤のクラスの例は、これに限定されるわけではないが、貧水溶性抗癌剤、薬物耐性に関連する抗癌剤、アンチセンス核酸、リボザイム、トリプレックス剤、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、放射線増感剤、超抗原、プロドラッグ活性化酵素、および抗血管新生剤を含む。
ある実施形態において、クロロトキシン剤と会合される治療（たとえば抗癌、抗血管新生など）剤は、核酸剤である。
多くの癌および腫瘍が、点突然変異、遺伝子欠失、または重複などの、さまざまな程度の遺伝子障害に関連していることが示されている。遺伝子の発現を調節するための多くの新しい癌処置方法、たとえば「アンチセンス」、「アンチジーン」、および「ＲＮＡ干渉」が開発されている（Ａ．Ｋａｌｏｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００４，３：４−１２；Ｙ．Ｎａｋａｔａら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｅｕｋａｒｙｏｔ．Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒ．，２００５，１５：１６３−１８２；Ｖ．Ｗａｃｈｅｃｋ ａｎｄ Ｕ．Ｚａｎｇｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗｉｔｔｋｅ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２００６，５９：６５−７３；Ａ．Ｋｏｌａｔａら、Ｈａｎｄｂ．Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００６，１７３：１７３−１９６）。このような手法はたとえば、アンチセンス核酸、リボザイム、トリプレックス剤、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して、ｍＲＮＡをアンチセンス核酸でもしくはＤＮＡをトリプレックス剤でマスキングすること、ヌクレオチド配列をリボザイムで切断すること、またはＲＮＡ干渉に関与する複雑な機構によるｍＲＮＡの破壊のいずれかによって、標的遺伝子の特定のｍＲＮＡまたはＤＮＡの転写または翻訳を遮断する。これらの方法のすべてで、主にオリゴヌクレオチドが活性剤として使用されるが、小型分子および他の構造も利用されている。遺伝子発現を調節するためのオリゴヌクレオチドベースの方法は一部の癌の処置には大きな可能性を有するが、主にこれらの化合物の癌細胞内のその作用部位への送達が無効であることによって、オリゴヌクレオチドの薬理利用は妨げられてきた。（Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，２０００，１０：２９７−３１０；Ｙ．Ｓｈｏｊｉ ａｎｄ Ｈ．Ｎａｋａｓｈｉｍａ，Ｃｕｒｒ．Ｃｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，２００４，１０：７８５−７９６；Ａ．Ｗ Ｔｏｎｇら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００５，７：１１４−１２４）。
いくつかの実施形態において、薬剤は、治療（たとえば抗癌）剤として有用である核酸分子を含む第２の治療剤と組合せて投与される、および／または第２の治療剤を含む。核酸の多様な種類および構造形がこのような方法に好適であり得る。これらは、非制限的な例として、１本鎖（ｓｓＤＮＡ）および２本鎖（ｄｓＤＮＡ）を含むＤＮＡ；これに限定されるわけではないが、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、酵素ＲＮＡを含むＲＮＡ；ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、３本鎖ＤＮＡ（たとえば短鎖オリゴヌクレオチドに会合したｄｓＤＮＡ）などを含む。
本発明のいくつかの実施形態において、核酸剤は約５〜２０００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、核酸剤は、少なくとも約６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０以上のヌクレオチド長である。いくつかの実施形態において、核酸剤は、約２０００、１９００、１８００、１７００、１６００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０未満のヌクレオチド長である。
いくつかの実施形態において、核酸剤は、プロモータおよび／または転写を制御する他の配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸剤は、複製起点および／または複製を制御する他の配列を含む。いくつかの実施形態において、核酸剤は、プロモータおよび／または複製起点を含まない。
本発明の実施での使用に好適な核酸抗癌剤は、腫瘍形成および細胞増殖または細胞形質転換に関連する遺伝子（たとえば細胞分割を刺激するタンパク質をコードする、癌原遺伝子）、血管新生／抗血管新生遺伝子、腫瘍サプレッサ遺伝子（細胞分割を抑制するタンパク質をコードする）、腫瘍増殖および／または腫瘍移動に関連するタンパク質をコードする遺伝子、ならびにアポトーシスまたは他の形の細胞死を誘発する自殺遺伝子、特に急速に分割する細胞において最も活性である自殺遺伝子を標的とする核酸抗癌剤を含む。
腫瘍形成および／または細胞形質転換に関連する遺伝子配列の例は、ＭＬＬ融合遺伝子、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＴＥＬ−ＡＭＬ１、ＥＷＳ−ＦＬＩ１、ＴＬＳ−ＦＵＳ、ＰＡＸ３−ＦＫＨＲ、Ｂｃｌ−２、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＡＭＬ１−ＭＴＧ８、Ｒａｓ、Ｆｏｓ ＰＤＧＦ、ＲＥＴ、ＡＰＣ、ＮＦ−１、Ｒｂ、ｐ５３、ＭＤＭ２など；多剤耐性遺伝子などの過剰発現配列；サイクリン；ベータ−カテニン；テロメラーゼ遺伝子；ｃ−ｍｙｃ、ｎ−ｍｙｃ、Ｂｃｌ−２、Ｅｒｂ−Ｂ１およびＥｒｂ−Ｂ２；ならびにＲａｓ、Ｍｏｓ、Ｒａｆ、およびＭｅｔなどの変異配列を含む。腫瘍サプレッサ遺伝子の例は、これに限定されるわけではないが、ｐ５３、ｐ２１、ＲＢ１、ＷＴ１、ＮＦ１、ＶＨＬ、ＡＰＣ、ＤＡＰキナーゼ、ｐ１６、ＡＲＦ、ニューロフィブロミン、およびＰＴＥＮを含む。抗癌療法で有用な核酸分子によって標的化できる遺伝子の例は、インテグリン、セレクチンおよびメタロプロテイナーゼなどの腫瘍移動に関連するタンパク質をコードする遺伝子；血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）またはＶＥＧＦｒなど新しい血管の形成を促進するタンパク質をコードする抗血管新生遺伝子；エンドスタチン、アンギオスタチン、およびＶＥＧＦ−Ｒ２などの新生血管形成を阻害するタンパク質をコードする抗血管新生遺伝子；ならびにインターロイキン、インターフェロン、線維芽細胞増殖因子（α−ＦＧＦおよびβ−ＦＧＦ）、インスリン様増殖因子（たとえばＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、形質転換増殖因子（たとえばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、幹細胞因子およびその受容体ｃ−Ｋｉｔ（ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ）リガンド、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４ ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ヒアルロン（ｈｙａｌｕｒｉｎ）／ＣＤ４４などのタンパク質をコードする遺伝子を含む。当業者によって認識されるように、上述の例は排他的ではない。
本発明による使用のための核酸は、たとえば、抗癌剤または他の治療剤として、プローブ、プライマーなどを含む、多様な活性のいずれかを有し得る。核酸は、酵素活性（たとえばリボザイム活性）、遺伝子発現阻害活性（たとえばアンチセンスまたはｓｉＲＮＡ剤などとして）、および／または他の活性を有し得る。核酸は、それ自体活性であり得るか、または（たとえば送達された核酸の複製および／または転写によって）活性核酸剤を送達するベクターであり得る。本明細書の目的では、このようなベクター核酸は、それらが治療活性剤をコードする、またはそうでなければ送達する場合は、それら自体が治療活性を有していなくても、「治療剤」と見なされる。
ある実施形態において、クロロトキシン剤は、アンチセンス化合物を含むまたはコードする核酸治療剤と組合せて投与される、および／または核酸治療剤を含む。「アンチセンス化合物または剤」、「アンチセンスオリゴマー」、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」および「アンチセンスオリゴヌクレオチド類似体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、アンチセンス化合物をＲＮＡ中の標的配列にＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合によってハイブリダイズさせて、標的配列内にＲＮＡオリゴマーヘテロ２本鎖を形成させる、ヌクレオチド塩基およびサブユニット対サブユニット主鎖の配列を指す。オリゴマーは、標的配列内で正確な配列相補性または準相補性を有し得る。このようなアンチセンスオリゴマーは、標的配列を含有するｍＲＮＡの翻訳を遮断もしくは阻害し得る、または遺伝子転写を阻害し得る。アンチセンスオリゴマーは、２本鎖または１本鎖配列に結合し得る。
本発明の実施での使用に好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドの例は、たとえば以下の総説：Ｒ．Ａ Ｓｔａｈｅｌら、Ｌｕｎｇ Ｃａｎｃｅｒ，２００３，４１：Ｓ８１−Ｓ８８；Ｋ．Ｆ．Ｐｉｒｏｌｌｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００３，９９：５５−７７；Ａ．Ｃ．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ ａｎｄ Ｒ．Ｐ．Ｒｉｖｅｒｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００３，５：１１８−１２２；Ｎ．Ｍ．Ｄｅａｎ ａｎｄ Ｃ．Ｆ．Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３，２２：９０８７−９０９６；Ｎ．Ｓｃｈｉａｖｏｎｅら、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，２００４，１０：７６９−７８４；Ｌ．Ｖｉｄａｌら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００５，４１：２８１２−２８１８；Ｔ．Ａｂｏｕｌ−Ｆａｄｌ，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００５，１２：２１９３−２２１４；Ｍ．Ｅ．Ｇｌｅａｖｅ ａｎｄ Ｂ．Ｐ．Ｍｏｎｉａ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，２００５，５：４６８−４７９；Ｙ．Ｓ．Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．，２００５，１１：２８１１−２８２３；Ｅ．Ｒａｙｂｕｒｎら、Ｌｅｔｔ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｄｉｓｃｏｖ．，２００５，２：１−１８；Ｅ．Ｒ．Ｒａｙｂｕｒｎら、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｅｍｅｒｇ．Ｄｒｕｇｓ，２００６，１１：３３７−３５２；Ｉ．Ｔａｍｍ ａｎｄ Ｍ．Ｗａｇｎｅｒ，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００６，３３：２２１−２３８で言及されたものを含む（そのそれぞれはその全体が参照により本明細書に組み入れられている）。
好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドの例はたとえば、アポトーシスの強力な阻害薬であり、濾胞性リンパ腫、乳癌、結腸癌および前立腺癌、ならびに中間型／高悪性度リンパ腫を含む多くの癌で過剰発現される、ｂｃｌ−２ ｍＲＮＡの開始コドン領域を標的としたホスホロチオエートオリゴマーである、オリマーソン（ｏｌｉｍｅｒｓｏｎ）ナトリウム（Ｇｅｎｔａ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＮＪが開発したＧｅｎａｓｅｎｓｅ（商標）またはＧ３１２３９としても公知）を含む（Ｃ．Ａ．Ｓｔｅｉｎら、Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００５，３２：５６３−５７３；Ｓ．Ｒ．Ｆｒａｎｋｅｌ，Ｓｅｍｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００３，３０：３００−３０４）。他の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｃＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）に向けられた混合主鎖オリゴヌクレオチドである、ＧＥＭ−２３１（ＨＹＢ０１６５，Ｈｙｂｒｉｄｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）（Ｓ．Ｇｏｅｌら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２０３，９：４０６９−４０７６）；ＰＫＣ−アルファのアンチセンス阻害薬である、アフィニタク（ＩＳＩＳ ３５２１またはアプリノカルセン、ＩＳＩＳ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）；細胞周期、組織リモデリング、脂質輸送および細胞死の制御に関与し、乳癌、前立腺癌および結腸癌で過剰発現される糖タンパク質であるクラスタリンに対する２’−メトキシエチル修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドである、ＯＧＸ−０１１（Ｉｓｉｓ １１２９８９，Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；ｃ−ｒａｆ−１ ｍＲＮＡの３’−非翻訳領域の配列に相補的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドである、ＩＳＩＳ ５１３２（Ｉｓｉｓ １１２９８９，Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）（Ｓ．Ｐ．Ｈｅｎｒｙら、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．，１９９７，１２：４０９−４２０；Ｂ．Ｐ．Ｍｏｎｉａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９６，９３：１５４８１−１５４８４；Ｃ．Ｍ．Ｒｕｄｉｎら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００１，７：１２１４−１２２０）；ヒトＨ−ｒａｓ ｍＲＮＡ発現のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドアンチセンス阻害薬である、ＩＳＩＳ ２５０３（Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）（Ｊ．Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２００３，２７０：１６２８−１６４４）；ＧＥＭ ６４０（ＡＥＧ ３５１５６，Ａｅｇｅｒａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｉｎｃ．ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｎ，Ｉｎｃ．）などの、アポトーシス経路の実質的部分を遮断するアポトーシスタンパク質のＸ結合阻害薬（ＸＩＡＰ）を標的とする、または２’−Ｏ−メトキシエチルキメラオリゴヌクレオチドのＩＳＩＳ ２３７２２（Ｉｓｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）などの、アポトーシスタンパク質（ＩＡＰ）の阻害薬であるスルビビンを標的とする、オリゴヌクレオチド；ＤＮＡメチルトランスフェラーゼを標的とするＭＧ９８；およびヒトリボヌクレオチド還元酵素のＲ２小型サブユニット成分のｍＲＮＡのコード領域に相補的である２０マーオリゴヌクレオチドの、ＧＴＩ−２０４０（Ｌｏｒｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を含む。
他の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、ｃ−Ｍｙｂ、ｃ−Ｍｙｃ、およびｃ−Ｒａｆに対して開発されているアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む（たとえばＡ．Ｂｉｒｏｃｃｉｏら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２００３，２２：６５７９−６５８８；Ｙ．Ｌｅｅら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００３，６３：２８０２−２８１１；Ｂ．Ｌｕら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，２００４，６４：２８４０−２８４５；Ｋ．Ｆ．Ｐｉｒｏｌｌｏら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００３，９９：５５−７７；およびＡ．Ｒａｉｔら、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２００３，１００２：７８−８９を参照）。
ある実施形態において、本発明による使用のための核酸抗癌剤は、干渉ＲＮＡ分子を含む、または干渉ＲＮＡ分子をコードする。「干渉ＲＮＡ」および「干渉ＲＮＡ分子」という用語は、本明細書では互換的に使用され、遺伝子発現を阻害もしくは下方制御できる、または配列特異的方法で、たとえばＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を媒介することによって遺伝子を発現停止させることができる、ＲＮＡ分子を指す。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、相補的標的１本鎖ｍＲＮＡの分解および対応する翻訳配列の「発現停止」を誘発する、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって引き起こされる進化的に保存された配列特異的機構である（ＭｃＭａｎｕｓ ａｎｄ Ｓｈａｒｐ，２００２，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００２，３：７３７）。ＲＮＡｉは、より長いｄｓＲＮＡ鎖の、約２１−２３ヌクレオチド長の生物活性のある「低分子干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）配列への酵素切断によって機能する（Ｅｌｂａｓｈｉｒら、Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，２００１，１５：１８８）。ＲＮＡ干渉は、癌療法への有望な手法として浮上してきた。
本発明の実施での使用に好適な干渉ＲＮＡは、複数の形のいずれかで提供することができる。たとえば干渉ＲＮＡは、単離低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、または低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の１つ以上として提供することができる。
本発明での使用に好適な干渉ＲＮＡ分子の例は、たとえば以下の総説：Ｏ．Ｍｉｌｈａｖｅｔら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｒｅｖ．，２００３，５５：６２９−６４８；Ｆ．Ｂｉら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，２００３，３：４１１−４１７；Ｐ．Ｙ．Ｌｕら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００３，５：２２５−２３４；Ｉ．Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈら、Ｓｅｍｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．，２００４，１４：２２３−２３０；Ｍ．Ｉｚｑｕｉｅｒｄｏ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００５，１２：２１７−２２７；Ｐ．Ｙ．Ｌｕら、Ａｄｖ．Ｇｅｎｅｔ．，２００５，５４：１１７−１４２；Ｇ．Ｒ．Ｄｅｖｉ，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００６，１３：８１９−８２９；Ｍ．Ａ．Ｂｅｈｌｋｅ，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２００６，１３：６４４−６７０；およびＬ．Ｎ．Ｐｕｔｒａｌら、Ｄｒｕｇ Ｎｅｗｓ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．，２００６，１９：３１７−３２４に引用されたｉＲＮＡを含む（そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み入れられている）。
好適な干渉ＲＮＡ分子の他の例は、これに限定されるわけではないが、ｐ５３干渉ＲＮＡ（たとえばＴ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９６：５５０−５５３；Ｍ．Ｔ．Ｈｅｍｍａｎら、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２００３，３３：３９６−４００）；慢性骨髄性白血病および急性リンパ芽球性白血病の発症に関連するｂｃｒ−ａｂｌ融合を標的とする干渉ＲＮＡ（たとえばＭ．Ｓｃｈｅｒｒら、Ｂｌｏｏｄ，２００３，１０１：１５６６−１５６９；Ｍ．Ｊ．Ｌｉら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２００３，１３：４０１−４０９）、未分化大細胞リンパ腫の７５％に見られ、腫瘍形成に関連する構成的活性型キナーゼの発現を引き起こすタンパク質である、ＮＰＭ−ＡＬＫの発現を阻害する干渉ＲＮＡ（Ｕ．Ｒｉｔｔｅｒら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２００３，１３：３６５−３７３）；Ｒａｆ−１（Ｔ．Ｆ．Ｌｏｕら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，２００３，１３：３１３−３２４）、Ｋ−Ｒａｓ（Ｔ．Ｒ．Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２００２，２：２４３−２４７）、ｅｒｂＢ−２（Ｇ．Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００４，２７９：４３３９−４３４５）などの癌遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ；結腸直腸癌での主な形質転換イベントと考えられているＴ細胞因子標的遺伝子のトランス活性化をその過剰発現によって引き起こす、ｂ−カテニンタンパク質を標的とする干渉ＲＮＡ（Ｍ．ｖａｎ ｄｅ Ｗｅｔｅｒｉｎｇら、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．，２００３，４：６０９−６１５）を含む。
いくつかの実施形態において、本明細書に記載するようなクロロトキシン剤は、治療計画と組合せてまたは治療計画の一部として投与され、１つ以上の治療計画が血管新生に関連する疾患、障害、または状態の処置のために推奨されている。ほんの数例を挙げると、癌処置に推奨される投薬計画は、ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖのＵＲＬを有するウェブサイト、すなわち国立癌研究所のウェブサイトに見出すことができる。黄斑変性症の処置に推奨される投薬計画は、ＵＲＬ ｗｗｗ．ｍａｙｏｃｌｉｎｉｃ．ｏｒｇ／ｍａｃｕｌａｒ−ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ／ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．ｈｔｍｌを有するウェブサイトに見出すことができる。処置投薬計画は、化学療法、外科手術および／または放射線療法を含み得る。
Ｃ．標識部分
ある実施形態において、クロロトキシン剤は、少なくとも１つの標識部分によって標識される。たとえば１つ以上のクロロトキシン部分および／または１つ以上の治療部分は、標識部分によって標識され得る。
標識部分は、試験される組織への結合後に、クロロトキシン剤の検出を促進し得る。標識部分は、標識部分が測定可能であるシグナルを発生する、およびその強度が組織に結合された診断剤の量に関連付けられる（たとえば比例する）ように選択され得る。
いくつかの実施形態において、標識は、クロロトキシン剤の所望の生物または製薬活性を実質的に妨害しない。ある実施形態において、標識は、１つ以上の標識部分のクロロトキシン部分への、たとえばクロロトキシン部分のペプチド配列上の非干渉部分への結合または包含を含む。このような非干渉位置は、クロロトキシン部分の腫瘍細胞への特異的結合に関与しない位置である。
標識部分は、興味のある組織または系への結合後に、クロロトキシン剤の検出を可能にする任意の実体であり得る。多種多様の検出可能な薬剤のいずれも、本発明のクロロトキシン剤の標識部分として使用することができる。標識部分は直接検出され得るか、または間接的に検出され得る。標識部分の例は、これに限定されるわけではないが：各種のリガンド、放射性核種（たとえば３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３５Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、６４Ｃｕ、１８７Ｒｅ、１１１Ｉｎ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕなど）、蛍光染料（詳細な例示的な蛍光染料については、下を参照）、化学発光剤（たとえばアクリジニウム（ａｃｒｉｄｉｎｕｍ）エステル、安定化ジオキセタンなど）、生物発光剤、スペクトル分解型無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち量子ドット）、金属ナノ粒子（たとえば金、銀、銅、白金など）ナノクラスタ、常磁性金属イオン、酵素（酵素の詳細な例については下を参照）、比色標識（たとえば染料、コロイド金など）、ビオチン、ジゴキシゲニン（ｄｉｏｘｉｇｅｎｉｎ）、ハプテン、および抗血清またはモノクローナル抗体が入手可能であるタンパク質を含む。
ある実施形態において、標識部分は蛍光標識を含む。多種多様の化学構造および物理的特徴の多数の公知の蛍光標識部分は、本発明の診断方法の実施での使用のために好適である。好適な蛍光染料は、これに限定されるわけではないが、フルオレセインおよびフルオレセイン染料（たとえばフルオレセインイソチオシアニンまたはＦＩＴＣ、ナフトフルオレセイン、４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセインまたはＦＡＭなど）、カルボシアニン、メロシアニン、スチリル染料、オキソノール染料、フィコエリトリン、エリトロシン、エオシン、ローダミン染料（たとえばカルボキシテトラメチル−ローダミンまたはＴＡＭＲＡ、カルボキシローダミン６Ｇ、カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、リサミンローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）など）、クマリンおよびクマリン染料（たとえばメトキシクマリン、ジアルキルアミノクマリン、ヒドロキシクマリン、アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）など）、オレゴングリーン染料（たとえばオレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４など）、テキサスレッド、テキサスレッド−Ｘ、スペクトラムレッド（商標）、スペクトラムグリーン（商標）、シアニン染料（たとえばＣｙ−３（商標）、Ｃｙ−５（商標）、Ｃｙ−３．５（商標）、Ｃｙ−５．５（商標）など）、アレクサフルオール染料（たとえばアレクサフルオール３５０、アレクサフルオール４８８、アレクサフルオール５３２、アレクサフルオール５４６、アレクサフルオール５６８、アレクサフルオール５９４、アレクサフルオール６３３、アレクサフルオール６６０、アレクサフルオール６８０など）、ボディーピー染料（たとえばボディーピーＦＬ、ボディーピーＲ６Ｇ、ボディーピーＴＭＲ、ボディーピーＴＲ、ボディーピー５３０／５５０、ボディーピー５５８／５６８、ボディーピー５６４／５７０、ボディーピー５７６／５８９、ボディーピー５８１／５９１、ボディーピー６３０／６５０、ボディーピー６５０／６６５など）、ＩＲＤｙｅｓ（たとえばＩＲＤ４０、ＩＲＤ７００、ＩＲＤ８００など）などを含む。好適な蛍光染料のさらなる例および蛍光染料をタンパク質およびペプチドなどの他の化学的実体にカップリングする方法については、たとえば“Ｔｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｂｅｓ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ”，９ｔｈＥｄ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲを参照。蛍光標識剤の好ましい特性は、高いモル吸収係数、高い蛍光量子収率、および光安定性を含む。ある実施形態において、標識フルオロフォアは望ましくは、スペクトルの紫外範囲（すなわち４００ｎｍ未満）よりもむしろ可視（すなわち４００〜７５０ｎｍ）における吸収および放出波長を示す。
ある実施形態において、標識部分は酵素を含む。好適な酵素の例は、これに限定されるわけではないが、ＥＬＩＳＡで使用される酵素、たとえばホースラディッシュペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼなどを含む。他の例は、ベータ−グルクロニダーゼ、ベータ−Ｄ−グルコシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼなどを含む。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアナート、グルタルアルデヒドなどのリンカー基を使用して、クロロトキシン部分にコンジュゲートされ得る。
ある実施形態において、標識部分は、単光子放出型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）または陽電子（Ｐｏｓｉｔｉｏｎ）放出断層撮影法（ＰＥＴ）によって検出可能である放射性同位体を含む。このような放射性核種の例は、これに限定されるわけではないが、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、ヨウ素−１２５（１２５Ｉ）、ビスマス−２１２（２１２Ｂｉ）、ビスマス−２１３（２１３Ｂｉ）、アスタチン−２２１（２１１Ａｔ）、銅−６７（６７Ｃｕ）、銅−６４（６４Ｃｕ）、レニウム−１８６（１８６Ｒｅ）、レニウム−１８６（１８８Ｒｅ）、リン−３２（３２Ｐ）、サマリウム−１５３（１５３Ｓｍ）、ルテチウム−１７７（１１７Ｌｕ）、テクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）、ガリウム−６７（６７Ｇａ）、インジウム−１１１（１１１Ｉｎ）、およびタリウム−２０１（２０１Ｔｌ）を含む。
ある実施形態において、標識部分はガンマカメラによって検出可能である放射性同位体を含む。このような放射性同位体の例は、これに限定されるわけではないが、ヨウ素−１３１（１３１Ｉ）、およびテクネチウム−９９ｍ（９９ｍＴｃ）を含む。
ある実施形態において、標識部分は、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）での良好な造影強調剤である常磁性金属イオンを含む。このような常磁性金属イオンは、これに限定されるわけではないが、ガドリニウムＩＩＩ（Ｇｄ３＋）、クロムＩＩＩ（Ｃｒ３＋）、ジスプロシウムＩＩＩ（Ｄｙ３＋）、鉄ＩＩＩ（Ｆｅ３＋）、マンガンＩＩ（Ｍｎ２＋）、およびイッテルビウムＩＩＩ（Ｙｂ３＋）を含む。ある実施形態において、標識部分はガドリニウムＩＩＩ（Ｇｄ３＋）を含む。ガドリニウムは、ＦＤＡが承認したＭＲＩ用造影剤であり、異常な組織に蓄積して、このような異常な範囲を磁気共鳴画像で非常に明るく（強調）する。ガドリニウムは、体の各種の範囲において、特に脳において正常組織と異常組織との間に強いコントラストを与えることが公知である。
ある実施形態において、標識部分は、核磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）によって検出可能である安定な常磁性同位体を含む。好適で安定な常磁性同位体の例は、これに限定されるわけではないが、炭素−１３（１３Ｃ）およびフッ素−１９（１９Ｆ）を含む。
Ｄ．クロロトキシン剤と治療剤および／または標識部分との会合
ある実施形態において、クロロトキシン剤は、少なくとも第２の治療剤および／または標識部分と会合する部分である。
クロロトキシン剤と治療剤および／または標識部分との会合は、共有結合的または非共有結合的であり得る。結合、相互作用、またはカップリングの性質とは無関係に、クロロトキシン剤と治療剤との会合は、いくつかの実施形態において、第２の治療剤が腫瘍へのおよび腫瘍中への輸送／送達の前または間に、クロロトキシン剤から解離しないほど十分に選択的、特異的および強力である。クロロトキシン剤と第２の治療剤との会合は、当業者に公知の任意の化学的、生化学的、酵素的または遺伝的カップリングを使用して達成され得る。
ある実施形態において、クロロトキシン剤と治療剤および／または標識部分との会合は非共有結合的である。非共有結合的相互作用の例は、これに限定されるわけではないが、疎水性相互作用、静電相互作用、双極子相互作用、ファンデルワールス相互作用、および水素結合を含む。
ある実施形態において、クロロトキシン剤と治療剤および／または標識部分との会合は共有結合的である。当業者によって認識されるように、部分は直接的または間接的（たとえば後述するようにリンカーを介して）のどちらかで相互に結合され得る。
ある実施形態において、クロロトキシン剤と治療剤および／または標識部分は、相互に直接共有結合される。直接共有結合は、アミド、エステル、炭素間、ジスルフィド、カルバメート、エーテル、チオエーテル、尿素、アミン、またはカーボネート結合などの結合によることが可能である。共有結合は、クロロトキシン剤および／または治療剤に存在する官能基を利用することによって達成可能である。代わりに、重要でないアミノ酸は、カップリング目的で有用な基（アミノ、カルボキシまたはスルフヒドリル）を導入するであろう別のアミノ酸によって置換され得る。代わりに、さらなるアミノ酸をクロロトキシン剤に添加して、カップリング目的で有用な基（アミノ、カルボキシまたはスルフヒドリル）を導入することができる。部分を共に結合するために使用できる好適な官能基は、これに限定されるわけではないが、アミン、無水物、ヒドロキシル基、カルボキシ基、チオールなどを含む。活性化剤、たとえばカルボジイミドを使用して直接結合を形成することができる。多種多様の活性化剤が当分野で公知であり、治療剤とクロロトキシン部分との結合に好適である。
他の実施形態において、クロロトキシン剤と治療剤および／または標識部分とは、リンカー基を介して相互に間接的に共有結合される。これは、ホモ官能性剤およびヘテロ官能性剤を含む、当分野で周知の任意の数の安定な２官能性剤を使用して達成することができる（このような薬剤の例は、たとえばＰｉｅｒｃｅ Ｃａｔａｌｏｇ ａｎｄ Ｈａｎｄｂｏｏｋを参照）。２官能性リンカーの使用が活性化剤の使用と異なるのは、２官能性リンカーが得られたクロロトキシン剤に存在する結合部分を生成するのに対して、活性化剤は反応に関与する２つの部分の間に直接カップリングを生成するという点である。２官能性リンカーの役割は、２つのそうでなければ不活性な部分の間の反応を可能にすることであり得る。代わりにまたはさらに、反応生成物の一部となる２官能性リンカーは、そのリンカーがある程度の立体配座上の柔軟性をクロロトキシン剤に与えるように選択され得る（たとえば、２官能性リンカーは、複数の原子を含有するアルキル直鎖を含み、たとえばアルキル直鎖は２〜１０個の炭素原子を含有する）。代わりにまたはさらに、２官能性リンカーは、クロロトキシン剤と治療剤との間に形成された結合が切断可能である、たとえば加水分解可能であるように選択され得る（このようなリンカーの例については、たとえば米国特許第５，７７３，００１号；同第５，７３９，１１６号および同第５，８７７，２９６号を参照、そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み入れられている）。このようなリンカーはたとえば、コンジュゲートの加水分解後にクロロトキシン剤および／または治療剤により高い活性が見られるときに使用され得る。治療剤がクロロトキシン剤から切断され得る例示的な機構は、リソソーム（ヒドラゾン、アセタール、およびシス−アコニテート様アミド）の酸性ｐＨでの加水分解、リソソーム酵素（カテプシン（ｃａｐｔｈｅｐｓｉｎ）および他のリソソーム酵素）によるペプチド切断、およびジスルフィドの還元）を含む。治療剤がクロロトキシン剤から切断される別の機構は、細胞外または細胞内での生理的ｐＨにおける加水分解を含む。この機構は、治療剤をクロロトキシン部分にカップリングするために使用される架橋剤が生分解性／生腐食性実体、たとえばポリデキストランなどであるときに適用される。
たとえばヒドラゾン含有クロロトキシン剤は、所望放出特性を与える導入されたカルボニル基によって生成することができる。クロロトキシン剤は、１端にジスルフィド基を、反対端にヒドラジン誘導体を備えたアルキル鎖を含むリンカーによって生成することもできる。ヒドラゾン以外の官能基を含有するリンカーは、リソソームの酸性環境で切断される可能性も有する。たとえばクロロトキシン剤は、エステル、アミド、およびアセタール／ケタールなどの、細胞内で切断可能であるヒドラゾン以外の基を含有するチオール反応性リンカーから生成できる。
ｐＨ感受性リンカーのクラスの別の例は、アミド基に隣接したカルボン酸基を有するシス−アコニテートである。カルボン酸は、酸性リソソーム中でのアミド加水分解を加速する。同様の種類の加水分解速度の加速を複数の他の種類の構造によって達成するリンカーも使用できる。
クロロトキシン剤のための別の考えられる放出方法は、リソソーム酵素によるペプチドの酵素加水分解である。一例において、ペプチド性毒素は、アミド結合を介してパラ−アミノベンジルアルコールに結合され、次にカルバメートまたはカーボネートがベンジルアルコールと治療剤との間に生成される。ペプチドの切断によって、アミノベンジルカルバメートまたはカーボネートの崩壊、および治療剤の放出が引き起こされる。別の例において、フェノールは、カルバメートの代わりにリンカーの崩壊によって切断することができる。別の変形では、ジスルフィド還元を使用して、パラ−メルカプトベンジルカルバメートまたはカーボネートの崩壊を開始する。
治療剤および／または標識部分がタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドである実施形態において、クロロトキシン剤および治療剤は、融合タンパク質から共に生成し得る。上ですでに定義したように、融合タンパク質は、その個々のペプチド主鎖を介した共有結合によって結合された２つ以上のタンパク質またはペプチドを含む分子である。本発明の方法で使用する融合タンパク質は、当分野で公知の任意の好適な方法によって産生することができる。たとえば融合タンパク質は、ポリペプチド合成装置を使用する直接タンパク質合成方法によって産生することができる。代わりに、遺伝子断片のＰＣＲ増幅は、アンカープライマーを使用して実施することができ、アンカープライマーによって２つの連続遺伝子断片の間に相補的オーバーハングを生じ、続いて遺伝子断片はアニーリング、再増幅されて、キメラ遺伝子配列を生成させることができる。融合タンパク質は、標準組換え方法によって得ることができる（たとえばＭａｎｉａｔｉｓら“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄＥｄ．，１９８９，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．を参照）。これらの方法は一般に（１）所望の融合タンパク質をコードする核酸分子の構築；（２）核酸分子の組換え発現ベクターへの挿入；（３）発現ベクターによる好適な宿主細胞の形質転換；および（４）宿主細胞での融合タンパク質の発現を含む。このような方法によって産生された融合タンパク質は、当分野で公知であるように、培地から直接、または細胞の溶解のどちらかによって回収および単離され得る。形質転換宿主細胞によって産生されたタンパク質を精製する多くの方法が、当分野で周知である。これらは、これに限定されるわけではないが、沈殿、遠心分離、ゲル濾過、および（イオン交換、逆相、およびアフィニティ）カラムクロマトグラフィーを含む。他の精製方法が記載されている（たとえばＤｅｕｔｓｃｈｅｒら、“Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９９０，Ｖｏｌ．１８２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。
当業者がただちに認識できるように、本発明の方法で使用するクロロトキシン剤は、任意の数のクロロトキシン部分を含むことができ、任意の数の異なる方法で相互に会合された任意の数の治療剤および／または標識部分と会合させることができる。コンジュゲートの設計は、その所期の目的およびその使用の特定の状況で望ましい特性に影響されるであろう。クロロトキシン部分を治療剤に会合または結合させてクロロトキシン剤を形成する方法の選択は、当業者の知識の範囲内であり、一般に部分間で望ましい相互作用の性質（すなわち共有結合的対非共有結合的および／または切断可能対切断不可能）、治療剤の性質、含まれる部分の官能化学基の存在および性質などによって変わるであろう。
標識クロロトキシン剤では、クロロトキシン剤（または治療剤）と標識部分との間の会合は、共有結合的または非共有結合的であり得る。共有結合的会合の場合、クロロトキシン（または治療剤）および標識部分は、上述のように直接または間接的のどちらかで相互に結合され得る。
ある実施形態において、クロロトキシン部分（または治療剤）と標識部分との間の会合は非共有結合的である。非共有結合的会合の例は、これに限定されるわけではないが、疎水性相互作用、静電相互作用、双極子相互作用、ファンデルワールス相互作用、および水素結合を含む。たとえば標識部分は、クロロトキシン剤（または治療剤）にキレート化によって非共有結合させることができる（たとえば金属アイソトープは、クロロトキシン部分に結合、たとえば融合されたｐｏｌｙＨｉｓ領域にキレート化させることができる）。
ある実施形態において、クロロトキシン剤（または治療剤）は、同位体標識される（すなわちクロロトキシン剤（または治療剤）は、通常自然界に見出される原子質量または質量数とは異なる原子質量または質量数を有する原子によって置換された１個以上の原子を含有する）。代わりにまたはさらに、同位体は、クロロトキシン剤および／または治療剤に結合され得る。
当業者がただちに認識できるように、本発明のある方法で使用する標識クロロトキシン剤は、任意の数の標識部分を含むことができ、任意の数の治療剤と会合させることができる。このような薬剤および標識部分は、任意の数の異なる方法で相互に会合させることができる。標識クロロトキシン剤の設計は、その所期の目的、その使用の状況で望ましい特性、および検出から選択された方法に影響されるであろう。
ＩＩ．血管新生を減少させる方法
本発明の血管新生を減少させる方法は、クロロトキシン剤の量を被験体に投与することをしばしば含み、ここでクロロトキシンの量は、クロロトキシン剤が投与されない対照被験体で観察または予想されるものと比較して、血管新生の程度が低下されるように有効である。
Ａ．適応
本発明の方法は、異常な血管新生を含む疾患または状態を改善および／または処置するのに有用であり得る。「異常な血管新生」は、本明細書で使用するように、発生、再生、および創傷修復などの正常な生物学的プロセスで発生しない血管新生を指す。本発明の方法を使用して減少され得る血管新生は、いくつかの実施形態において、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、およびその組合せからなる群より選択される因子によって刺激され得る。
血管新生は多様な病的プロセスに関与するため、本発明の方法は、たとえば癌（転移癌を含む）、眼の新生血管形成（黄斑変性症など）、炎症性疾患（関節炎など）などの疾患を処置および／または改善するのに有用であり得る。
腫瘍は、転移の増殖および／または発症を継続するために、新たな血管の形成に依存するようになることが多い。それゆえ本発明の方法は、腫瘍を改善および／または処置するのに有用であり得る。クロロトキシン剤を投与され得る被験体は、転移を開始している、またはすでに転移した腫瘍を有し得る。被験体は、１つ以上の転移を有し得る。いくつかの実施形態において、腫瘍および／または転移のサイズが縮小される。
いくつかの実施形態において、被験体は、脈絡膜新生血管形成を特徴とする状態もしくは疾患に罹患しているか、または状態もしくは疾患のリスクに瀕している。このような状態は、これに限定されるわけではないが、黄斑変性症、近視、眼球外傷、弾性線維性仮性黄色腫、およびその組合せを含む。
黄斑変性症は、６５歳以上のアメリカ人における失明および盲目の主な原因である。黄斑変性症は、通例は加齢性（ＡＭＤまたはＡＲＭＤと呼ばれることが多い）として発生することが多いが、若年性黄斑変性症も同様に発生する。ＡＭＤ／ＡＲＭＤでは、黄斑、すなわち明瞭な中心視に関与する脈絡膜の一部が変性する。黄斑変性症は通例、乾性（非血管新生）または湿性（血管新生）のどちらかとして診断される。
乾性黄斑変性症では、ドルーゼンとして公知の（ｋｎｗｎ）黄色がかった斑点が、たいていは黄斑周囲の劣化した組織による沈着または残屑から蓄積を開始する。中心視の喪失（ｌｅｓｓ）は通常は徐々に発生して、滲出型黄斑変性症の失明ほど重篤ではない。
滲出型黄斑変性症は、「血管新生」と呼ばれることで示唆されるように、たとえば黄斑で異常増殖する新たな血管を特徴とする。このような新たな血管は、網膜の下で増殖することがあり、血液および体液を漏出させる。このような漏出によって、光感受性網膜細胞に対して永久的な損傷が引き起され、網膜細胞は死に、中心視に盲点が生成する。滲出型黄斑変性症は、さらに２つの種類に分類され得る。潜在型の滲出型黄斑変性症では、網膜下での新たな血管増殖は顕著でなく、漏出はあまり明らかではなく、通例、あまり重篤でない失明（ｖｉｓｉｏｎ ｌｅｓｓ）が起きる。古典的な形の滲出型黄斑変性症では、血管の増殖および瘢痕形成は、網膜の下に観察できる非常に明瞭に線引きされた輪郭を有する。古典的な滲出型黄斑変性症は、古典的な脈絡膜新生血管形成としても公知であり、通常はより重篤な失明（ｖｓｉｏｎ ｌｏｓｓ）を引き起こす。
多くのＡＭＤ／ＡＲＭＤを含む滲出型黄斑変性症における血管新生を役割を考えると、本発明の方法は、このような障害を処置および／または改善するのに有用であり得る。滲出型黄斑変性症の現在の療法は、薬物を特定の細胞に標的化するための光線力学的療法（ＰＤＴ）と場合により組合される、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（商標）、Ｍａｃｕｇｅｎ（商標）および／またはビズダイン（商標）などの血管新生阻害薬を含む。高エネルギーのレーザー光を使用して異常な血管のある脈絡膜の範囲に小規模な火傷を精製する光凝固も、滲出型黄斑変性症を処置するために使用される。
いくつかの実施形態において、被験体は、滲出型黄斑変性症および／または加齢性黄斑変性症に罹患している。滲出型黄斑変性症に罹患している被験体の中では、被験体は潜在型または古典型に罹患し得る。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、既存の新生血管系の退行を引き起こす。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は新たな血管の出芽を防止する。ある実施形態において、クロロトキシン剤は、滲出型黄斑変性症の他の処置、たとえば光凝固、他の血管新生阻害薬を用いた処置、光線力学的療法などと組合される。
Ｂ．投薬量および投与
本発明の方法では、クロロトキシン剤、またはその製薬組成物は一般に、少なくとも１つの所望の結果を達成するのに必要または十分であるような量および時間で投与されるであろう。たとえばクロロトキシン剤は、血管の形成を低速化もしくは阻害する、および／または既存の新生血管系の退行を引き起こすような量および時間で投与することができる。このような効果は、たとえば他の方法で検出可能であり得る臨床的利益を生じ得る。たとえば、癌患者での血管新生の減少によって、腫瘍サイズの縮小、転移の数の減少、転移の形成の防止などが引き起こされ得る。同様に、黄斑変性症患者での血管新生の減少によって、視力の改善が引き起こされ得る。別の例として、関節炎患者では、血管新生の減少によって、炎症が低減され、症状が軽減され得る。
本発明による投薬計画は、単回用量またはある期間にわたる複数回用量より成り得る。投与は、１日１回または複数回、毎週（また他の数日間隔で）または間欠的なスケジュールであり得る。投与されるクロロトキシン剤、またはその製薬組成物の正確な量は、被験体間で異なり、複数の因子に依存するであろう（以下を参照）。実施例７で議論するように、たとえばＰＥＧ化によるクロロトキシン剤の修飾は、血管新生に対する有効性を維持しながら、投与頻度を低下させ得る。本発明のいくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、週に５回未満投与される。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は、週に２回未満投与される。
クロロトキシン剤、またはその製薬組成物は、所望の治療効果を達成するために有効な任意の投与経路を使用して投与され得る。本発明のある実施形態において、クロロトキシン剤（またはその製薬組成物）は全身に送達される。代表的な全身投与経路は、これに限定されるわけではないが、筋肉内、静脈内、肺、および経口経路を含む。全身投与はまた、たとえば輸液もしくはボーラス注入によって、または上皮層もしくは粘膜皮膚層（たとえば経口、粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって実施され得る。ある実施形態において、クロロトキシン剤は静脈内投与される。
他の投与経路も使用され得る。ある実施形態において、クロロトキシン剤は、静脈内、頭蓋内、筋肉内、腫瘍内、皮下、眼内、眼周囲、局所適用からなる群より選択される経路によって、またはその組合せによって投与される。
眼新生血管形成疾患における血管新生の程度を低下させることが所望であり得る。いくつかの実施形態において、クロロトキシン剤は眼に送達され得る。眼への送達は、たとえば硝子体内注射、結膜下注射などの眼内および／または眼周囲経路を使用して達成され得る。クロロトキシン剤の眼への局所適用は、たとえば点眼薬を使用しても達成され得る。
眼投与経路は、黄斑変性症などの眼の新生血管形成疾患の処置に特に有用であり得る。
投与経路に応じて、有効用量は、処置される被験体の体重；体表面積；原発臓器／腫瘍サイズ；ならびに／または転移の数、サイズ、および／もしくは種類に従って計算され得る。適切な投薬量の最適化は、ヒト臨床試験で観察された薬物動態データを考慮して、当業者がただちに行うことができる。最終的な投薬計画は、薬物の作用を変更する各種の因子、たとえば薬物の特異的活性、損傷の重症度および患者の応答性、患者の年齢、状態、体重、性別および食事、任意の存在する感染症の重症度、投与時間、他の療法の使用（または不使用）、ならびに他の臨床因子を考慮して、主治医が決定するであろう。クロロトキシン剤を使用して試験を実施するときに、適切な投薬レベルおよび処置期間に関するさらなる情報が生じるであろう。
代表的な投薬量は、１．０ｐｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重を含む。たとえば全身投与では、投薬量は、１００．０ｎｇ／ｋｇ体重〜１０．０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
さらに詳細には、クロロトキシン剤が静脈内投与される、ある実施形態において、薬剤の投薬は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、たとえば約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇまたは約０．０３ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇのクロロトキシンを含む１回以上の用量の投与を含み得る。たとえば、ある実施形態において、それぞれ約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇまたは１．０ｍｇ／ｋｇ超のクロロトキシンを含有する、クロロトキシン剤の１回以上の用量が投与され得る。他の実施形態において、それぞれ約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．１０ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．２０ｍｇ／ｋｇ、約０．２５ｍｇ／ｋｇ、約０．３０ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ、約０．４０ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ、約０．５０ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ、約０．６０ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ、約０．７０ｍｇ／ｋｇ、約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．８０ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．９０ｍｇ／ｋｇ、約０．９５ｍｇ／ｋｇ、約１．０ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ超のクロロトキシンを含有する、クロロトキシン剤の１回以上の用量が投与され得る。また他の実施形態において、それぞれ約１．０ｍｇ／ｋｇ、約１．０５ｍｇ／ｋｇ、約１．１０ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約１．２０ｍｇ／ｋｇ、約１．２５ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ、約１．４０ｍｇ／ｋｇ、約１．４５ｍｇ／ｋｇ、約１．５０ｍｇ／ｋｇ、または約１．５０ｍｇ／ｋｇ超のクロロトキシンを含有する、クロロトキシン剤の１回以上の用量が投与され得る。このような実施形態において、処置は単回用量のクロロトキシン剤の投与または２回用量、３回用量、４回用量、５回用量、６回用量もしくは６回を超える用量の投与を含み得る。２回連続用量は、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、７日間隔、または７日超の間隔（たとえば１０日、２週間、または２週間超）で投与され得る。
Ｃ．血管新生の程度
血管新生を減少させる本発明の方法において、血管新生の程度は、対照との比較で決定され得る。当業者によって理解されるように、対照レベルは、多様な方法で取得および／または推定され得る。投与されている被験体に類似している対照被験体からのデータが比較に使用され得る。代わりにまたはさらに、標準値が対照値として使用され得る。このような標準値は、たとえば臨床記録、アーカイブ、文献などで入手され得る公知のデータ、値、パラメータなどから計算および／または外挿され得る。
血管新生の程度は、多様な方法で測定され得る。たとえば、ヘモグロビン含有量、新生血管形成の面積、所与の視野でカウントした分枝点の数などは、血管新生の程度の表示として作用し得る。転移の数（たとえば癌患者における）、視力スコア（たとえば眼の新生血管形成疾患に罹患している被験体における）などの臨床測定値も、血管新生の程度の尺度として作用し得る。
いくつかの実施形態において、血管新生の程度は、対照被験体と比較して少なくとも５０％低下される。
Ｄ．併用療法
本発明の方法は、さらなる療法と組合せて利用できることが認識されるであろう（すなわち本発明による処置は、１つ以上の所望の治療薬もしくは医療的手技と同時に、その前に、またはそれに続いて投与することができる）。このような併用投薬計画で使用される療法（治療薬または手技）の詳細な組合せは、所望の治療薬および／または処置の適合性および達成される所望の治療効果を考慮するであろう。
たとえば癌の血管新生を減少させるために、本発明の方法は、処置される腫瘍に応じて、外科手術、放射線療法（たとえばガンマ線放射、中性子線（ｎｅｕｒｏｎ ｂｅａｍ）放射線療法、電子線放射線療法、陽子線療法、近接照射療法、全身放射性同位体）、内分泌療法、温熱療法、および寒冷療法を含む他の手技と共に使用することができる。
転移性脳腫瘍の多くの症例において、本発明の方法は、原発腫瘍を除去する外科手術の後に投与されることが多いであろう。脳腫瘍の処置では、外科手術の主な目標は、肉眼的全摘出、すなわち眼に見えるすべての原発腫瘍の除去を達成することである。このような目標を達成する際の問題の１つは、これらの腫瘍が浸潤性であること、すなわちこれらの腫瘍が正常な脳構造内を縫うように進む傾向があることである。さらに、患者の脳から安全に除去できる腫瘍の量に大きなばらつきがある。腫瘍の一部または全部が脳制御の重要な機能の領域に位置する場合には、除去は一般に不可能である。さらに、外科手術のみによって離れた部位の転移を除去および／または破壊することは不可能であるか、または実際的でないかもしれない。
転移性脳腫瘍の多くの症例において、本発明の処置は、放射線療法と組合せて（すなわち放射線療法と同時に、その前に、またはその後に）投与されることが多いであろう。通常の処置では、放射線療法は一般に、外科手術の後である。放射線は一般に、数週間にわたって一連の日常的な処置（フラクションと呼ばれる）として投与される。放射線を投与するこの「フラクション化された」手法は、腫瘍細胞の破壊を最大限にして、正常な隣接する脳に対する副作用を最小限にするために重要である。放射線が投与される面積（放射野と呼ばれる）は、できる限り正常な脳の多くが含まれないようにするために、慎重に計算される。
代わりにまたはさらに、本発明の方法は、任意の副作用を弱める薬剤（たとえば制吐薬など）などの他の治療剤および／または他の承認された化学療法薬と組合せて投与することができる。化学療法剤の例は、これに限定されるわけではないが、いくつか挙げると、アルキル化薬（たとえばメクロレタミン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、イホスファミドなど）、代謝拮抗薬（たとえばメトトレキセートなど）、プリン拮抗薬およびピリミジン拮抗薬（たとえば６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、シタラビン、ゲムシタビンなど）、紡錘体毒（たとえばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン、パクリタキセルなど）、ポドフィロトキシン（たとえばエトポシド、イリノテカン、トポテカンなど）、抗生物質（たとえばドキソルビシン、ブレオマイシン、マイトマイシンなど）、ニトロソ尿素（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）（たとえばカルムスチン、ロムスチン、ノムスチンなど）、無機イオン（たとえばシスプラチン、カルボプラチンなど）、酵素（たとえばアスパラギナーゼなど）、およびホルモン（たとえばタモキシフェン、ロイプロリド、フルタミド、メゲストロールなど）を含む。最新の癌療法のさらなる包括的な議論については、その内容が参照により本明細書に組み入れられている、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／、ＦＤＡ承認腫瘍薬のリストｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ｄｒｕｇｌｉｓｔｆｒａｍｅ．ｈｔｍ、およびＴｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎｔｈ Ｅｄ．１９９９を参照。
本発明の方法はまた、処置投薬計画の一部としての細胞傷害剤の１つ以上のさらなる組合せと共に使用可能であり、ここで細胞傷害剤のさらなる組合せは：ＣＨＯＰＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）；ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）；ＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）；ＣＡＰ−ＢＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）；ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキセート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン、およびロイコボリン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、ロイコボリン、シタラビン、ブレオマイシン、およびビンクリスチン）；ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキセート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン、およびロイコボリン）；ＭＯＰＰ（メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジン）；ＡＢＶ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびビンブラスチン）と交互の、ＭＯＰＰ（メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、ビンクリスチン、プレドニゾンおよびプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（アドリアマイシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、およびダカルバジン）と交互の、ＭＯＰＰ（メクロレタミン（ｍｅｃｈｌｏｅｔｈａｍｉｎｅ）、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびプロカルバジン）；ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン、およびプレドニゾン）；ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキセート、およびエトポシド）；ＭＩＭＥ（メチル−ｇａｇ、イホスファミド、メトトレキセート、およびエトポシド）；ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量シタラビン（ｃｙｔａｒｉｂｉｎｅ）、およびシスプラチン）；ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｉｓｏｌｏｎｅ）、高用量シタラビン、およびシスプラチン）；ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン、およびブレオマイシン）；ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビン、およびプレドニゾン）；ＣＶＰ−１（シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびプレドニゾン）、ＥＳＨＯＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン（ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｉｓｏｌｏｎｅ）、高用量シタラビン、ビンクリスチンおよびシスプラチン）；ＥＰＯＣＨ（シクロホスファミドのボーラス用量および経口プレドニゾンと共に、９６時間にわたるエトポシド、ビンクリスチン、およびドキソルビシン）、ＩＣＥ（イホスファミド、シクロホスファミド、およびエトポシド）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン、およびブレオマイシン）、ＣＨＯＰ−Ｂ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン、およびブレオマイシン）、ＣＥＰＰ−Ｂ（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、およびブレオマイシン）、およびＰ／ＤＯＣＥ（エピルビシンまたはドキソルビシン、ビンクリスチン、シクロホスファミド、およびプレドニゾン）から選択される。
当業者によって認識されるように、本発明の処置方法と組合せて投与される１つ以上の治療剤の選択は、処置される転移性腫瘍に依存するであろう。
たとえば脳腫瘍に処方される化学療法薬は、これに限定されるわけではないが、経口摂取される、テモゾロミド（テモダール（登録商標））、プロカルバジン（マチュレーン（登録商標））、およびロムスチン（ＣＣＮＵ）；静脈内投与される、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標）またはビンカサール（Ｖｉｎｃａｓａｒ）ＰＦＳ（登録商標））、シスプラチン（プラチノール（登録商標））、カルムスチン（ＢＣＮＵ、ＢｉＣＮＵ）、およびカルボプラチン（パラプラチン（登録商標））；ならびに経口、静脈内または髄腔内（すなわち髄液中に直接注射される）投与することができる、メトトレキセート（ｍｅｘｏｔｒｅｘａｔｅ）（リウマトレックス（登録商標）またはトレクサール（登録商標））を含む。ＢＣＮＵは、外科手術中にポリマー・ウェハー・インプラント（グリアデル（Ｇｉａｄｅｌ）（登録商標）ウェハー）の形でも投与される。脳腫瘍で最も普通に処方される併用療法の１つは、ＰＣＶ（プロカルバジン、ＣＣＮＵ、およびビンクリスチン）であり、通常は６週間おきに投与される。
処置される腫瘍が神経外胚葉起源の脳腫瘍である実施形態において、本発明の方法は、痙攣および脳浮腫などの症状の管理のための薬剤と組合せて使用され得る。脳腫瘍に関連する痙攣を制御するためにうまく投与される抗痙攣薬の例は、これに限定されるわけではないが、フェニトイン（ジランチン（登録商標））、カルバマゼピン（テグレトール（登録商標））およびジバルプロエクスナトリウム（デパコート（登録商標））を含む。脳の膨張は、ステロイド（たとえばデキサメタゾン（デカドロン（登録商標））によって処置され得る。
Ｄ．製薬組成物
上述のように、本発明の血管新生の程度を低下させる方法は、クロロトキシン剤のそれ自体での、または製薬組成物の形での投与を含む。製薬組成物は一般に、少なくとも１つのクロロトキシン剤の有効量および少なくとも１つの製薬的に許容される担体または賦形剤を含む。
製薬組成物は、当分野で周知の通常の方法を使用して調合され得る。最適な製薬的製剤は、投与経路および所望の投薬量に応じて変更することができる。このような製剤は、投与した化合物の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランスに影響し得る。製剤によって、固体、液体または半液体製薬組成物が産生され得る。
製薬組成物は、投与を容易にして、投薬量を均一にするために、投薬単位形で調合され得る。「単位投薬形」という表現は、本明細書で使用するように、処置される患者のためのクロロトキシン剤の物理的に別個の単位を指す。各単位は、所望の治療効果を生じるように計算された活性物質の所定の量を含有する。しかし組成物の総投薬量は、正しい医学的判断の範囲内で主治医によって決定されるであろうことが理解されるであろう。
上述のように、ある実施形態において、クロロトキシン剤は注射または輸液によって静脈内投与される。注射または輸液による投与に好適な製薬組成物は、好適な分散化剤または湿潤剤、および懸濁化剤を使用する公知の技術に従って調合され得る。製薬組成物は、非毒性希釈剤または溶媒中の、たとえば２，３−ブタンジオールの溶液としての、滅菌注射用液剤、懸濁剤または乳剤でもあり得る。使用され得る許容されるビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液（米薬局方）および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに滅菌固定油は、液剤または懸濁剤の媒体として慣習的に使用される。この目的で、合成モノまたはジグリセリドを含む任意の無刺激性固定油を使用することができる。オレイン酸などの脂肪酸も、注射用製剤の調製に使用され得る。
注射用製剤は、たとえば細菌保持フィルタによる濾過によって、または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌注射用媒体に溶解もしくは分散させることができる滅菌固体組成物の形で滅菌剤を包含することによって、滅菌することができる。
薬物の効果を延長するために、注射からの薬物の吸収を低速化することがしばしば望ましい。このことは、活性成分を油性ビヒクルに溶解または懸濁することによって達成され得る。注射用デポー形は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマー中で薬物のマイクロカプセル化マトリクスを形成することによって作製される。薬物のポリマーに対する比および使用した特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出速度を制御することができる。体組織に適合性であるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を封入することによって、デポー注射用製剤も調製することができる。
本明細書で議論するように、クロロトキシン剤への修飾（たとえばポリマーへの共有結合など）は、クロロトキシン剤の生物学的利用能を向上させるために使用され得る。
ＩＩＩ．アネキシンＡ２の結合剤および調節剤
アネキシンＡ２（アネキシンＩＩ、ＡＮＸ２、リポコルチンなどとしても公知）は、上皮細胞表面の細胞膜に結合しているのを見出すことができる。アネキシンＡ２は、細胞増殖制御、シグナル伝達経路、およびプラスミン生成を含む広範囲の役割に関係している。アネキシンはＡ２は、癌細胞で過剰発現することが示されている。
本明細書で紹介するデータは、クロロトキシンの結合パートナーとしてのアネキシンＡ２の役割を裏付けている。クロロトキシンの抗血管新生および抗腫瘍効果（本明細書および当分野で確立された）を考えると、アネキシンＡ２とのその潜在的な相互作用は特に興味深い。アネキシンＡ２は、内皮細胞でのプラスミン（セリンプロテアーゼ）の生成を促進する。この作用は、ｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）およびプラスミノーゲンに結合するアネキシンＡ２によって媒介され得る。プラスミン過剰産生は、血管新生および転移に関連してきた。同時に、プラスミン切断β−２−糖タンパク質１は、血管新生を阻害することが観察されている。
本明細書で紹介するデータは、血管新生に対するクロロトキシンの観察された効果とその潜在的な結合パートナーとの間の興味深い関連を提供する。
クロロトキシンの潜在的な相互作用パートナーとしてアネキシンＡ２を同定することによって、アネキシンＡ２が新規療法開発のための標的として確認される。アネキシンＡ２に結合する、および／またはアネキシンＡ２を調節する薬剤は、クロロトキシンが潜在的にそうであるように、有用な治療剤として作用し得る。このような調製剤のスクリーニングによって新たな療法が明らかとなり得て、そのいくつかはクロロトキシンとは異なる特徴を有し得る。このような新たな療法によって、たとえばより広範囲の疾患の処置および／または改善、異なる細胞種類への標的化、異なる投薬計画および投与経路による投薬などが可能になり得る。
ある実施形態において、アネキシンＡ２に結合する薬剤を同定する方法が提供される。このような薬剤は、たとえば血管新生関連障害のためのさらなる療法を開発するのに有用であり得る。このような方法は通例、アネキシンＡ２を発現する細胞を含む試料を提供するステップと；試料と試験剤とを接触させるステップと；試験剤がアネキシンＡ２に結合するか否かを決定するステップと；決定に基づいて、試験剤をアネキシンＡ２に結合する薬剤として同定するステップと；を含む。いくつかの実施形態において、試験剤がアネキシンＡ２機能を調節するか否かを決定するさらなるステップが実施される。
ある実施形態において、アネキシン活性が変更されるように、細胞にアネキシンＡ２を調節する薬剤を接触させることを含む、アネキシンＡ２を発現する細胞中でアネキシンＡ２活性を調節する方法が提供される。
多様な試験剤のいずれも、本発明の方法で使用され得る。小型分子（たとえば化合物ライブラリで見出すことができる小型分子など）は、並行アッセイでスクリーニング可能であり、アネキシンＡ２に結合するおよび／またはアネキシンＡ２活性を調節する小型分子を同定することができる。化合物の歴史的コレクションからのライブラリおよび／または多様性指向型合成からのライブラリなどの化合物ライブラリは、本発明での使用に好適であり得る。
代わりにまたはさらに、クロロトキシン断片、誘導体、および／またはバリアントは、ある新規のおよび／または所望の特徴を有するクロロトキシン断片、誘導体、および／またはバリアントを同定するために、本発明の方法を使用してスクリーニングされ得る。別の例として、他の毒素ならびにその断片、誘導体、およびバリアントは、アネキシンＡ２に結合する、および／またはアネキシンＡ２を調節する（ｍｏｄｕｌｃａｔｅ）能力について試験され得る。関連するサソリ毒は、本明細書で議論されてきた。
調節され得るアネキシンＡ２の活性は、いくつかの実施形態において、プラスミノーゲン／プラスミン活性化因子系の制御を含み得る。たとえばアネキシンＡ２は、プラスミノーゲンおよびｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）と相互作用して、プラスミン生成に関与する。
いくつかの実施形態において、アネキシンＡ２活性は、ある結合パートナーへの結合を含む。アネキシンＡ２の公知の結合パートナーは、これに限定されるわけではないが、プラスミノーゲン、ｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）、Ｓ１００Ａ１０（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１０、カルパクチン軽鎖およびアネキシンＩＩ軽鎖としても公知）、Ｆ−アクチン、β２−糖タンパク質Ｉ、ホスホリパーゼＡ２、およびＲａｃ−１含有複合体を含む。
いくつかの実施形態において、アネキシンＡ２活性は、細胞膜表面への局在、内皮（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｎ）細胞への局在、カルシウム依存性リン脂質膜への局在、内皮接着結合での局在、上皮接着結合での局在、Ｆアクチン集合プラットフォームでの局在、および／またはエンドソームへの局在を含む。
いくつかの実施形態において、アネキシンＡ２活性は、細胞増殖制御、シグナル伝達を含む。いくつかの実施形態において、アネキシンＡ２活性は、ホスホリパーゼＡ２の抑制を含む。
アネキシンＡ２は、細胞内部のある機能に関与するとも考えられている。いくつかの実施形態において、アネキシンＡ２活性は、アクチン集合への関与、エンドソームのソーティング、膜ドメインの安定化、またはその組合せを含む。
アネキシンＡ２はまた、細胞外である機能を有することが考えられている、またはそのことが公知である。このような活性は、抗凝固反応への関与（おそらくプラスミン／プラスミノーゲン活性化因子系の介在物質としてのその効果による）および破骨細胞形成（ｏｆｒｍａｔｉｏｎ）および骨吸収に関与する自己分泌因子としての作用を含む。
以下の実施例は、本発明の作製および実施の方式のいくつかを説明する。しかし、これらの実施例が例証目的のためだけであり、本発明の範囲を制限するものでないことが理解されるべきである。さらに、実施例の説明が過去形で示されていない限り、本文は、明細書の残りの部分と同様に、実験が実際に実施され、データが実際に得られたことを示すものではない。
（実施例１）
ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイでのクロロトキシンの抗血管新生活性
本実施例は、ＴＭ−６０１（クロロトキシンの合成形）が血管新生に対して用量依存性阻害効果を有することを証明する。ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイでは、血管新生促進因子（血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、リポ多糖類（ＬＰＳ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＩＬ−６、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）をＴＭ−６０１と組合せて試験した。ＴＭ−６０１は、用量依存的方式でこれらの因子のそれぞれによって刺激された血管新生を阻害した。
物質および方法
ＣＡＭアッセイは以前に公開されたように実施した（たとえばＭｏｕｓａ Ｓ．Ｓ．ら、Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｒｅｓｖｅｒａｔｒｏｌ ｏｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｌａｔｅｌｅｔ／ｆｉｂｒｉｎ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ ｔｕｍｏｒ ｇｒｏｗｔｈ ｉｎ ｔｈｅ ｃｈｉｃｋ ｃｈｏｒｉｏａｌｌａｎｔｏｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｍｏｄｅｌ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ．２００５；５２（１）：５９−６５、その内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられている）。ニワトリ受精卵を３７℃、湿度５５％で孵化させた。受精１０日後に、気室を隠している卵殻の範囲に、皮下注射針で穿刺して小さな穴を作った。鶏卵側面の卵殻の、胚膜の無血管部分の上に直接、第２の穴を穿刺した。第１の穴に陰圧を印加することによって、第２の穴の下に偽の気室を作ると、それにより膜が卵殻から分離した。脱落したＣＡＭの上の卵殻に、小型の砥石車を使用して面積が約１．０ｃｍ２の窓を切り取り、下にあるＣＡＭに直接アクセスできるようにした。フィルタディスクを３ｍｇ／ｍＬ酢酸コルチゾンに浸漬し、続いて滅菌条件下で風乾した。
各実験は、負の対照群（ＰＢＳ）、正の対照群（血管新生促進因子）、ならびに血管新生促進因子および異なる用量のＴＭ−６０１による処置群を含んでいた。ＶＥＧＦ（２μｇ／ｍＬ）、ｂＦＧＦ（１μｇ／ｍＬ）、ＬＰＳ（５μｇ／ｍＬ）、ＥＧＦ（１００μｇ／ｍＬ））ＩＬ−６（１０μｇ／ｍＬ）、ＰＤＧＦ（１０μｇ／ｍＬ）、ＴＮＦα（１０μｇ／ｍＬ）またはＨＧＦ（１０μｇ／ｍｌ）を含む滅菌フィルタディスクを成長中のＣＡＭ上に置いた。２４時間後に、ＴＭ−６０１（０．００１〜１００μｇ）または対照ビヒクルをＣＡＭに局所的に添加した。刺激の第３日に、ＣＡＭを収集した。フィルタディスク直下のＣＡＭ組織を胚から除去して、組織をＰＢＳで３回洗浄した。５ｍｍフィルタディスク範囲の血管分枝点を血管出芽オペレータの定量的指標として、倍率３０倍でカウントして、平均測定値を報告した。以下の式を使用して、ＶＥＧＦ刺激による血管新生阻害の平均パーセントを計算した：
実験は１群当り卵８個を有するように設計した。しかし、技術上の理由で、大半の実験群に残った評価可能な卵は、もっと少なかった。さらにｂＦＧＦ実験は、それぞれその独自の生理食塩水対照および正のｂＦＧＦ対照を用いる２つの別個の実験で実施した。このデータは、ＴＭ−６０１の濃度範囲で用量依存性阻害効果を示すためにプールされた。
結果
血管新生促進因子はそれぞれ、ＣＡＭアッセイで血管新生を強く刺激した（図１）。血管分枝点の数の定量的測定値を使用して、血管新生出芽を評価した。新生血管形成阻害のパーセントは、各試験品の用量で計算した。ＴＭ−６０１は、試験を行った血管新生促進化合物それぞれ（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＰＳ、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、およびＨＧＦ）に対して、用量依存方式での強力な血管新生阻害薬であった（図２および３）。このような広範囲の血管新生阻害は、多くの他の血管新生阻害薬とは異なる。公知の血管新生阻害薬は通例、血管新生に関与する経路の一部またはサブセットのみを阻害して、他のシグナル伝達経路に適応できる、および／または他のシグナル伝達経路を使用できる腫瘍に対しては有効でない。
ｂＦＧＦ、ＬＰＳ、またはＥＧＦ刺激血管新生に対するＴＭ−６０１の観察された最大の阻害効果は、試験を行った用量範囲では約７５〜８５％であった。ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、またはＨＧＦ刺激血管新生に対するＴＭ−６０１の観察された最大の阻害効果は、試験を行った用量範囲では約６５〜７５％であった。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、発明者らは、ＴＭ−６０１のより高い阻害効果はＴＭ−６０１のなお高い用量によって観察されるであろうと推測している。
考察／結論
ＣＡＭアッセイを使用して、ＴＭ−６０１が抗血管新生活性を有するか否かについて試験を行った。ＴＭ−６０１は、異なる血管新生促進化合物によって刺激された血管新生に対して強力な阻害効果を有することを示した。ＶＥＧＦ刺激およびＥＧＦ刺激血管新生の阻害は、最も強力な効果を有すると思われ、試験を行った最大用量で９０％超の阻害に達した。ＶＥＧＦ刺激血管新生の阻害は、０．００１μｇという低用量でも５０％超の阻害に達した。
ＬＰＳ−刺激血管新生に対するＴＭ−６０１の阻害効果の試験を行った。ＬＰＳは、グラム陰性細菌の外膜の主成分である。ＬＰＳは、強い免疫応答を誘導して、血管新生も直接誘導する（たとえばＰｏｌｌｅｔら、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ＴＲＡＦ６−ｍｅｄｉａｔｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＦ−κＢ ａｎｄ ｃ−Ｊｕｎ Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ ｋｉｎａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ．２００３．１０２（５）：１７４０−２を参照、その全体の内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている）。ＴＭ−６０１は、ＬＰＳによって刺激された血管新生を遮断することも見出された。
試験を行った血管新生促進化合物はそれぞれ異なる受容体に結合するが、いくつかは下流シグナル伝達経路を共有する。たとえばＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびＬＰＳはすべて、ｐ３８ ＭＡＰＫおよびＥＲＫ１／２経路を介してシグナル伝達を行う。
（実施例２）
インビボでのマトリゲル・プラグ・アッセイによって測定したＴＭ−６０１の抗血管新生活性
本実施例に記載する実験によって、各種の投与経路によって送達されたＴＭ−６０１がマウスでのインビボのマトリゲル・プラグ・アッセイで血管新生を阻害する能力を試験した。全身送達されたＴＭ−６０１（週３回の静脈内注射による１０ｍｇ／ｋｇ ＴＭ−６０１）によって、新たな血管の形成が著しく減少したのに対して、局所送達された（すなわちＴＭ−６０１をマトリゲル中に混合することによる）または皮下注射（１０ｍｇ／ｋｇ ＴＭ−６０１を毎日注射）によるＴＭ−６０１によっては減少しなかった。実験群の被験体では、いずれの体重減少も観察されず、ＴＭ−６０１処置が重篤な毒性を発生しないという概念と一致した。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、発明者らは、これらの実験結果によってクロロトキシンの投与経路が抗血管新生能力に影響を有し得ることが示唆されることを提唱する。
物質および方法
高濃度マトリゲルマトリクス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を１００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、および３ｎｇ／ｍＬへパリンと、４℃にて混合した。８周齢メスＣ５７ＢＬ／６は５群に無作為に割当て、各群にマウス５匹とした。試験の実験設計を表１に示す。
マウスの１群に上述のようにマトリゲルを移植して、正の対照とした。マウスの第２および第３の群には、移植前にマトリゲルにＴＭ−６０１を添加したマトリゲルを移植した。第２群のマウスにはそれぞれ、プラグ１個当たりＴＭ−６０１ ５００μｇを含有するプラグを移植した；第３群のマウスにはそれぞれ、プラグ１個当たりＴＭ−６０１ ５μｇを含有するプラグを移植した。第４群および第５群のマウスには、（ＴＭ−６０１を添加しない）マトリゲルを移植して、試験期間を通じて１０ｍｇ／ｋｇ／注射にて、静脈内に週３回または皮下に毎日のどちらかによってＴＭ−６０１の用量を投与した。５００μＬマトリゲルプラグ２個を与えた各マウスには、左右相称で皮下組織に注射した。円形プラグを形成するために、通常の皮下挿入の後に、針先を左右に移動させることによって、幅広の皮下ポケットを形成した。注射は、内容物全体がプラグ中に送達されるように、２１−２５Ｇ針（ｎｅｅｄｌｅｄ）を用いて迅速に実施した。マトリゲルプラグを試験の第０日に移植して、処置は第１日に開始した。処置期の間、動物の体重を第１、４、８、１１、および１４日に測定した。
１４日後、プラグを収集した。マウスを安楽死させて、プラグの上の皮膚を引き戻した。プラグは、組織学的分析のために、切開して、固定し、パラフィンに包埋した。評価可能な各プラグからの厚さ５μｍの切片３枚をＣＤ３１抗体によって免疫染色して、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって対比染色した。顕微鏡下でプラグの断面積の血管数を測定することによって、各マトリゲルプラグを分析した。各処置群について、少なくとも６個のマトリゲルプラグを分析して、微細血管の平均数を計算した。
結果
血管新生は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびへパリンを添加した皮下マトリゲルプラグによって刺激された。ＴＭ−６０１がこのマウスモデルで抗血管新生効果を有するか否かを評価するために、ＴＭ−６０１を、移植前にマトリゲルと混合するか、または動物に全身的に投与した。１４日後、各群の平均微細血管数によって、処置群の１つがマトリゲルプラグ中への血管増殖の著しい減少を示したことが指摘された（図４）。週３回投与した静脈内注射（１０ｍｇ／ｋｇ／注射）によって、血管数の１．９分の１への低下が生じた（ｐ＜０．０１対対照）。同じ用量だが皮下投与した、ＴＭ−６０１のより頻繁な全身送達は、血管新生の遮断に有効でなかった。試験開始時のＴＭ−６０１ ５または５００μｇのマトリゲルプラグ中への局所送達によって、血管新生は著しく減少しなかった。微細血管染色結果の例を図５に示す。
試験を通じて、すべてのマウス群で体重減少は観察されず、ＴＭ−６０１処置には重篤な毒性が関連していないことが示唆された（図６）。
考察／結論
マトリゲル・プラグ・アッセイでは、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で週３回投与されたＴＭ−６０１によって、新たな血管形成は著しく減少した。対照的に、１０ｍｇ／ｋｇでのより頻繁な皮下注射は同様の効果を示さず、ＴＭ−６０１の抗血管新生活性が投与経路に感受性であり得ることが示唆された。マウスにおけるＴＭ−６０１の薬物動態を測定した以前の実験では、静脈内経路は、皮下注射と比較してＴＭ−６０１のより高い循環濃度を生じることが示された。より頻繁な投薬スケジュールによっても、このモデルでは１０ｍｇ／ｋｇでの皮下送達によって血管新生は減少しなかった。
実施例１に記載した実験では、ＣＡＭアッセイを使用して、ＴＭ−６０１の抗血管新生活性を測定した。ＣＡＭアッセイでは、血管新生促進化合物（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＰＳ、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、またはＨＧＦ）で飽和させた濾紙にＴＭ−６０１を直接加えた。ＴＭ−６０１は、これらの各血管新生促進化合物の用量依存性阻害を示し、最大の阻害は、試験を行った最大用量である１００μｇにて観察された（図３）。血管新生部位へのＴＭ−６０１の同様の局所送達によってこのような結果を再現する試みではＴＭ−６０１の５μｇまたは５００μｇのどちらかを移植時にマトリゲルプラグに直接添加した。これらの特別な実験でＣＡＭアッセイによって観察された結果とは対照的に、このような局所薬物送達様式によって、マトリゲル・プラグ・アッセイでの血管新生は遮断されなかった。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、発明者らは、２つの実験モデルにおけるＴＭ−６０１の吸収、分布、代謝、および／または排出の相違が異なる結果の原因であり得ると推測している。
（実施例３）
インビトロ・マトリゲル・プラグ・アッセイでのＴＭ−６０１の抗血管新生活性に対する投与の用量、経路、および頻度の効果
本実施例に記載する実験は、各種の用量で、各種の投与経路によって、および各種の頻度にて送達されたＴＭ−６０１の抗血管新生活性を調べるために実施した。マウスに移植されたマトリゲルプラグ中への血管増殖は、多様な条件について測定した。０．４、２、１０、および５０ｍｇ／ｋｇの用量はもちろんのこと、静脈内および皮下経路による投与ならびに週３回、週２回、および週１回の投薬スケジュールでも試験を行った。週３回の静脈内注射による１０ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇ ＴＭ−６０１の送達によって、マトリゲルプラグでの新たな血管の形成は著しく減少した。試験を行った他の投薬パラメータでは（すなわちより低い用量にて、皮下注射による、およびより低頻度の投薬）、いずれのＴＭ−６０１も血管新生に対して阻害効果を有さないことが観察された。
物質および方法
高濃度マトリゲルマトリクス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を１００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、および３ｎｇ／ｍＬへパリンと、４℃にて混合した。８周齢メスＣ５７ＢＬ／６は９群に無作為に割当て、各群にマウス６匹とした。５００μＬマトリゲルプラグ２個を与えた各マウスには、左右相称で皮下組織に注射した。円形プラグを形成するために、通常の皮下挿入の後に、針先を左右に移動させることによって、幅広の皮下ポケットを形成した。注射は、内容物全体がプラグ中に送達されるように、２１−２５Ｇ針（ｎｅｅｄｌｅｄ）を用いて迅速に実施した。マトリゲルプラグを試験の第０日に移植して、処置は第１日に開始した。試験の実験設計を表２に示す。
マウスの１群に上述のように調製したマトリゲルを移植して、正の対照とした。他の動物には、試験期間を通じてＴＭ６０１を全身的に投薬した。処置期の間、動物の体重を第１、５、８、１２および１４日に測定した。
第１４日の終わりに、プラグ除去前に２〜７群のマウスから、最終用量の１分後および３０分後（各群の動物１〜３）ならびに最終用量の１５分後および６０分後（各群の動物４〜６）に血液を収集した。血液は、ＣＯ２／Ｏ２麻酔下での後眼窩穿刺により、未コートヘマトクリット管を使用してリチウムへパリン管内へ収集した。血液を１，５００×ｇで１５分間遠心分離して、血漿を新たな管に移した。試料を−７０℃で貯蔵して、分析のために別の研究所に出荷した。
１４日後、プラグを収集した。マウスを安楽死させて、プラグの上の皮膚を引き戻した。プラグは、組織学的分析のために、切開して、固定し、パラフィンに包埋した。評価可能な各プラグからの厚さ５μｍの切片３枚をＣＤ３１抗体によって免疫染色して、Ｈ＆Ｅによって対比染色した。顕微鏡下でプラグの断面積の血管数を測定することによって、各マトリゲルプラグを分析した。各処置群について、７から１０個のマトリゲルプラグを分析して、微細血管の平均数を計算した。
血液の酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）分析は、以下のように実施した。ＥＬＩＳＡ方法は、ウサギ抗ＴＭ−７０１抗体を使用して開発した。ＴＭ−７０１は、ＴＭ−６０１とアミノ酸が１つが異なり、残基２９にチロシン置換がある。ウサギ抗ＴＭ−７０１抗血清は、ＴＭ−６０１と交叉反応することが示されている。９６ウェルプレートの各ウェルを、ＰＢＳ中の抗ＴＭ−７０１抗体 ２００ｎｇによって４℃にて一晩コーティングした。プレートは、自動プレート洗浄器を使用して洗浄した。すべての洗浄は、洗浄緩衝液３００μＬ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）による洗浄５回のサイクルで実施した。サイクルのうち最後の４回の洗浄には、各洗浄の間の２０秒間の浸漬期間が含まれていた。試料または標準を希釈剤（１％ウシ血清アルブミンを含有する洗浄緩衝液）で希釈して、１００μｌを分析した。プレートを室温にて静かに振とうしながら７５〜９０分間インキュベートして、次に前と同様にプレートを洗浄した。標準手順を使用してビオチン化した抗ＴＭ−７０１抗体を各ウェルの希釈剤１００μＬの量に添加した。各ウェルは、ビオチン化抗体８５ｎｇ（２．７ｍｇ／ｍｌ原液の１／３２００希釈）を含有していた。プレートを静かに振とうしながら６０分間インキュベートして、前と同様に洗浄した。ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ・ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を希釈剤で１／５００に希釈して、１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを静かに振とうしながら４５〜６０分間インキュベートした。次にプレートを前と同様に洗浄したが、ただし最後の洗浄液を除去せずに、代わりに液をプレート上に５分間残存させた。次にウェルをＰＢＳ ２００μｌですすいで、各ウェルにＡＢＴＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）１００μｌを添加した。プレートを５分ごとに混合して、２０分後にＢｉｏＲａｄ Ｍｏｄｅｌ ５５０プレートリーダーを使用して吸収を４１５ｎｍにて読み取った。ソフトウェアパッケージ“Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ．５．２．１．”を使用して、未知の試料濃度を計算した。
結果
血管新生は、ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、およびへパリンを添加した皮下マトリゲルプラグによって刺激された。ＴＭ−６０１がこのマウスモデルで抗血管新生効果を有するか否かを評価するために、ＴＭ−６０１を全身注射した。１４日後、各群の平均微細血管数によって、処置群の２つがマトリゲルプラグ中への血管増殖の著しい減少を示したことが指摘された：１０または５０ｍｇ／ｋｇのどちらかの用量での、週３回の静脈内注射（図７）。週３回静脈内投与した、より低用量のＴＭ６０１は統計的に有意な方式で血管新生に影響を及ぼさなかったが、用量依存性効果があるように思われた（図８）。
興味深いことに、（静脈内投与経路によって血管新生を減少させた）１０ｍｇ／ｋｇ用量の５倍のＴＭ６０１の毎日の皮下注射は、わずかではあるが、統計的に有意ではない血管新生の減少を引き起こした。さらに、投薬頻度を週３回から週２回または１回に減少させると、抗血管新生活性の損失が生じた。微細血管染色結果の例を図９に示す。
試験を通じて、いずれの処置群でも体重減少は観察されず、ＴＭ６０１処置に関連する重篤な毒性がないことが示唆された（図１０）。
最終用量の後に血液試料を収集して、血漿ＴＭ６０１レベルを分析した（図１１）。ＴＭ６０１レベルおよび半減期は、前の試験で見られたものと同様であった。
考察／結論
マトリゲル・プラグ・アッセイでは、１０または５０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で週３回投与されたＴＭ−６０１によって、新たな血管形成は著しく減少した。それにもかかわらず、５０ｍｇ／ｋｇまでのより頻繁な皮下注射は同様の効果を示さず、ＴＭ−６０１の抗血管新生活性が投与経路に感受性であり得ることが示唆された。５０ｍ／ｋｇでの毎日の皮下投薬は、実験経過中の累積用量の１０倍以上の増加に相当する（５０ｍｇ／ｋｇ×１４回の皮下注射が１０ｍｇ／ｋｇ×６回の静脈内注射に匹敵した）。それゆえ、より頻繁な投薬スケジュールおよび著しくより多くの総累積用量によっても、５０ｍｇ／ｋｇの皮下送達によって、わずかではあるが、統計的に有意でない血管新生の減少のみが引き起こされた。同様の知見が実施例２に記載された。この実験を含めて、マウスにおけるＴＭ６０１の薬物動態を測定した実験では、静脈内経路は、皮下注射と比較して、ＴＭ６０１のより高いピーク循環濃度を生じることが示された（たとえば図１１を参照）。
本試験の別の興味深い知見は、静脈内送達の頻度がＴＭ−６０１の抗血管新生効果にとって重要であるということである。週３回の投薬スケジュールによって著しい血管新生の阻害が引き起こされたのに対して、週２回または１回のどちらもこのモデルでは血管新生に影響を及ぼさなかった。
ＴＭ−６０１投与のすべての経路、用量レベル、およびスケジュールも、週３回投与した５０ｍｇ／ｋｇまでのＴＭ６０１の静脈内送達も含めて、マウスでの耐容性は良好であった。すべての動物群で、１４日間の試験を通じて体重が増加した。
（実施例４）
漿尿（ｃｈｏｒｉａｌｌａｎｔｏｉｃ）膜で培養されたヒト腫瘍に対するＴＭ−６０１の抗腫瘍活性
実施例１で証明されたように、ＴＭ−６０１は、ＣＡＭアッセイでＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＰＳ、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、およびＨＧＦによって刺激された血管新生を阻害する。本実施例に記載する実験は、ＴＭ−６０１が腫瘍増殖をこの抗血管新生活性によって低速化させられるか否かを判定するために実施した。
ニワトリ卵ＣＡＭの表面に移植された腫瘍細胞は、血管新生を刺激する。ＴＭ−６０１は、いくつかのヒト腫瘍細胞株のＣＡＭアッセイで腫瘍増殖を低速化することが示されている。それにもかかわらず、ＴＭ−６０１は、インビトロで腫瘍細胞増殖を低速化せず、このことによってＴＭ−６０１が腫瘍増殖に間接的に影響を及ぼすことが示唆される。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、ＴＭ−６０１は血管系に対するその効果によって腫瘍増殖に影響を及ぼすことが仮定される。この仮説を試験するために、ＣＡＭ上で培養した腫瘍ＴＭ−６０１または生理食塩水のどちらかによって処置して、次にヘモグロビンレベルを分析した。ＴＭ−６０１は、腫瘍中のヘモグロビンの量を著しく減少させることが見出され、それゆえ腫瘍の血管新生をおそらく減少させた。
物質および方法
細胞培養
ヒト腫瘍細胞株はＡＴＣＣから供給され、供給者からの勧告に従って培養した。例外は、Ｄ５４−ＭＧ系統（Ｄｒ．Ｂｉｇｎｅｒ提供、Ｄｕｋｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）および膵臓癌からの初代分離株であった。ＣＡＭへの添加前に、サブコンフルエントの培養物をトリプシン処理して、３０μＬ中１×１０６細胞の濃度まで再懸濁させた。表３に、腫瘍−ＣＡＭ実験で使用した腫瘍細胞株を挙げる。
細胞増殖試験
Ｕ８７およびＰＣ−３細胞は、ＡＴＣＣによる勧告に従って培養した。Ｕ８７増殖試験では、ウェル当り約２００細胞を９６ウェルトレーに平板培養して、３７℃にて５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。次に各ウェルから培地を吸引して、ＴＭ−６０１を約１００、３３、１０、３．３、１．０、０．３３、０．１、０．０３、０．０１、０．０３または０μＭ含有する新鮮な培地と交換して、７２時間インキュベートした。この期間の終了時の細胞数を決定するために、スルホローダミン法を使用した（Ｓｉｇｍａカタログ番号ＴＯＸ−６）。最初に５０％ＴＣＡ ２５μＬを各ウェルに添加して、プレートを４℃で１時間インキュベートした。次にウェルを水で４回洗浄して、風乾させた。次に、４％スルホローダミン溶液５０μｌを各ウェルに添加して、細胞を３０分間染色した。次にウェルを１％酢酸で３回洗浄して、風乾させた。最後に、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ １００μｌを各ウェルに添加して、５分後にトレーを混合し、次にプレートリーダーで５６５ｎｍの吸収を読み取った。ＰＣ−３増幅試験では、細胞を２４ウェルトレーにウェル当り約１×１０４細胞で平板培養して、３７℃、５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。各ウェルから培地を吸引して、無添加の、ＴＭ−６０１ ２０ｎＭ、または１μＭを含有する新鮮な培地と交換した（２つずつ）。次に細胞をさらに７２時間インキュベートして、トリプシン処理後に細胞を血球計でカウントした。
腫瘍ＣＡＭ
受精ニワトリ卵を３７℃、湿度５５％で孵化させた。受精１０日後に、気室を隠している卵殻の範囲に、皮下注射針で小さな穴を穿刺した。鶏卵側面の卵殻の、胚膜の無血管部分の上に直接、第２の穴を穿刺した。第１の穴への陰圧印加によって、第２の穴の下に偽の気室を作ると、それにより膜が卵殻から分離した。脱落したＣＡＭの上の卵殻に、小型の砥石車を使用して面積が約１．０ｃｍ２の窓を切り取り、下にあるＣＡＭに直接アクセスできるようにした。ＣＡＭの表面を乾燥させて、細胞（１×１０６細胞）３０μＬをＣＡＭに加えた。同時に、ＴＭ−６０１ １０μｇを腫瘍表面に直接添加した。腫瘍の増殖を７日継続させ、このときに腫瘍塊を除去および秤量した。
腫瘍内のヘモグロビンの測定に同様の方法を使用した。１×１０６細胞をマトリゲル（増殖因子減少型、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）と混合して、発生第１０日にＣＡＭに適用した。対照として、マトリゲルのみをＣＡＭに適用した。細胞をＴＭ−６０１の１００μＭ原液０．９μＬ（３６０ｎｇ ＴＭ−６０１）と混合することによって、細胞をＴＭ−６０１で処置した。さらに、１００μＭ原液０．１μＬをマトリゲル周囲に加えた（ＴＭ−６０１ ４０ｎｇ）。腫瘍を７日後に収集して、いずれの下部血管系からも切除した。腫瘍を２回蒸留した水０．５ｍＬ中でホモジナイズして、試料を４，０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離した。次に上清を収集し、上清５０μＬをドラブキン試薬５０μＬ（Ｓｉｇｍａ）と混合した。室温にて１５〜３０分後、この混合物を９６ウェルプレートに配置した。５４５ｎｍの光学密度を測定して、既知のヘモグロビン濃度の標準曲線と比較した。
結果
腫瘍−ＣＡＭ実験は、３つの異なる場合で実施した。第１のパイロット実験では、３つの腫瘍系統に対して試験を行った（ＰＣ−３、Ｕ８７およびＳｋ−Ｍｅｌ−２８）。ＣＡＭ表面に移植した腫瘍は、未処置またはＴＭ−６０１ １０μｇによる処置のどちらかであった。増殖７日後に、腫瘍を秤量して（表４）、各腫瘍の平均腫瘍値を比較した。腫瘍のＴＭ−６０１処置によって、ＰＣ−３およびＵ８７腫瘍にて腫瘍増殖の著しい低下が生じた（ｐ＜０．０５）（図１２）。
腫瘍の写真を腫瘍の外植時に撮影すると、腫瘍の血管形成の減少があるように見えた（図１３）。この観察には２つの説明があった：ＴＭ−６０１が腫瘍増殖を減少させて、したがって血管新生の刺激の低下が生じたか、またはＴＭ−６０１が血管新生を減少させて、これにより腫瘍増殖が低速化したかのどちらかである。これら２つの可能性を区別するために、ＰＣ−３およびＵ８７のインビトロ培養物を各種の量のＴＭ−６０１の存在下で増殖させた。増殖７２時間後に、２つの異なる濃度のＴＭ−６０１の存在下で増殖させたＰＣ−３細胞の数は、ＴＭ−６０１の非存在下で増殖させた細胞と著しく異なっていなかった。平均細胞数は、２０ｎＭ ＴＭ６０１の７１２，５００個、１μＭ ＴＭ６０１の７０８，５００個に対して、対照では７４０，０００個であった。同様に、広範囲のＴＭ−６０１濃度では、Ｕ８７細胞の数は著しく減少しなかった（図１４）。それゆえ、ＴＭ−６０１は培養中のＰＣ−３またはＵ８７細胞の増殖には影響を及ぼさず、ＴＭ−６０１は腫瘍細胞に直接作用しないことが示唆された。実施例１で上述したように、ＴＭ−６０１はＣＡＭモデルで血管新生を阻害し、ＴＭ−６０１の主な効果が抗血管新生化合物としてであることが示唆される。
第２の腫瘍−ＣＡＭ実験は、初期の知見を確認して、腫瘍細胞株の数を増やすために実施した。以前に試験を行った３つの細胞株に加えて、ＨＳ６８３、Ｄ５４ＭＧ、Ｈ１２９９および原発性膵臓癌も調べた（表５）。これらの結果によって、Ｕ８７およびＰＣ−３腫瘍の腫瘍増殖に見られた効果が確認され、第１の実験では統計的に有意でなかったＳＫ−Ｍｅｌ２８腫瘍増殖が第２の実験では有意であることも示された。原発性膵臓癌単離物の腫瘍増殖もＴＭ−６０１によって減少した。この実験でＴＭ−６０１に応答しなかった腫瘍細胞株には、ＨＳ６８３、Ｄ５４およびＨ１２９９が含まれていた。この知見の考えられる１つの理由は、これらの腫瘍がより低速で増殖し、したがって迅速な腫瘍増殖のためには血管による補助が必要な段階に到達し得なかったことである。このことがあてはまる場合、次に腫瘍血管系を減少させる抗血管新生化合物が有効であるとは予想されないであろう。
腫瘍−ＣＡＭモデルでＴＭ−６０１が新生血管形成を減少させる理論をさらに裏付けるために、ＣＡＭ上で増殖した腫瘍中の総ヘモグロビンを測定した。図１６は、ＴＭ−６０１処置によって、試験した３つの腫瘍すべて（Ｕ８７、Ｄ５４および膵臓癌）のヘモグロビンレベルが著しく低下したことを示す。興味深いことに、Ｄ５４腫瘍増殖は、１つの実験ではＴＭ−６０１処置による影響は受けなかったが（図１５）、別の実験のヘモグロビン測定値によって、Ｄ５４腫瘍の血液レベルが低下したことが示された。
考察／結論
漿尿膜アッセイ（ＣＡＭアッセイ）によるデータによって、ＴＭ−６０１がＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、リポ多糖、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、またはＨＧＦによって刺激された血管新生を阻害することが示される。ＴＭ−６０１がこの抗血管新生効果によって腫瘍増殖を低速化できるか否かを判定するために、実験を実施してＴＭ−６０１のＣＡＭ表面でのヒト腫瘍増殖に対する効果を評価した。ＣＡＭ上で増殖する腫瘍細胞は、増殖を維持するために血液供給を刺激すると共に必要とする、固形塊を形成する。本報告で紹介するデータは、ＴＭ−６０１が抗血管新生効果によって腫瘍増殖を阻害するという仮説を裏付けている。ＣＡＭに移植したいくつかのヒト腫瘍の増殖は、ＴＭ−６０１によって減少した。これにはＰＣ−３、Ｕ８７、ＳＫ−Ｍｅｌ−２８および膵臓癌細胞が含まれていた。それにもかかわらず、すべての腫瘍が応答したわけではなく、いくつかの細胞は、ある実験では応答したが、他の実験では応答しなかった。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、我々が示唆するのは、これらの観察の１つの説明が、腫瘍が血管による補助に依存するために、酸素および栄養素が制限されるようになる時点まで腫瘍が増殖する必要があるということである。このことは、実験開始時に移植される細胞がより少ない場合には発生しないかもしれない。ＴＭ−６０１に対する応答を示さなかった腫瘍は、応答した他のより大きい腫瘍よりも平均して小さい傾向があるので（図１５を参照）、これがこの矛盾の原因であり得ることに注目された。ＴＭ−６０１が血管系に作用して、腫瘍細胞増殖には直接作用しないという証拠は図１４および１６に示されており、図では腫瘍細胞増殖はインビトロでＴＭ−６０１に感受性でないことと、ＣＡＭ上で増殖した腫瘍のＴＭ−６０１処置によって腫瘍内でのヘモグロビンの減少が生じたこととが示されている。それゆえ、ＣＡＭアッセイを使用して、ＴＭ−６０１が特定の血管新生促進因子（たとえばＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、リポ多糖、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、およびＨＧＦ）によって刺激された新生血管形成はもちろんのこと、ヒト腫瘍細胞によって刺激された血管新生も阻害することが示された。
（実施例５）
クロロトキシンの相乗作用性抗血管新生効果
ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイを使用する先の実験により、合成クロロトキシン（ＴＭ−６０１）がＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦα、またはＨＧＦによって刺激された血管新生に対して用量依存性阻害効果（ａｆｆｅｃｔ）を有することが示されている。現在の実施例では、この効果は、第２の契約研究所によって実施された、独立検証実験であった。さらに、抗血管新生効果は、抗ＶＥＧＦ抗体剤ＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓに対して、同様の濃度のＴＭ−６０１で発生した。ＴＭ−６０１がＡｖａｓｔｉｎまたはＬｕｃｅｎｔｉｓのどちらかと共に投与された場合、効果は相加的または相乗的のどちらかであった。最後にＴＭ−６０１は、ＣＡＭアッセイで静脈内注射されたときに、血管新生を阻害することが示された。
ニワトリ胚漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイを使用する実験を実施して、ＴＭ−６０１の抗血管新生特性をさらに評価した。ＣＡＭアッセイでの新生血管形成に対する効果は、実施例１に記載されている。本実施例では、非刺激型新生血管形成に対するＴＭ−６０１の効果を調べるために；ＶＥＧＦ−、ｂＦＧＦ−およびＬＰＳ−刺激血管新生の阻害を示す実施例１に記載した条件を反復するために；静脈内注射したＴＭ−６０１の抗血管新生効果を精査するために；ＴＭ−６０１と公知の血管新生阻害薬（ＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓ）の効力を比較するために；ならびにＴＭ−６０１とＡｖａｓｔｉｎまたはＬｕｃｅｎｔｉｓのどちらかとの組合せを試験するために、さらなるＣＡＭ実験を実施した。（ＡｖａｓｔｉｎまたはＬｕｃｅｎｔｉｓ（Ｌｕｅｎｔｉｓ）と組合せた実験は、少なくとも２回実施した）。
ＴＭ−６０１は、上で概説した実験それぞれにおいて血管新生を用量依存方式で阻害することが示された。観察された効果は、どちらも抗ＶＥＧＦ抗体剤であるＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓに対して、同様の濃度で発生した。結果によって、ＴＭ−６０１と２つの抗ＶＥＧＦ抗体との間に相加または相乗効果のどちらかがあることも示される。
物質および方法
ＣＡＭアッセイは、アッセイが実施された契約研究所に応じて、２つの異なる方法を使用して実施した。１つの契約研究所では受精ニワトリ卵を３７℃、湿度５５％で孵化させた。受精１０日後に、気室を隠している卵殻の範囲に、皮下注射針で小さな穴を穿刺した。鶏卵側面の卵殻の、胚膜の無血管部分の上に直接、第２の穴を穿刺した。第１の穴への陰圧印加によって、第２の穴の下に偽の気室を作ると、それにより膜が卵殻から分離した。脱落したＣＡＭの上の卵殻に、小型の砥石車を使用して面積が約１．０ｃｍ２の窓を切り取り、下にあるＣＡＭに直接アクセスできるようにした。フィルタディスクを３ｍｇ／ｍＬ酢酸コルチゾン（ｒｔｉｓｏｎｅ ａｃｅｔａｔｅ）に浸漬し、続いて滅菌条件下で風乾した。各実験は、対照群（ＰＢＳ）、正の対照群（血管新生促進因子）および異なる用量のＴＭ−６０１を添加した血管新生促進因子による処置群を含んでいた。２μｇ／ｍＬのＶＥＧＦを含む滅菌フィルタディスクを成長中のＣＡＭ上に置いた。２４時間後に、ＴＭ−６０１（０．００１〜１００μｇ）または対照ビヒクルをＣＡＭに局所的に添加した。刺激の第３日に、ＣＡＭを収集した。フィルタディスク直下のＣＡＭ組織を胚から除去して、組織をＰＢＳで３回洗浄した。５ｍフィルタディスク範囲の血管分枝点を、血管新生促進化合物に応答する血管出芽の定量的指標として、倍率３０倍でカウントした。各卵を２つの異なるオペレータによって分析して、平均測定値を報告した。以下の式を使用して、ＶＥＧＦ刺激による血管新生阻害の平均パーセントを計算した：
第２の契約研究所では、ＣＡＭアッセイを以下のように実施した。受精ニワトリ卵を強制空気循環される加湿孵卵器で３７．５℃にて孵化させた。胚齢３日に、卵を割り開き、胚を１００ｍｍ３ペトリプレートに慎重に移して、細胞培養インキュベータ内で３７．５℃にてその発生を続けた。直径約２ｍｍの予め作製したメチルセルロースディスクを胚齢５日に、胚漿尿膜の上に静かに移植して、試験剤のみ、または血管新生刺激剤（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＰＳ、対照溶液）のどちらかをメチルセルロースディスクの上に添加した。ＶＥＧＦを４０ｎｇ／ディスク、ｂＦＧＦを２０ｎｇ／ディスクで、そしてＬＰＳを１００ｎｇ／ディスクで添加した。胚を細胞培養インキュベータでさらに２日間インキュベートした。胚齢７日に、染色した脱脂粉乳溶液注射後に、ＣＡＭ膜を調べて、新たな血管形成について定量分析した。血管新生に対する処置の効果は、生存ニワトリ胚のみを用いて、ＣＡＭの血管密度指数（ｉｎｄｅｘｅｄ）（ＶＤＩ）を決定することによって評価した。各ＣＡＭのＶＤＩは、Ｉｍａｇｅ Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェアを使用して、メチルセルロースディスクに被覆された範囲での血管と３個の等距離中心円とによって作られた交点の数を表す。各群（Ｎ＞５）の定量分析に基づく平均ＶＤＩを、生理食塩水対照のパーセントとして表６および７に示す。２つの研究所で生成されたデータ間の内部整合性および比較の目的で、阻害曲線を含む図は、上に挙げたＰＲＩ Ａｌｂａｎｙによって使用された同じ式を使用して評価した。血管新生刺激が印加されず、同じ式が使用できなかったため、図１は例外である。
２つのＣＡＭ方法の間には、２つの主要な相違がある。第２の契約研究所ではニワトリ卵を割り開けるのに対して、第１の研究所ではＣＡＭアッセイを卵殻内で行う。また、薬物添加時点から血管新生分析時まで、第２の研究所ではアッセイを２日間実施し、第１の研究所はアッセイを３日間実施する。これらの方法には他のさらに微小な相違も存在し得る。
結果
第１の研究所では、ＴＭ−６０１が非刺激血管新生を用量依存方式で遮断することが見出された。対照の非刺激卵を、ＴＭ−６１０の各種量で処置した非刺激卵と比較した。この方法で、卵の正常な血管新生プロセスに対するＴＭ−６０１の効果の試験を行った。生データを表６に示し、曲線のプロットを図１７に示す。
第２の研究所も、ＴＭ−６０１がＶＥＧＦ−、ｂＦＧＦ−およびＬＰＳ−刺激血管新生を阻害することを示す、実施例１に記載された結果を再現した。前と同様に、この効果も用量依存方式で見られた（表７および図１８）。ＴＭ−６０１ ０．００１μｇで処置したＶＥＧＦ刺激によって刺激された胚の群を除いて、すべての値は、刺激剤のみの対照と比較して統計的に有意に減少された。図１９に示す写真は、典型的であり、血管新生刺激剤のみで処置したＣＡＭと比較した、ＴＭ−６０１で処置したＣＡＭを示す。
現在までの知見によって、ＴＭ−６０１が血管形成に対して阻害効果を有することが示されている。しかし、効力が他の抗血管新生治療薬にどの程度匹敵するかを決定するために、ＣＡＭ実験を実施し、その実験ではＶＥＧＦ−刺激血管新生の阻害がＴＭ−６０１はもちろんのこと、２つの承認抗血管新生治療薬、ＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓについても測定された。ＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓのどちらも、組換えヒト化抗ＶＥＧＦ抗体である。これらは、Ｌｕｃｅｎｔｉｓがその浸透性を向上させるために設計されたより分子量の小さい抗体断片であるという点で異なる。ＣＡＭに添加した阻害薬の重量に基づく阻害曲線を比較すると、ＬｕｃｅｎｔｉｓおよびＴＭ−６０１は最も効力があった（阻害薬の最小質量にて最大の阻害、図２１）。阻害薬のモル量に関してプロットすると、Ａｖａｓｔｉｎ抗体のサイズが比較的大きく、ＴＭ−６０１のサイズがより小さいために、曲線が移動する（図２２）。モル基準では、ＴＭ−６０１はＡｖａｓｔｉｎまたはＬｕｃｅｎｔｉｓよりも効力が低い。
ＴＭ−６０１が複数の受容体経路（ＶＥＧＦ、ｂＦＧＦ、ＬＰＳ、ＥＧＦ、ＩＬ−６、ＰＤＧＦ、ＴＮＦαおよびＨＧＦ）によって刺激される血管新生を阻害し、Ａｖａｓｔｉｎ／ＬｕｃｅｎｔｉｓがＶＥＧＦ経路のみに作用することを考えて、我々は次に、ＴＭ−６０１がＡｖａｓｔｉｎまたはＬｕｃｅｎｔｉｓのどちらかと共に作用して、抗血管新生効果の効力を上昇させることができるか否かについて試験を行った。その場合、この効果は相加的（各阻害薬の和のみ）、または相乗的（相加的を超える）のどちらかであり得る。この実験は２回実施した。図２３および２４に示すように、ＴＭ−６０１およびＡｖａｓｔｉｎまたはＬｕｃｅｎｔｉｓのどちらかの適用によって、どちらかの薬物単独よりも高い抗血管新生活性が生じた。この効果が相加的活性から生じるか否か、または相乗的効果が発生するか否かは、まだ明らかでない。
考察／結論
新生血管形成に対するＴＭ−６０１の用量依存性阻害活性が、２つの独立した研究所で再現された。１つの研究所によるデータは、阻害のレベルが、血管新生を刺激するために血管新生促進因子を使用したときに（図２５）、正常に発生しているニワトリ胚血管系に対する阻害効果（図２４）と比較して、より顕著であることを示している。ＶＥＧＦ−刺激血管新生の阻害は、局所適用されたＴＭ−６０１によってはもちろんのこと（図１８）、単回静脈内注射後にも観察された（図２０）。
ＴＭ−６０１処置から生じた血管新生阻害のレベルが他の抗血管新生化合物と同様であるか否かを判定するために、２つの抗ＶＥＧＦ抗体（ＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓ）をＴＭ−６０１と同じ実験で個別に添加した。質量基準では、ＴＭ−６０１およびＬｕｃｅｎｔｉｓは最も有効であったが、ＬｕｃｅｎｔｉｓおよびＡｖａｓｔｉｎは、モル基準で表したときにＴＭ−６０１よりも有効であった。ＴＭ−６０１および他の抗血管新生剤をさらに比較することを目的とした今後の実験には、黄斑変性症の眼モデルなどのインビボモデルが含まれ得る。このようなモデルは、ＴＭ−６０１がＡｖａｓｔｉｎおよびＬｕｃｅｎｔｉｓと同じくらい有効であるか否かの判定を容易にし得る、クリアランス速度および副作用の検討を可能にし得る。
実験の別のセットでは、ＴＭ−６０１は、ＡｖａｓｔｉｎまたはＬｕｃｅｎｔｉｓのどちらかと共に投与された。本実施例の実験によって、ＴＭ−６０１がこれらの２つの抗ＶＥＧＦ抗体と相加的または相乗的に作用するか否かを最終的に判定することはできなかった。個別に投与した各薬物の阻害効果の和は、２つの薬物を同時に投与したときに観察される阻害効果とおおよそ等しく、相加効果が示唆される。
それにもかかわらず、別の方法で組合せ効果を分析することによって相乗効果が示唆され得る。Ａｖａｓｔｉｎ用量を１０倍（０．０６７ピコモルから０．６７ピコモル）に増加させたとき、血管新生阻害のレベルは４７％しか上昇しなかったのに対して、わずか０．２５ピコモルのＴＭ−６０１を０．０６７ピコモルのＡｖａｓｔｉｎに添加すると、１５８％の上昇が生じた（図２３Ａ）。このような応答は、ＬｕｃｅｎｔｉｓをＴＭ−６０１と組合せたときにも観察された（図２３Ｂ）。それゆえ、モル基準では、ＡｖａｓｔｉｎまたはＬｕｃｅｎｔｉｓのどちらかにＴＭ−６０１を添加すると、どちらかの抗体薬物の濃度を単独で上昇させるよりも、血管新生の阻害に著しく有効であった。
（実施例６）
クロロトキシンによる脈絡膜新生血管形成の阻害および退行
新たな血管の形成（血管新生）およびこのような血管の維持は、転移の重要な要素と考えられる。本実施例によって、クロロトキシンが血管新生を阻害するおよび／または既存の新たに形成された血管の退行を引き起こす能力を、脈絡膜新生血管形成アッセイを使用して評価した。クロロトキシンを血管形成の誘導時付近から投与したときに、クロロトキシンによって新たな血管形成の著しい減少が引き起こされた。血管形成が誘導された数日後にクロロトキシンが投与された実験パラダイムでは、クロロトキシンによって脈絡膜新生血管形成の著しい退行が引き起こされた。
物質および方法
脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）は、マウスにおいて５３０ｎｍレーザを用いた光凝固によって誘導した。各網膜に３個の火傷を、網膜後極の９、１２、および３時の位置に与えた。ブルッフ膜の断裂は、レーザ誘導時に気泡が生じたときに成功であると判定した。気泡が観察された火傷だけを本試験に含めた。
第１の実験において、生理食塩水に溶解させたＴＭ−６０１の５０ｍｇ／ｍＬ溶液の硝子体内注射１μＬを片眼に注射して（ｎ＝動物１７匹、定量化可能な火傷４９個）、生理食塩水１μＬをーザ光凝固後に片方の眼に注射した（ｎ＝動物１７匹、定量化可能な火傷４４個）。７日後、注射を反復した。試験の第１４日に、マウスにフルオレセイン標識デキストラン（２ｘ１０６平均分子量、Ｓｉｇｍａ）を灌流させ、脈絡膜フラットマウントを作製して、蛍光顕微鏡法で検査した。
第２の実験では、第１日にレーザ光凝固を実施した。第７日に、処置開始前にＣＮＶベースライン測定のために、マウス１０匹の１群（定量化可能な火傷３０個）にフルオレセイン標識デキストランを灌流させた。残りのマウスには、ＴＭ−６０１の５０ｍｇ／ｍＬ溶液の１μＬの眼内注射を片眼に（ｎ＝動物１２匹、定量化可能な火傷３４個）、生理食塩水を片方の眼に（ｎ＝動物１３匹、定量化可能な火傷３２個）投与した。第１４日に、残りのマウスすべてにフルオレセイン標識デキストランを灌流させ、脈絡膜フラットマウントを作製して、蛍光顕微鏡法で検査した。
脈絡膜新生血管形成病変のサイズを脈絡膜フラットマウントで測定した。フルオレセイン標識デキストランによる灌流の後、眼を除去して、１０％緩衝ホルマリン中で１時間固定した。角膜およびレンズを除去して、網膜全体を眼杯から切除した。脈絡膜の放射状切断を縁から赤道まで行い、眼杯でフラットマウントを作製した。フラットマウントは、蛍光顕微鏡法で検査して、画像をデジタル化した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して、各火傷に関連する脈絡膜新生血管形成の総面積を測定した。
結果
レーザ光凝固によるマウスのブルッフ膜の断裂によって脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）が生じ、これは新生血管加齢性黄斑変性症の患者で発生するＣＮＶの多くの態様に似ている。ＴＭ−６０１がこのモデルにおける新たな血管形成に影響するかどうかを判定するために、ＴＭ−６０１ ５０μｇの硝子体内注射をレーザ光凝固の日（第１日）および第７日に実施した。対照眼には、同じ時点で生理食塩水を注射した。ブルッフ膜断裂の１４日後、各眼からの脈絡膜フラットマウントを分析した。ＴＭ−６０１処置は、５０μｇの眼内ＴＭ−６０１用量によって新たな血管の形成を著しく減少させる（図３２および３４）。
このモデルの先在する新生血管系に対するＴＭ−６０１の効果を評価するために、ＴＭ−６０１ ５０μｇの眼内注射による処置を、ブルッフ膜断裂の７日後まで遅延させた。この時点で、新生血管形成の大きな部位がすでに存在していた（図２６のベースラインを参照）。第７日の単回生理食塩水注射は、第１４日に測定した新たな血管形成に対する効果がなかったのに対して（図３３の対照）、ＴＭ−６０１の単回注射はＣＮＶの著しい退行を引き起こした（図２６および２７）。
考察／結論
本実施例によっては、局所投与ＴＭ−６０１がＣＮＶを著しく抑制して、ＣＮＶの退行を引き起こせることが証明される。新たな血管の退行は、ＣＮＶ病変内のアポトーシスによって起こることが示された。（たとえばＬｉｍａ Ｒ．ら、２００６．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｎｏｎ−ｃｏｌｌａｇｅｎｏｕｓ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ａ２（ＩＶ）ｃｏｌｌａｇｅｎ ｃａｕｓｅｓ ｉｎｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｏｒｏｉｄａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｄｕｃｉｎｇ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ２０８：１６１−１６６を参照、その内容全体は、その全体が参照により本明細書に組み入れられている）。ＣＮＶマウスモデルは、黄斑変性症の湿性形の疾患状態に似ている。本試験で用いた硝子体内投与経路は、黄斑変性症の臨床的に承認された療法である、Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）の投与に使用される経路であるため、臨床的に重要であり得る。
（実施例７）
ＰＥＧ化クロロトキシンの生物学的利用濃および抗血管新生効果
本実施例では、ＰＥＧ化クロロトキシンを試験して、インビボでのクロロトキシンの半減期を延長させられるか否かを判定した。ＰＥＧ化クロロトキシンの抗血管新生効果も調べた。
物質および方法
ＰＥＧ化
ＴＭ−６０１は、多分散直鎖４０ｋＤａ ＰＥＧ−プロピオンアルデヒド（ＤｏｗＰｈａｒｍａ）を使用する還元的アミノ化（ａｎｉｍａｔｉｏｎ）によって、ペプチドのＮ末端でＰＥＧ化した。
ＴＭ−６０１の半減期測定
非腫瘍保持Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、ＴＭ−６０１を（約２ｍｇ／ｋｇの用量で）単回尾静脈注射によって静脈内注射した。血液試料を各種の時点で採取し、抗ＴＭ−６０１抗体を使用してＥＬＩＳＡによってＴＭ−６０１のレベルを決定した。
マウス・マトリゲル・プラグ
高濃度マトリゲルマトリクス（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製）を１００ｎｇ／ｍＬ ＶＥＧＦ、１００ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦ、および３ｎｇ／ｍＬへパリンと、４℃にて混合した。８周齢メスＣ５７ＢＬ／６は各群に無作為に割当て、各群にマウス６匹とした。５００μＬマトリゲルプラグ２個を与えた各マウスには、左右相称で皮下組織に注射した。円形プラグを形成するために、通常の皮下挿入の後に、針先を左右に移動させることによって、幅広の皮下ポケットを形成した。注射は、内容物全体がプラグ中に送達されるように、２１−２５Ｇ針を用いて迅速に実施した。マトリゲルプラグを試験の第０日に移植して、処置は第１日に開始した。動物にビヒクル（生理食塩水）、ＴＭ−６０１、またはＰＥＧ化ＴＭ−６０１のいずれかを静脈内注射によって投薬した。３つの投薬計画：２週間にわたって週１回（第１日に１回および第８日に１回；「Ｑ７Ｄ×２」）、２週間にわたって週２回（第１日、第４日、第８日、および第１１日；「Ｑ３Ｄ×２／２」）、および２週間にわたって週５回（第１日、第２日、第３日、第４日、第５日、第８日、第９日、第１０に日、第１１日、および第１２日；「Ｑ１Ｄ×５／２」）を使用した。１４日後にプラグを収集した。マウスを安楽死させて、プラグの上の皮膚を引き戻した。プラグは、組織学的分析のために、切開して、固定し、パラフィンに包埋した。評価可能な各プラグからの厚さ５μｍの切片３枚をＣＤ３１抗体によって免疫染色して、ヘマトキシリンおよびエオシンによって対比染色した。各マトリゲルプラグの断面積の血管数を顕微鏡下で分析した。
結果／考察
図２８に示すように、ＰＥＧ化ＴＭ−６０１は、未修飾ＴＭ−６０１と比較してインビボでの半減期の延長を示した。ＰＥＧ化によってＴＭ−６０１の半減期は約３２倍、すなわち約２５分（ＴＭ−６０１）が約１６時間（ＴＭ−６０１−ＰＥＧ）に延長された。
半減期の延長を、血管新生モデルで動物により低い頻度で投薬する能力に変換した。マウス・マトリゲル・プラグ・アッセイでは、多様なスケジュールに従ってＴＭ−６０１またはＰＥＧ化ＴＭ−６０１（ＴＭ−６０１−ＰＥＧ）のどちらかを動物に投与した。微細血管密度を測定して、このような密度の低下が抗血管新生効果を示すと解釈した。
ＴＭ−６０１およびＴＭ−６０１−ＰＥＧはどちらも、試験を行った２つの最も頻繁な投薬スケジュール（２週間にわたって週２回、「Ｑ３Ｄ×２／２」；および２週間にわたって週５回、「Ｑ１Ｄ×５／２」）で抗血管新生効果を有した（図２９）。ＴＭ−６０１は、試験を行った最も低頻度の投薬スケジュール（２週間にわたって週１回、「Ｑ７Ｄ×２」）でいずれの抗血管新生効果も示さなかったのに対して、このような投薬スケジュールでＴＭ−６０１−ＰＥＧを用いた処置では、微細血管密度の著しい低下が生じた（図２９）。
いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、動物により低頻度で投薬する能力は、ＴＭ−６０１と比較した、ＴＭ−６０１−ＰＥＧのより長期間にわたる有効性によるものであり得る。このような有効性の向上によって、新たな血管形成の部位でのより長期間の暴露がもたらされ、より長期の効果が可能となる。
（実施例８）
結膜化注射によって送達されたクロロトキシンの抗血管新生効果
滲出型黄斑変性症などのいくつかの眼の障害には、異常な血管新生が含まれる。本実施例では、ＴＭ−６０１の抗血管新生効果について、血管新生の動物眼モデル（特にマウス脈絡膜新生血管形成モデル）で試験を行った。眼に投与するために一般に使用される経路である結膜下注射によってＴＭ−６０１を送達して、血管新生に対するその有効性を調べた。
物質および方法
マウス脈絡膜新生血管形成モデル
マウスの脈絡膜新生血管形成（ＣＮＶ）は、５３０ｎｍレーザ光凝固によって誘導した。各網膜に３個の火傷を、網膜後極の９、１２、および３時の位置に与えた。ブルッフ膜の断裂は、レーザ誘導時に気泡が生じたときに成功したことが明らかであった。気泡が観察された火傷だけを試験に含めた。
結膜下注射
生理食塩水に溶解させたＴＭ−６０１ ５μＬの眼周囲（結膜下）注射を第１日および第８日に片眼に対して行った。ＴＭ−６０１は、総用量がそれぞれ約１０、５０、２５０および１０００μｇとなるように、約２、１０、５０および２００ｍｇ／ｍｌの濃度で調製した。動物の１群に同じ量の生理食塩水を注射した。試験の第１４日に、マウスにフルオレセイン標識デキストラン（２×１０６平均分子量、Ｓｉｇｍａ）を灌流させ、脈絡膜フラットマウントを作製して、蛍光顕微鏡法で検査した。片方の眼（未処置眼）は対照として扱い、注射を投与しなかった。
脈絡膜新生血管形成の測定
脈絡膜新生血管形成病変のサイズを脈絡膜フラットマウントで測定した。フルオレセイン標識デキストランによる灌流の後、眼を除去して、１０％緩衝ホルマリン中で１時間固定した。角膜およびレンズを除去して、網膜全体を眼杯から切除した。脈絡膜の放射状切断を縁から赤道まで行い、眼杯でフラットマウントを作製した。フラットマウントは、蛍光顕微鏡法で検査して、画像をデジタル化した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ）を使用して、各火傷に関連する脈絡膜新生血管形成の総面積を測定した。
結果および考察
脈絡膜新生血管形成をマウスの眼で誘導して、マウスの片眼を結膜へのＴＭ−６０１注射によって処置した。未処置眼は対照として扱った。図３０に示すように、ＴＭ−６０１処置によって、新生血管形成の総面積の用量依存的な縮小が引き起こされた。結膜下送達ＴＭ−６０１の抗血管新生効果は、ＴＭ−６０１ 約６０μｇ（約２０〜３０ｍｇ／ｋｇにほぼ等しい）で最大化するように思われる。このような縮小は、生理食塩水を注射した対照と比較したときに、有意に異なっていた（ｐ＜０．０５）。興味深いことに、対照の未注射眼（「片方の眼」）の新生血管形成の総面積も用量依存方式で縮小するように思われたが、縮小は注射した眼で見られた縮小ほど大きくなかった。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、このような観察された効果は、片方の眼の注射部位から広がったＴＭ−６０１の結果であり得る。それにもかかわらず、未注射の片方の眼で観察された効果は、アーチファクトであり得る。
これらの結果によって、ＴＭ−６０１は結膜下注射によって送達されたときに、用量依存方式で抗血管新生効果を及ぼすことが示される。
（実施例９）
ＴＭ−６０１含有点眼薬の局所適用
実施例８によって、ＴＭ−６０１は眼に送達されて、眼の新たな血管形成を遮断できることが証明された。実施例８では、ＴＭ−６０１を結膜下注射によって送達した。ＴＭ−６０１の送達について試験を行った他の投与経路は、眼内（実施例６を参照）、硝子体内（実施例６を参照）、および静脈内（実施例２を参照）を含み、そのすべてが抗血管新生的に有効なＴＭ−６０１を送達するのにうまく使用された。
本実施例において、眼への別の投与経路が調べられた。ＴＭ−６０１は、点眼薬の形で局所送達され、抗血管新生効果について試験された。局所投与は、非侵襲性であるという利点を与える。点眼薬によって、血管新生関連障害（たとえば滲出型黄斑変性症）などの障害の処置のために、ＴＭ−６０１を眼に送達する代わりの方法が可能となり得る。
物質および方法
本実施例で使用する脈絡膜新生血管形成のマウスモデルおよびＣＮＶを測定する手段は、実施例８に記載した通りであった。
ＴＭ−６０１は、試験の間、局所点眼薬によって１日３回投与した。ＴＭ−６０１は、７０％デキストランおよび０．３％ヒプロメロース（活性成分）を含有する溶液に、約１、５または２５ｍｇ／ｍＬのいずれかの濃度で溶解させた。それゆえ、約１０μＬの各液滴によって、用量は約１０、５０または２５０μｇであった。実施例８と同様に、第１４日に、すべてのマウスにフルオレセイン標識デキストランを灌流させ、脈絡膜フラットマウントを作製して、蛍光顕微鏡法で検査した。
結果および考察
合計約０、０．０３ｍｇ、０．１５ｍｇ、または０．７５ｍｇのＴＭ−６０１を点眼薬によって、脈絡膜新生血管形成が誘導されたマウスに送達した。図３１に示すように、局所送達ＴＭ−６０１は、試験を行った最も高い用量（７５０μｇ；約２５〜４０ｍｇ／ｋｇ）で有効であった。試験を行ったいずれの用量においても、毒性は観察されなかった。これらの結果によって、ＴＭ−６０１は点眼薬によって送達されたときに血管形成を遮断できることが証明される。
（実施例１０）
クロロトキシン結合パートナー
クロロトキシンがその抗血管新生効果を及ぼす機構をさらに理解するために、発明者らは、クロロトキシンの結合パートナーを同定するための一連の実験を実施している。先の実験によって、クロロトキシンが腫瘍細胞の表面で抗原（または複数の抗原）に特異的に結合することが示された。発明者らは、このような抗原または複数の抗原の同一性を解明するための実験を設計した。
いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、発明者らは、クロロトキシンと特異的に相互作用するタンパク質または抗原の関連する特性が：１）プルダウンアッセイでのクロロトキシンとの共沈、２）クロロトキシンを結合しない細胞株への結合がないこと、３）原形質膜中での存在、４）ビーズおよび／もしくは非クロロトキシン由来ペプチドなどの対照試薬との相互作用が存在しないこと、５）ＴＭ−６０１ペプチドによって競合的方式で混乱され得る、細胞株との相互作用、６）タンパク質／抗原がこのような細胞中でノックアウトおよび／もしくはノックダウンされたときの、細胞へのクロロトキシン結合の減少、ならびに／または７）タンパク質／抗原の発現が戻ったときの、このようなノックアウトおよび／もしくはノックダウン細胞へのクロロトキシン結合の回復の１つ以上を含み得ることを提唱する。
タンパク質架橋実験を使用して、クロロトキシンに結合し得るタンパク質を同定する。ＴＭ−６０１は、Ｕ８７神経膠腫細胞に結合可能となるであろう。細胞は、クロロトキシンに結合し得る細胞の表面でタンパク質を架橋する膜不浸透性剤によって処理する。（タンパク質−クロロトキシン複合体を含むであろう）全細胞溶解液を、電気泳動によってポリアクリルアミドゲルで分離する。架橋複合体は、ウェスタンブロットで親和性精製抗ＴＭ−６０１抗体を使用してプローブする。クロロトキシンの潜在的結合剤は、ウェスタンブロットのバンドを使用して同定されるであろう。
クロロトキシンを合成ビオチン化したものであるＴＭ−６０２を使用して、プルダウン実験も実施する。タンパク質架橋実験と同様に、ＴＭ−６０２はＵ８７神経膠腫細胞に結合可能となるであろう。細胞は、表面タンパク質をクロロトキシンで架橋するために処理した。複合体は、全細胞溶解液から抗ＴＭ−６０１抗体が結合されたビーズを使用してプルダウンさせる。（抗ＴＭ−６０１抗体は、ＴＭ−６０２も認識する）。プルダウンされた複合体を電気泳動によってポリアクリルアミドゲルで分離する。ゲル上のタンパク質は、クロロトキシンの潜在的な結合剤に相当する。いくつかのタンパク質バンドをゲルから切除して、ガスクロマトグラフィー／質量分析法によって配列決定した。
最初のプルダウン実験によって、複数のタンパク質がクロロトキシンの潜在的な結合剤として同定された。細胞膜と会合するタンパク質であるアネキシンＡ２は、クロロトキシンの潜在的な結合パートナーの１つであった。アネキシンＡ２は、抗ＴＭ−６０１抗体によって複合体としてプルダウンさせて、抗アネキシンＡ２抗体を使用するウェスタンブロットで検出した。
アネキシンＡ２がクロロトキシンを結合する可能性を調べるために、アネキシンＡ２の発現に対して向けられたｓｉＲＮＡを使用したノックダウン実験を実施した。次に、アネキシンＡ２についてノックダウンされた細胞に結合するクロロトキシンを評価した。
トレーサー量の放射性標識ＴＭ−６０１の細胞表面への結合を４℃にて実施した。さらに、表面受容体に対する競合を示すために、未標識ＴＭ−６０１の増加量を加えた。結合は、未処置Ｐａｎｃ−１細胞または細胞中のアネキシンＡ２を減少させるｓｉＲＮＡのセットを形質移入されたＰａｎｃ−１細胞のどちらかに対して実施した。図３２に示すように、アネキシンＡ２のｓｉＲＮＡノックダウンは、ＴＭ−６０１の細胞表面への表面結合を著しく低下させることが見出された。
アネキシンＡ２は、内皮細胞表面で発現され、ある腫瘍タイプでは過剰発現される。アネキシンＡ２は、プラスミノーゲンおよびプラスミンなどの血管形成促進および／または抗血管形成タンパク質の変換を制御する結合位置として特徴付けられてきた。
インビボでのアネキシンＡ２とクロロトキシンの間に特異的な相互作用があるように思われる。アネキシンＡ２がクロロトキシンにインビボで結合するか否かを明らかにするさらなる実験が実施されている。いずれの特定の理論にも束縛されたくはないが、クロロトキシンが、アネキシンＡ２に結合して、それにより血管新生に関与する因子のアネキシンＡ２による制御を変化させることによって、その抗血管新生効果のいくつかを媒介し得ることが提唱されている。
アネキシンＡ２は、広範囲の役割に関係してきた。クロロトキシンの、抗（ａｎｔｉｏ）血管新生効果およびアネキシンＡ２との潜在的な相互作用は、プラスミン／プラスミノーゲン活性化因子系を制御するアネキシンＡ２の提唱された役割の観点から興味深い。アネキシンＡ２は、内皮細胞でのプラスミン（セリンプロテアーゼ）の生成を促進する。この作用は、アネキシンＡ２のｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）およびプラスミノーゲンへの結合によって媒介され得る。プラスミンの過剰産生は、血管新生および転移に関連してきた。同時に、プラスミン切断β−２−糖タンパク質１は、血管新生を阻害することが観察されている。クロロトキシン、アネキシンＡ２、およびプラスミンなどの下流制御タンパク質を含む正確な機構の詳細事項はまだ明らかになっていないが、本明細書で紹介したデータによって、クロロトキシンの血管新生に対する観察された効果とその潜在的な結合パートナーとの間に興味深い関連が与えられている。
クロロトキシンが多様な疾患および状態に有効な療法であることを考慮すると（本明細書および当分野で確証されたように）、本知見によって、クロロトキシンの潜在的な相互作用パートナーとしてのアネキシンＡ２が、新たな医薬品を同定するための所望の標的であることが確証される。アネキシンＡ２に結合する、および／またはアネキシンＡ２を調節する薬剤は、クロロトキシンが潜在的にそうであるように、有用な治療剤として作用し得る。このような調製剤のスクリーニングによって新たな療法が明らかとなり得て、そのいくつはクロロトキシンとは異なる特徴を有し得る。このような新たな療法によって、たとえばより広範囲の疾患の処置および／または改善、異なる細胞種類への標的化、異なる投薬計画および投与経路による投薬などが可能になり得る。
クロロトキシンの他の潜在的な結合剤（たとえば最初のプルダウン実験によって同定された）も、さらなる実験で調査され得る。
他の実施形態
本発明の他の実施形態は、明細書の検討または本明細書で開示した本発明の実施から当業者に明らかになるであろう。明細書および実施例は単なる例示と見なされるものとし、本発明の真の範囲は以下の請求項によって示される。

Claims (2)

  1. クロロトキシンポリペプチドとのアネキシンＡ２の相互作用を調節する薬剤を同定する方法であって、
    ａ）アネキシンＡ２を発現する細胞を含む試料を提供するステップと；
    ｂ）該クロロトキシンポリペプチドの存在下で、該試料と試験剤とを接触させるステップと；
    ｃ）該試験剤がアネキシンＡ２を発現する細胞に対する該クロロトキシンポリペプチドの相互作用を調節するか否かを決定するステップと；
    ｄ）該試験剤の結合がアネキシンＡ２を発現する該細胞に対する該クロロトキシンポリペプチドの結合を調節する場合に、該試験剤をアネキシンＡ２の相互作用を調節する薬剤として同定するステップと；
    を含む、方法。
  2. 前記試験剤がアネキシンＡ２機能を調節するか否かを決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
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