CN107541513B - 用于沉默cd317的小分子干扰rna、重组载体、药物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于敲低CD317的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体和宿主细胞及其应用，所述小分子干扰RNA具有与CD317的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。本发明提供了一种靶向CD317的促进肿瘤细胞凋亡的新方法，主要涉及一种高效沉默人CD317基因的小干扰RNA序列及其抗肿瘤应用，特别涉及CD317siRNA与抗肿瘤血管生成药物或放、化疗等能造成肿瘤细胞营养剥夺的治疗策略的联合应用。

Description

用于沉默CD317的小分子干扰RNA、重组载体、药物及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学、基因工程技术以及生物医药领域，具体涉及一种用于沉默CD317的小分子干扰RNA、重组载体、药物及其应用。

背景技术

CD317又名BST-2(Bone Marrow Stromal Cell Antigen 2)、HM1.24、Tetherin,位于人19号染色体p13.2位点，编码181个氨基酸。CD317蛋白大小约为35kDa，是一种脂筏相关I型跨膜糖蛋白，定位于细胞膜表面以及各种细胞器膜的表面。研究发现，CD317是一种新型免疫应答因子，在抗病毒免疫方面发挥病毒颗粒束缚因子(Tetherin)的作用。

此外，CD317是一个肿瘤相关抗原，在骨髓瘤、乳腺癌、结肠癌等恶性肿瘤上高表达。【参见：Swiecki,M.,et al.(2013)."BST-2/tetherin:structural biology,viralantagonism,and immunobiology of a potent host antiviral factor."Mol Immunol54(2):132-139.】，CD317过表达对肿瘤细胞增殖、转移以及凋亡抵抗等恶性行为具有促进作用【参见：1.Cai D,Cao J,Li Z et al.Up-regulation of bone marrow stromalprotein 2(BST2)in breast cancer with bone metastasis.BMC Cancer,2009,9:102.2.Sayeed，A.,et al.Aberrant Regulation of BST2(Tetherin)Promoter EnhancesCell Proliferation and Apoptosis Evasion in High Grade Breast CancerCells.Plos One,2013.8(6).】。

目前靶向CD317的治疗方法开发主要聚焦在单克隆抗体方面。据报道CD317单克隆抗体可以通过ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)效应抑制多发性骨髓瘤、肾细胞肾癌、子宫内膜癌等的发展【1.S.Kawai,Y.Azuma,E.Fujii,K.etal.Interferon-alpha enhances CD317expression and the antitumor activity ofanti-CD317monoclonal antibody in renal cell carcinoma xenograft models,CancerSci,99(2008)2461-2466.2.Y.T.Tai,H.M.Horton,S.Y.Kong,et al.Potent in vitro andin vivo activity of an Fc-engineered humanized anti-HM1.24antibody againstmultiple myeloma via augmented effector function,Blood,119(2012)2074-2082.3.T.Yokoyama,T.Enomoto,S.Serada,A.et al.,Plasma membrane proteomicsidentifies bone marrow stromal antigen 2as a potential therapeutic target inendometrial cancer,Int J Cancer,132(2013)472-484.】。单抗疗法有两个主要的缺陷：其一，以ADCC为主要效应手段，过分依赖于免疫功能。肿瘤病人免疫功能已经紊乱，免疫力低下，ADCC效应较弱，无法对肿瘤细胞产生较强的破坏作用；其二，目前应用的单抗多数含有鼠源成分，容易引起排斥，导致副作用发生或者抗体被快速清除，无法产生疗效。

截止本发明之前，是否可以通过直接调控CD317的表达治疗肿瘤尚缺乏明确的结论和直接的实验证据。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种用于沉默CD317的小分子干扰RNA、shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体、药物和宿主细胞及应用。

本发明提供的小分子干扰RNA能直接特异性靶向CD317的mRNA并导致mRNA降解，产生基因沉默效应；本发明提供的shRNA、shRNA的编码DNA、重组载体能通过促使宿主细胞中CD317的mRNA降解间接地沉默CD317的表达。

本发明涉及的英文缩写及其中文释义如下：

mRNA：信使RNA；siRNA：小分子干扰RNA；shRNA：短发夹RNA；

CD317-shRNA：具有靶向CD317信使RNA的短发夹RNA；

第一方面，本发明提供了一种小分子干扰RNA，所述小分子干扰RNA具有与CD317的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp。

在本发明一实施方式中，所述小分子干扰RNA的长度为21～27bp。

在本发明一实施方式中，所述小分子干扰RNA如SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:20所示核苷酸序列中的任一种。具体地，SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:20所示核苷酸序列中，序列SEQID NO:1与SEQ ID NO:2、序列SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4分别构成配对的正义链和反义链，以此类推。

在本发明一实施方式中，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或SEQID NO:2所示。

可以理解的是，SEQ ID NO:1～SEQ ID NO:20所示的小分子干扰RNA仅仅是一种具体示例，本领域技术人员可以通过设计靶向CD317其他位点的siRNA实现相似的沉默结果，应纳入本发明的保护范围。

在本发明一优选实施方式中，所述小分子干扰RNA的3’端修饰有两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸。具体地，如dTdT。

第二方面，本发明提供了一种shRNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了一种shRNA的编码DNA，所述shRNA具有如第一方面所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。

第四方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体为在病毒载体、质粒载体的重组位点插入如第三方面所述的编码shRNA的DNA得到的重组载体。

可以理解的是，本领域技术人员可以通过常规siRNA干扰载体或siRNA干扰途径实现CD317基因的沉默，应纳入本发明保护范围。所述的常规siRNA干扰载体或途径包括但不限于：1)病毒介导的shRNA，2)Crispr CAS9技术，3)通过常见商业化基因转染试剂，比如阳离子脂质体Lipofectamine 3000作为转染试剂直接向细胞转染siRNA等siRNA干扰途径实现CD317基因的沉默。

具体地，还可通过CRISPR/Cas9双载体慢病毒系统实现CD317的沉默。

具体地，还可通过腺病毒介导的shRNA干扰技术实现CD317的沉默。

第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，包括如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体中的至少一种。

第六方面，本发明提供了一种如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或第五方面所述的宿主细胞在制备：1)调节、调整或抑制CD317基因表达的药物；2)预防和/或治疗人CD317基因过表达相关疾病的药物；3)预防和/或治疗人CD317所调控下游基因过表达、缺失相关疾病的药物中的应用。

在本发明一实施方式中，所述药物为基因药物，优选为靶向基因投递药物。

第七方面，本发明提供了一种药物组合物，包括如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或第五方面所述的宿主细胞中的至少一种。

在本发明一实施方式中，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体；常见地，所述的药学上可接受的载体商业化基因转染试剂包括阳离子脂质体Lipofectamine 3000，但不限于此。

第八方面，本发明提供了一种传递核酸分子到细胞的方法，其包括使细胞与如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或第五方面所述的宿主细胞中的至少一种接触。

在本发明一实施方式中，所述细胞在体内，但不限于此。

在本发明一实施方式中，采用体外转染或体内皮下注射或肌肉注射的方式使所述细胞与如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或第五方面所述的宿主细胞中的至少一种接触。但没有特别限定。

第九方面，本发明提供了如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或第五方面所述的宿主细胞按下述一种或多种方法进行应用：

(1)将如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或第五方面所述的宿主细胞单独进行应用；

(2)将如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或第五方面所述的宿主细胞与化疗、放疗、手术、生物治疗、免疫治疗中的一种或几种联合应用；

(3)采用体内靶向投递的方式将所述如第一方面所述的小分子干扰RNA、如第二方面所述的shRNA、如第三方面所述的编码shRNA的DNA、如第四方面所述的重组载体或第五方面所述的宿主细胞直接投递到患者体内进行治疗。

在本发明一实施方式中，所述第(2)种应用方式中，所述化疗、放疗为向患者施用抗肿瘤血管生成药物或造成肿瘤细胞营养剥夺的放、化疗。

本发明提供的技术方案具有如下有益效果：

本发明提供的人CD317siRNA能够高效沉默肿瘤细胞CD317的表达，显著促进血清剥夺诱导的肿瘤细胞凋亡，但不影响正常培养状态肿瘤细胞。实体瘤进展过程由于血管畸形、或者经历放化疗、抗血管生成治疗策略，往往处于一种营养匮乏的状态，而正常细胞的营养状态则不受影响。针对这样的肿瘤患者，如果以合适的siRNA运送系统或者腺病毒将CD317基因进行沉默，有望在不损伤正常细胞的情况下显著促进肿瘤细胞的凋亡。

因此，本发明涉及的siRNA及其用法为临床肿瘤治疗提供了新的视角，也为抗血管生成或者放化疗提供了一种优秀的联用策略，为临床肿瘤治疗方法优化提供了新的可能。特别是CD317siRNA与抗肿瘤血管生成药物或放、化疗等能造成肿瘤细胞营养剥夺的治疗策略的联合应用提供了新选择。

附图说明

图1为本发明实施例1、2提供的Hela，SK-OV-3和MCF-7细胞CD317mRNA的RT-PCR检测结果；A、B、C分别展示Hela、MCF-7以及SK-OV-3细胞上观察到的结果；

图2为本发明实施例3提供的Hela，SK-OV-3和MCF-7细胞凋亡情况流式细胞术检测结果；

A、B、C分别展示Hela、MCF-7以及SK-OV-3细胞上观察到的结果。

具体实施方式

以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

下述实施例中所用的方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook,J.,Russell,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3^rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。

所用引物及核算序列均由上海吉玛公司合成。

作为本发明的优选实施例，选择目前较为常见的阳离子脂质体Lipofectamine3000作为转染试剂。

若无特别说明，本发明采用的其他试剂均为市售商品。

实施例1siRNA设计

根据siRNA靶序列基本原则，针对人CD317基因转录本(NM_004335.3)设计1条21个核苷酸的siRNA序列，即si-CD317,包括正义链和反义链，其碱基序列如下：

正义链(下划线为SEQUENCE NO.1):

5’-CCAGGUCUUAAGCGUGAGAdTdT-3’；

反义链(下划线为SEQUENCE NO.2)：

5’-UCUCACGCUUAAGACCUGGdTdT-3’。

本实施例选择的阴性对照(NC)siRNA碱基序列如下：

正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’；

反义链：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。

本发明实施例采用的干扰片段的3’端添加两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸，以增强siRNA在体内和体外的稳定性，防止降解。

实施例2干扰效果验证

本发明选用的细胞系为高表达人CD317的子宫颈癌细胞Hela、卵巢癌细胞SK-OV-3和乳腺癌细胞MCF-7。转染方法及结果验证如下：

1、细胞转染

根据siRNA合成报告，加入适量DEPC水配制20μM贮存液；

接种细胞于12孔板，密度以过夜培养后细胞汇合度达到60％-80％为宜；

用50μL Opti-MEM培养基稀释4μL Lipofectamine 3000转染试剂，充分混匀，室温静置5分钟；

用50μL Opti-MEM培养基稀释2μL siRNA，充分混匀，室温静置5分钟；

将上述步骤2)跟步骤3)的稀释液混合，充分混匀后室温静置10分钟。此时混合液中siRNA与Lipofectamine3000的比例为1:2；

将步骤5)转染混合液逐滴加入细胞培养孔，然后十字交叉法混匀；

细胞继续培养36小时，以备后续实验。

2、干扰效果检测

2-1、RNA抽提

转染siRNA 36h后，去除培养基，PBS洗涤一遍，加入1mL Trizol充分裂解细胞；

收集裂解液于1.5mL EP管中，加入200μL氯仿。颠倒混匀15s后室温静置3min,然后12000rpm，4℃离心15min；

吸取400μL上清，加入预冷的异丙醇400μL，混匀后12000rpm，4℃离心15min；

去除上清，用75％的乙醇清洗沉淀物，7500rpm，4℃离心8min。

真空干燥5min后加入20μL DEPC水，室温溶解5-10min；

用Nanodrop测定RNA浓度和纯度。

2-2、将上述RNA逆转录成cDNA

按下表配置逆转录反应A液,混匀后于70℃孵育5min,置冰上备用；

配制逆转录反应B液，体系如下所示：

将A液与B液混匀，于42℃温育1h，然后70℃孵育10min灭活逆转录酶，终止反应。

2-3、实时定量PCR测定CD317表达情况

在无核酸酶的PCR反应管中PCR反应液，体系如下：

在Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，条件如下：95℃变性30s；循环40次，[95℃15s，56℃15s，72℃20s/荧光信号检测]×40循环，扩增结束后，进行65-95℃熔解曲线分析收集；

采用2-△△CT对PCR结果进行半定量分析。结果如图1所示。图1为CD317特异性siRNA的沉默效果验证，由图1可知，本发明提供的siRNA可高效沉默Hela(A)、MCF-7(B)以及SK-OV-3(C)细胞中CD317的表达，沉默效果最高可达90％。

实施例3 流式细胞术分析CD317沉默对肿瘤细胞凋亡的影响

1、细胞预处理

1)细胞转染siRNA 36h后，胰蛋白酶-EDTA消化细胞，重悬至3×10 5细胞/mL,接种于12孔板；

2)培养过夜后，换无血清培养基继续培养48h,设立有血清组作为对照；

2、流式细胞术分析细胞凋亡情况

1)无血清饥饿细胞后，收集上清，然后用不含EDTA的胰酶消化、收集细胞悬液；

2)将细胞上清以及细胞悬液500g，4℃离心5min，收集上清以及细胞悬液里的细胞，并将二者合并；

3)用预冷的PBS洗涤细胞3次，然后用100μL 1×AnnexinV Binding Buffer重悬细胞；

4)每个样品都加入5μL Annexin V-FITC和5μL PI染液，轻轻混匀，室温避光反应15min；注意设置单染以及空白对照，后续流式检测调补偿需要；

5)孵育结束后，每个样品加入400μL预冷的1×AnnexinV Binding Buffer，轻轻混匀；在1h内检测；

6)流式细胞仪检测凋亡情况：Annexin V-FITC单阳性的细胞为早期凋亡细胞，Annexin V-FITC/PI双阳性的细胞为晚期凋亡细胞。

结果如图2所示。图2为CD317基因沉默促进血清剥夺诱导的肿瘤细胞凋亡效果验证，由图2可知，CD317基因沉默显著不影响正常培养状态的肿瘤细胞凋亡，但显著促进血清剥夺诱导的肿瘤细胞凋亡，A、B、C分别展示Hela、MCF-7以及SK-OV-3细胞上观察到的结果。

为进一步说明本发明的有益效果，本发明采用表1所示序列替换实施例1中的SEQUENCE NO.1和SEQUENCE NO.2，其他步骤不变；验证各siRNA对Hela、MCF-7以及SK-OV-3细胞中CD317的表达的沉默效果(如表1所示)，并验证CD317基因沉默促进血清剥夺诱导的肿瘤细胞凋亡效果。

表1所示siRNA对CD317基因沉默促进血清剥夺诱导的肿瘤细胞凋亡效果验证结果与实施例2一致，即：CD317基因沉默显著不影响正常培养状态的肿瘤细胞凋亡，但显著促进血清剥夺诱导的肿瘤细胞凋亡。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种小分子干扰RNA，其特征在于，所述小分子干扰RNA具有与CD317的信使RNA互补的核苷酸序列，长度为19～27bp，所述小分子干扰RNA的核苷酸序列为SEQ ID NO:13和SEQID NO:14所示核苷酸序列，所述小分子干扰RNA的3’端修饰有两个呈单链悬挂结构的脱氧核糖核苷酸。

2.一种shRNA，为具有茎环结构的单链RNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。

3.一种编码shRNA的DNA，其特征在于，所述shRNA具有如权利要求1所述的小分子干扰RNA的正义链或反义链的核苷酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体为在病毒载体、质粒载体的重组位点插入如权利要求3所述的编码shRNA的DNA得到的重组载体。

5.一种宿主细胞，其特征在于，包括如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求2所述的shRNA、如权利要求3所述的编码shRNA的DNA、如权利要求4所述的重组载体中的至少一种。

6.如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求2所述的shRNA、如权利要求3所述的编码shRNA的DNA、如权利要求4所述的重组载体和如权利要求5的所述的宿主细胞中的至少一种在制备：1)调节、调整或抑制CD317基因表达的药物；2)预防和/或治疗人CD317基因过表达相关疾病的药物；3)预防和/或治疗人CD317所调控下游基因过表达、缺失相关疾病的药物中的应用。

7.一种药物组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求2所述的shRNA、如权利要求3所述的编码shRNA的DNA、如权利要求4所述的重组载体和如权利要求5的所述的宿主细胞中的至少一种。

8.一种非治疗为目的的传递核酸分子到细胞的方法，其特征在于，包括使细胞与如权利要求1所述的小分子干扰RNA、如权利要求2所述的shRNA、如权利要求3所述的编码shRNA的DNA、如权利要求4所述的重组载体和如权利要求5的所述的宿主细胞中的至少一种接触。

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