CN107184984B

CN107184984B - Rpl10的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN107184984B
Application number: CN201710427474.8A
Authority: CN
Inventors: 许国雄; 史继敏; 张劲国; 张凌云
Original assignee: Jinshan Hospital of Fudan University
Current assignee: Jinshan Hospital of Fudan University
Priority date: 2017-06-08
Filing date: 2017-06-08
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2037-06-08
Also published as: CN107184984A

Abstract

本发明涉及RPL10的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。本发明发现敲除RPL10后可抑制卵巢癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，过表达RPL10后可促进卵巢癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，细胞凋亡减少，提示RPL10具有抑制卵巢癌发生发展的作用，可作为新兴治疗靶点，针对卵巢癌RPL10高表达的病人给予降低RPL10的表达，存在潜在治疗效果，RPL10的抑制剂可用于制备治疗卵巢癌的药物。本发明还提供了一种RPL10敲低效果十分显著的siRNA，其具备良好的药物开发前景。

Description

RPL10的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及卵巢癌的基因治疗领域，具体地说，涉及RPL10的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

背景技术

卵巢癌是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位，对妇女生命造成严重威胁。卵巢癌的治疗手段主要包括手术治疗、化学治疗和放射治疗等，但难以彻底治愈。另外，由于复发、耐药问题以及放化疗的毒副反应等造成其预后极差。如何提高卵巢癌患者生存率、降低肿瘤复发率成为现阶段临床研究的热点。

近年来，随着分子生物学、免疫学和病毒学的发展，基因治疗得以迅速发展。基因治疗是指在患者的肿瘤细胞中插入某种特定的基因片段、核酸物质或克隆基因，从而抑制、诱导、杀死或改变肿瘤细胞的行为。

核糖体蛋白L10(RPL10，又名QM)是核糖体蛋白家族成员之一。核糖体蛋白家族是人体细胞内合成蛋白质的主要成员，在遗传信息的传递过程中发挥着不可替代的作用，但是合成蛋白质传递遗传信息并不是核糖体蛋白的唯一功能，其还发挥着蛋白质翻译以外的功能，大量研究证实了多种核糖体蛋白在肿瘤中表达上调，部分在肿瘤中表达下调。目前的研究结果证明，核糖体蛋白家族通过调控癌基因和抑癌基因表达，调控细胞周期和凋亡、促进血管生成、协同染色体上的基因发挥更加广泛的作用，如调节肿瘤增殖、浸润、转移恶性生物学行为。RPL10最早于1991年被发现作为Wilms肿瘤的抑癌因子。现有研究表明RPL10在斑节对虾的卵巢中高表达，但是在人卵巢组织及卵巢肿瘤中尚无相关研究。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供RPL10抑制剂的新用途。

本发明提供了RPL10的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用。

本发明还提供了RPL10的抑制剂在制备试剂中的应用，所述的试剂用于：

a)抑制卵巢癌细胞增殖；

b)抑制卵巢癌细胞迁移；

c)抑制卵巢癌细胞侵袭；或

d)促进卵巢癌细胞凋亡。

作为本发明的一个优选例，所述的抑制剂选自以RPL10蛋白或它们的转录本为靶序列、且能够抑制其蛋白表达或基因转录的反义核酸；或能表达或形成所述反义核酸的构建物。

作为本发明的另一优选例，所述的抑制剂为一种siRNA分子，其正义链和反义链的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

作为本发明的另一优选例，所述的抑制剂为一种shRNA分子，其编码序列如SEQ IDNO:7和SEQ ID NO:8所示。

作为本发明的另一优选例，所述的抑制剂为一种构建物，所述的构建物为包含SEQID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的载体。

本发明还提供了一种治疗卵巢癌的siRNA分子，所述的siRNA分子的正义链和反义链的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供了一种治疗卵巢癌的shRNA分子，所述的shRNA分子的编码序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。

本发明还提供了一种构建物，所述的构建物为包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的载体。

本发明还提供了一种药物组合物，包含如上所述的siRNA分子、如上所述的shRNA分子，或如上所述的构建物，以及药学上可接受的药物载体。

如本文所用，所述的“RPL10抑制剂”包括了拮抗剂、下调剂、阻滞剂、阻断剂等，只要它们能够下调RPL10的表达水平。它们可以是化合物、化学小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平(包括DNA、RNA)的，也可以是抑制RPL10表达的病毒产品。所述的RPL10抑制剂是指任何可降低RPL10的活性、降低RPL10的稳定性、下调RPL10的表达、减少RPL10有效作用时间的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于下调RPL10有用的物质。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋白抑制剂，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调RPL10的表达。

本发明优点在于：

1、本发明发现敲除RPL10后可抑制卵巢癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，促进细胞凋亡，过表达RPL10后可促进卵巢癌细胞株的增殖、迁移和侵袭，细胞凋亡减少，提示RPL10具有抑制卵巢癌发生发展的作用，可作为新兴治疗靶点，针对卵巢癌RPL10高表达的病人给予降低RPL10的表达，存在潜在治疗效果，RPL10的抑制剂可用于制备治疗卵巢癌的药物。

2、本发明合成的siRNA敲低效果显著优于其他siRNA，具备良好的药物开发前景，取得了预料不到的技术效果。

附图说明

图1.Western-blot方法验证RPL10-siRNA的敲低效果。

图2.PHY-310慢病毒载体图谱。

图3.Western-blot方法验证RPL10-shRNA-388的敲低效果。

图4.RPL10对细胞增殖的影响。a和c：RPL10-shRNA的敲低表达验证；e：增殖实验显示RPL10敲低(RPL10-shRNA)可抑制细胞增殖；b和d：RPL10-plasmid的高表达验证；f：增殖实验显示RPL10表达增高后(RPL10-plasmid)可促进细胞增殖。

图5.Transwell迁移和侵袭实验。a：RPL10敲低后的迁移和侵袭，RPL10-shRNA可抑制卵巢癌细胞的迁移和侵袭；b：RPL10过表达后的迁移和侵袭，RPL10-plasmid可促进卵巢癌细胞的迁移和侵袭。

图6.流式检测细胞凋亡实验。a：RPL10-shRNA及其对照组Control的流式检测凋亡结果，RPL10-shRNA的早期凋亡细胞比例较对照组多；b：RPL10-plasmid及其对照组Vector的流式检测凋亡结果，RPL10-plasmid的早期凋亡细胞比例较对照组少。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

一、合成RPL10-siRNA

1、RPL10-siRNA序列信息

RPL10-humo-339S1：

sense(5'-3')：5'CAUGGUGUCAGAUGAAUAU 3'(SEQ ID NO:1)

antisense(5'-3')：5'AUAUUCAUCUGACACCAUG 3'(SEQ ID NO:2)

RPL10-humo-388S2：

sense(5'-3')：5'GCCCGAAUUUGUGCCAAUA 3'(SEQ ID NO:3)

antisense(5'-3')：5'UAUUGGCACAAAUUCGGGC 3'(SEQ ID NO:4)

RPL10-humo-723S3：

sense(5'-3')：5'GUCCACCUAUGUCUUUGUA3'(SEQ ID NO:5)

antisense(5'-3')：5'UACAAAGACAUAGGUGGAC3'(SEQ ID NO:6)

在以上各序列的3'端均增加TT以增强其稳定性。

2、RPL10-siRNA-388S2沉默效果最佳

卵巢癌细胞OVCAR-3铺板24小时给予RPL10-siRNA及对照组C-siRNA转染(罗氏X-tremeGENE siRNA转染试剂10μl+siRNA 2μg)，转染48小时后提取蛋白。结果见图1，可见RPL10-siRNA-388(S2)敲低效果最明显，敲低效率高达99％，显著高于其他siRNA序列的敲低效率(P<0.05)。

二、合成RPL10-shRNA

1、慢病毒干扰载体的构建

(1)RPL10-shRNA-388S2序列信息

由于RPL10-siRNA-388S2的敲低效果最为明显，以此合成shRNA。

Top strand：

5'-gatccGCCCGAATTTGTGCCAATATTCAAGAGATATTGGCACAAATTCGGGCTTTTTTg-3'(SEQID NO:7)

Bottom strand：

5'-aattcAAAAAAGCCCGAATTTGTGCCAATATCTCTTGAATATTGGCACAAATTCGGGCg-3'(SEQID NO:8)

(2)RNAi慢病毒重组质粒的构建

1)shRNA的退火；

2)shRNA载体(PHY-310慢病毒载体，购于汉尹生物科技(上海)有限公司，载体图谱如图2所示)的酶切及回收；

3)shRNA载体与引物的连接；

4)将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞中进行转化；

5)重组质粒的制备；

6)测序鉴定阳性克隆。

最终shRNA的编码序列插入到PHY-310慢病毒载体的BamH I和EcoR I位点之间，经过比对，重组克隆中插入片段序列与设计的oligo序列完全一致。2、慢病毒的包装和病毒滴度的测定

使用HG transgene reagent将构建的慢病毒表达载体和包装质粒共转染293T细胞，包装OVCAR-3病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度为1*10⁹TU/ml。

3、RPL10-shRNA-388沉默效果验证

使用RPL10-shRNA干预卵巢癌细胞株：以MOI＝20(OVCAR-3)加入病毒建立稳转细胞株(RPL10-shRNA)。对照组空转等量慢病毒颗粒(Control)。使用Western-blot方法验证敲除效率，实验重复3次。结果见图3，RPL10-shRNA-388敲低效果较对照下降60％。

三、RPL10对细胞增殖的影响

以MOI＝20(OVCAR-3)建立RPL10敲低表达的RPL10-shRNA细胞株，对照组空转等量慢病毒颗粒(Control)。同时合成RPL10质粒接慢病毒转染OVCAR-3细胞，以MOI＝15建立RPL10过表达的RPL10-plasmid细胞株，对照组空转等量接有空质粒的慢病毒颗粒(Vector)。

经Western-blot(图4中a、b、c和d)验证敲除效率，WST法(图4中e和f)检测增殖效率，分别用酶标仪测24h、48h、72h OD450nm的吸光度。各时间点检测之前，每孔加10μl WST-1，放回培养箱继续培养2小时。结果表明卵巢癌细胞株OVCAR-3敲除RPL10后可显著抑制卵巢癌细胞的增殖。

四、RPL10对细胞迁移、侵袭功能的影响

1、RPL10低表达的Transwell迁移实验

OVCAR-3细胞用无血清RPMI-1640培养基混悬，计数50000个/100μl，上室加入100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％FBS的RPMI-1640培养基，36小时后取出上室，PBS洗3遍，4％多聚甲醛固定15分钟，结晶紫浸泡30分钟，PBS洗3遍，用棉签轻轻擦掉小时上面的细胞，显微镜下计数穿过小室的迁移细胞，分别重复三次。结果(图5中a)显示RPL10-shRNA细胞迁移能力较对照细胞低。

2、RPL10低表达的Transwell侵袭实验

用不含血清的培养基RPMI-1640稀释Matrigel基质胶至终浓度为250μg/ml，上室加入80μl稀释后的matrigel胶，放37度静置4小时，吸弃上清析出液。OVCAR-3细胞用无血清RPMI-1640培养基混悬，计数50000个/100μl，上室加入100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％FBS的RPMI-1640培养基，48小时后取出上室，PBS洗3遍，4％多聚甲醛固定15分钟，结晶紫浸泡30分钟，PBS洗3遍，用棉签轻轻擦掉小室上面的细胞，显微镜下计数穿过小室的侵袭细胞，分别重复3次。结果(图5中a)显示RPL10-shRNA细胞侵袭能力较对照细胞低。

3、RPL10过表达的Transwell迁移实验

OVCAR-3细胞用无血清RPMI-1640培养基混悬，计数50000个/100μl，上室加入100ul细胞悬液，下室加入600μl含10％FBS的RPMI-1640培养基，36小时后取出上室，PBS洗3遍，4％多聚甲醛固定15分钟，结晶紫浸泡30分钟，PBS洗3遍，用棉签轻轻擦掉小时上面的细胞，显微镜下计数穿过小室的迁移细胞，分别重复三次。结果(图5中b)显示RPL10-plasmid细胞迁移能力较对照细胞增强。

4、RPL10过表达的Transwell侵袭实验

用不含血清的培养基RPMI-1640稀释Matrigel基质胶至终浓度为250μg/ml，上室加入80μl稀释后的matrigel胶，放37度静置4小时，吸弃上清析出液。OVCAR-3细胞用无血清RPMI-1640培养基混悬，计数50000个/100μl，上室加入100μl细胞悬液，下室加入600μl含10％FBS的RPMI-1640培养基，48小时后取出上室，PBS洗3遍，4％多聚甲醛固定15分钟，结晶紫浸泡30分钟，PBS洗3遍，用棉签轻轻擦掉小室上面的细胞，显微镜下计数穿过小室的侵袭细胞，分别重复3次。结果(图5中b)显示RPL10-plasmid细胞侵袭能力较对照细胞增强。

五、RPL10对细胞凋亡的影响

取处在对数生长期的RPL10-shRNA及其对照组Control，RPL10-plasmid及其对照Vector，PBS清洗、胰酶(不含EDTA)消化、离心(800rpm，5min，25℃)。此过程中，培养细胞用的旧培养基、PBS清洗液等液体均要回收；完全培养基终止消化后，回收上清液，PBS清洗，离心(800rpm，8min，4℃)；重复上步骤两次；弃残留液体后，加入1×binding buffer 100μl重悬；分别加入5μl APC(RPL10-shRNA及其对照组Control)或5μl FITC(RPL10-plasmid及其对照Vector)和5μl PI，操作过程中避光；室温静置15min，避光；加入1×binding buffer400μl重悬；一小时内完成流式细胞仪检测。结果(图6)显示RPL10-shRNA细胞凋亡较对照组增多，RPL10-plasmid细胞凋亡较对照组减少。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 复旦大学附属金山医院

<120> RPL10的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用

<130> /

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

caugguguca gaugaauau 19

<210> 2

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

auauucaucu gacaccaug 19

<210> 3

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcccgaauuu gugccaaua 19

<210> 4

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

uauuggcaca aauucgggc 19

<210> 5

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 5

guccaccuau gucuuugua 19

<210> 6

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 6

uacaaagaca uagguggac 19

<210> 7

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gatccgcccg aatttgtgcc aatattcaag agatattggc acaaattcgg gcttttttg 59

<210> 8

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

aattcaaaaa agcccgaatt tgtgccaata tctcttgaat attggcacaa attcgggcg 59

Claims

1.RPL10的抑制剂在制备治疗卵巢癌的药物中的应用，所述的抑制剂选自以RPL10蛋白或它们的转录本为靶序列、且能够抑制其蛋白表达或基因转录的反义核酸；或能表达或形成所述反义核酸的构建物。

2.RPL10的抑制剂在制备试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂用于：

a)抑制卵巢癌细胞增殖；

b)抑制卵巢癌细胞迁移；

c)抑制卵巢癌细胞侵袭；或

d)促进卵巢癌细胞凋亡，

所述的抑制剂选自以RPL10蛋白或它们的转录本为靶序列、且能够抑制其蛋白表达或基因转录的反义核酸；或能表达或形成所述反义核酸的构建物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂为一种siRNA分子，其正义链和反义链的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂为一种shRNA分子，其编码序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制剂为一种构建物，所述的构建物为包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示序列的载体。

6.一种治疗卵巢癌的siRNA分子，其特征在于，所述的siRNA分子的正义链和反义链的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

7.一种治疗卵巢癌的shRNA分子，其特征在于，所述的shRNA分子的编码序列如SEQ IDNO.7和SEQ ID NO.8所示。

8.一种构建物，其特征在于，所述的构建物为包含SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8所示序列的载体。

9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求6所述的siRNA分子、权利要求7所述的shRNA分子，或权利要求8所述的构建物，以及药学上可接受的药物载体。