KR20030031709A

KR20030031709A - 세포사멸을 유도하는 리보솜 단백질 ｓ3 유전자 및 이의용도

Info

Publication number: KR20030031709A
Application number: KR1020010063504A
Authority: KR
Inventors: 김준; 장창영
Original assignee: (주)바이오인스티튜트; 김준
Priority date: 2001-10-15
Filing date: 2001-10-15
Publication date: 2003-04-23
Also published as: KR100447091B1

Abstract

본 발명은 세포사멸을 유도하는 리보솜 단백질 S3 유전자(rpS3) 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 rpS3 유전자를 세포사멸을 유도하므로 암세포를 특이적으로 사멸시키거나 발현조절을 통한 암세포로의 전환을 방지하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

세포사멸을 유도하는 리보솜 단백질 Ｓ3 유전자 및 이의 용도{Ribosomal protein S３ gene inducing apoptosis and a use thereof }

본 발명은 세포사멸을 유도하는 리보솜 단백질 S3 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 세포사멸을 유도하는 리보솜 단백질 S3 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 유전자를 발현시켜 세포사멸을 유도하는 방법에 관한 것이다.

생명체는 DNA에 손상을 입히는 외부로부터의 화학물질 및 자외선 등에 노출되어 끊임없이 공격을 당하게 운명지워져 있다. 또한 산소호흡의 결과로 생체내에서 생긴 반응성이 강한 산소 화합물들에 의한 oxidative DNA damage는 매우 다양한 손상을 DNA에 입히게 된다. 이를 복구하는 것이 DNA 복구효소(Repair enzyme)인데, 이들의 이상이 노화나 암과 같은 퇴행성 질환을 일으키게 된다.

rpS3 유전자는 UV endonuclease Ⅲ를 발현시키는데, 이 효소는 피부암을 일으키기 쉬운 질병인 XP(xeroderma pigmentosum) group D cell에서 없거나 변형되어 있다.

UV (ultraviolet light) 엔도뉴클라제(endonuclease)란 자외선에 조사되어 손상을 입은 DNA를 잘라서 복구해 주는 excision DNA 복구 효소 (repair enzyme)를 일컫는다. 이들은 대개 손상받은 염기를 DNA glycosylase activity로 잘라 내어, AP (apurinic/apyrimidinic) 사이트를 형성시킨 후, AP endonuclease activity를 이용하여 AP 사이트를 절단하는 bi-functional한 효소들이거나, 자외선 조사로 인하여 생긴 DNA의 bulky한 손상 부위를 인식하여 잘라 내는 excision endonuclease 활성을 가진 효소들이다.

색소성 건피증(XP; Xeroderma pigmentosum)은 의학적으로 햇빛 및 자외선에 초감수성을 나타내는, 사람의 유전질환으로서 상염색체열성(autosomal recessive)으로 유전되며, 햇빛에 의해 유도되는 피부암과 악성 흑색종의 발생빈도를 증가시켜, 20세 이전에 요절하게 하는데, 어떤 경우 이 질병은 진행성의 신경퇴화까지 이르게 한다 (Kraemer dt al., 1984 Carcinogenesis 5, 511-514). XP 환자들로부터 구해 배양된 세포는 UV 에 의해서 죽는 감수성이 증가하고 화학적으로 유도된 bulky DNA 손상들의 많은 부위의 제거가 비효율적일 뿐만 아니라 UV-induced DNA repair synthesis의 수준이 감소됨을 보인다. 특히 피리미딘 이중체(pyrimidine dimer)와 같은 손상 DNA를 제거해 주지 못하는 것으로 미루어 절제수선(excision repair)을 정상적으로 수행하지 못하는 것으로 알려져 있다. 세포융합으로 UV-induced repair synthesis의 회복 여부에 의거하여 8개의 상보성 그룹(complementation group)이 규정되었다. 7개의 상보성 그룹(A-G)은 비정상적인 절제수선(excision repair)을 하고, 하나의 변형된 집단(XP-variant)은 post replication repair가 잘못되어 있으나 정상 수준의 절제수선(excision repair)을 나타낸다.

XP-D 상보성 그룹으로부터 나온 사람의 세포들에는 human AP endonuclease I 이 없거나 변형되어 있음을 밝혀냈다. 이 AP 엔도뉴클라제 I과 UV 엔도뉴클라제 Ⅲ는 같은 효소임이 밝혀졌다. 또한 이 효소의 AP 엔도뉴클라제의 기작은 β-elimination을 통한 lyase (또는 AP endonuclease)임을 밝혀졌으며, 기질 특이성에선, 자외선에 의해 피리미딘 이중체(pyrimidine dimer)가 생성된 부위의 phosphodiester bond를 끊어주는 기작이 있음도 아울러 발견하였다(Kim et al., 1995 J. Biol. Chem. 270, 13620-13629).

이 단백질을 정제하여 클로닝한 결과, ribosomal protein S3임이 밝혀졌는데 이는 40S 서브유닛의 외부 표면에 위치한 단백질이며, rpS3 유전자의 산물이다. 클로닝된 rpS3 유전자를 E. coli에서 발현시켜본 결과 UV 엔도뉴클라제 활성(endonuclease activity)이 발견됨으로써 AP 엔도뉴클라제 Ⅰ, UV 엔도뉴클라제 Ⅲ 및 ribosomal protein S3 세 단백질은 동일한 단백질임이 밝혀졌고, 재조합 S3도 역시 피리미딘 이중체(pyrimidine dimer)의 phosphodiester bond를 끊어주는 활성을 가지고 있음이 확인되었다(Kim et al., 1995 J. Biol. Chem. 270, 13620-13629; Kuhnlein et al., 1978 Nucleic Acids Res. 5, 951-960; Deutsch et al., 1997 J. Biol. Chem. 272, 32857-32860).

rpS3 유전자는 인간 염색체 11번의 11q13.3 - q13.5에 위치한다. 특이할 점은 rpS3 유전자는 결장직장암(colorectal cancer) 환자에서 과발현된다는 보고가 있다. 그러므로 rpS3의 유전자 산물은 XP-D에서는 없거나 변형되어 있고, 대장암에서는 과발현되며, 다른 암과도 관련이 되어 있을 가능성이 매우 높다. 이 뿐 아니라 11q13.3 - q13.5 부위의 연구는 자주 유전자의 구조적 이상(structural abnormality), 증폭(amplification)이 일어나고, 다발성 내분비 신생물 타입 Ⅰ(multiple endocrine neoplasia type Ⅰ), 유방암(breast carcinoma), B 세포 신생종양과 같은 인체 암의 발생시에 과발현 되는 현상이 있다(Pogue-Geile et al., 1991Mol. Cell. Biol.11, 3842-3849).

본 발명자들은 세포사멸에 관여하는 유전자를 탐색하던 중 유전자의 복구효소로 알려진 rpS3(ribosomal protein S3) 유전자의 N-말단 도메인이 세포사멸에 관여함을 최초로 밝히고, 이 도메인을 포함하는 재조합 벡터를 세포에서 발현시켜 세포사멸을 유도함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 리보좀 단백질 S3 유전자의 세포사멸 도메인과 유전자 복구 도메인을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 도메인 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 벡터를 세포에서 발현시키는 세포사멸유도방법을 제공하는 것이다.

이하, 본 발명의 구성을 설명한다.

도 1은 리보좀 단백질 S3 유전자를 동물세포에서 발현을 위한 본 발명 재조합 발현벡터 pcDNA3/rpS3의 모식도이다.

도 2는 rpS3 유전자를 마우스의 형질세포종인 MPC-11 세포주에서 발현시켰을때의 세포사멸을 일으켜 DNA 절편들이 생성됨을 확인한 결과이다.

도 3은 rpS3 단백질을 GFP 단백질과 융합시키기 위하여 구축한 재조합 벡터 pEGEP-rpS3의 모식도이다.

도 4는 GFP 단백질 및 DAPI staining을 이용하여 rpS3 유전자가 세포내에서 발현될때의 세포사멸 유도능을 관찰한 결과이다,

도 5는 본 발명에서 구축한 rpS3 유전자의 여러 가지 결손형 돌연변이들(deletion mutant)를 나타낸 모식도이다.

도 6은 rpS3 유전자중에서 유전자 복구활성에 관여하는 도메인을 탐색하기 위하여 효소활성분석법으로 각 돌연변이들의 활성을 측정한 결과이다.

도 7은 rpS3 유전자중에서 세포사멸에 관여 도메인을 탐색하기 위하여 GFP 융합 단백질을 이용하여 각 돌연변이들의 세포사멸율을 측정한 결과이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 rpS3 유전자를 세포내에서 발현시켜 기존에 보고되지 않은 세포사멸활성을 확인하고, rpS3 유전자의 다양한 deletion mutant를 제조하여 세포사멸 기능을 갖는 domain을 탐색한다.

구체적으로 본 발명에서는 rpS3 유전자를 동물세포에서 발현시키기 위하여 rpS3 유전자(genbank, acession number U14992, 서열목록 5, 6)를 벡터 pcDNA3(invitrogen,. No. U790-20)에 삽입하고 마우스의 형질세포종(plasmacytoma)인 MPC-11에서 발현시켜 세포사멸활성을 나타냄을 확인한다.

상기 rpS 3 유전자중 세포사멸활성을 갖는 도메인(domain)을 탐색하기 위하여 여러 가지 결손형 돌연변이들(deletion mutants)을 제조하여 세포사멸활성을 조사한 결과, N 말단의 26개 아미노산(서열번호 1, 2)이 세포사멸활성부위임을 알 수 있었다.

한편, rpS 3 유전자 중에서도 C말단의 165번부터 212 아미노산(서열번호 3,4)이 유전자 복구활성을 나타냄을 확인하였다.

본 발명의 세포사멸 도메인은 통상의 유전자 재조합 기술을 이용하여 다른 구조 유전자와 재조합시켜 사용할 수 있고, 이때 사용하는 벡터의 종류에는 제한이 없으며, 당업계에서 통상의 지식을 가진자가 어려움 없이 적의하게 선택할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : rpS3 유전자 및 이를 포함하는 재조합 벡터의 구축

유전자은행(Genebank)에 등록된 rpS3 유전자(acession number U14992)를 발현시키기 위해 동물세포 발현벡터 pcDNA3(Invitrogen, No.V790-20)의 HindIII -BamHI 부위에 결합시켜 재조합 발현벡터 pcDNA3/rpS3을 구축하였다(도 1).

실시예 2 : rpS3유전자의 발현에 의한 세포 사멸 유도능의 확인

rpS3 유전자를 동물 세포에서 발현시키기 위하여 상기 실시예 1에서 제조한 재조합 벡터 pcDNA3/rpS3를 마우스의 형질세포종(plasmacytoma)인 mpc-11세포주에 지질소포형성(liposome) 제형인 SuperFect (Qiagen, No.301305)를 이용하여 transfection시킨 후 26시간 발현시킨 후 세포를 수확하여 lysis buffer(1M Tris-HCl, 0.1M EDTA, 0.5% Triton X-100) 100㎕에 풀고, 얼음에서 15분에서 30분 있은 후, 4℃에서 13000 rpm으로 15분간 원심분리를 한 다음 상등액을 취하였다. 상기 상등액에 digest buffer(5M NaCl, 1M Tris-HCl, 100mM EDTA, 2% SDS) 330㎕와 프로테아제 K(Sigma, No.P6556) 2.5㎕를 넣은 후 37℃에서 12시간 반응시켰다. 이 용액에 페놀을 400㎕ 넣고 강하게 흔들어준 후 상등액을 200㎕씩 분주한 후 100% 에탄올 1㎖과 10M 암모늄아세테이트 100㎕를 넣고 -70℃에 2시간 침전시킨 후 4℃에서 15000rpm으로 15분 원심분리한 후 침전물을 획득하고, 상기 침전물을 17㎕의 물에 녹인 다음 RNase(Sigma, No.R2638) 3㎕를 넣고 37℃에서 1시간 반응시켰다. 이 반응물을 2% 아가로스 겔에 50볼트로 4시간 전기영동시킨 후 UV 조사기를 이용하여 DNA를 확인하였다.

세포사멸이 일어나는 세포들에서는 세포가 자기의 유전자를 자르는 특징적으로 인하여 DNA 절편이 형성되는데, 상기 실험결과 도 2에 나타난 바와 같이, pcDNA 벡터만 발현된 세포(lane1)에서는 DNA절편이 생성되지 않는 반면, pcDNA-rps3가 발현된 세포(lane2)에서 DNA 절편이 생성되어 rps3유전자가 세포사멸에 관여함을 알 수 있었다.

실시예 3 : GFP 단백질을 이용한 rpS3의 세포사멸 유도능의 확인

rpS3 단백질을 GFP(Green Fluorescence Protein) 단백질에 융합시켜서 발현시키기 위하여 rps3 유전자를 pEGFP-C1(clontech, No.6084-1) 벡터에 삽입시켜 재조합 벡터 pEGFP-C1/rpS3 (도 3)를 구축하였다.

상기 벡터를 마우스의 형질세포종(plasmacytoma)인 mpc-11 세포주에서 발현시키고 상기 세포를 수확하여 3.7% paraformaldehyde(Sigma, No.P6148)로 고정시킨 후 0.1㎍/㎖의 DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole)(Sigma, No.D9542) 염색약으로 염색하여 형광현미경으로 확인하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, GFP 단백질과 GFP-rpS3 단백질은 녹색으로 보이고 핵은 청색으로 보이는데, GFP-rpS3가 들어가 발현된 세포에서 세포 사멸의 특징인 핵이 파괴되는 현상을 확인할 수 있었다. 반면에 GFP만 발현시킨 세포에서는 이러한 현상이 일어나지 않는 것을 확인하여 rpS3가 세포사멸을 일으킴을 확인할 수 있었으며, 또한 rpS3가 세포사멸을 유도할 때 핵으로 이동하는 현상도 확인하였다.

실시예 4 : rpS3 유전자 및 이의 mutant의 제조

상기 rpS3 유전자중 세포사멸 및 유전자 복구에 관여하는 도메인을 탐색하기 위하여 도 5에 나타난 바와 같이 돌연변이(ΔN14, ΔN18, ΔK18A, ΔN25, ΔN164,ΔC14, ΔC30 , ΔC47, ΔC66, ΔC217) 들을 제조한 후 대장균에서 발현시켰다.먼저, 돌연변이들은 양쪽 말단에 EcoRI과 XhoI 사이트를 넣은 하기의 프라이머를 이용하여 PCR한 후 pGEX-5X-1(Pharmacia , No.27-4584-01) 벡터에 삽입시킴으로서 재조합 벡터를 구축하고, 재조합 벡터를 GST bead(Phamacia, No.27-4570-01)로 정제하였다.

rpS3의 deletion mutant들을 제조하기 위하여 사용한 프라이머 및 deletion mutant들의 특성

ΔN14	5'-GAATTCATGGGCATCTTCAAAGCTGAA-3', 5'-CTCGAGTTATGCTGTAGGCACGGT-3'
ΔN14	N-말단에서 14개의 아미노산이 제거
ΔN18	5'-GAATTCATGGCTGAACTGAATGAGTTT-3', 5'-CTCGAGTTATGCTGTAGGCACGGT-3'
ΔN18	N-말단에서 18개의 아미노산이 제거
ΔK18A	18번째 라이신을 알라닌으로 치환함
ΔN25	5'-GAATTCATGCGGGAGCTGGCTGAAGAT-3', 5'-CTCGAGTTATGCTGTAGGCACGGT-3'
ΔN25	N-말단에서 25개의 아미노산이 제거
ΔN164	N164: HpaI으로 잘라서 앞부분을 제거함
ΔC14	5'-GAATTCATGGCAGTGCAAATATCC-3', 5'-CTCGAGTTACCCACCCTTCTGTTCTGA-3'
ΔC14	C-말단에서 14개의 아미노산이 제거
ΔC30	5'-GAATTCATGGCAGTGCAAATATCC-3', 5'-CTCGAGTTAAGGTTCCACAATGCTCAC-3'
ΔC30	C-말단에서 30개의 아미노산이 제거
ΔC47	5'-GAATTCATGGCAGTGCAAATATCC-3', 5'-CTCGAGTTAACCACTTGGGTCCCAGGG-3'
ΔC47	C-말단에서 47개의 아미노산이 제거
ΔC66	5'-GAATTCATGGCAGTGCAAATATCC-3', 5'-CTCGAGTTAGAGGAGCACATGGCGGAG-3'
ΔC66	C-말단에서 66개의 아미노산이 제거
ΔC217	5'-GAATTCATGGCAGTGCAAATATCC-3', 5'-CTCGAGTTACGTAAGAAACTCATTCAG-3'
ΔC217	C-말단에서 217개의 아미노산이 제거
[주]PCR 조건 : 94℃에서 5분한 후, 94℃ 1분-55℃ 2분-72℃ 1분을 30회 반복한 후, 72℃에서 10분

실시예 5 : rps 3 유전자 중 복구에 관여하는 도메인의 탐색

rps 3 유전자중에서 유전자 복구활성에 관여하는 도메인을 탐색하기 위하여 효소활성분석법으로 rpS3의 wild type과 상기 실시예 4에서 제조한 mutant(ΔN14,ΔN18, ΔK18A, ΔN25, ΔN164, ΔC14, ΔC30, ΔC47, ΔC66)들의 유전자 복구활성을 측정하였다.

³H로 lable된 1 nmol PM2 phage DNA에 UV 250J/m²을 가해준 것과 가해주지 않은 것에 똑같이 정제된 각각의 wild type과 mutant rpS3 단백질(0.25ug)들을 15-30분 처리하였다. 이 때 반응 버퍼는 40 mM Tris-HCl(pH 8.0), 70 mM KCl, 0.01% Triton X-100, 3 mM EDTA, 10 , 2-mercaptoethanol 이다. 반응이 끝난 후 100ul 의 0.3 M K₂HPO₄-KOH(pH 12.4)를 3-5분 처리하여 DNA 복구 효소에 의해 nick이 생긴 DNA를 변성(denaturation)시켰으며, 이 때 대조군으로 모든 DNA를 변성시키는 0.3 M K₂HPO₄-KOH(pH 13.2)를 100ul 처리하였다. 1M K₂HPO₄-KOH(pH 4.0)를 25℃에서 1 분 처리하여 nick이 안 생긴 정상적인 DNA를 원래대로 복귀시켜 준다. 그러면 복구효소에 의해 잘려진 DNA만 선형으로 남게 된다. 200 ul의 5M NaCl을 첨가해 준 후 잘 섞어주었다.

1ml의 필터링 버퍼(filtering buffer; 1M NaCl, 0;05M Tris-HCl pH 8.2)를 첨가해 주고 잘 섞어준 후 membrane filter(Schleicher and schuell, No.B-6, 0.45 microns)를 이용해서 filter를 하면 선형 DNA만 멤브레인에 남게한 다음, 5 ml 2xSSC (0.3 N NaCl, 0.03 M Nacitrate)로 두세번 세척(washing)해주었다. 멤브레인을 말린 후 toluene scintillation liquid counter를 이용해서 멤브레인에 남아있는³H-labled PM2 DNA를 측정하였다. 이 때 계산되는 unit은 (1 f mol strandnicks/min)으로 정의되며, 1분에 1 fmol 의 nick을 형성하는 효소의 양을 의미한다.

실험결과, 도 6에 나타난 바와 같이, N-말단의 164 아미노산을 제거해도 유전자 복구 기능을 가지고 있으므로 165 아미노산 이후에 유전자 복구의 기능을 하는 도메인이 있다는 것을 알 수 있다. 또 C-말단에서부터 제거해 나간 돌연변이들을 보면 30 아미노산까지 제거해도 유전자 복구기능에는 이상이 없다.

따라서 C-말단 부위(165-212아미노산)가 유전자 복구의 기능을 하는 부위로 확인되었다.

실시예 6 : rpS3 유전자 중 세포사멸에 관여하는 도메인의 탐색.

rpS3 유전자중에서 세포사멸에 관여하는 도메인을 탐색하기 위하여 pEGFP-C1(Clontech., No.6084-1) 벡터에 wild type과 상기 실시예 2에서 GST 융합 단백질을 만들 때 사용한 방법으로 돌연변이(ΔN14, ΔN18, ΔK18A, ΔC30, ΔC66, ΔC217)들을 넣어서 GFP 융합단백질을 이용하여 이들 GFP에 융합된 단백질들의 세포사멸을 일으키는 정도를 측정하였다.

먼저, 각각의 유전자를 포함하고 있는 벡터를 MPC-11 세포에 transfection 시킨 후 26시간 발현시킨 다음, 수확하여 3.7% paraformaldehyde(Sigma, No.P6148)로 고정시킨 후 0.1㎍/㎖의 DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole)(Sigma, No.D9542) 염색약으로 염색하여 형광현미경으로 확인했다. 세포사멸을 일으키는 정도는 GFP 융합 단백질이 발현된 세포는 녹색을 나타내므로 각각의 돌연변이마다 녹색을 띠는 세포중에서 세포사멸을 일으켜 핵이 깨지고 있는 세포의 비율을 하기식 (Ⅰ)에 의해 계산하였다.

그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 N-말단의 14개 아미노산이 제거될 때까지 세포사멸율에 변화가 없다가 18개의 아미노산이 제거되면 세포사멸율이 떨어지는 것을 알 수 있다. 반면, C-말단을 제거했을 때에는 오히려 세포사멸율이 증가하는 결과를 보이므로 세포사멸에 관여하는 부분은 N-말단부위의 26 아미노산으로도 세포사멸을 일으킬 수 있음을 알 수 있다.

상기의 결과를 종합하여 볼 때, rpS 3 유전자 중 N-말단 부위(1-26아미노산)가 세포사멸을 유도하는 부위였고, C-말단 부위(165-212아마노산)가 유전자 복구의 기능을 하는 부위임을 알 수 있었다.

이상, 상기 실시예에서 명백한 바와 같이, 본 발명의 rpS3 유전자 중 세포사멸 도메인 및 DNA 복구 유전자를 세포내에서 발현시킬 경우 암세포의 세포사멸 및 손상된 DNA를 복구시키는 작용을 하므로, 상기 유전자의 발현조절을 통한 암세포로의 전환을 방지하고, 암의 세포사멸을 유도하는 효과가 있어 의약산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

서열번호 2에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 세포사멸유전자.
서열번호 4에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 복구 유전자.
제1항 또는 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제1항의 유전자를 세포내에서 발현시킴을 특징으로 하는 세포사멸 유도방법.
제2항의 유전자를 세포내에서 발현시킴을 특징으로 하는 DNA 복구 유도방법.