CN109563510A - 使用mir-302前驱体作为抗癌药物用于治疗人类肺癌的组合物及方法 - Google Patents

使用mir-302前驱体作为抗癌药物用于治疗人类肺癌的组合物及方法 Download PDF

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Abstract

本发明大体上关于使用人造小RNA，诸如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)及其发夹型前驱体(pre‑miRNA)作为肿瘤抑制抗癌药的组合物及方法，其用于治疗人类肿瘤及癌症，尤其(但不限于)用于治疗皮肤癌(黑色素瘤)、血液癌(白血病)、前列腺癌、乳癌、肝癌及肺癌以及各种赘生性肿瘤，诸如含有源自组织的全部三个胚层，包括外胚层、中胚层及内胚层的多种肿瘤细胞及癌细胞的脑肿瘤及畸胎癌。更特定言之，本发明是关于miR‑302类siRNA(siR‑302)及/或miR‑302前驱体(pre‑miR‑302)用于开发针对多种人类癌症，特别是肺癌的新颖药物及疗法的用途。

Description

使用MIR-302前驱体作为抗癌药物用于治疗人类肺癌的组合 物及方法
以引用方式并入任何优先权申请案
标记于随本申请案提交的申请资料表中的国外或国内优先权主张的任何及所有申请案于此将以引用的方式并入。
本申请案主张于2012年8月10日申请的美国专利申请案第13/572,263号的优先权、于2014年9月30日申请的美国专利申请案第14/502,608号的优先权、以及于2014年10月29日申请的美国专利申请案第14/527,439号的优先权，其全部名称皆为「An InducibleGene Expression Composition for Using Eukaryotic Pol-2 Promoter-DrivenTranscription in Prokaryotes and The Applications Thereof」。本申请案亦主张于2016年5月27日申请的名称为「Production and Utilization of A Novel Anti-CancerDrug in Therapy」的美国专利申请案第15/167,219号的优先权。本申请案进一步主张于2016年5月27日申请的名称为「Use of MicroRNA Precursors as Drugs for InducingCD34-positive Adult Stem Cell Expansion」的美国专利申请案第15/167,226号的优先权。本申请案为于2012年8月10日申请的美国专利申请案第13/572,263号、于2014年9月30日申请的美国专利申请案第14/502,608号、以及于2014年10月29日申请的美国专利申请案第14/527,439号的部分延续案(CIP)申请案，其全部名称皆为「An Inducible GeneExpression Composition for Using Eukaryotic Pol-2 Promoter-DrivenTranscription in Prokaryotes and The Applications Thereof」。本申请案亦为于2016年5月27日申请的名称为「Production and Utilization of A Novel Anti-Cancer Drugin Therapy」的美国专利申请案第15/167,219号的部分延续案(CIP)申请案。本申请案进一步亦为于2016年5月27日申请的名称为「Use of MicroRNA Precursors as Drugs forInducing CD34-positive Adult Stem Cell Expansion」的美国专利申请案第15/167,226号的部分延续案(CIP)申请案。其于此藉由引用并入，如同其完整地于本文中阐述。
序列表的引用
如通过EFS-Web以ASCII格式档案提交的序列表根据35U.S.C.§1.52(e)于此以引用的方式并入。序列表的ASCII格式档案的名称为23415553.TXT，ASCII格式档案的创建日期为2017年2月23日，且ASCII格式档案的大小为99KB。
背景技术
领域
本发明大体上关于使用重组小RNA，诸如小干扰RNA(siRNA)、微RNA(miRNA)及其发夹型前驱体(pre-miRNA)作为肿瘤抑制抗癌药的组合物及方法，其用于治疗人类肿瘤及癌症，尤其但不限于是用于治疗皮肤癌(黑色素瘤)、血液癌(白血病)、前列腺癌、乳癌、肝癌及肺癌以及各种赘生性肿瘤(neoplastic tumors)，诸如含有源自组织的全部三个胚层，包括外胚层、中胚层及内胚层的多种肿瘤细胞及癌细胞的脑肿瘤及畸胎癌。更特定言之，本发明是关于人造miR-302类siRNA(siR-302)及/或miRNA前驱体(pre-miR-302)用于开发用于多种抗癌疗法，特别是用于人类肺癌治疗的新颖药物的用途。此等siRNA/pre-miR-302药物可在原核生物中以表达复制(competent)DNA载体及/或所得发夹型RNA产物形式产生。由于原核细胞不天然地转录或加工发夹型RNA，其中该等RNA的结构类似于原核生物的基因表达系统中的转录终止代码，且另外考虑到原核生物中缺乏的若干必需酶，诸如第二型RNA聚合酶(Pol-2)及RNase III Dicer，本发明另外教示使用新发现的原核生物中发夹型RNA转录机制(其首先揭示于发明人的美国专利申请案第13/572,263号的优先权中)来于原核生物中表达pre-miRNAs，或称作原核生物产生的miRNA前驱体(pro-miRNA)的新颖基因表达方法。另外，由于miR-302为人类胚胎干细胞(hESCs)中的肿瘤抑制因子微小RNA，本发明中呈现的发明人的发现可另外用于设计及开发适用于治疗其他肿瘤及癌症相关疾病的新药物、疫苗及/或疗法。
相关技术的描述
干细胞为含有许多适用于刺激新细胞生长及组织再生、修复或再生受损/老化组织、治疗衰老相关疾病及预防肿瘤形成及癌症进展的有效成分的资源丰富的百宝箱。因此，可设想，发明人可使用此等干细胞作为筛检、鉴别及制造此等干细胞特异性成分的工具以开发针对多种人类疾病的新颖药物及疗法。因此，由此获得的药物及疗法可用于许多医药及治疗应用，诸如用于研究、诊断及/或治疗的生物医学套组、装置及设备，或其组合。
微RNA(miRNA)为人胚胎干细胞(hESCs)中的主要有效成分之一。主要hESC特异性miRNA种类包括但不限于miR-302家族、miR-371至373家族及miR-520家族的成员。其中，已发现miR-302家族在肿瘤抑制中起功能性作用(Lin等人，2008及2010；Lin等人的美国专利第9,394,538号、第9,399,773号及第9,422,559号)。MiR-302含有八(8)个家族成员(miR-302s)，包括四(4)个正义miR-302(a、b、c及d)及四(4)个反义miR-302*(a*、b*、c*及d*)。此等正义及反义miRNA成员部分匹配且可彼此形成双链双螺旋。miR-302的前驱体由miR-302a与a*(pre-miR-302a)、miR-302b与b*(pre-miR-302b)、miR-302c与c*(pre-miR-302c)及miR-302d与d*(pre-miR-302d)形成，在一端有连接序列(茎环)。为了活化miR-302功能，miR-302前驱体(pre-miR-302s)首先由细胞RNase III Dicer加工为成熟miR-302s且进一步与某些阿尔古(AGO)蛋白形成RNA诱导的沉默复合物(RISCs)，随后导致许多靶基因转录物(mRNAs)、尤其包括一些主要致癌基因mRNAs的RNA干扰(RNAi)介导的直接降解或转译抑制，如发明人的先前美国专利第9,394,538号、第9,399,773号及第9,422,559号(Lin等人)中所揭示。
MiR-302为hESCs及诱导多能干细胞(iPSCs)中发现的最富集非编码(ncRNA)种类。发明人的先前研究已显示，miR-302超出hESC H1或H9细胞中所发现水平的异位过度表达能够以类似于桑椹胚阶段早期人类受精卵的多能干细胞的几乎无致肿瘤性的情况下将人类正常及癌细胞两者重新编程为hESC类iPSCs(Lin等人，2008、2010及2011；Lin等人的EP2198025；Lin等人的美国专利申请案第12/149,725号及第12/318,806号；Lin等人的美国专利第9,394,538号)。相对静止(Relative quiescence)为此等miR-302诱导的iPSCs的确定特征，而晚期囊胚源性hESCs及其他先前报导的三/四因子诱导的(Oct4-Sox2-Klf4-c-Myc或Oct4-Sox2-Nanog-Lin28)iPSCs全部展示类似于赘生性肿瘤/癌细胞的极快速细胞增殖速率(12-15小时/周期)(Takahashi等人，2006；Yu等人，2007；Wernig等人，2007；Wang等人，2008)。为揭示miR-302的此肿瘤抑制效应，发明人为鉴别涉及两种miR-302靶向G1-检查点调节子，包括周期素依赖性激酶2(CDK2)(Lin等人，2010；Lin等人的美国专利第9,394,538号)及BMI-1(Lin等人，2010；Lin等人的美国专利第9,422,559号)的第一批研究人员。发明人的研究发现miR-302同时沉默此两种主要靶基因以在细胞周期的G1-S转化期间抑制细胞周期素-E-CDK2以及细胞周期素-D-CDK4/6路径，以预防多能干细胞的致肿瘤性。此外，发明人亦发现miR-302的重新编程功能可经由部分重新编程机制将高级恶性癌症重新编程至低级良性或甚至几乎正常状态(Lin等人的美国专利第9,399,773号)。
然而，尚不知晓此等先前发现的miR-302的肿瘤抑制功能是否可直接用于人类肺癌疗法。鉴于各种各样的肺癌类型，发明人的先前专利及其相关申请不可确定此可能性。不同于其他人类癌症，肺癌的病理性病因复杂，包括空气污染、吸烟、石棉沉着病、病毒、长期发炎、基因突变及其他癌症转移至肺组织中，或甚至其组合。由于如此大的复杂度，即使专家亦不可容易地预测其他癌症的新疗法用于治疗肺癌的成效。可能需要涉及更新颖治疗机制以处理肺癌的复杂度。
miR-302与肺癌之间不存在直接基因联系。编码miR-302的基因体序列位于人类染色体4，常与长寿相关的保守区的4q25基因座中。更确切地说，miR-302编码于La核糖核蛋白结构域家族成员7(LARP7)基因的内含子区中且经由发明人发现的内含子miRNA生物合成路径表达(Ying及Lin，2004；Barroso-delJesus，2008；图13；SEQ.ID.NO.5)。在发明人的先前研究中，发明人观测到引入miR-302可在转染细胞中刺激许多其他hESC特异性miRNAs的表达，诸如miR-92、miR-93、miR-367、miR-371～373、miR-374及miR-520家族成员(Lin等人，2008、2010及2011；Lin等人的EP 2198025；Lin等人的美国专利申请案第12/149,725号及第12/318,806号)。使用在线「TARGETSCAN」及「PICTAR-VERT」程式的分析另外显示miR-302于此等经刺激miRNAs共用超过400个靶基因，表明其亦可与mir-302起类似功能作用。此等共用靶基因包括但不限于以下的成员：RAB/RAS相关致癌基因、ECT相关致癌基因、多形性腺瘤基因(pleiomorphic adenoma genes)、E2F转录因子、细胞周期素D结合Myb类转录因子、HMG-盒转录因子、Sp3转录因子、转录因子CP2类蛋白、NFkB活化蛋白基因、细胞周期素依赖性激酶(CDKs)、MAPK/JNK相关激酶、SNF相关激酶、肌球蛋白轻链激酶、TNF-α诱导蛋白基因、DAZ相关蛋白基因、LIM相关同源盒基因、DEAD/H盒蛋白基因、叉头盒蛋白基因(forkheadbox protein genes)、BMP调节因子、Rho/Rac鸟嘌呤核苷酸交换因子、IGF受体(IGFR)、内皮素受体、左右决定因子(Lefty)、细胞周期蛋白、p53诱导性核蛋白基因、RB蛋白类1(Rb-like1)、RB结合蛋白基因、Max结合蛋白基因、c-MIR细胞免疫识别调节子(c-MIR cellularmodulator of immune recognition)、Bcl2类细胞凋亡易化子、原钙黏蛋白、TGFβ受体、整合素β4/β8、抑制素(inhibin)、锚蛋白、SENP1、NUFIP2、FGF9/19、SMAD2、CXCR4、EIF2C、PCAF、MECP2、组蛋白乙酰转移酶MYST3、细胞核RNP H3及许多细胞核受体及因子。大多数此等靶基因参与胚胎发育及致肿瘤性。因此，可设想，miR-302可另外刺激其同源miRNAs，诸如miR-92、miR-93、miR-367、miR-371～373、miR-374及miR-520，以增强及/或维持其功能。
尽管miR-302适用于设计及开发新颖抗癌药物/疫苗，但其制造成问题，因为天然miR-302仅可见于人类多能干细胞(诸如hESCs)中，其原始来源极有限且高度引起争论。或者，合成小干扰RNAs(siRNA)可用以模拟pre-miR-302；然而，因为pre-miR-302的结构由两个错配的miR-302及miR-302*股形成，所以彼等完美匹配的siRNA模拟物无法置换miR-302*的功能，miR-302*的序列完全不同于siRNA的反义链。举例而言，siRNA-302a模拟物的反义链为5'-UCACCAAAAC AUGGAAGCAC UUA-3'(SEQ.ID.NO.1)，而天然miR-302a*为5'-ACUUAAACGU GGAUGUACUU GCU-3'(SEQ.ID.NO.2)。因为完整miR-302功能必须由其正义miR-302及反义miR-302*链两者产生，所以使用siRNA模拟物的许多先前报导已显示与自然界中的天然miR-302功能不同的结果。另一方面，发明人近期的iPSCs探索可提供pre-miR-302制造的替代性解决方案(Lin等人的EP 2198025；Lin等人的美国专利申请案第12/149,725号及第12/318,806号)。尽管如此，使此等iPSCs生长的成本及风险仍过高以致无法用于现在的工业制造。
或者，使用原核感受态细胞可为制造人类miRNAs及其前驱体(pre-miRNAs)的可能方法。然而，原核细胞不具有真核miRNA表达及加工所需的若干必需酶，诸如Drosha及Dicer蛋白质。此外，原核RNA聚合酶不会高效地转录具有高二级结构的小RNA，诸如发夹型pre-miRNAs及shRNAs。事实上，由于如pre-miRNAs的发夹型RNA结构与原核基因表达系统中的内在转录终止代码类似(McDowell等人，Science 1994)，故不存在细菌基因组中编码的真正miRNA种类，且细菌不会天然地表达miRNA。因此，若发明人可在原核生物中表达人类miRNAs，则所得miRNAs将保持其类似于pri-miRNA(多个pre-miRNAs的大初级团簇(largeprimary cluster))及/或pre-miRNA(一个单发夹RNA)的前驱体形式。然而，如上所述，真正的挑战为如何促使人类miRNAs于原核生物中的表达。为克服此问题，发明人的美国专利申请案第13/572,263号、第14/502,608号及第14/527,439号的优先权发明已确立一种用于产生原核生物产生的微RNA(pro-miRNA)的方法。经测试，由此获得的pro-miRNAs与其天然pre-miRNA对应物具有相同序列、结构及功能。
如自当前教科书习得，所属技术领域中具有通常知识者皆熟知原核与真核转录机制极不同且因此彼此不兼容。举例而言，基于当前理解，真核RNA聚合酶不直接结合至启动子序列且需要额外辅助蛋白(辅因子)来起始转录，而原核RNA聚合酶为直接结合至启动子序列以起始转录的单一全酶。亦为常识的还有：真核信使RNA(mRNA)是藉由第二型RNA聚合酶(Pol-2)于细胞核中合成，且随后经加工且输出至细胞质用于蛋白质合成，而原核RNA转录及蛋白质转译在相同段DNA外在相同位置同时发生。此是因为原核生物诸如细菌及古菌不具有任何细胞核样结构。因此，此等天然差异使得原核细胞难以或甚至不可能使用真核启动子产生真核RNA。
先前技术尝试使用细菌或噬菌体启动子在细菌细胞中产生哺乳动物肽及/或蛋白质，诸如Buechler的美国专利第7,959,926号及Mehta的美国专利第7,968,311号。为了起始表达，将所要基因克隆至由细菌或噬菌体启动子驱动的质体载体中。基因不得含有任何非编码内含子，因为细菌不具有用以加工内含子的任何RNA剪接机构。随后，将由此获得的载体引入至细菌细胞的感受态菌株，诸如大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)中，以便表达基因的转录物(mRNAs)且随后将mRNAs转译为蛋白质。尽管如此，细菌及噬菌体启动子，诸如Tac、Lac、Tc、T1、T3、T7及SP6 RNA启动子不为Pol-2启动子且其转录活动倾向于为易错过程，其造成突变且不能表达任何发夹型RNA结构，如McDowell等人(Science 1994)所报导。另外，Mehta进一步教示，甘油(glycerol/glycerin)可用以增加细菌转化的效率；然而，无教示是关于RNA转录、尤其是Pol-2启动子驱动的原核RNA转录的增强。由于真核与原核转录系统之间不具有兼容性，所以此等先前技术仍受限于将原核RNA启动子用于原核生物中的基因表达，且原核RNA启动子中无一者适用于表达发夹型RNA，诸如pre-miRNAs及shRNAs。
归因于系统不兼容性，在发明人的pro-miRNAs发明之前不存在于原核生物中产生pre-miRNA/shRNA类药物的方法。此外，pre-miRNA/shRNA的大小约为70至85个核苷酸长，其太大且成本太高以致无法藉由RNA合成机器制得。为克服此等问题，本发明采用pro-miRNAs。藉由添加模拟真核转录辅因子的一些确定化学诱导剂，发明人可为原核细胞建立新颖适应环境，以将真核Pol-2及/或Pol-2类病毒启动子用于转录发夹型pre-miRNAs及shRNAs。优势为：第一，归因于细菌的快速生长而有成本效益地大批量生产；第二，由于不需要培育生长专用hESCs或iPSCs而易于处置；第三，就Pol-2启动子驱动的RNA转录而言，存在高保真度生产率；第四，归因于原核生物中不具有真正的miRNA，所得pre-miRNAs及siRNAs的纯度高；及最后，无内毒素，其可藉由某些化学品处理而进一步移除。因此，一种产生高品质及高数量的pro-miRNAs作为治疗人类肺癌的药物的方法为高度理想的。
【发明内容】
本发明是关于发夹型RNAs，诸如pre-miR-302s(SEQ.ID.NO.6至SEQ.ID.NO.9)及其siRNA模拟物(siR-302)用于治疗人类肺癌的用途。pre-miR-302及siR-302是藉由使用某些化学诱导剂刺激及增强原核细胞中的真核启动子驱动的发夹型RNA转录的新颖pro-miRNA产生方法制得。此等化学诱导剂包括3-吗啉基丙烷-1-磺酸[或称作3-(N-吗啉基)丙磺酸；MOPS]、甘油(或称作丙三醇)及乙醇、以及其功能类似物，诸如2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)及甘露醇。另外，可设想与此等诱导剂具有类似结构的化学品可具有相同功能。然而，MOPS通常用作细菌细胞溶解中的缓冲剂，乙醇为熟知消毒剂，且甘油藉由使细菌细胞壁不稳定而频繁用作为细菌转化(transformation)中的抑菌剂。鉴于MOPS、乙醇及甘油的此等已知功能，没有人将预期使用0.001％至4％(体积/体积)浓度的此等化学品以在原核生物中诱发真核启动子驱动的基因表达。
基于以上描述，本发明亦含有使用原核细胞产生作为用于癌症疗法的治疗药物及/或疫苗的人类微RNA前驱体(pre-miRNAs)及/或shRNAs的设计及方法。更特定言之，本发明为使用原核细胞产生特殊种类的pre-miRNA类药剂的设计及方法，该等药剂称为原核生物产生的miRNA前驱体(pro-miRNA)，能够将高级恶性/转移性人类癌细胞重新编程为低级良性或甚至正常样状态。较佳地，此等pro-miRNAs为肿瘤抑制因子微RNAs(TS-miRNA)，与miR-302a、b、c、d、e、及/或f的前驱体(pre-miR-302s)及其天然家族簇以及其人工重新设计的小发夹型RNAs(shRNAs)及/或其组合类似。pre-miR-302类shRNAs的结构包括pre-miR-302茎-臂序列的不完全及完全匹配双螺旋构形，其可形成于单一单元或多个单元簇中。另外，pre-miR-302类shRNA的错配部分可位于茎臂或环区中，与预期pre-miR-302序列具有约30％至100％同源性。此等设计可提高标靶特异性及/或减少有效递送及癌症疗法所需的pro-miR-302的拷贝数。适合于此类药物治疗的人类细胞包括活体外、离体及/或活体内正常细胞、肿瘤细胞及癌细胞。
较佳地，用于本发明的原核细胞为细菌感受态细胞，特定言之大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)，且化学诱导剂为MOPS、乙醇或甘油，或其混合物。另外较佳地，使用的真核RNA启动子为真核Pol-2启动子(亦即EF1α启动子)或Pol-2相容的(Pol-2类)病毒启动子(亦即巨细胞病毒CMV启动子)。藉由真核RNA启动子介导的基因可编码选自由以下组成的群组的非编码或蛋白质编码RNA或两者(诸如含内含子的基因转录物)：微RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)、信使RNA(mRNA)、其前驱体及同系物，及其组合。为了诱导基因表达，原核细胞经真核RNA启动子介导的基因转染，且接着在与鲁利亚-贝尔塔尼(Luria-Bertani；LB)培养液的细菌培养基类似的培养基中在37℃下在添加化学诱导剂的情况下生长>24小时。
为了展示该等化学诱导剂对于原核生物中的人类微RNA产生的可诱导性，发明人将来自发明人的优先权美国专利申请案第12/149,725号及第12/318,806号的慢病毒载体pSpRNAi-RGFP-miR302修饰为新质体载体pLenti-EF1a-RGFP-miR302，其中SpRNAi-RGFP基因表达是藉由真核Pol-2或Pol-2类启动子，诸如EF1α及/或CMV启动子，或两者的重组组合驱动(图1A)。此后，发明人藉由其转化大肠杆菌感受态细胞且接着使用红色萤光蛋白(RGFP)的表达作为用于量测pre-miR-302s(pro-miR-302s)的转录及产生速率的可见标记物，如图1B中所示。由于miR-302家族簇(SEQ.ID.NO.5)亦经进一步修饰以编码于RGFP基因的5'-内含子区[例如5'-非转译区(5'-UTR)或第一内含子]中，各RGFP mRNA的转录导致产生一个4-发夹miR-302前驱体簇(pri-miR-302)及/或四个1-发夹miR-302前驱体(pre-miR-302s)，如图5及图6中所示。由于原核生物中不具有RNase III Dicer，pri-miR-302转录物将最终(藉由大肠杆菌中的某些单链RNA酶)分解为1-发夹pre-miR-302s，其全部可经提取且另外用作本发明的治疗药物。广义地说，将5'-UTR及3'-UTR视为本发明的内含子的一部分。
所有miR-302成员在其前5'-十七(17)个核苷酸中共用完全相同的序列5'-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3'(SEQ.ID.NO.3)，且在其成熟微RNA的全长23核苷酸中具有>82％同源性。基于藉由在线计算程式TARGETSCAN及PICTAR-VERT预测的结果，此等miR-302s同时靶向几乎相同基因，包括>600种人类基因。另外，miR-302亦与mir-92、mir-93、mir-200c、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373、mir-374及mir-520家族成员共用许多重迭靶基因，该等家族成员全部可具有类似功能。大部分此等靶基因是在早期胚胎发生期间参与启动及/或建立某些谱是特异性细胞分化的发育信号及转录因子(Lin等人，2008)。许多此等靶基因亦为熟知致癌基因；因此，miR-302s可能充当肿瘤抑制因子以预防正常hESC生长偏离为肿瘤/癌细胞。
在一些实施例中，揭示抑制癌细胞增殖的方法。方法包括使该癌细胞与一定量的含有SEQ.ID.NO.3的发夹型pre-miRNA接触，该量足以抑制癌细胞增殖。在一些实施例中，该量不足以抑制正常细胞增殖。在一些实施例中，该量在10至200μg/mL范围内。在一些实施例中，该量为10μg/mL、15μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、200μg/mL或其间的值。在一些实施例中，pre-miRNA为甘胺酰甘油(glycylglycerin)囊封的pro-miR-302。在一些实施例中，癌细胞在动物中且将甘胺酰甘油囊封的pro-miR-302注射至动物的血流中以处理癌细胞。在一些实施例中，甘胺酰甘油囊封的pro-miR-302以每毫升动物血液10至200微克之间的浓度注射至动物中。在一些实施例中，甘胺酰甘油囊封的pro-miR-302以10μg/mL、15μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、125μg/mL、150μg/mL、200μg/mL或其间的值的浓度注射至动物中。在一些实施例中，甘胺酰甘油囊封的pro-miR-302以每天两次、每天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每四周一次或其间的值的频率注射至动物中。在一些实施例中，甘胺酰甘油囊封的pro-miR-302以每周两次的频率注射至动物中。在一些实施例中，癌细胞来自选自由以下组成的群组的癌症：膀胱癌、肺癌、脑癌、肝癌、乳癌、黑色素瘤、非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma)、子宫颈癌、卵巢癌及骨癌。在一些实施例中，癌细胞为肺癌细胞。
在原核生物中诱导真核启动子驱动的基因表达。
大肠杆菌(E.coli)感受态细胞是以pLenti-EF1α-RGFP-miR302质体，使用z-感受态大肠杆菌转化套组(Zymo Research,Irvine,CA)转化(图1A)，且在37℃下在以170rpm频繁搅拌的情况下在补充有0.1％(v/v)MOPS及0.05％(v/v)甘油(诱导剂)的混合物的鲁利亚-贝尔塔尼(LB)培养液中培养。在隔夜培育之后，转化的大肠杆菌感受态细胞表达可在LB培养液的颜色中明显可见的高丰度红色RGFP蛋白质，而空白对照大肠杆菌未呈现RGFP，如图2中所示。功能性RGFP的存在指示其编码的RNA及蛋白质均在感受态细胞中成功地产生及处理。
为了进一步确认藉由化学诱导剂诱导的基因表达的特异性，制备两个转化的大肠杆菌菌株：一个携有含有CMV启动子驱动的绿色萤光蛋白(GFP)基因的pLVX-Grn-miR302+367质体载体，且另一个携有上述pLenti-EF1α-RGFP-miR302载体。在仅与0.1％(v/v)MOPS一起隔夜培育之后，经pLVX-Grn-miR302+367转化的大肠杆菌变为绿色，而经pLenti-EF1α-RGFP-miR302转化的另一个仍显示红色，如图3中所示。此结果指示如MOPS的化学诱导剂可经由真核pol-2或Pol-2类病毒启动子刺激特定RNA转录及其相关蛋白质生产。特定言之，注意到RGFP及GFP产量如此丰富以致即使大肠杆菌细胞亦藉由对应红色及绿色可视地染色。
在本发明测试的所有化学品中，前三种最强力诱导剂为MOPS、甘油及乙醇，如图4中所示。诱导性RGFP生产的定量结果是藉由蛋白质印迹分析(Western blot analysis)进一步确认，如图5及实例3中所示。细菌RuvB蛋白质充当标准化RGFP表达的管家标准。亦发现此等经识别诱导剂的可诱导性与其浓度成比例地具剂量依赖性。在无任何处理的情况下，阴性对照大肠杆菌细胞在不存在任何萤光染色的情况下仅显示其原始颜色。因此，根据所有此等结果，本发明明确提供新颖化学诱导性组合物及其用于调节原核细胞中的真核pol-2驱动或Pol-2类病毒启动子驱动的RNA生产的应用。鉴于以上论证，对于所属技术领域中具有通常知识者而言，使用其他基因或相关cDNAs代替RGFP基因在原核生物中产生功能性RNAs及相关蛋白质为显而易见的。
在原核生物中诱导真核启动子驱动的pre-miRNA表达。
伴随上文显示的RGFP诱导实验，发明人另外量测pri-/pre-miR-302s及其成熟miR-302s在具有或不具有化学诱导的pLenti-EF1α-RGFP-miR302转化的细胞中的表达。如图6及实例4中所示，已藉由RNA印迹分析(Northern blot analysis)确认诱导的pri-/pre-miR-302生产的定量结果。与图4及5中的RGFP诱导的结果类似，在用MOPS、甘油或乙醇处理的转化细胞，但未在空白对照中强烈侦测到pri-/pre-miR-302表达，指示此等化学诱导剂实际上经由真核pol-2启动子刺激编码pri-/pre-miRNAs于原核细胞中的表达(图6)。由于pre-miRNAs及shRNAs的结构相似性，对于所属技术领域中具有通常知识者而言，使用本发明以产生其他类型的pri-/pre-miRNA种类为显而易见的，诸如但不限于miR-34、miR-125、miR-146、miR-200、miR-371～373及miR-520。为了澄清，将此等人造原核生物产生的pri-/pre-miRNAs称作pro-miRNAs。
由于pLenti-EF1α-RGFP-miR302含有位于RGFP基因的5'-UTR中的miR-302家族簇(图1A及图1B)，诱导的RGFP基因表达亦将产生miR-302簇(pri-miR-302)及其衍生物pre-miR-302a、b、c及d(pre-miR-302s)，如图1B中所展示。由于原核生物中不具有RNase IIIDicer，发现由此获得的pri-miR-302及pre-miR-302s保持为发夹型微RNA前驱体，该等前驱体适用于开发治疗药物。在人类细胞中，此等pre-miR-302s及pri-miR-302可处理成熟miR-302以引发其肿瘤抑制功能。类似地，本发明亦可用于产生其他类型的TS-miRNA种类及其前驱体，诸如miR-34a、miR-146a、miR-373及miR-520家族。
所得pro-miRNAs可自感受态大肠杆菌细胞容易地提取(实例5及6)且藉由高效液相层析(HPLC)进一步纯化(图10A及10B)。在纯化的pro-miR-302s内，发明人已使用微RNA微阵列分析(图11B及12)及RNA定序[图13A(pri-miR-302)及13B(pre-miR-302s)]识别鉴定所有miR-302家族成员(miR-302a、a*、b、b*、c、c*、d及d*)。特定言之，定序结果显示此等pro-miR-302s全部与其天然pre-miR-302对应物共有完全相同的序列(图13B)。此外，发明人已将此等pro-miR-302s调配为静脉内(IV)/活体内注射的可溶药物以测试其对于活体内人类肝癌的治疗效果(实例11)。如图14中所示，在3次注射治疗之后，pro-miR-302药物成功地减小活体内移植人类肝癌的>90％体积，将平均癌症尺寸缩小至相比于未治疗癌症的<10％。此外，藉由苏木精及曙红(H&E)染色的组织学检查另外展示此显著治疗效果不仅起因于miR-302的经报导肿瘤抑制功能(Lin等人,2010)，且亦起因于先前尚未观测到的另一新颖重新编程功能。举例而言，图15明显地显示pro-miR-302药物可在活体内将高级人类肝癌的恶性特性重新编程至与正常肝组织几乎类似的良性得多的阶段。此等经治疗癌症可甚至形成正常肝样结构，诸如经典肝小叶、中央静脉(CV)及门脉三联管(portal triads；PT)。因此，此等证据强有力地指示pro-miR-302不仅能够抑制肿瘤/癌细胞生长，且亦能够在活体内将人类癌症的恶性重置为相对良性或正常状态，对于癌症药物设计产生完全新颖的治疗效果。
在本发明中，质体载体及其编码的非编码RNAs(亦即pre-miRNA/shRNA及pri-miRNA)均可在原核细胞，较佳大肠杆菌DH5α感受态细胞中同时扩增(实例1、5及6)。用于分离扩增的pLenti-EF1α-RGFP-miR302质体DNA及转录的pri-/pre-miR-302s的方法描述于实例5及6中。用于将质体载体(亦即pLenti-EF1α-RGFP-miR302)递送至原核细胞中的技术称作细胞转化，而用于将扩增的ncRNAs(亦即pro-/pri-/pre-miR-302s)递送至真核细胞中的方法可选自由以下组成的群组：细胞内饮、化学/甘果糖输注(glycerol infusion)、肽/脂质/化学物质介导的转染、电穿孔、基因枪穿透、微注射、转座子/反转录转座子插入、及/或腺病毒/反转录病毒/慢病毒感染。
pro-miR-302诱导的多能干细胞分化作用。
已报导miR-302将哺乳动物体细胞重新编程为人胚胎干细胞(hESC)类诱导多能干细胞(iPSC)，如发明人的优先权美国专利申请案第12/149,725号及第12/318,806号中所展示。已使用此等iPSCs设计及开发许多干细胞应用及疗法。尽管如此，由于培养此等iPSCs及hESCs成本极高且费力，因此自此等多能干细胞收集miR-302及其前驱体为困难且低效的。另一方面，制造合成shRNA模拟物为pre-miR-302生产的另一可能的替代方案；然而成本仍极昂贵。另外，合成shRNA与天然pre-miR-302之间的相似性为存有疑虑的。为了解决此等问题，本发明提供一种用于在原核生物中大批量产生pre-miR-302的简单、廉价且高效的方法。此外，此等原核生物产生的pre-miR-302s(pro-miR-302s)的提取及纯化相对容易且具成本效益，如本发明的图6及实例6中所示。
发明人已使用pLenti-EF1α-RGFP-miR302转化的大肠杆菌细胞产生及分离高数量及品质的pLenti-EF1α-RGFP-miR302载体及pro-miR-302s，如实例5及6中所示。pLenti-EF1α-RGFP-miR302及pro-miR-302s均适用于产生iPSCs。遵循实例2，当藉由本发明产生的pro-miR-302s转导(transduced)至人类皮肤原代角质细胞中时，转染的角质细胞重新编程为表达强力hESC标记物Oct4的hESC类iPSCs(图7)。在图8及实例8中，发明人另外进行亚硫酸氢盐DNA定序检定以显示全DNA脱甲基确实发生于Oct4及Sox2基因两者的启动子中，该等基因为关键重新编程因子以及hESC标记物中的两者。由于已知全DNA脱甲基及Oct4表达为体细胞重新编程以形成hESC类iPSCs的第一步(Simonsson及Gurdon,Nat Cell Biol.6:984-990,2004)，自MOPS诱导的大肠杆菌细胞提取物分离的pro-miR-302s经证实有效地作为适用于iPSC分化的天然pre-miR-302s。因此，pro-miR-302及pre-miR-302在干细胞诱导中具有相同功能。
pre-miR-302诱导的CD34阳性成体干细胞扩增及/或再生。
已发现微RNA miR-302将哺乳动物体细胞重新编程为hESC类iPSCs(Lin,2008,2010,2011；Lin的美国专利申请案第12/149,725号及第12/318,806号)。使用此等iPSCs，已开发出许多推进现代再生医学的干细胞相关生物医学应用及疗法。然而，miR-302仅大量发现于hESCs而非分化组织细胞中。另外，自hESCs分离miR-302为高度有争议、高成本且繁琐的。为解决此等问题，发明人的美国专利申请案第15/167,226号的优先权已提供一种用于在原核生物中大批量产生pre-miRNAs(或称作pro-miRNAs)及其siRNA模拟物的简单、廉价、快速且诱导性的组合物及方法。使用此方法，自原核细胞产生及分离pre-miR-302(pro-miR-302s)相对容易且具成本效益，如本发明的图6及实例6中所示。
经分离pre-miR-302s之一种较佳应用为在正常组织或癌组织中诱导CD34阳性成体干细胞的扩增。如图17A及17B中所示，发明人使用新颖甘胺酰甘油调配的基于pre-miR-302的药物在创伤愈合及癌症疗法中的近期研究显示相对较低浓度(50至500μg/mL)的调配pre-miR-302作为候选药物的治疗不仅极大地增强无疤创伤愈合，且亦在小鼠及猪皮肤中的受损组织区域周围活体内诱导CD34阳性成体干细胞扩增。基于与图17A的对照(仅抗生素软膏)结果相比的图17B的miR-302治疗(pre-miR-302s+抗生素软膏)结果，明显地显示在pre-miR-302治疗之后，活体内CD34阳性成体干细胞群体(藉由绿色萤光抗CD34抗体标记)具≥40倍增加。当前已知的CD34阳性干细胞类型包括但不限于皮肤、毛发、肌肉、血液(造血)、间充质及神经干细胞。鉴于此发现，由于miR-302可用于活体内诱导CD34阳性成体干细胞扩增及/或再生，此治疗效果亦可帮助再生长及/或复生功能性成体干细胞以治疗人体的退行性疾病，诸如但不限于阿兹海默氏症(Alzheimer's disease)、帕金森氏症(Parkinson's disease)、骨质疏松、糖尿病及癌症。
将pro-miR-302在活体内用于肝癌疗法。
发明人的先前研究已展示此方法在活体外治疗人类肝细胞癌HepG2细胞中的可行性(Lin等人，2010)。如图9中所示，治疗的肿瘤/癌细胞重新编程为iPSCs(标记为mirPS-HepG2)且形成拟胚体样细胞集落(embryoid body-like cell colonies)。此外，亦发现miR-302在治疗的癌细胞群体中诱发>95％细胞凋亡。图9的顶图另外显示DNA含量的流式细胞术分析，回应于细胞周期阶段而在miR-302治疗之后展现有丝分裂细胞群体的显著减少(45.6％至17.2％)。此等结果指示miR-302可有效地减弱人类肝癌细胞的快速细胞周期速率且因此造成此等癌细胞的显著细胞凋亡。
由于累积基因突变而认为癌症进展过程不可逆；然而，本发明揭示可在活体内将高级恶性癌症重新编程回低级良性或甚至正常样阶段的新颖pre-miRNA(pro-miR-302)功能，其中该机制可与称作自发癌症消退(spontaneous cancer regression)的极稀有自然治愈过程相关。自发癌症消退以100,000个癌症患者中小于1个的比率罕见地出现。发明人发现pro-miR-302治疗能够在人类肝癌中将此稀有治愈比率增加至>90％。如图14中所示，使用pro-miR-302s作为治疗SCID-灰棕色裸小鼠(n＝6)的人类肝癌异种移植物的药物的治疗结果展示此pro-miR-302药物成功地将癌症尺寸自728±328mm3(未处理空白对照，C)减小至75±15mm3(经pro-miR-302治疗，T)，指示平均癌症尺寸的约90％减小率，而其他合成siRNA模拟物(siRNA-302)的治疗不提供任何类似治疗效果。
进一步的组织学检查(图14的最右图)显示仅在pro-miR-302治疗的癌症移植物，但未在其他治疗或对照中观测到正常肝小叶样结构(圈出且藉由黑色箭头指出)，表明已出现重新编程机制以将恶性癌细胞特性重置回相对正常样状态(癌症逆转)。此新颖重新编程机制可能起因于miR-302对人类致癌基因，特别是参与癌症进展的彼等突变致癌基因的基因沉默效应。藉由使彼等突变致癌基因沉默，pro-miR-302能够将癌基因表达模式重置回正常样状态，因此产生癌症逆转的治疗结果。尽管如此，此活体内重新编程机制可不同于先前报导的活体外体细胞重新编程(Lin等人，2008及2011)，因为未在pro-miR-302治疗之后在活体内识别到Oct4阳性多能干细胞。
更详细组织学检查(图15)进一步确认pro-miR-302药物确实将高级(IV级)人类肝癌移植物重新编程至更良性低级(小于II级)状态。如图15中所示，治疗的癌症移植物形成含有中央静脉(CV)样及门脉三联管(PT)样结构(藉由黑色箭头指示)的经典肝小叶，与正常肝组织结构(顶部)高度类似。未治疗、siRNA治疗、pro-miR-302治疗的人类肝癌移植物及正常肝组织之间的活体内组织学比较(图16)亦显示未经治疗的移植人类肝癌(顶部)侵略性地侵入周围正常组织，诸如肌肉及血管中，且形成块状细胞-细胞及癌症-组织融合结构，表明其高恶性及转移。siRNA模拟物(siRNA-302)的治疗不显著降低移植肝癌的恶性(上中部)，可能归因于siRNA在活体内的短半衰期。相比之下，pro-miR-302的治疗不仅将移植癌细胞重新编程至正常肝细胞样形态(未融合)，且亦成功地抑制任何向周围组织中的癌症侵袭(下中部)。相比于正常肝组织(底部)，pro-miR-302治疗的癌症明显地显示类似小叶结构、正常腺细胞样布置及细胞-细胞与癌症-组织接合处之间的极清晰边界(黑色箭头)，表明此等经治疗癌症已极大地降级至极良性状态。经6至10次的pro-miR-302药物的进一步连续治疗可完全消除所有6个样品(n＝6)中的癌症异种移植物。
pro-miR-302在活体内用于肺癌疗法的运用。
在本发明中，发明人想要扩展miR-302治疗于肺癌疗法中的应用。为达成此目标，发明人首先测试甘胺酰甘油囊封的pro-miR-302(或称作配方#6；F6)对于自患者分离的不同肺癌细胞类型的生长的剂量依赖性肿瘤抑制效应，且发现活体外使用25至50μg/mL的F6溶液呈现针对所有测试的肺癌细胞增殖，但不会针对正常细胞生长的最佳抑制结果(图18)。为了进一步量测F6药物针对恶性肺癌细胞类型的生长的效能，进行软琼脂集落(softagar colony)形成检定。如图19A及19B中所示，发明人发现此软琼脂系统中的典型人类恶性肺癌细胞株-A549的集落形成能力在F6治疗之后显著降低，尤其在大型集落(直径≥200μm)的群体中。此结果明显地展示调配的pre-miR-302s对恶性/转移性肺癌细胞的增殖的治疗效果。此外，图20显示多种不同人类肺癌细胞类型，包括EGFR、p53及K-Ras致癌基因的突变类型中的若干驱动基因的突变状态。图20的中栏中示出的图片为源自未经任何治疗的四种不同人类肺癌细胞株(类型)的原始癌细胞所形成的集落，而图片中栏的右侧上的图显示一次F6治疗对此等肺癌类型的集落形成的抑制效应，其中所得药物效能分类为四组：敏感组(平均集落大小减小>50％)、部分敏感组(减小25至50％)、部分耐药组(减小<25％)及耐药组(无效0％)。结合在一起，此等结果确认经设计的pro-miR-302治疗可显著抑制许多恶性/转移性肺癌类型的生长及集落形成能力。特定言之，PC9/IR细胞的剧烈药物敏感反应亦暗示酪胺酸激酶抑制剂(TKI)介导的耐药路径与miR-302介导的肿瘤抑制路径之间可能的抵消关系(counteractive relationship)，导出用于克服高级恶性/转移性肺癌的耐药性问题的改良方法。
在使用活体内原位肺癌检定的进一步动物试验(图22A-22C)中，发明人将肺癌细胞注射于各测试小鼠的左胸腔中以观测肺间癌转移。结果，发现于右叶中的癌结节应指示肺癌自左叶中的原发癌植入侧转移。图22A展示不同实验及对照组中的肺癌结节的数目，且图22B显示代表性照片。在图22A中，黑色条说明左叶中发现的结节，且白色条显示右叶中发现的结节。作为图22A及22B中示出的结果，两个治疗组(50及100μg/ml)中的结节数目在肺左叶及右叶中均显著减少。对照组的结节数目为分别为左叶及右叶中的8.7±6.0及23.8±12.0。在治疗之后，调配pre-miR-302(F6)药物成功地将结节数目分别减少为50μg/mL组中的1.6±1.9及8.3±5.3及100μg/mL组中的22.5±1.4及4.75±3.9。此外，组织活检体的组织学检查(图22C)显示仍在全部三组中观测到典型肺腺癌结构(圈出且藉由黑色箭头指出)，但肿瘤数目及尺寸在两个治疗组的肺组织中均显著减小。此等资料确认此调配pre-miR-302(F6)药物对于在活体内，尤其在转移性肺腺癌区域中抑制非小细胞肺癌(NSCLC)的生长及转移而言的治疗效能极强。
为了进一步评估F6药物对转移性肺腺癌的强治疗效果，发明人降低活体内原位肺癌模型(对于两个治疗组，n＝11，且对于对照组，n＝5)中的F6溶液的治疗频率。如图23A及23B中所示，在此重复动物试验性实验中，小鼠如下地用F6治疗：在第3周及第4周期间每周经由尾端静脉注射两次且接着在第5周之后每周注射一次，直到牺牲。基于体重与总血容量的比计算F6的施用剂量，以在所有测试小鼠中保持相同F6治疗浓度。每周观测及量测萤光素酶信号(Luciferase signals)一次以追踪转移癌生长。最后，在治疗后第42天牺牲小鼠。为了进一步评估pre-miR-302药物的急性毒性效应，一个测试组的小鼠仅在第3周及第4周期间用F6治疗四次，其接着标记为50(4)组(图23B)。此外，发明人亦测试仅甘胺酰甘油的配方在此活体内小鼠模型中的毒性以排除药物递送调配方案的任何可能的毒性干扰。
治疗频率降低的第二动物试验的治疗结果(图24A至24C)显示与前述活体内原位肺癌实验(图22A至22C)中所观测高度一致的抗癌效应及结节抑制模式。对照组的结节数目(图24A)分别为左叶及右叶中的9.4±2.2及34.8±7.7，而F6(pre-miR-302)治疗成功地将结节数目减少为50(4)μg/mL组中的6.75±4.6及29.3±3.9，50μg/mL组中的5.9±2.7及16.3±4.4，及100μg/mL组中的4.3±2.9及10.5±4.4。图24B进一步展示图24A中的所有对照及经治疗肺癌组织的代表性照片。有趣的是，自治疗组分离的肺组织的照片不仅显示左叶及右叶两者中的结节数目的显著减少，且亦显示肺表面下的愈合疤痕组织，表明亦在肺癌的受损组织区域中藉由F6治疗刺激增强型正常组织修复效应(图24C)。此外，自F6治疗组分离的活检组织的进一步组织学检查显示肿瘤中的淋巴细胞浸润(圈出且藉由黑色箭头指出)，指示亦藉由F6治疗刺激强免疫反应，尤其是在高剂量F6治疗组(100μg/mL组；图24C的最右栏)的组织中。
总之，所有此等发现明显地总结出F6(调配pre-miR-302药物)对高度恶性及转移性肺癌，诸如NSCLC的生长的活体内治疗效果。本发明的此等观测治疗效果包括但不限于抑制肺癌细胞生长、抑制癌结节形成、抑制癌转移、预防耐药性、增加免疫系统反应及增强癌症受损组织区域中的正常组织修复。本发明的pre-/pro-miR-302药物的所有此等治疗效果极适用于设计及开发用于多种医药及治疗应用的新颖药物及疗法。
A.定义
为了便于理解本发明，下文定义多个术语：
核苷酸：由糖部分(戊醣)、磷酸酯及含氮杂环碱基组成的DNA或RNA的单体单元。碱基经由糖苷碳(戊醣的1'碳)连接至糖部分且碱基及糖的该组合为核苷。含有至少一个结合至戊醣的3'或5'位置的磷酸酯基的核苷为核苷酸。DNA及RNA分别由称作去氧核糖核苷酸及核糖核苷酸的不同类型的核苷酸单元组成。
寡核苷酸：由两个或更多个、较佳大于三个、且通常大于十个DNA及/或RNA单体单元组成的分子。长于13个核苷酸单体的寡核苷酸亦称作多核苷酸。精确大小将取决于许多因素，其转而取决于寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸可以任何方式产生，包括化学合成、DNA复制、RNA转录、反转录或其组合。
核苷酸类似物：在结构上与腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)不同，但与核酸分子中的正常核苷酸的替代物充分类似的嘌呤或嘧啶核苷酸。
核酸组合物：核酸组合物是指单链或双链分子结构中的寡核苷酸或多核苷酸，诸如DNA或RNA序列，或混合DNA/RNA序列。
基因：寡核苷酸或多核苷酸序列编码RNA及/或多肽(蛋白质)的核酸组合物。基因可为RNA或DNA。基因可编码非编码RNA，诸如小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、及其RNA前驱体以及衍生物。或者，基因可编码蛋白质/肽合成必需的蛋白质编码RNA，诸如信使RNA(mRNA)及其RNA前驱体以及衍生物。在一些情况下，基因可编码亦含有至少微RNA或shRNA序列的蛋白质编码RNA。
初级RNA转录物：在无任何RNA处理或修饰的情况下直接自基因转录的RNA序列，其可选自由以下组成的群组：mRNA、hnRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA、pre-microRNA、病毒RNA及其RNA前驱体以及衍生物。
前驱体信使RNA(pre-mRNA)：蛋白质编码基因的初级RNA转录物，其经由称为转录的细胞内机制由真核生物中的真核第二型RNA聚合酶(Pol-II)机构生产。pre-mRNA序列含有5'-非转译区(UTR)、3'-UTR、外显子及内含子。
内含子：编码非蛋白质阅读框架的基因转录物序列之一或多个部分，诸如框内内含子、5'-UTR及3'-UTR。
外显子：编码蛋白质阅读框架的基因转录物序列(cDNA)之一或多个部分，诸如用于细胞基因、生长因子、胰岛素、抗体及其类似物/同系物以及衍生物的cDNA。
信使RNA(mRNA)：pre-mRNA外显子的集合体，其在藉由细胞内RNA剪接机构(剪接体)移除内含子之后形成且充当肽/蛋白质合成的蛋白质编码RNA。由mRNAs编码的肽/蛋白质包括但不限于酶、生长因子、胰岛素、抗体及其类似物/同系物以及衍生物。
互补DNA(cDNA)：含有与mRNA序列互补的序列且不含任何内含子序列的单链或双链DNA。
正义链：与同源mRNA呈相同序列顺序及组成的核酸分子。正义构形藉由「+」、「s」或「正义」符号标明。
反义链：与对应mRNA分子互补的核酸分子。反义构形以「-」或「*」符号或以DNA或RNA前面的「a」或「反义」标定，例如「aDNA」或「aRNA」。
碱基对(bp)：双链DNA分子中腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)，或胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)的配对关系。在RNA中，尿嘧啶(U)取代胸腺嘧啶。一般而言，配对关系经由氢键结实现。举例而言，正义核苷酸序列「5'-A-T-C-G-U-3'」可与其反义序列「5'-A-C-G-A-T-3'」形成完全碱基配对。另外，G及U可形成非沃森及克里克配对(non-Watson-and-Crick pairing)，诸如「5'-T-G-C-3」与「5'-G-U-A-3'」的配对。
5'-端：在连续核苷酸的5'位处不具有核苷酸的末端，其中一个核苷酸的5'-羟基藉由磷酸二酯键联接合至下一核苷酸的3'-羟基。其他基团，诸如一或多个磷酸根可存在于末端上。
3'-端：在连续核苷酸的3'位处不具有核苷酸的末端，其中一个核苷酸的5'-羟基藉由磷酸二酯键联接合至下一核苷酸的3'-羟基。其他基团，最通常羟基可存在于末端上。
模板：由核酸聚合酶复制的核酸分子。取决于聚合酶，模板可为单链、双链或部分双链的。合成复本与模板，或与双链或部分双链模板的至少一条链互补。RNA及DNA均沿5'至3'方向合成。核酸双螺旋的两条链始终对准以使得两条链的5'端在双螺旋的相对端(且必然地，3'端亦如此)。
核酸模板：双链DNA分子、双链RNA分子、杂交分子诸如DNA-RNA或RNA-DNA杂合体、或单链DNA或RNA分子。
保守：若核苷酸序列非随机地杂交至预先选择序列的精确互补段(exactcomplement)，则核苷酸序列相对于预先选择(基准(referenced))序列保守。
同源或同源性：指示多核苷酸与基因或mRNA序列之间的相似性的术语。举例而言，核酸序列可与特定基因或mRNA序列部分或完全同源。同源性可表示为藉由类似核苷酸的数目相比于核苷酸的总数目所测定的百分比。另外，胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)彼此同源。
互补的或互补性或互补：基于依据上述「碱基对(bp)」规则建立关系的两个聚核苷酸(亦即mRNA及cDNA的序列)之间的匹配碱基配对所使用的术语。举例而言，序列「5'-A-G-T-3'」与序列「5'-A-C-T-3」以及「5'-A-C-U-3'」互补。另外，G及U可在RNA双螺旋或RNA-DNA配对序列中彼此互补。举例而言，序列「5'-U-G-C-3'」与序列「5'-G-U-A-3'」、以及「5'-G-U-G-3'」、以及「5'-G-C-G-3'」及「5'-G-C-A-3'」互补。互补可在两条DNA链、DNA与RNA链之间或两条RNA链之间。互补性可为「部分」或「完全」或「总体」。部分互补性或互补仅在根据碱基配对规则只有核酸碱基中的一些匹配时出现。完全或总体互补性或互补在碱基在核酸链之间完全或完美匹配时出现。核酸链间之间的互补程度对核酸链之间的杂交的效率及强度具有显著影响。在扩增反应中，以及在取决于核酸之间的结合的侦测方法中，此尤其重要。百分比互补性或互补是指核酸之一条链中失配碱基相对总碱基的数目。因此，50％互补意谓一半碱基错配且一半匹配。即使核酸的两条链的碱基数不同，两条链的核酸亦可互补。在此情况下，互补出现于对应于较长链上的一些碱基的较长链的一部分之间，其中该较长链上的该等碱基与较短链上的碱基配对。
互补碱基：通常在DNA或RNA采用双链组态，诸如DNA-DNA、DNA-RNA及RNA-RNA双螺旋以及由部分DNA及部分RNA杂交序列之间的配对所形成的任何双螺旋时配对的核苷酸。
互补核苷酸序列：与另一单链上的核苷酸序列充分互补以藉由由此产生的氢键结在两条链之间特异性杂交的DNA或RNA的单链分子中的核苷酸序列。
杂交(Hybridize/Hybridization)：在充分互补以经由碱基配对形成复合物的核苷酸序列之间形成双螺旋。当引子(或剪接模板)与标靶(模板)「杂交」时，此类复合物(或杂合体)足够稳定以提供DNA聚合酶起始DNA合成所需的引发功能(priming function)。在可竞争性抑制的两个互补聚核苷酸之间存在特异性，亦即非随机相互作用。
转录后基因沉默：在mRNA降解或转译抑制层级上的靶向基因敲除(knockout)或基因敲落(knockdown)效应，其通常藉由外来/病毒DNA或RNA转基因(transgenes)或小抑制RNAs触发。
RNA干扰(RNAi)：真核生物中的转录后基因沉默机制，其可藉由小抑制RNA分子，诸如微RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)及小干扰RNA(siRNA)触发。此等小RNA分子通常充当基因沉默子，干扰与小RNAs具有完全或部分互补性的细胞内基因的表达。
基因沉默效应：在基因功能经抑制之后的细胞反应，包含但不限于细胞周期衰减、G0/G1-检查点阻滞、肿瘤抑制、抗致肿瘤性、癌细胞凋亡及其组合。
非编码RNA(ncRNA)：无法用于经由细胞内转译机构合成肽或蛋白质的RNA转录物。非编码RNA包括长及短调节RNA分子，诸如微RNA(miRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)及双链RNA(dsRNA)。此等调节RNA分子通常充当基因沉默子，干扰与非编码RNAs具有完全或部分互补性的细胞内基因的表达。
微RNA(miRNA)：能够结合至与微RNA的序列具有部分互补性的靶向基因转录物(mRNAs)的单链RNA。成熟微RNA通常设定大小为约17-27个寡核苷酸的长度，且能够取决于微RNA与其标靶mRNA(s)之间的互补性而直接降解其细胞内mRNA标靶或抑制其靶向mRNA(s)的蛋白质转译。天然微RNAs发现于几乎所有真核生物中，充当针对病毒感染的防御且允许在植物及动物发育期间调节特定基因表达。原则上，一个微RNA通常靶向多个标靶mRNAs以履行其完整功能，而另一方面，多个miRNAs可靶向相同基因转录物以增强基因沉默效应。
微RNA前驱体(pre-miRNA)：发夹型单链RNA，其含有茎-臂及茎-环区，用于与细胞内RNase III Dicer核糖核酸内切酶相互作用以产生一或多个成熟微RNAs(miRNAs)，该一或多个成熟微RNAs(miRNAs)能够沉默与成熟微RNA序列具有完全或部分互补性的靶向基因或特定靶向基因的族群。pre-miRNA的茎-臂可形成完全(100％)或部分(错配)杂交双螺旋，而茎-环连接茎-臂双螺旋之一端，以形成组装至具有一些阿尔古蛋白(AGO)的RNA诱导沉默复合物(RISC)中所需的圆或发夹-环构形。
原核生物产生的微RNA前驱体(pro-miRNA)：与天然微RNA前驱体(pre-miRNA)类似，但自藉由原核感受态细胞中的真核启动子驱动的人工重组微RNA表达质体所转录的发夹型RNAs。举例而言，pro-miR-302在结构上与pre-miR-302相同(图13A及图13B)，但自大肠杆菌DH5α感受态细胞中的pLVX-Grn-miR302+367或pLenti-EF1α-RGFP-miR302载体所转录(实例1)。由于原核细胞通常不表达短发夹型RNAs，诸如真核pre-miRNAs，其中结构类似于原核生物中的转录终止代码，原核生物中的pro-miRNAs产生通常需要添加一些限定的化学诱导剂以刺激真核启动子驱动的发夹型RNA转录(图2-4)。
小干扰RNA(siRNA)：大小为约18-27个完全碱基配对的核糖核苷酸双螺旋且能够降解具有几乎完美的互补性的靶基因转录物的短双链RNA。
小或短发夹RNA(shRNA)：含有一对部分或完全匹配的茎-臂核苷酸序列的单链RNA，该对核苷酸序列由不匹配环寡核苷酸分开以形成发夹型结构。许多天然miRNA以shRNA形式保留于细胞中，诸如前驱体微RNA(pre-miRNA)。
载体：能够在不同基因环境中移动及滞留的重组核酸组合物，诸如重组DNA(rDNA)。一般而言，另一核酸可操作地连接于其中。载体可能能够在细胞中自主复制，在此情况下，载体及附接段会复制。一种类型的较佳载体为游离基因体(episome)，亦即能够进行染色体外复制的核酸分子。较佳载体为能够自主复制及表达核酸者。能够引导编码一或多种多肽及/或非编码RNA的基因的表达的载体在本文中称为「表达载体」或「表达复制(completent)载体」。尤其重要的载体允许自使用逆转录酶产生的mRNA克隆cDNA。载体可含有由以下各者组成的组分：病毒或第二型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)启动子或两者、Kozak共同转译起始位点、聚腺苷酸化信号、复数个限制/克隆位点、pUC复制起点、用于表达复制感受态原核细胞中的至少一个抗生素抗性基因的SV40早期启动子、视情况存在的用于在哺乳动物细胞中复制的SV40来源及/或四环素反应元件。载体的结构可为选自由质体、病毒载体、转座子、反转录转座子、DNA转基因、跳跃基因及其组合组成的群的单链或双链DNA的线性或环状形式。
启动子：聚合酶分子识别，或可能结合至，且引发RNA转录的核酸。出于本发明的目的，启动子可为已知聚合酶或其辅因子结合位点、增强子及其类似物、可藉由所需聚合酶起始RNA转录物合成的任何序列。
真核启动子：核酸基元序列，其为RNA及/或基因转录所需且可藉由真核第二型RNA聚合酶(Pol-2)、Pol-2等效物及/或Pol-2相容性(Pol-2类)病毒聚合酶识别用于引发RNA/基因转录。
第二型RNA聚合酶(Pol-II或Pol-2)启动子：可藉由真核第二型RNA聚合酶(Pol-II或Pol-2)识别且因此能够起始真核信使RNA(mRNA)及/或微RNA(miRNA)的转录的RNA启动子。举例而言，Pol-2启动子可为哺乳动物RNA启动子，如EF1α启动子，或病毒/反转录病毒启动子，如巨细胞病毒(CMV)启动子，或其组合，但不限于此。
第二型RNA聚合酶(Pol-II或Pol-2)等效物：选自由哺乳动物第二型RNA聚合酶(Pol-II或pol-2)及Pol-II相容性(Pol-2类)病毒RNA聚合酶组成的群的真核转录机构。
Pol-II相容性(Pol-2类)病毒启动子：能够使用真核Pol-2或Pol-2等效转录机构引发基因及/或RNA表达的病毒RNA启动子。举例而言，Pol-2类病毒启动子可为巨细胞病毒(CMV)启动子或反转录病毒长末端重复序列(LTR)启动子，但不限于此。
顺反子：编码胺基酸残基序列且包括上游及下游DNA表达控制元件的DNA分子中的核苷酸序列。
内含子切除：造成RNA加工、成熟及降解，包括RNA剪接；外来体消化；无意义介导衰变(NMD)加工；及其组合的细胞机制。
RNA处理加工：造成RNA成熟、修饰及降解，包括RNA剪接；内含子切除；外来体消化；无意义介导衰变(NMD)；RNA编辑；RNA加工；及其组合的细胞机制。
靶细胞：单个或复数个选自由以下组成的群的人类细胞：体细胞、组织、干细胞、生殖系细胞、畸胎瘤细胞、肿瘤细胞、癌细胞及其组合。
癌组织：源自由以下组成的群的赘生性组织：皮肤癌、前列腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、脑肿瘤/脑癌、淋巴瘤、白血病及其组合。
表达复制载体：选自由质体、病毒载体、转座子、反转录转座子、DNA转基因、跳跃基因及其组合组成的群的单链或双链DNA的线性或环状形式。
抗生素抗性基因：能够降解选自由以下组成的群的抗生素的基因：青霉素G、链霉素、安比西林(ampicillin；Amp)、新霉素、G418、卡那霉素(kanamycin)、红霉素、巴龙霉素(paromycin)、霍火霉素(phophomycin)、大观霉素(spectromycin)、四环素(Tet)、多西环素(Dox)、利福平(rifapicin)、两性霉素B、健大霉素、氯霉素、先锋霉素、泰乐菌素及其组合。
限制/克隆位点：用于限制酶裂解的DNA基元，包括(但不限于)AatII、AccI、AflII/III、AgeI、ApaI/LI、AseI、Asp718I、BamHI、BbeI、BclI/II、BglII、BsmI、Bsp120I、BspHI/LU11I/120I、BsrI/BI/GI、BssHII/SI、BstBI/U1/XI、ClaI、Csp6I、DpnI、DraI/II、EagI、Ecl136II、EcoRI/RII/47III/RV、EheI、FspI、HaeIII、HhaI、HinPI、HindIII、HinfI、HpaI/II、KasI、KpnI、MaeII/III、MfeI、MluI、MscI、MseI、NaeI、NarI、NcoI、NdeI、NgoMI、NotI、NruI、NsiI、PmlI、Ppu10I、PstI、PvuI/II、RsaI、SacI/II、SalI、Sau3AI、SmaI、SnaBI、SphI、SspI、StuI、TaiI、TaqI、XbaI、XhoI、XmaI裂解位点。
基因递送：选自由以下组成的群的基因工程改造方法：多聚核糖体转染、脂质转染、化学转染、电穿孔、病毒感染、DNA重组、转座子插入、跳跃基因插入、显微注射、基因枪穿透及其组合。
基因工程改造：选自由以下组成的群的DNA重组方法：DNA限制及接合、同源重组、转基因并入、转座子插入、跳跃基因整合、反转录病毒感染及其组合。
细胞周期调节因子：参与控制细胞分裂及增殖速率的细胞基因，由(但不限于)CDK2、CDK4、CDK6、细胞周期蛋白、BMI-1、p14/p19Arf、p15Ink4b、p16Ink4a、p18Ink4c、p21Cip1/Waf1及p27Kip1及其组合组成。
肿瘤抑制效应：细胞抗肿瘤及/或抗癌机制及反应，由(但不限于)细胞周期衰减、细胞周期停滞、抑制肿瘤细胞生长、抑制细胞致肿瘤性、抑制肿瘤/癌细胞转化、诱导肿瘤/癌细胞凋亡、诱导正常细胞恢复、将高级恶性癌细胞重新编程至更良性低级状态(肿瘤消退)及其组合组成。
癌症治疗效应：起因于药物治疗的细胞反应及/或细胞机制，包括(但不限于)抑制癌基因表达、抑制癌细胞增殖、抑制癌细胞侵袭及/或迁移、抑制癌转移、诱导癌细胞死亡、预防肿瘤/癌症形成、预防癌症复发、抑制癌症进展、修复受损组织细胞、将高级恶性癌症重新编程至更良性低级状态(癌症消退/缓解)及其组合。
基因沉默效应：在基因功能经抑制之后的细胞反应，由(但不限于)抑制癌基因表达、抑制细胞增殖、细胞周期停滞、肿瘤抑制、癌症消退、癌症预防、细胞凋亡、细胞修复及/或复原、细胞重新编程、将患病细胞重新编程至相对正常状态(自发治愈)及其组合组成。
癌症逆转：在活体外、离体或活体内将高级癌症的恶性特性重置回相对正常样低级状态的重新编程机制。
靶细胞：单个或复数个选自由以下组成的群的人类细胞：体细胞、组织、干细胞、生殖系细胞、畸胎瘤细胞、肿瘤细胞、癌细胞及其组合。
癌组织：源自由以下组成的群的赘生性组织：皮肤癌、前列腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、脑肿瘤/脑癌、淋巴瘤、白血病及其组合。
转录诱导剂：可诱导及/或增强自原核细胞中的pol-2或Pol-2类启动子的真核RNA及/或基因转录的化学剂。举例而言，转录诱导剂含有(但不限于)与MOPS、乙醇、甘油以及其功能类似物，诸如2-(N-吗啉基)乙磺酸(MES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)及甘露醇，或其混合物类似的化学结构。
抗体：具有编码能够结合预先选择配位体的受体的预先选择保守域结构的肽或蛋白质分子。
医药及/或治疗应用：适用于诊断、干细胞产生、干细胞研究及/或疗法开发、组织/器官修复及/或复原、创伤愈合治疗、肿瘤抑制、癌症疗法及/或预防、疾病治疗、药物生产及其组合的生物医学利用、装置及/或设备。
B.组合物及应用
一种使用发夹型RNA治疗人类肺癌的组合物及方法，其包含：(a)提供至少一个含有SEQ.ID.NO.3的发夹型RNA；及(b)使(a)的发夹型RNA与含有至少一个肺癌细胞的癌症个体接触，以在肺癌细胞中释放发夹型RNA的肿瘤抑制功能且因此对癌症产生抗癌疗法效应。发夹型RNA的结构可呈pre-miRNA、shRNA及siRNA，或其组合的形式。较佳地，含有SEQ.ID.NO.3的发夹型RNA是藉由原核生物中的真核启动子介导的转录系统制得，其中此真核启动子介导的转录系统的活化是藉由含有与3-(N-吗啉基)丙烷-1-磺酸(MOPS)、乙醇或甘油，或其混合物类似的化学结构的一些化学诱导剂于原核细胞中诱导。较佳地，真核启动子介导的转录系统为位于质体载体中的Pol-2及/或Pol-2类启动子驱动的基因表达盒且原核生物为大肠杆菌(E.coli)细胞的感受态菌株，其已藉由含有真核启动子介导的转录系统的质体载体转化。较佳地，用于诱导该等发夹型RNA的真核启动子介导的转录的条件为细菌培养条件，诸如在添加化学诱导剂的情况下在37℃下的鲁利亚-贝尔塔尼(LB)培养液。
【图式简单说明】
仅出于说明目的且非限制地尤其参看图式，说明：
图1A及图1B显示真核启动子驱动的表达载体组合物(1A)及其关于原核生物中的RNA转录物及/或蛋白质产生的表达机制(1B)。为展现本发明，新pLenti-EF1α-RGFP-miR302载体(图1A)充当在MOPS、甘油及/或乙醇刺激下转化大肠杆菌DH5α感受态细胞以产生RGFP蛋白质以及miR-302及其前驱体(pre-miR-302)的实例组合物。pLenti-EF1α-RGFP-miR302为经本发明人设计以含有编码经修饰红色萤光蛋白(RGFP)基因的5'-UTR区中的miR-302家族簇序列(SEQ.ID.NO.5)的基因表达盒的慢病毒质体载体。pLenti-EF1α-RGFP-miR302的设计适用于表达原核生物及真核生物中的多种多样的微RNA、shRNA及siRNA的前驱体。根据所揭示的机制(1B)，一般熟习此项技术者易于使用任何微RNA/shRNA/siRNA代替miR-302来诱导本发明所描述的真核启动子介导的基因表达。黑色箭头指示原核及真核细胞中存在的路径，而空白箭头指示仅存在于真核细胞中的步骤。
图2描绘用(左侧)或不用(右侧)0.1％(v/v)MOPS及0.05％(v/v)甘油的混合物处理的细菌培养液的结果。大肠杆菌感受态细胞已在化学诱导剂处理的前经pLenti-EF1α-RGFP-miR302转化。
图3显示在用0.1％(v/v)MOPS处理的后的不同细菌团粒的结果。大肠杆菌感受态细胞已在MOPS处理之前经pLVX-Grn-miR302+367(绿色)或pLenti-EF1α-RGFP-miR302(红色)转化。
图4显示各种化学诱导剂在大肠杆菌感受态细胞中诱导Pol-2启动子驱动的基因表达的可诱导性。在所有测试的化学品中，前三种最强力诱导剂为MOPS、甘油及乙醇。所用化学品浓度可介于约0.001％至4％、最佳0.01％至1％范围内。
图5显示分别由MOPS、甘油及乙醇诱导的红色RGFP蛋白质表达的蛋白质印迹法结果。细菌RuvB蛋白质用作管家标准以标准化所侦测的RGFP表达。自空白大肠杆菌细胞提取(亦即未经载体转化)的蛋白质用作阴性对照。
图6显示分别由MOPS、甘油及乙醇诱导的miR-302家族簇(约700nt)及其衍生前驱体(具有1至4个发夹的pre-miR-302)的表达的RNA印迹法结果。自空白大肠杆菌细胞提取的RNA用作阴性对照。
图7显示使用自细菌感受态细胞提取物(BE)分离的miR-302及/或pre-miR-302的iPSC生成，其藉由如图6中所示的RNA印迹分析证实。如所报导，miR-302重新编程iPSC(或称为mirPSC)形成球样细胞集落且表达强Oct4作为标准hESC标记物。
图8显示由自细菌感受态细胞提取物(BE)分离的miR-302及/或pre-miR-302诱导的Oct4及Sox2基因启动子的全DNA脱甲基，其藉由如图6中所示的RNA印迹分析证实。如Simonsson及Gurdon(Nat Cell Biol.6,984-990,2004)所论证，全DNA脱甲基及Oct4表达两种迹象皆为体细胞重新编程以形成iPSC所需。
图9显示人类肝癌细胞株HepG2响应于miR-302转染的活体外致肿瘤性检定。在miR-302转染之后获得的细胞标记为mirPS-HepG2，指示其癌细胞特性变至诱导多能干细胞(iPSC)样状态。比较miR-302转染前后的形态及细胞周期速率的变化。藉由对细胞形态的流式细胞量测术分析的峰图表(n＝3，p<0.01)展示对应于细胞周期阶段的各细胞DNA含量。
图10A及10B显示使用合成标准uDNA(来自Sigma-Genosys)及自pLenti-EF1α-RGFP-miR302转化的大肠杆菌细胞分离的新鲜提取的pro-miR-302的HPLC纯化及分析的结果。标准uDNA经设计以等于呈以下形式的天然pre-miR-302a：5'-CCACCACUUA AACGUGGAUGUACUUGCUUU GAAACUAAAG AAGUAAGUGC UUCCAUGUUU UGGUGAUGG-3'(SEQ.ID.NO.4)。
图11A及11B显示使用自空白大肠杆菌感受态细胞或pLenti-EF1α-RGFP-miR302(RGFP-miR302)转染细胞提取的小RNA的微RNA(miRNA)微阵列分析的结果。所提取的小RNA如图10B的绿色标记区域中所示藉由HPLC进一步纯化。图11A显示，来自空白大肠杆菌细胞的RNA几乎不呈现微RNA(绿色点意谓在统计学上不显著，而红色点指示阳性结果)。此是因为原核生物不具有微RNA表达及加工所需的若干必需酶，诸如Pol-2、Drosha及RNase IIIDicer。此外，原核RNA聚合酶不会高效地转录具有高二级结构的小RNA，诸如发夹型pre-miRNA及shRNA。因此，仅使用本发明，发明人可刺激特定微RNA(诸如miR-302a、a*、b、b*、c、c*、d及d*，如图11B中所示)于原核细胞中的表达。因为原核细胞不具有Dicer，所以所有微RNA保持呈其前驱体构形，诸如pri-miRNA(4发夹的簇)及/或pre-miRNA(1发夹的前驱体)。综合而言，图10B及11B的结果已确定两个事实：(1)自RGFP-miR302转染细胞提取的小RNA主要含有纯miR-302前驱体，及(2)大肠杆菌感受态细胞中几乎不存在其他种类的微RNA污染。
图12显示自空白大肠杆菌感受态细胞(第1组，如图11A中所示)或pLenti-EF1α-RGFP-miR302转染细胞(第2组，如图11B中所示)提取的经表达微RNA的清单。小于500的信号在统计学上不显著(如图11A及11B中的绿色所示)，其可能由低复本数表达或高背景造成。
图13A及图13B显示miR-302家族簇(家族)(13A，SEQ.ID.NO.13，其中pro-miR-302a、pro-miR-302b、pro-miR-302c及pro-miR-302d的序列加底线)及个别pro-miR-302a(SEQ.ID.NO.6)、pro-miR-302b(SEQ.ID.NO.7)、pro-miR-302c(SEQ.ID.NO.8)及pro-miR-302d(SEQ.ID。NO.9)序列(13B)的测序结果。在转录之后，miR-302家族簇(＝pri-miR-302)的序列为 而pro-miR-302a、pro-miR-302b、pro-miR-302c及pro-miR-302d的个别序列分别如下： 及
图14显示使用pro-miR-302作为注射药物处理SCID-灰棕色裸小鼠中的人类肝癌异种移植物的预试验新药(pre-IND)试验的活体内治疗结果。在三次处理(每周一次)之后，pro-miR-302药物(＝pre-miR-302)成功地将癌症大小自728±328mm3(未经处理的空白对照，C)减小至75±15mm3(经pro-miR-302处理，T)，指示平均癌症大小减小约90％比率！合成siRNA模拟物(siRNA-302)处理中未发现显著治疗效果。进一步组织学检查(最右图)发现，正常肝小叶样结构(由黑色箭头指出的圆圈)仅于经pro-miR-302处理的癌症中形成但不于其他处理或对照中形成，表明重新编程机制可发生以将恶性癌细胞特性重置回相对正常样状态(称为「癌症逆转」)。
图15显示活体内正常肝组织与经pro-miR-302处理的人类肝癌异种移植物之间的组织学类似性。在三次处理(每周一次)之后，pro-miR-302药物成功地将高级(IV级)人类肝癌移植物重新编程至更良性低级(低于II级)状态。类似于正常肝组织(顶图)，经处理的癌症移植物可形成含有中央静脉(CV)样及门脉三联管(PT)样结构(由黑色箭头指示)的经典肝小叶。因为癌细胞通常比正常肝细胞酸性更大，所以苏木精与曙红(H&E)染色的结果展示癌细胞中更多紫色而正常肝细胞中更多红色。
图16显示SCID-灰棕色裸小鼠中未经处理、经siRNA处理、经pro-miR-302处理的人类肝癌移植物及正常肝组织之间的病理组织学比较。在未经处理的情况下(顶图)，移植的人类肝癌侵袭性侵入至正常组织(诸如肌肉及血管)中且形成大规模细胞-细胞及癌症-组织融合结构，指示其恶性及高转移。siRNA模拟物(siRNA-302)处理不显著降低移植的癌症的恶性(中上图)，可能归因于siRNA的短半衰期。相比之下，pro-miR-302处理不仅将移植的癌症重新编程至相对正常样形态(无融合)，且亦极大地抑制癌症侵入至周围组织中(中下图)。与正常肝组织(底图)相比，经pro-miR-302处理的癌症形成正常样小叶结构、腺样细胞配置以及细胞-细胞及癌症-组织接合处之间的清楚边界(黑色箭头)，表明此等经处理的癌症已降级至极良性状态。
图17A及17B显示活体内未经处理(17A)及经miR-302处理(17B)的伤口之间的愈合结果的比较。将分离的miR-302分子(20-400μg/mL)与二-/三-胺酰化甘油(di-/tri-glycylglycerin)、递送试剂及抗生素软膏一起调配以形成候选药物，用于测试猪背皮肤上2cm×2cm大开放伤口的活体内处理(各组的n＝6)。在十(10)次处理之后，将愈合的伤口剥离且进一步制成组织切片用于在显微镜下进行组织学检查。资料显示，经miR-302处理的伤口中无可见疤痕或可见极小疤痕(无疤痕)(17B顶图，n＝6/6)，而几乎所有未经处理(仅经抗生素软膏处理)的伤口含有大疤痕(17A)。此外，显著大量CD34阳性成体干细胞扩增簇(经绿色萤光抗体标记)见于经miR-302处理的伤口中(17B底图，n＝6/6)，但未见于未经处理的对照伤口中(17A底图，n＝0/6)。此等结果表明，pre-miR-302能够诱导CD34阳性成体干细胞增殖及/或再生，以便增强组织修复及再生，对由人类退行性疾病(诸如阿兹海默氏症、帕金森氏症、骨质疏松症、糖尿病及癌症)造成的病变产生极有益的治疗效果。此类治疗效果亦可帮助将高级恶性癌症重新编程为低级良性或甚至正常样组织，一种称为「癌症逆转」或「癌症消退」的新颖机制。
图18分别显示使用pro-miR-302作为抗癌药以治疗正常肺上皮细胞株BEAS2B(左上图)、自肺癌患者CL1-0分离的癌性肺腺癌组织细胞(中上图)及自另一癌症患者A549分离的肺腺癌组织细胞(右上图)的剂量依赖性癌症疗法的结果，以及此等肺癌回应于50(左下图)及100(右下图)微克(μg)/mL的两种不同浓度的pro-miR-302治疗的剂量依赖性治疗结果。
图19A及19B显示使用软琼脂集落形成检定，调配pre-miR-302(F6)药物针对活体外恶性肺癌细胞生长的治疗效能。图19A展示F6对人类恶性肺癌A549细胞株的集落数及大小的抑制效应的条形图结果。图19B显示不同F6处理之前及之后平均癌症集落大小的照片，从左往右分别为：对照(用PBS处理的原始癌症)、F5(仅用基于甘胺酰甘油的调配物溶液处理)、F6-25(用25μg/mL F6处理)及F6-50(用50μg/mL F6处理)。
图20显示多种不同人类肺癌细胞株及类型，包括EGFR、p53及K-Ras致癌基因的突变类型中的若干驱动基因的突变状态(如不同癌细胞集落的图片中栏的左图上所示)。图20的中栏显示藉由源自未经任何治疗的四种不同人类肺癌细胞株(类型)的原始癌细胞形成的集落，而图片中栏的右图显示一次F6治疗(50μg/mL)对此等不同肺癌类型的集落形成的抑制效应，其中所得药物效能分类为四组：敏感组(平均集落大小减小>50％)、部分敏感组(减小25至50％)、部分耐药组(减小<25％)及耐药组(无效0％)。
图21A及21B显示使用称作F6的调配pro-miR-302(＝pre-miR-302)药物治疗小鼠的高度恶性及转移性人类肺癌植入物的第一动物试验性实验的治疗频率(21A)及影像摄取频率(21B)的时间表流程图。
图22A、22B及22C显示使用称作F6的调配pro-miR-302(＝pre-miR-302)药物治疗小鼠的高度恶性及转移性人类肺癌植入物的第一动物试验性实验的治疗结果。分别地，图22A展示小鼠的不同治疗及对照组中发现的肺癌结节的数目，且图22B显示治疗组及对照组中发现的所有肺癌组织的代表性照片。图22C显示典型肺腺癌结构(圈出且藉由黑色箭头指出)的组织学检查结果。
图23A及23B显示使用调配pre-miR-302(F6)药物治疗小鼠的高度恶性及转移性人类NSCLC植入物的第二动物试验性实验的治疗频率(23A)及影像摄取频率(23B)的时间表流程图。
图24A、24B及24C显示使用调配pre-miR-302(F6)药物治疗小鼠的高度恶性及转移性人类NSCLC的药物治疗频率相比于第一动物试验降低的第二动物试验实验的治疗结果。分别地，图24A展示小鼠的不同治疗组及对照组中发现的肺癌结节的数目，且图24B显示治疗组及对照组中发现的所有肺癌组织的代表性照片。图24C显示淋巴细胞浸润，在F6治疗之后的植入肿瘤/癌症(圈出且藉由黑色箭头指出)中发生的典型抗癌免疫反应。
【实施方式】
在以下实验公开内容中，以下缩写适用：M(摩尔)；mM(毫摩尔)；μm(微摩尔)；mol(摩尔)；pmol(皮摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；℃(摄氏度)；RNA(核糖核酸)；DNA(去氧核糖核酸)；dNTP(三磷酸去氧核糖核苷酸)；PBS(磷酸盐缓冲盐水)；NaCl(氯化钠)；HEPES(N-2-羟基乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)；HBS(HEPES缓冲生理盐水)；SDS(十二烷基硫酸钠)Tris-HCl(参-羟基甲胺基甲烷-盐酸盐)；ATCC(美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville,MD)；hESC(人类胚胎干细胞)；及iPSC(诱导多能干细胞)。
实例
1.细菌细胞培养及化学处理
大肠杆菌DH5α感受态细胞以一部分的形式获自z-复制大肠杆菌转化套组(ZymoResearch,Irvine,CA)且接着藉由与5μg预制质体载体，诸如pLenti-EF1α-RGFP-miR302或pLVX-Grn-miR302+367混合而转化。未经转化的细胞通常在37℃下在以170rpm频繁搅拌的情况下于补充有10mM MgSO4及0.2mM葡萄糖的鲁利亚-贝尔塔尼(LB)培养液中生长，而经转化的细胞在另外补充有额外100μg/ml安比西林的上述LB培养液中培养。为进行化学诱导，将0.5至2ml的MOPS、甘油及/或乙醇分别或以组合形式添加至存在100μg/ml安比西林的补充有10mM MgSO4及0.2mM葡萄糖的1升LB培养液中。对于阴性对照，经转化的细胞在上述补充有安比西林的LB培养液中培养，但不添加任何化学诱导剂。结果显示于图2-4中。
2.人类细胞培养及微RNA转染
人类肝癌细胞株HepG2是获自ATCC且根据制造商的建议进行维持。为进行转染，将15μg pre-miR-302溶解于1ml新鲜RPMI培养基中且与50μl X-tremeGENE HP DNA转染剂(Roche,Indianapolis,IN)混合。在10分钟培育之后，将混合物添加至含有50％至60％融合度的HepG2的100mm细胞培养皿中。在12至18小时后更新培养基。在此等转染细胞形成球样iPSC集落之后，将培养基变为补充有20％基因敲除血清、1％MEM非必需胺基酸、100μMβ-巯基乙醇、1mM GlutaMax、1mM丙酮酸钠、10ng/ml bFGF、10ng/ml FGF-4、5ng/ml LIF、100IU/ml青霉素/100μg/ml链霉素、0.1μM A83-01及0.1μM丙戊酸(Stemgent,San Diego,CA)的基因敲除DMEM/F-12培养基(Invitrogen)，且在37℃下在5％CO2以下培养细胞。结果显示于图9中。
3.蛋白质提取及蛋白质印迹分析
遵循制造商的建议，细胞(106)经补充有蛋白酶抑制剂抗纤维蛋白溶酶肽(Leupeptin)、TLCK、TAME及PMSF的CelLytic-M溶解/提取试剂(Sigma)溶解。溶解物在4℃下在12,000rpm下离心20分钟且回收上清液。使用E-max微盘读取器(Molecular Devices,CA)上的经改良SOFTmax蛋白质检定套装来量测蛋白质浓度。将各30μg细胞溶解物在还原(+50mM DTT)及非还原(无DTT)条件下添加至SDS-PAGE样品缓冲液，且煮沸3分钟，随后负载至6至8％聚丙烯酰胺凝胶上。藉由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分解蛋白质，电转染至硝化纤维素膜上且在室温下在Odyssey阻断试剂(Li-Cor Biosciences,Lincoln,NB)中培育2小时。接着，将一级抗体施加至试剂且在4℃下培育混合物。一级抗体包括Oct3/4(SantaCruz Biotechnology,Santa Cruz,CA)、RuvB(Santa Cruz)及RGFP(Clontech)。在隔夜之后，膜用TBS-T冲洗三次且接着在室温下将山羊抗小鼠IgG结合二级抗体暴露于AlexaFluor 680反应性染料(1:2,000；Invitrogen-Molecular Probes)1小时。在三次额外TBS-冲洗之后，使用Li-Cor Odyssey Infrared Imager及Odyssey软体v.10(Li-Cor)进行免疫印迹的萤光扫描及影像分析。结果显示于图5中。
4.RNA提取及RNA印迹分析
总RNA(10μg)经mirVanaTMmiRNA分离套组(Ambion,Austin,TX)分离，藉由15％TBE-脲聚丙烯酰胺凝胶或3.5％低熔点琼脂糖凝胶电泳分级，且电转染至耐纶膜上。藉由[LNA]-DNA探针(5'-[TCACTGAAAC]ATGGAAGCAC TTA-3')(SEQ.ID.NO.10)探针进行miR-302及相关pre-miR-302的侦测。探针已藉由高效液相层析(HPLC)纯化且在[32P]-dATP(＞3000Ci/mM，Amersham International,Arlington Heights,IL)存在下经末端转移酶(20单位)进行尾端标记20分钟。结果显示于图6中。
5.质体扩增及质体DNA/总RNA提取
转化之后的大肠杆菌DH5α感受态细胞(来自实例1)在37℃下在以170rpm频繁搅拌的情况下于补充有10mM MgSO4及0.2mM葡萄糖的LB培养液中培养。为诱导真核启动子驱动的RNA转录，将0.5至2ml MOPS、甘油及/或乙醇添加至每1升LB培养液中以传播经转化的细胞隔夜。使用HiSpeed质体纯化套组(Qiagen,Valencia,CA)，遵循制造商的方案，但伴以不向P1缓冲液中添加RNA酶A的小改动而分离经转化的细胞中的扩增的质体DNA及表达的mRNA/微RNA。此后，将含有质体及mRNA/微RNA的最终提取产物溶解于DEPC处理的ddH2O中且在使用前储存于-80℃下。为了仅纯化扩增的质体载体，将RNA酶A添加至P1缓冲液中且遵循制造商的方案进行提取程序。
6.微RNA及pre-miRNA分离/纯化
为了纯化微RNA及pre-miRNA，使用mirVanaTMmiRNA分离套组(Ambion,Austin,TX)，遵循制造商的方案进一步提取自实例5分离的总RNA。将由此获得的最终产物溶解于DEPC处理的ddH2O中且在使用前储存于-80℃下。由于细菌RNA极快速(在几小时内)地天然降解，而真核发夹型微RNA前驱体(pre-miRNA及pri-miRNA)在4℃下在很大程度上保持稳定(半衰期至多3-4天)，发明人可使用此半衰期差异来获取相对纯的pri-/pre-miRNA用于其他应用。举例而言，由此获得的pre-miR-302可用于将体细胞重新编程为hESC类iPSC，如图9中所示。
7.免疫染色检定
如先前报导地对组织样品进行包埋、切片及免疫染色(Lin等人,2008)。一级抗体包括Oct4(Santa Cruz)及RGFP(Clontech,Palo Alto,CA)。萤光染料标记的山羊抗兔或马抗小鼠抗体用作二级抗体(Invitrogen-Molecular Probes,Carlsbad,CA)。在具有Metamorph imaging程序(Nikon)的萤光80i微观定量系统下以100×或200×放大率检查及分析阳性结果。结果显示于图7中。
8.亚硫酸氢盐DNA定序
使用DNA分离套组(Roche)自约2,000,000个细胞分离基因组DNA且遵循销售商的建议，另外用亚硫酸氢盐(CpGenome DNA修饰套组，Chemicon,Temecula,CA)处理1μg经分离DNA。亚硫酸氢盐处理将所有未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶仍保持为胞嘧啶。对于亚硫酸氢盐DNA定序，发明人藉由以下PCR引子扩增Oct4基因的启动子区：5'-GAGGCTGGAG CAGAAGGATT GCTTTGG-3'(SEQ.ID.NO.11)及5'-CCCTCCTGAC CCATCACCTCCACCACC-3'(SEQ.ID.NO.12)。对于PCR，亚硫酸氢盐修饰的DNA(50ng)与引子(总共100pmol)在1×PCR缓冲液中混合，加热至94℃后维持2分钟，且紧接着在冰上冷却。随后，如下进行25个PCR循环：94℃维持1分钟及70℃维持3分钟，使用Expand High Fidelity PCR套组(Roche)。具有适当尺寸的PCR产物藉由3％琼脂糖凝胶电泳进一步分级，藉由凝胶提取过滤器(Qiagen)纯化，且接着用于DNA定序。此后，藉由比较经转化的DNA序列与未经转化的DNA序列中的不变胞嘧啶产生DNA甲基化位点的详细概况，如图8中所示。
9.DNA-密度流动式细胞测量术
使细胞胰蛋白酶化，球粒化且藉由在-20℃下再悬浮于1ml含预冷70％甲醇的PBS中1小时而固定。细胞经球粒化且用1ml PBS洗涤一次且接着再次球粒化且在37℃下再悬浮于1ml含1mg/ml碘化丙锭、0.5μg/ml RNA酶的PBS中30分钟。此后，在BD FACSCalibur(SanJose,CA)上分析约15,000个细胞。藉由绘制相对于脉冲面积的脉冲宽度且在单细胞上闸控而排除细胞二重峰。使用套装软体Flowjo，使用「沃森实用(Watson Pragmatic)」算法分析收集的资料。结果显示于图9的顶图中。
10.微RNA(miRNA)微阵列分析
在约70％融合度下，使用mirVanaTMmiRNA分离套组(Ambion)分离来自各细胞培养物的小RNA。使用1％甲醛-琼脂糖凝胶电泳及分光光度计量测(Bio-Rad)评估经分离的小RNA的纯度及数量，且紧接着在干冰中冷冻且提交至LC Sciences(San Diego,CA)用于miRNA微阵列分析。各微阵列晶片经杂交，经Cy3或Cy5标记的单一样品或分别经Cy3及Cy5标记的一对样品。根据制造商的建议进行背景减除及标准化。对于双样品检定，进行p值计算且产生大于3倍的差异表达转录物的清单(黄色-红色信号)。最终微阵列结果显示于图11A及11B中，且差异表达微RNA的清单显示于图12中，其比较自空白大肠杆菌细胞溶解物(第1组)提取的小RNA与自pLenti-EF1α-RGFP-miR302转化的细胞溶解物(第2组)提取的彼等小RNA。
11.活体内肝癌疗法试验
将人类肝癌异种移植至免疫功能不全SCID-灰棕色小鼠中为研究肝癌转移及疗法的有效动物模型。为建立此模型，发明人混合5百万个人类肝癌(HepG2)细胞与100μL基质凝胶且将混合物分别皮下移植至小鼠后肢的各侧腹中。因此，小鼠后肢两侧经受大致相同量的癌细胞移植。在移植后约两周观测癌症且平均尺寸为约15.6±8mm3(治疗之前的起始癌症尺寸)。对于各小鼠，发明人选择具有较大癌症的一侧作为治疗组且较小的另一侧作为对照组。由于相同小鼠在一侧用空白调配物试剂(阴性对照)且在另一侧用调配药物(pro-miR-302)治疗，由此获得的结果可使由个体差异所致的任何可能的变化最小化。
为了将pro-miR-302活体内递送至目标癌症区域中，发明人与专业调配物公司Latitude(San Diego,CA)订约将pro-miR-302脂质体囊封至160至200nm直径纳米粒子中。经测试，此等含pro-miR-302的纳米粒子在室温下持续超过两周，且在4℃下持续超过一个月保持几乎100％稳定，而其他合成siRNA模拟物(siRNA-302)全部在相同条件下在3至5天内快速降解超过50％，指示pro-miRNA而非siRNA足够稳定地用作疗法药物。对于毒性检定，发明人分别另外最大限度地注射300μL调配pro-miR-302(1mg/mL)至小鼠尾端静脉(n＝8)中，且在六个月内在所有测试小鼠中未观测到可侦测副作用。一般而言，未经修饰的核糖核酸相对无免疫原性且可容易地经组织细胞代谢，使得成为活体内疗法的安全工具。
为测试药物效能，发明人分别在小鼠的一侧皮下注射200μL调配pro-miR-302且在另一侧皮下注射200μL空白调配物试剂，且继续相同注射模式三次(每周注射一次)。将药物及试剂施加至癌症部位的周围区域且由癌症及其周围组织在18小时内吸收。在第三次注射之后的一周收集样品。移除心脏、肝、肾及移植肿瘤用于进一步组织学检查。藉由触诊监测肿瘤形成且使用式(长度×宽度2)/2计算肿瘤体积。对肿瘤病变进行计数、解剖、称重且使用H&E及免疫染色检定进行组织学检查。组织学检查显示心脏、肝及肾中无可侦测组织病变。结果显示于图14、15及16中。
12.活体内创伤愈合试验
在此状况下，甘胺酰甘油囊封的pre-miR-302藉由基于乳膏的抗生素软膏调配以用于活体内治疗。由于miR-302为人类ESC及iPSC中的最丰富ESC特异性miRNA物种，发明人提出miR-302的体细胞重新编程功能可能亦能够诱导及/或维持成体干细胞再生，以促进活体内组织修复及再生过程。为了测试此理论，由解剖刀解剖产生猪皮创伤且尺寸为大致二平方公分(2cm2)。将具有或不具有pre-miR-302(5mg/mL)的预制备软膏(0.5mL)分别均匀涂覆于伤口上，且覆盖整个受伤区域，且接着另外藉由液体绷带密封。在第0、1、2、3、4、5、7、9、11、14及17天施加治疗。在第0、1、2、3、4、5、7、9、11、14、17及20天藉由Sony DSC-H9相机拍摄各伤口的照片。使用Image Pro Plus 7.0成像软体测定各时间点处的各伤口的面积。根据下式计算各治疗时间点处的伤口愈合或闭合的百分比：(第0天伤口面积-第N天伤口面积)/第0天伤口面积×100。最终，自各伤口收集组织样品且浸泡于10％(v/v)福马林溶液中，随后用于制备H&E染色组织学切片。此动物试验的结果展示相比于其他miR-434治疗及空白对照，miR-302治疗显著增强伤口愈合速度，快两倍以上。此外，在治疗之后十七(17)天，miR-302治疗的伤口区域留下较少或几乎无疤痕(n＝6/6)，而其他治疗及对照导致相对较大疤痕。为了进一步量测皮肤中的miRNA穿透率，发明人已自新愈合组织的活检体分离总RNA且接着藉由一组miR-302a特异性引子运作定量反转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)检定以确认甘胺酰甘油囊封的pre-miR-302成功地在治疗组织中活体内递送且加工为成熟miR-302。
13.活体外肺癌针对药物的敏感性测试
甘胺酰甘油囊封的pre-miR-302/pro-miRNA药物(或称作配方#6；F6)对不同肺癌细胞类型的生长的剂量依赖性肿瘤抑制效应使用在0至200μg/mL范围内，较佳在25至100μg/mL之间的各种pre-miR-302浓度测试(图18)。为了进一步测试F6药物针对恶性肺癌细胞生长的效能，进行软琼脂集落形成检定，如图19A及19B中所示。发现典型人类恶性肺癌细胞株A549的生长及集落形成能力均在一次F6治疗(25或50μg/mL)之后经显著抑制，尤其在大型集落(直径≥200μm)的群体中。另外，图20进一步展示若干驱动致癌基因于多种不同人类肺癌细胞类型中的突变状态，包括突变EGFR、p53及K-Ras致癌基因的状态。图20的中栏显示由未经任何治疗的四种不同人类恶性/转移性肺癌细胞株(类型)的原始癌细胞形成的癌症集落的图片，而中栏右侧的图显示一次F6治疗(50μg/mL)对此等肺癌类型的集落形成的抑制效应，其中此等癌细胞类型中的所得药物效能分类为四组：敏感组(平均集落大小减小>50％)、部分敏感组(减小25至50％)、部分耐药组(减小<25％)及耐药组(0％)。
14.活体内肺癌疗法试验
在理解发明人的调配pre-miR-302药物(F6)对不同人类肺癌细胞类型的效能之后，发明人另外使用原位肺癌小鼠模型分析其活体内治疗效能。图21A及21B显示用于活体内生物成像系统(IVIS)的F6治疗频率及影像摄取频率的时间表流程图。对于原位肿瘤植入检定，将A549-Luci肺癌细胞(20μl含有10ng基质胶的PBS中的1×105个细胞)注射至6周龄NOD SCID小鼠(治疗组中n＝9且对照组中n＝3)的胸腔中。藉由萤光素酶影像观测的生物成像研究指示此等植入小鼠在植入之后四(4)周产生许多肺癌转移结节。此后，小鼠经由尾端静脉注射每周用F6治疗两次，直至杀死(图21A)。在植入后第14天，将小鼠分成三组：标准生理盐水(NS)，及50或100μg/mL F6治疗组，如IVIS的成像结果(图21B)中所示。基于体重与总血容量的比计算所用F6溶液的体积以在相同测试小鼠组中保持相同F6治疗浓度。每周观测及量测萤光素酶信号一次。最后，在第一次F6治疗之后42天杀死小鼠。收集诸如肺、肝、脾及肾的主要器官且藉由10％福马林固定，且接着使用肉眼及微观镜检查来计数所得肺结节。用于实验的小鼠的数目是基于在P＜0.05处，具有98％侦测到结节数目的2倍组间差异的能力的目标。
在使用活体内原位肺癌检定的动物试验(图22A-22C)中，发明人将肺癌细胞注射于各测试小鼠的左胸腔中以观测肺间癌转移。结果，发现于右叶中的癌结节指示肺癌自左叶中的原发癌植入侧转移。图22A展示不同实验及对照组中的肺癌结节的数目，且图22B显示代表性照片。在图22A中，黑色条说明左叶中发现的结节，且白色条显示右叶中发现的结节。作为图22A及22B中示出的结果，两个治疗组(50及100μg/ml)中的结节数目在肺左叶及右叶中均显著减少。亦进行进一步的组织学检查(图22C)以观测所有组中的典型肺腺癌结构(圈出且藉由黑色箭头指出)。
为了进一步评估F6药物对转移性肺腺癌的强治疗效果，发明人降低活体内原位肺癌模型(对于两个治疗组，n＝11，且对于对照组，n＝5)中的F6溶液的治疗频率。如图23A及23B中所示，在此重复动物试验中，小鼠如下地用F6治疗：在第3周及第4周期间每周经由尾端静脉注射两次且接着在第5周之后每周注射一次，直到杀死。基于体重与总血容量之比计算F6的施用剂量以在所有测试小鼠中保持相同F6治疗浓度。每周观测及量测萤光素酶信号一次。最后，在治疗后第42天杀死小鼠。为了评估pre-miR-302药物的急性毒性效应，一个测试组的小鼠仅在第3周及第4周期间用F6治疗四次，将其标记为50(4)组(图23B)。此外，发明人亦测试仅甘胺酰甘油配方于此活体内小鼠模型中的毒性以排除递送调配物药剂(F5)的任何可能的毒性干扰，该递送调配物药剂实际上对癌细胞既不呈现毒性亦不呈现任何显著效应。
15.统计分析
免疫染色、蛋白质印迹法及RNA印迹法分析中任何超过75％的信号强度变化视为阳性结果，其转而经分析且呈现为平均值±SE。藉由单向方差分析(one-way ANOVA)进行资料的统计分析。当主效应显著时，邓尼特事后测试(Dunnett's post-hoc test)用于识别与对照显著不同的组。为在两个治疗组之间进行成对比较，使用双尾学生t测试(two-tailedstudent t test)。对于涉及超过两个治疗组的实验，进行方差分析，接着进行事后多范围测试。p<0.05的概率值视为显著。所有p值测定自双尾测试。
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16.Lin的美国专利申请案第12/318,806号。
17.Lin的美国专利申请案第13/572,263号。

Claims (20)

1.一种使用重组发夹型微RNA前驱体(pre-miRNA)来治疗人类肺癌的方法，其包含：
(a)提供含有SEQ.ID.NO.3的至少一个发夹型pre-miRNA；及
(b)将(a)的该pre-miRNA与含有至少一个人类肺癌细胞的癌症个体接触，以在(b)的该癌症个体的该肺癌细胞上激活(a)的该pre-miRNA的抗癌效果。
2.如权利要求1所述的方法，其中含有SEQ.ID.NO.3的该pre-miRNA为SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8或SEQ.ID.NO.9、或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其中含有SEQ.ID.NO.3的该pre-miRNA为miR-302a、miR-302b、miR-302c或miR-302d的前驱体、或其组合。
4.如权利要求1所述的方法，其中含有SEQ.ID.NO.3的该pre-miRNA进一步在人类肺癌细胞中被处理为miR-302a、miR-302b、miR-302c或miR-302d、或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其中该pre-miRNA由原核细胞中的真核启动子驱动的RNA转录产生。
6.如权利要求5所述的方法，其中诱导该真核启动子驱动的RNA转录所需的DNA序列为位于质体载体中的基因表达盒。
7.如权利要求6所述的方法，其中该基因表达盒编码SEQ.ID.NO.5的序列。
8.如权利要求6所述的方法，其中该质体载体为含有巨细胞病毒CMV启动子或哺乳动物EF1α启动子或两者的pLenti-EF1α-RGFP-miR302载体。
9.如权利要求5所述的方法，其中该真核启动子驱动的RNA转录是藉由使含有3-(N-吗啉基)丙烷-1-磺酸(MOPS)的化学剂与携有至少一个基因表达盒的至少一个转化原核细胞接触而诱导，该至少一个基因表达盒编码SEQ.ID.NO.6、SEQ.ID.NO.7、SEQ.ID.NO.8或SEQ.ID.NO.9的序列、或其组合。
10.如权利要求1所述的方法，其中该肺癌为肺腺癌。
11.如权利要求1所述的方法，其中该肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)。
12.如权利要求1所述的方法，其中该pre-miRNA用于作为医药及治疗应用中药物成分的一部分。
13.如权利要求1所述的方法，其中该pre-miRNA适用于活体内治疗该人类肺癌。
14.如权利要求13所述的方法，其中该pre-miRNA的该治疗抑制癌细胞生长。
15.如权利要求13所述的方法，其中该pre-miRNA的该治疗抑制癌细胞的集落及结节形成。
16.如权利要求13所述的方法，其中该pre-miRNA的该治疗抑制癌转移。
17.如权利要求13所述的方法，其中该pre-miRNA的该治疗预防癌细胞的耐药性。
18.如权利要求13所述的方法，其中该pre-miRNA的该治疗刺激针对癌细胞生长的免疫系统反应。
19.如权利要求13所述的方法，其中该pre-miRNA的该治疗增强癌症受损组织区域中的正常组织修复。
20.如权利要求1所述的方法，其中该抗癌效果包括抑制肺癌细胞生长、抑制癌结节形成、抑制癌转移、预防耐药性、增加免疫系统反应及增强癌症受损组织区域中的正常组织修复。
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