WO2018068893A1 - Synthese und struktur chemisch schaltbarer fluoreszenzsonden auf der basis von aminosäuren - Google Patents

Synthese und struktur chemisch schaltbarer fluoreszenzsonden auf der basis von aminosäuren Download PDF

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WO2018068893A1
WO2018068893A1 PCT/EP2017/001198 EP2017001198W WO2018068893A1 WO 2018068893 A1 WO2018068893 A1 WO 2018068893A1 EP 2017001198 W EP2017001198 W EP 2017001198W WO 2018068893 A1 WO2018068893 A1 WO 2018068893A1
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fluorescence
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compound
metal ion
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PCT/EP2017/001198
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Dirk-Peter Herten
Dominik Brox
Andreas Haderspeck
Thorben Marcel CORDES
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Universität Heidelberg
Rijksuniversiteit Groningen
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    • C09B11/10—Amino derivatives of triarylmethanes
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH

Definitions

  • the present invention relates to a compound comprising at least one chelating group, at least one linker and at least one fluorophore, and methods for increasing the resolution in fluorescence microscopy, for multiplexing in fluorescence microscopy, and for the quantitative detection of metal ions using this compound.
  • high-resolution single-molecule localization microscopy usually uses light-driven, ie photophysical processes, which are controlled by irradiating an additional wavelength or increasing the irradiation power.
  • the most important processes are photoactivation, as in Photo Activation Localization Microscopy (PALM), or reversible photoactivation / deactivation, as in Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM).
  • PAM Photo Activation Localization Microscopy
  • STORM Stochastic Optical Reconstruction Microscopy
  • the activation of the fluorescent probes is also achieved thermally (direct STORM-dSTORM), e.g. by adding buffers containing reducing and oxidizing agents and driving the dye out of the off-state (i.e., inactive state) back to the on-state (i.e., active state).
  • proteins are modified with an antigen-binding site that can reversibly bind the dye malachite green.
  • the fluorescence emission of the dye is suppressed in aqueous solution due to the rapid diffusion and the flexibility of its structure and only becomes visible when it binds to the binding site.
  • the use of reversible binding for high-resolution single molecule localization microscopy has been demonstrated experimentally.
  • a method that fluorescence-based on transient binding works. labeled oligonucleotides based (DNA-Paint).
  • the target proteins are labeled with short oligonucleotides and the fluorescently labeled complementary strands are added. If a labeled complementary strand hybridizes to an oligonucleotide, an on-state is reached while the freely diffusing oligonucleotides only contribute to background fluorescence.
  • probes use the rearrangement of a specific fluorescent dye to a spirocyclic compound that has no fluorescence.
  • cyclization at neutral pH is reversible and suitable for imaging with high-resolution single-molecule localization microscopy.
  • the disadvantage of conventional high-resolution microscopy lies in the photophysical processes which require additional light sources and / or higher irradiation powers. This results in higher technical requirements:
  • the irradiation intensities must be optimized so far that the switching kinetics of the fluorescence probes is in the correct range and at the same time the photon yield should be maximized in order to increase the localization accuracy and thus the achieved resolution of the image as much as possible.
  • the additional excitation lines lie in the blue or ultraviolet spectral range and cause photo damage to the samples, which can lead to the fixation of the living cells.
  • multiplexing ie, parallel detection / imaging channels
  • Fluorescence microscopy is most commonly used for spectral multiplexing based on different excitation and detection wavelengths.
  • the importance of the fluorescence lifetime ie the lifetime of the excited state, is increasing more and more.
  • Other properties such as polarization anisotropy, are of secondary importance.
  • spectral multiplexing different excitation wavelengths are used, so that different light sources, especially lasers, are needed.
  • the light emitted by the sample is transmitted by means of dichroic beamsplitters or prisms Detection arms divided with different wavelength ranges.
  • crosstalk Due to the imperfection of beam splitters and filters and because of the wide excitation and emission spectra of the dyes, however, there is always a crosstalk in the other detection channels (crosstalk), which can only be corrected later by calibration. In order to be able to superimpose images of different wavelengths, they first have to be corrected for chromatic aberrations. With spectral multiplexing, you can currently reach up to five different channels. The multiplexing based on the fluorescence lifetime may be at the same excitation and emission wavelength - but requires either pulsed or intensity modulated excitation sources (mostly lasers) and a detection technique aligned to measure time periods on the pico- to nanosecond-time scale.
  • This object is achieved by the embodiments of the present invention characterized in the claims.
  • a compound comprising at least one chelating group, at least one linker and at least one fluorophore represented by the formula (1):
  • one of the groups R 1 and R 2 comprises at least one fluorophore and the other of the groups R 1 and R 2 comprises at least one linker;
  • R 3 is selected from a group consisting of H, a C 1 to C 3 alkyl group, a halogenated C 1 to C 3 alkyl group, a carboxy group, a carbonyl group, a
  • n is a natural number from 0 to 6;
  • X is a single bond or a substituent according to the formula (X-1);
  • Y is a chelating group of formula (Y-1) or formula (Y-2)
  • R 5 and R 6 may be independently of one another and R 5 and R 6 are independently selected from a group consisting of H, a C 1 to C 3 alkyl group, a halogenated C 1 to C 3 alkyl group, a carboxy group, a carbonyl group, a Amino group, a sulfonate group, a phosphate group, a hydroxy group and a halogen; and
  • R 7 and R 8 are independently selected from the group consisting of pyridyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, pyridizinyl, isoquinolinyl, imidazolyl, quinolyl, bis (phenantroline) yl, carboxy, carboxyester, and crown ethers -Rest, are selected.
  • the compound of the invention combines the three functions mentioned above: fluorophore, linker and chelating group.
  • a metal ion can be complexed, which influences the fluorescence of the fluorophore, which can either be activated or deactivated.
  • the complex formation of the compound of the invention with a metal ion depending on the choice of the metal ion and the fluorophore, an intramolecular activation or deactivation of the fluorescence.
  • the linker allows a direct, targeted labeling of a sample with the compound of the invention.
  • the binding of the metal ion changes the charge of the probe, which for example, to increase / decrease the affinity of specific and unspecific binding with other molecules.
  • the compound of the invention is also referred to as a "fluorescent probe".
  • one of the groups R 1 and R 2 comprises at least one fluorophore and the respectively other of the groups R and R 2 comprises at least one linker.
  • the group R 1 comprises at least one fluorophore
  • the group R 2 comprises at least one linker.
  • the group R 1 comprises at least one linker and the group R 2 comprises at least one fluorophore.
  • the term "fluorophore” is understood to mean a fluorescent compound which can absorb light energy of a specific wavelength and then emit light with a longer wavelength
  • the fluorophore used in the compound according to the invention is not subject to any particular restriction. consisting of derivatives of xanthene, acridine, cyanine, coumarin, rhodamine, silicon-rhodamine, carbopyrin, boronipyrromethene, perylene and oxazine, Oxazine, rhodamine and carbopyronine are preferred because of their good photophysical properties.
  • At least one fluorophore is present in the compound of the invention.
  • each fluorophore can be selected from the group defined above independently of the other fluorophores.
  • two fluorophores can be used, one of which can be influenced by one metal ion and the other of which is independent of this metal ion.
  • the metal ion-independent fluorophore can be used for a ratiometric quantitative analysis of the metal ion.
  • the compound of the present invention has exactly one fluorophore.
  • linker is not particularly limited and includes molecular fragments or functional groups coupling the compound of the present invention to at least one other compound or at least one functional group of a compound
  • the linker may be introduced into the compound according to the invention via amine reactions, thiol reactions, carboxylate reactions, hydroxy reactions, aldehyde or ketone reactions, reactions of active hydrogen, photochemical reactions or cycloadditions (see “Bioconjugation Techniques” by Greg T. Hermanson, 2nd Edition, Academic Press 2008).
  • the compounds or functional groups used in an amine reaction for providing linkers are not particularly limited and can be, for example, isothiocyanates, isocyanates, acylazides, NHS esters, sulfonyl chlorides, aldehydes, glyoxals, epoxides, oxiranes, carbonates, arylating agents, imido esters, carbodiimides, Anhydrides, fluorophenyl, Hydroxymethylphosphinderivate or guani- dinated amines.
  • Examples of functional groups or compounds with which a linker can be provided by a thiol reaction are haloacetyls, alkyl halide derivatives, maleimides, aziridines, acryloyl derivatives, arylating agents, thiol disulfide exchange agents, such as pyridyl disulfide, TNB thiol or disulfide reducing agents, or Vinylsulfonderivate.
  • a linker can be introduced into the compound according to the invention by means of a thiol reaction in the context of a dative metal-thiol bond, of native chemical ligation or of cisplatin modification of methionine and cysteine.
  • the functional groups or compounds used in a carboxylate reaction are not particularly limited for providing a linker and may be selected from diazoalkanes, diazoacetyl compounds, carbonyldiimidazoles or carbodiimides.
  • the functional groups or compounds used in a hydroxy reaction to provide linkers are not particularly limited and can be, for example, epoxides, oxiranes, carbonyldiimidazoles, N, N'-disuccinimidyl carbonates or N-hydroxysuccinimidyl chloroformates, halogenated hydrocarbons or isocyanates.
  • the linker may be introduced by hydroxy reaction by oxidation with periodate or enzymatic oxidation.
  • linkers provided by aldehyde or ketone reactions are also not particularly limited and can be provided by the reaction of hydrazine derivatives, Schiff base formation, reductive amination or Mannich condensation.
  • linker can be obtained, for example, by reactions of active hydrogen with diazonium derivatives or in the context of Mannich condensation or iodination reactions.
  • the linker can be provided, for example, by photochemical reactions of aryl azides and halogenated aryl azides, benzophenones, anthraquinones, diazo compounds, diazirine derivatives or psoralen compounds.
  • the linker can be obtained by using cycloaddition reactions, for example, a Diels-Alder reaction, complex formation with boronic acid derivatives, or click chemistry by Cu 1 promoted azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition can be used.
  • cycloaddition reactions for example, a Diels-Alder reaction, complex formation with boronic acid derivatives, or click chemistry by Cu 1 promoted azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition can be used.
  • the linker is selected from a group consisting of biotin, propargyl, tetrazine, methyl tetrazine, haloalkane (halo-tag ligand), benzylguanine (SNAP tag ligand) and derivatives thereof ,
  • at least one linker is present.
  • each linker from the group defined above can be selected independently of the other linkers.
  • the compound of the present invention has exactly one linker.
  • the sample which can be labeled with the linker of the compound of the present invention is not particularly limited.
  • it may be a protein or an antibody.
  • Linkage between the linker and the sample can be achieved via a covalent or a strong affinity binding, such as, for example, affinity binding.
  • the substituent R 3 is selected from a group consisting of H, a C 1 to C 3 alkyl group, a halogenated C 1 to C 3 alkyl group, a carboxy group, a carbonyl group, an amino group, a hydroxy group and a halogen.
  • R 3 is selected from H or a C 1 to C 3 alkyl group. According to a specific embodiment, R 3 is H.
  • n is a natural number of 0 to 6, for example, 1 to 4. According to a specific embodiment, n is 1 or 4.
  • the substituent X in the compound of the present invention is a single bond or a substituent according to the formula (X-1).
  • R 4 is selected from a group consisting of H, a C 1 to C 3 alkyl group, a halogenated C 1 to C 3 alkyl group, a carboxy group, a carbonyl group, an amino group, a hydroxy group and a halogen.
  • the choice of the substituent R 4 is due to the desired reactivity of the compound. For example, it is possible to use substituents which influence the electron density in the chelating group and thus influence the binding affinity, kinetics and specificity.
  • substituents include, for example, a carboxy group, a carbonyl group, a halogen or a halogenated Ci- to C3-alkyl group.
  • the choice of the substituent can influence the solubility of the fluorescent probe.
  • a carboxy group, an amino group or a hydroxy group can be selected if the fluorescence probe is to be dissolved in a polar solvent.
  • the substituent may be, for example, a C 1 to C 3 alkyl group.
  • substituents is possible which provide additional binding sites for metal ions and thus increase the denticity, such as a carboxy group or an amino group.
  • R 4 is selected from H or a C 1 to C 3 alkyl group. In a specific embodiment, R 4 is H.
  • chelating group means a polydentate ligand that occupies at least two coordination sites of a metal ion.
  • the compound having a metal ion to form a complex is preferred, K + , Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ , Ni 2+ , Fe 3+ , Mn 2+ and Co +
  • the position with which the compound of the invention forms a complex with a metal ion is not particularly limited as long as at least part of the chelating group forms a complex with the metal ion.
  • the Fluorescence of the fluorophore of the compound of the invention can be influenced, whereby this can be either activated or deactivated.
  • the complex formation of the compound with a metal ion depending on the choice of the metal ion and the fluorophore, an intramolecular activation or deactivation of the fluorescence.
  • Y is a chelating group of the formula (Y-1) or the formula (Y-2).
  • a plurality of R 5 and R 6 may independently exist and are independently selected from a group consisting of H, a C 1 to C 3 alkyl group, a halogenated C 1 to C 3 alkyl group, a carboxy group, a Carbonyl group, an amino group, a sulfonate group, a phosphate group, a hydroxy group and a halogen.
  • the choice of substituents R 5 and R 6 is due to the desired reactivity of the compound. For example, it is possible to use substituents which influence the electron density in the chelating group and thus influence the binding affinity, kinetics and specificity.
  • substituents include, for example, a carboxy group, a carbonyl group, a halogen or a halogenated Ci- to C3-alkyl group.
  • the choice of the substituent can influence the solubility of the fluorescent probe.
  • a carboxy group, an amino group, sulfonate group, phosphate group or a hydroxy group can be selected if the fluorescence probe is to be dissolved in a polar solvent.
  • the substituent may be, for example, a C 1 to C 3 alkyl group.
  • R 5 and R 6 are independently selected from H or a C 1 to C 3 alkyl group.
  • a complex having a metal ion can be formed either via one of the substituents R 5 and R 6 and / or via at least one of the nitrogen atoms of the bipyridyl ring.
  • the complexation takes place via the nitrogen atoms of the bipyridyl ring.
  • a complex formation is achieved by the substituents R 5 and R 6 to the metal ion.
  • Ca 2+ or Zn 2+ can be complexed by the compound according to the invention.
  • Y corresponds to the formula (Y-1-1).
  • Y has a structure of the formula (Y-1-1), n is 1, R 3 is H and X is a single bond, so that the compound of the present invention has a structure represented by the following formula (2):
  • R 7 and R 8 are independently selected from a group consisting of a pyridyl, pyrimidinyl, pyrazinyl, pyridizinyl , Isoquinolinyl, imidazolyl, quinolyl, bis (phenantroline) yl, carboxy, carboxyester, and crown ether radical or derivatives thereof.
  • the selection of R 7 and R 8 from the above-mentioned group is not limited insofar as the two substituents R 7 and R 8 can form a polydentate ligand.
  • R 7 and R 8 may be the same or different. According to a preferred embodiment of the invention, R 7 and R 8 are the same. Particularly preferably, R 7 and R 8 are each a pyridyl radical.
  • the chewing-forming group Y corresponds to the formula (Y-2-1).
  • Y is of the formula (Y-2-1), n is 1 or 4, R 3 is H and X is a single bond, so that the compound has a structure represented by the following formula (3) or (4) having:
  • the invention provides a complex comprising the aforementioned compound and at least one metal ion.
  • the metal ion is not particularly limited as long as it can form a complex with the chelating group of the compound of the present invention.
  • the bond between metal ion and chelating group should preferably be reversible. Such reversibility can lead to a fast turnaround. switch the fluorescent probe, which allows improved resolution in fluorescence microscopy.
  • the fluorescence probe can be subdivided on the basis of its fluorescence activity as follows: Turn-on probes are activated by the complex formation with the metal ion and turn-off probes are deactivated by the complex formation with the metal ion.
  • the rate constants for the disintegration of the complex of metal ion and fluorescent probe are not particularly limited as long as rapid turn-on and turn-off of the fluorescent probe is enabled.
  • the complex of a turn-off probe decomposes with a rate constant of kd ⁇ 20 s _1 , preferably of kd ⁇ 15 s and particularly preferably of kd ⁇ 10 s _1 .
  • the rate of association can be arbitrarily controlled or optimized by choosing the metal ion concentration, which depends on the properties of the particular probe.
  • An advantage of turn-on probes is that it is easier to control the proportion of probes turned off. Turn-off probes have the advantage that the circuit can only be done specifically by the metal complexation. In the case of turn-on probes, spontaneous thermally driven conformational changes can also result in a short-term switching to the fluorescent form.
  • the metal ion is selected from the group consisting of Na + , K + , Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ , Ni 2+ , Fe 3+ , Mn 2+ and Co 2+ .
  • the complexation of Na + , K ⁇ Mg 2+ , Ca 2+ and Zn + preferably leads to an activation, ie activation, of the fluorescent probe and the complexation of Cu 2+ , Ni 2+ , Fe 3+ , Mn 2+ and Co 2+ to turn off, ie deactivating, the fluorescent probe.
  • the metal ion is selected from Ca 2+ , Zn 2+ , Cu 2+ , Ni 2+ , Fe 3+ , Mn 2+ or Co 2+ .
  • the advantage of these metal ions is, inter alia, that they can form a stable complex with, for example, EDTA.
  • EDTA can thus be added to a solution containing the complex according to the present invention. so that the metal ion is removed from the complex and bound in an EDTA complex, thus enabling switching of the probe.
  • the fluorescent probe is activated by the metal ion, ie if it is in the "switched on” state, it is deactivated by the addition of a complexing agent, such as EDTA, ie "switched off", since the complexing agent can bind the metal ion.
  • a complexing agent such as EDTA, ie "switched off”
  • the fluorescence probe is deactivated by the metal ion, ie if it is in the "switched off” state, it is activated by the addition of a complexing agent, such as EDTA, ie "turned on”, since the complexing agent can bind the metal ion.
  • the metal ion is Cu 2+ , since this can deactivate the fluorescence of the compound according to the invention particularly efficiently.
  • the present invention provides a method of increasing resolution in fluorescence microscopy, comprising the steps of:
  • step (iii) adjusting reversible complex formation between a metal ion and the chelating group of the compound used in step (ii) by adjusting an appropriate metal ion concentration
  • turn-on is understood according to the invention as “activating” a fluorescent probe.
  • switching off means “deactivating” the fluorescent probe.
  • marking denotes a targeted binding of the fluorescent probe to the sample to be examined by means of the linker.
  • the sample to be examined is not particularly limited.
  • proteins or antibodies can be labeled with the compound of the invention.
  • the method according to a second aspect of the invention can be used, for example, for high resolution single molecule localization microscopy.
  • the fluorescent probe is used for selection of a suitable linker for the specific labeling of sample components, e.g. by covalent coupling to target structures, such as proteins.
  • a suitable linker for the specific labeling of sample components, e.g. by covalent coupling to target structures, such as proteins.
  • the sample can be placed on a microscope equipped with a low noise, imaging detector, e.g. a CCD or CMOS sensor, with which the point imaging functions of individual molecules can be imaged.
  • a low noise, imaging detector e.g. a CCD or CMOS sensor
  • step (iii) of the process the previously defined complex according to the invention is formed.
  • the metal ion concentration for example.
  • the Cu 2+ concentration adjusted so that the fluorescent probes are switched on and off by reversible reaction with the metal ions randomly, with the majority of the fluorescent probes is in the off state, so that the point mapping functions of the remaining Superimpose probes only slightly.
  • the metal ion concentration may be adjusted so that the plurality of probes are turned on. Then, it is possible to analyze the intensity fluctuations of the individual probes with a correlative method (SOFI - super-resolution fluctuation imaging), which in turn leads to higher-resolution microscopic images.
  • SOFI - super-resolution fluctuation imaging The principle of this switchability is shown in Figure 2 for an embodiment of the present invention.
  • steps (iv) to (vi) can be carried out, for example, according to previously published methods (cf., for example, M. Schwering et al., Angewandte Chemie International Edition, 2011, 50, 2940-2945) the fluorescence of the probes is excited at a suitable wavelength and the reversible switching of the individual fluorescence probes is recorded time-resolved in image stacks.
  • the individual point mapping functions are located by known high spatial precision algorithms and the data used to reconstruct a high resolution image.
  • the imaging mode plays no role in this method, so that any method established in high-resolution single-molecule localization microscopy can be used, starting with the simple imaging of a plane, such as in Totale Internal Reflection Fluorescence Microscopy (TIRFM) or light-sheet microscopy, or three-dimensional imaging techniques, such as dual-plane imaging, the astigmatism method, or the double-helix method, to name the most important examples.
  • TRFM Totale Internal Reflection Fluorescence Microscopy
  • light-sheet microscopy or three-dimensional imaging techniques, such as dual-plane imaging, the astigmatism method, or the double-helix method, to name the most important examples.
  • the switching process can be decoupled from the excitation because this process is controlled by the concentration of the metal ions. Therefore, the excitation can be optimized to maximize photon yield and / or compatibility with living cells.
  • the technical requirements for the microscopes are considerably lower than, for example, STORM or PALM, since only the excitation of the fluorescence probe and a suitable detector are required.
  • the present invention provides a method for multiplexing in fluorescence microscopy, comprising the steps:
  • the compound of the invention can be used as marker A first for the specific labeling of sample components, e.g. by covalent coupling to target structures such as proteins.
  • step (iii) of this method at least one other sample component is also labeled with a fluorescent marker B.
  • This marker B is not particularly limited. He can e.g. be equipped with the same or a spectrally similar fluorescent dye as the marker A, but which is switched via a different mechanism compared to the compound of the invention.
  • the labeling of the sample with this marker B can be achieved, for example, via a covalent bond.
  • the switching mechanism of marker B is not particularly limited and may be selected from photodestruction, activation of fluorescence by a metal ion, quenching of fluorescence by other reagents, or activation of fluorescence by other reagents.
  • the compound according to the invention as marker A, whose fluorescence can be adjusted chemically by adjusting the metal ion concentration, with the marker B whose fluorescence can be controlled by another mechanism, it is possible to increase the number of imaging channels in multiplexing.
  • the marking of the sample with the markers A and B can also be carried out in reverse order.
  • additional portions of the sample may be labeled with at least one further fluorescent marker whose fluorescence, as with marker B, can be controlled by a mechanism other than that of marker A.
  • This marker is subject to the same limitations as Marker B in terms of its properties.
  • step (iv) at least one image of the components labeled with the activated marker A or with the activated marker B is taken.
  • the marker A or the marker B may have been activated before the marking of the sample or activated when he already marks the sample.
  • the fluorescence activity or inactivity of the compound of the invention is controlled by the formation of the complex of the invention as defined above.
  • the metal ion concentration can be set so that all markers A are initially switched off and show no fluorescence while the markers B are turned on.
  • marker A may be activated first and marker B deactivated.
  • the fluorescence deactivation of marker B may be e.g. by photo destruction or by adding a suitable reagent.
  • step (v) After image acquisition in step (iv), deactivation of the activated marker and activation of the deactivated marker occur in step (v).
  • step (vi) with identical excitation and detection, at least one second image can be recorded in which the other marker is activated, in contrast to step (iv).
  • Advantages of the method according to the invention for multiplexing in fluorescence microscopy include the independence of this method from the excitation and the detection and the usability in any fluorescence microscope, even in high-resolution techniques, such as structured illumination microscopy (SIM) or stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy, which allows higher resolutions to be achieved.
  • high-resolution techniques such as structured illumination microscopy (SIM) or stimulated Emission Depletion (STED) Microscopy, which allows higher resolutions to be achieved.
  • Spectral multiplexing is virtually unrivaled in conventional fluorescence microscopy. However, implementation in STED microscopy is rather expensive. Here you can currently reach a maximum of three spectrally different channels.
  • An advantage of the fluorescent probes according to the invention is that they can be used in combination with the spectral multiplexing. For conventional fluorescence microscopes with up to five spectral channels, the serial imaging of up to ten channels is possible, if only one switching process with five different dyes is used. If additional switching processes are added (e.g., with other metal ions), then an increase of five more imaging channels can be made per switching process (one set of fluorescent probes with five different dyes).
  • the switchable fluorescent probes according to the invention can be used for the simple implementation of multiplexing.
  • the present invention provides a method for quantitatively detecting metal ions comprising the steps of:
  • step (iii) measuring fluorescence activity; and (iv) Determination of metal ion concentration due to the fluorescence activity measured in step (iii).
  • step (ii) of the method defined above the complex according to the invention is formed and its fluorescence behavior is used to determine the metal ion concentration.
  • the fluorescent probe according to the invention can be added directly to a solution as an indicator in step (ii).
  • the metal ion concentration can be determined from a calibration curve of intensity or, alternatively, by ratiometric measurements on probes containing more than one fluorophore in step (iv) (homogeneous analysis).
  • the fluorescence probe according to the invention can be covalently coupled to certain sample constituents via the linker (heterogeneous analysis). In this way, the local change in the metal ion concentration of these components can be tracked. Both methods also work time-resolved - so they can be used to determine the change in metal ion concentration.
  • the present invention provides the use of the compound according to the invention for increasing the resolution in fluorescence microscopy, in particular for high-resolution single-molecule localization microscopy, for multiplexing in fluorescence microscopy or for the quantitative detection of metal ions.
  • the inventive method can be used.
  • FIG. 1 shows an example of a labeling of a target structure with the compound according to the invention using the established streptavidin-biotin bond.
  • FIG. 2 Schematic representation of the complexation of copper ions by an embodiment of the compound of the invention and the reversible "switching" of the fluorescence in the ensemble experiment by adding Cu 2+ or EDTA.
  • FIG. 3 Synthesis example of an artificial amino acid which can serve, for example, as a backbone of the compound according to the invention.
  • FIG. 4 Functionalization of the artificial amino acid shown in FIG. 3 with a fluorophore and a linker.
  • the left column exemplifies the principle of functionalization, while the middle column lists different fluorophores and the right column lists different linkers that can be used for the functionalization of the artificial amino acid.
  • FIG. 5 Exemplary synthesis route en route to an embodiment of the compound according to the invention.
  • the synthesis starts from commercially available amino acids and yields variously functionalized derivatives, i) picolyl bromide hydrobromide, 5 M sodium hydroxide solution, room temperature, 5 hours; ii) R-NFfe, HBTU, DIPEA, DMF, room temperature, 12 hours; iii) trifluoroacetic acid, room temperature, 5 hours.
  • FIG. 6 Exemplary synthesis route to the finished exemplary embodiment of a fluorescence probe labeled with Atto565 and biotin: i) Atto565 azide, sodium ascorbate, CuSO 4, DMF, 40 ° C., 3 hours; ii) trifluoroacetic acid, room temperature, 5 hours; iii) Biotinamidohexanoic acid NHS, DIPEA, DMF, 40 ° C, 3 hours.
  • the purification after step i) and iii) is carried out by means of HPLC.
  • FIG. 7 Exemplary embodiment of a fluorescence probe according to the invention labeled with Atto565 azide and biotinamidohexanoic acid.
  • FIG. 8 TIR fluorescence images (561 nm excitation) of a HeLa cell whose microtubules were labeled via anti- ⁇ -tubulin with a compound of Synthetic Example 1 using the fluorophore Cy3B and the linker PEGe-biotin.
  • FIG. 8a) shows the summation of the image sequences of the cell and FIG. 8d) shows a detail thereof.
  • Figures 8b) and 8e) show corresponding high-resolution images, which are based on the image sequence with the program rapidSTORM 2.21. (see Experiments) Valley part) were reconstructed. In the superimposition of the micrograph and the reconstruction (FIG. 8c)) and in the intensity cross section (FIG. 8f), an improvement of the resolution by approximately four times can be recognized.
  • FIG. 9 Fluorescence spectra of compound 1b of synthesis example 2 with increasing copper concentration (FIG. 9a)). Time-resolved measurement of fluorescence intensity. After addition of CuSÜ4 a very fast fluorescence quenching takes place. Addition of EDTA completely restores the fluorescence (FIG. 9b).
  • FIG. 10 Human He-La cells labeled with compound 1a of Synthetic Example 2. Anti-tubulin primary antibodies, anti-mouse biotin secondary antibodies, streptavidin and 1a (FIG. 10a) were used. Repeated addition of CuSÜ4 and EDTA allowed several switching cycles (Figure 10b)).
  • FIG. 11 Labeling of T cell receptor clusters with 1a of Synthesis Example 2. Above: Fixated Jurkat T cell stained with Atto488 phalloidin (FIG. 11a)) and with anti-pZAP70 biotin, streptavidin and 1a (FIG. 11b )); Center ( Figure 11c)): time series of the labeled cell in the presence of CuSÜ4.
  • the probes 1a are not all turned on at the same time, but dynamically "blinking", Bottom ( Figure 11d)): Overlaying the conventional sum image (fog-like structures) with the high-resolution image from the software rapidStorm 2.21 (punctiform structures) The intensity profile is shown along the line drawn in Figure 11d) ( Figure 11e, the punctiform structures correspond to the inner curve and the nebulous structures of the outer curve) the significantly increased resolution by using the "blinking" probes and the localization software from the curves in Figure 11e): The narrow intensity profile curve results from the high resolution image obtained by the present invention, and the wide curve is by conventional Method.
  • FIG. 12 Immunofluorescence images of regularly labeled microtubules in fixed Heia cells. Staining by regular fluorescently labeled anti-a-tubulin anti body (without switchable probe).
  • FIG. 12a individual image and associated intensity cross section through a filament
  • FIG. 12b summation image over a time series of 2,000 images
  • Figure 12c Reconstructed image of the rapidSTORM software from the same time series - due to the lack of switching process, no high-resolution information can be generated.
  • Figure 13 Chemical multiplexing: Human HeLa cells were labeled as described in Figure 10 with anti-tubulin, anti-mouse biotin, streptavidin and 1a of Synthetic Example 2. In addition, it was labeled with Atto565-phalloidin. Addition of CuSO 4 turns off 1a so that only the phalloidin labeled actin is visible ( Figure 13a)). After photo-destruction of the first structure and addition of EDTA, the structure labeled 1a can be "turned on” and imaged again ( Figure 13b).) A false-color image can be generated from both images, even though both structures were labeled with the same dye ( Figure 13c)). ,
  • the implementation of the three functional groups, i. of the fluorophore, the linker and the chelating group can be solved, for example, on the basis of an artificial amino acid.
  • commercially available amino acids can serve as starting compound for the synthesis of the compound of the invention.
  • the basis for the compound according to the invention can be an artificial amino acid which already carries a binding site for a metal ion, in particular Cu 2+ and can be functionalized at the carboxy and the amino function in each case with a fluorophore or a linker.
  • an artificial amino acid for example, BpyAla can be used, whose synthesis is described in Drienovskar et al., Chem. 2015, 6, 770-776, is shown. The reaction is shown in FIG.
  • the artificial amino acid shown in Figure 3 already contains a chelating group and, as shown in Figure 4, can also be functionalized with a fluorophore and a linker.
  • the left-hand column of FIG. 4 shows, by way of example, the principle of functionalization, while the middle column lists different fluorophores and the right-hand column lists different linkers which can be used, for example, for the functionalization of the artificial amino acid.
  • FIGS. 5 to 7 An example of the synthesis of embodiments of the compound according to the invention is shown in FIGS. 5 to 7.
  • two commercially available ⁇ -amino group BOC-protected amino acids (BOC-lysine, BOC-amino-alanine) can be used to form bis (pyridin-2-ylmethyl) amine thereon). as a chelating group (compound 2a, b).
  • This is carried out in 5M sodium hydroxide solution with 2- (bromomethyl) pyridine hydrobromide for five hours at room temperature with subsequent purification on silica gel.
  • the free carboxy group is used to introduce various functionalities, such as a propargyl group (3a, b), an H-tetrazine (4a, b) and a chloroalkane linker (halo-tag, (synthesized according to Los et al., ACS Chemical Biology 2008, 6, 373-382.), 5a, b).
  • the functionalities are each used as amines and introduced by // 7-s / ' / / activation of the carboxylic acid by means of HBTU in dry DMF with DIPEA as the base for 12 hours at room temperature.
  • the propargyl group can be used, for example, for dye labeling via copper-catalyzed click reaction with azide-labeled dyes or azide-labeled linkers.
  • Tetrazine and chloroalkane can be used for the specific labeling of target structures in cells. serve.
  • the image sequences in a) to f) in FIG. 8 show, by way of example, TIR fluorescence images (561 nm excitation) of a HeLa cell whose microtubules were labeled with a compound according to Synthesis Example 1.
  • the cells were grown in chamber chambers with 8 chambers (LabTek Nunc) with 150 pm thick glass bottom overnight at 10000 cells / cm 2 . Thereafter, they were fixed with 3.7% formaldehyde and 0.05% Triton X-100 in PBS for 10 minutes at 37 ° C and permeabilized and thereafter washed four times thoroughly with PBS.
  • the fixed and labeled cells were in a PBS buffer containing 16 ⁇ CuSO 4, so that the probes switched at irregular intervals between a fluorescent and an erased state by reversible binding and dissociation of Cu 2+ ions.
  • the image sequences (4000 images, 25 ms / image, excitation power 1, 1 mW) were summed on the one hand to form a conventional TIR fluorescence image (FIG. 8 a)) of the cell or a detail (FIG. 8 d)). to get out of it.
  • Image processing was done with Origin 9.1 and the freely available programs ImageJ Ver. 1.50g and InkScape Ver. 0.91.
  • Bovine serum albumin Fluka 05471 anti-a-tubulin, monoclonal, mouse Sigma Aldrich T8203 anti-mouse biotin, polyclonal, goat Sigma-Aldrich B7264
  • the biotin linker of 1a, b can be used for conjugation to biotinylated antibodies.
  • human HeLa cells were labeled with anti-tubulin, anti-mouse biotin, streptavidin and 1a.
  • the cells were grown in chamber chambers with 8 chambers (LabTek Nunc) with 150 pm thick glass bottom overnight at 10000 cells / cm 2 . Thereafter, they were fixed with 3.7% formaldehyde and 0.05% Triton X-100 in PBS for 10 minutes at 37 ° C and permeabilized and then washed four times thoroughly with PBS.
  • incubation buffer a solution of 2% BSA in PBS
  • incubation buffer a solution of 2% BSA in PBS
  • incubation of the antibodies diluted in incubation buffer at about 10 pg / mL After each incubation step, it was washed thoroughly four times with PBS. After incubation of 10 ⁇ g / ml streptavidin in incubation buffer for 20 minutes, it was washed three times thoroughly with PBS and incubated at a concentration of 10 -9 M in incubation buffer for 30 minutes.
  • Figure 11 demonstrates the use of the chemical switch for high resolution localization microscopy. It shows the labeling of T cell receptor clusters with 1a of Synthesis Example 2.
  • pZAP70 was labeled in receptor clusters of fixed Jurkat T cells. The cells were placed in chamber cover glasses (8 chambers Nunc LabTek, 150 ⁇ m glass thickness) at 5000 cells / cm 2 on the glass surface which had previously been coated with poly-L-lysine and anti-CD3 antibodies (see Abraham et al., J. Immunol., 2012, 189, 1898-1910.).
  • Bovine serum albumin Fluka 05471 anti-phospho-ZAP70-biotin Bioss bs3479r
  • FIG. 12a single image and associated intensity cross section through a filament
  • FIG. 12b summation image over a time series of 2,000 images
  • Figure 12c Reconstructed image of the randomSTORM software from the same time series - due to the lack of switching process, no high-resolution information can be generated.
  • anti-mouse biotin was incubated at 10 pg / mL in incubation buffer for one hour and then rinsed thoroughly with PBS again. Then, streptavidin (10 pg / ml) in incubation buffer for 20 minutes followed by thorough washing with PBS and incubation of 1a (10 -9 M) and ATTO565 phalloidin (10- 10 M) in incubation buffer for 30 minutes. After washing several times with PBS, the cells were microscoped in 50 ⁇ CuSO 4 solution in PBS on a TIRF / wide field microscope (see Example 2) when excited at 561 nm. In the presence of CuSÜ4, 1a is switched off and only the actin is visible and is displayed (FIG. 13 a)).
  • FIG. 13 b After photo-destruction and addition of 200 ⁇ M EDTA in PBS, the microtubules are visible (FIG. 13 b)).
  • the false-color image generated therefrom in FIG. 13c) has been produced with only one detection color; both times it is the dye Atto565.
  • Image processing was carried out with the freely available programs ImageJ Ver. 1 .50g and InkScape Ver. 0.91.
  • Bovine serum albumin Fluka 05471 anti-a-tubulin, monoclonal, mouse Sigma Aldrich T8203 anti-mouse biotin, polyclonal, goat Sigma-Aldrich B7264

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, umfassend mindestens eine chelatbildende Gruppe, mindestens einen Linker und mindestens einen Fluorophor, und Verfahren zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie, für Multiplexing in der Fluoreszenzmikroskopie und zum quantitativen Nachweis von Metallionen unter Verwendung dieser Verbindung.

Description

"Synthese und Struktur chemisch schaltbarer Fluoreszenzsonden auf der Basis von Aminosäuren"
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung, umfassend mindestens eine chelatbildende Gruppe, mindestens einen Linker und mindestens einen Fluorophor, und Verfahren zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie, für Multi- plexing in der Fluoreszenzmikroskopie und zum quantitativen Nachweis von Metallionen unter Verwendung dieser Verbindung.
Bislang nutzt die hochauflösende Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie meist Licht-getriebene, also fotophysikalische Prozesse, die durch Einstrahlung einer zusätzlichen Wellenlänge oder Erhöhung der Bestrahlungsleistung kontrolliert werden. Die wichtigsten Prozesse sind Fotoaktivierung, wie bei der Photo Activation Localiza- tion Microscopy (PALM), oder reversible Fotoaktivierung/-deaktivierung, wie bei der Stochastic Optical Reconstruction Microscopy (STORM). Zur Verbesserung der Schaltkinetik, von der die Qualität der Bilder abhängt, wird die Aktivierung der Fluoreszenzsonden auch thermisch erreicht (direct STORM - dSTORM), z.B. durch Zugabe von Puffern, die Reduktions- und Oxidationsmittel enthalten und den Farbstoff aus dem Auszustand (d.h. inaktiven Zustand) wieder in den Anzustand (d.h. aktiven Zustand) zurücktreiben.
In einem anderen Verfahren werden Proteine mit einer Antigenbindungsstelle modifiziert, die den Farbstoff Malachitgrün reversibel binden kann. Die Fluoreszenzemission des Farbstoffs ist in wässriger Lösung aufgrund der schnellen Diffusion und der Flexibilität seiner Struktur unterdrückt und wird erst sichtbar, wenn er an die Bindungsstelle bindet. Die Nutzung der reversiblen Bindung zur hochauflösenden Einzelmole- küllokalisationsmikroskopie konnte bereits experimentell gezeigt werden. In ähnlicher Weise funktioniert eine Methode, die auf der transienten Bindung fluoreszenzmar- kierter Oligonukleotide basiert (DNA-Paint). Hier werden die Zielproteine mit kurzen Oligonukleotiden markiert und die fluoreszenzmarkierten komplementären Stränge zugegeben. Hybridisiert ein markierter Gegenstrang an ein Oligonukleotid, erreicht man einen An-Zustand, während die frei diffundierenden Oligonukleotide nur zur Hintergrundfluoreszenz beitragen.
Weitere Sonden nutzen die Umlagerung eines bestimmten Fluoreszenzfarbstoffs zu einer spirozyklischen Verbindung, die keine Fluoreszenz aufweist. In diesem Zusammenhang konnte gezeigt werden, dass die Zyklisierung bei neutralem pH-Wert reversibel abläuft und zur Bildgebung mit hochauflösender Einzelmoleküllokalisati- onsmikroskopie geeignet ist.
Der Nachteil der herkömmlichen hochauflösenden Mikroskopie liegt in den fotophysikalischen Prozessen, die zusätzliche Lichtquellen und/oder höhere Bestrahlungs- leistungen erfordern. Hierdurch entstehen höhere technische Anforderungen: Die Bestrahlungsintensitäten müssen soweit optimiert werden, dass die Schaltkinetik der Fluoreszenzsonden im richtigen Bereich liegt und gleichzeitig soll die Photonenausbeute maximiert werden, um die Lokalisationsgenauigkeit und somit die erreichte Auflösung des Bildes soweit wie möglich zu erhöhen. Häufig liegen die zusätzlichen Anregungslinien im blauen oder ultravioletten Spektralbereich und führen zur Fotoschädigung der Proben, was bis zur Fixierung der lebenden Zellen führen kann.
Des Weiteren wird Multiplexing (d.h. parallele Detektions-/Abbildungskanäle) in der Fluoreszenzmikroskopie zurzeit standardmäßig über spektrale Eigenschaften der Farbstoffe erreicht. Am häufigsten wird in der Fluoreszenzmikroskopie das spektrale Multiplexing auf Basis unterschiedlicher Anregungs- und Detektionswellenlängen genutzt. Daneben nimmt auch die Bedeutung der Fluoreszenzlebensdauer, also der Lebensdauer des angeregten Zustande, immer mehr zu. Andere Eigenschaften, wie die Polarisationsanisotropie, sind eher von untergeordneter Bedeutung. Beim spektralen Multiplexing werden unterschiedliche Anregungswellenlängen genutzt, so dass unterschiedliche Lichtquellen, vor allem Laser, benötigt werden. Zusätzlich wird das von der Probe emittierte Licht mithilfe von dichroitischen Strahlteilern oder Prismen in Detektionsarme mit unterschiedlichen Wellenlängenbereichen geteilt. Aufgrund der Unvollkommenheit von Strahlteilern und Filtern und wegen der breiten Anregungsund Emissionsspektren der Farbstoffe kommt es allerdings immer wieder zu einem Übersprechen in die anderen Detektionskanäle (Crosstalk), das nur zum Teil durch Kalibrierung nachträglich korrigiert werden kann. Um Bilder unterschiedlicher Wellenlängen überlagern zu können, müssen diese zunächst auf chromatische Abberationen korrigiert werden. Mit spektralem Multiplexing erreicht man derzeit bis zu fünf verschiedene Kanäle. Das Multiplexing basierend auf der Fluoreszenzlebensdauer kann bei der gleichen Anregungs- und Emissionswellenlänge erfolgen - erfordert aber entweder gepulste oder intensitätsmodulierte Anregungsquellen (meist Laser) und eine zur Messung von Zeitspannen auf der Pico- bis Nanosekundenzeitskala ausgerichtete Detektionstechnik. Da die Fluoreszenzlebensdauer einer exponentiel- len Abnahme folgt und die charakteristischen Fluoreszenzlebensdauern von organischen Farbstoffen zwischen einer bis vier Nanosekunden (Zerfallskonstante) liegen, können damit maximal zwei, allerhöchstens drei verschiedene Kanäle abgebildet werden. Das Übersprechen zwischen den unterschiedlichen„Zeitkanälen" ist sehr groß und muss in jedem Fall korrigiert werden. Multiplexing-Varianten erlauben die simultane Abbildung der verschiedenen Kanäle und sind auch in lebenden Zellen einsetzbar. Sie können auch miteinander kombiniert werden.
Wesentliche Nachteile der herkömmlichen Multiplexingmethoden sind somit der Crosstalk und der höhere technische Aufwand bei den Anregungsquellen und der Detektionseinheiten.
Angesichts der oben dargelegten Probleme der herkömmlich verwendeten Methoden in der Fluoreszenzmikroskopie liegt der vorliegenden Erfindung demnach die Aufgabe zugrunde, eine Verbindung bereitzustellen, die eine Verbesserung der Auflösung in der Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie in zielgerichteter Weise (Targeting) ermöglicht und mit der eine Erhöhung der bildgebenden Kanäle (Multiplexing) in der Fluoreszenzmikroskopie erreicht werden kann, ohne dass ein höherer technischer Aufwand erforderlich ist und Crosstalk verhindert werden kann. Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.
Gemäß eines ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird insbesondere eine Verbindung bereitgestellt, die mindestens eine chelatbildende Gruppe, mindestens einen Linker und mindestens einen Fluorophor, dargestellt durch die Formel (1 ), umfasst:
Formel (1 ),
Figure imgf000005_0001
wobei
jeweils eine der Gruppen R1 und R2 mindestens einen Fluorophor umfasst und die jeweils andere der Gruppen R1 und R2 mindestens einen Linker umfasst;
R3 aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer haloge- nierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer
Aminogruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt ist;
n eine natürliche Zahl von 0 bis 6 ist;
X eine Einfachbindung oder ein Substituent gemäß der Formel (X-1 ) ist;
Formel (X-1 ),
Figure imgf000005_0002
wobei mehrere R4 unabhängig voneinander vorliegen können und jeweils aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt sind; und
Y eine chelatbildende Gruppe gemäß Formel (Y-1 ) oder Formel (Y-2) ist
Figure imgf000006_0001
Formel (Y-1 ) Formel (Y-2), wobei
mehrere R5 und R6 unabhängig voneinander vorliegen können und R5 und R6 unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Sulfonatgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt sind; und
R7 und R8 unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus einem Pyridyl-, Pyrimidinyl-, Pyrazinyl-, Pyridizinyl-, Isoquinolinyl-, Imidazolyl-, Quinolyl-, Bis(phenantrolin)yl-, Carboxy-, Carboxyester-, und Kronenether-Rest, ausgewählt sind.
Die erfindungsgemäße Verbindung kombiniert die drei oben genannten Funktionen: Fluorophor, Linker und chelatbildende Gruppe. Über die chelatbildende Gruppe kann ein Metallion komplexiert werden, das die Fluoreszenz des Fluorophors beeinflusst, wodurch dieser entweder aktiviert oder deaktiviert werden kann. Somit erfolgt durch die Komplexbildung der erfindungsgemäßen Verbindung mit einem Metallion, abhängig von der Wahl des Metallions und des Fluorophors, eine intramolekulare Aktivierung oder Deaktivierung der Fluoreszenz. Zudem erlaubt der Linker eine direkte, zielgerichtete Markierung einer Probe mit der erfindungsgemäßen Verbindung. Des Weiteren ändert sich durch die Bindung des Metallions die Ladung der Sonde, was z.B. zur Erhöhung/Erniedrigung der Affinität spezifischer und unspezifischer Bindungen mit anderen Molekülen führen kann.
In der vorliegenden Erfindung wird die erfindungsgemäße Verbindung auch als„Fluoreszenzsonde" bezeichnet.
Erfindungsgemäß umfasst jeweils eine der Gruppen R1 und R2 mindestens einen Fluorophor und die jeweils andere der Gruppen R und R2 mindestens einen Linker. Dies bedeutet, wenn die Gruppe R1 mindestens einen Fluorophor umfasst, umfasst die Gruppe R2 mindestens einen Linker. Im umgekehrten Fall umfasst die Gruppe R1 mindestens einen Linker und die Gruppe R2 mindestens einen Fluorophor.
Unter dem Begriff „Fluorophor" wird erfindungsgemäß eine fluoreszierende Verbindung verstanden, die Lichtenergie einer bestimmten Wellenlänge absorbieren und darauf Licht mit einer längeren Wellenlänge emittieren kann. Der in der erfindungsgemäßen Verbindung verwendete Fluorophor unterliegt hierbei keiner besonderen Einschränkung. Dabei kann der Fluorophor aus einer Gruppe, bestehend aus Derivaten von Xanthen, Acridin, Cyanin, Cumarin, Rhodamin, Silizium-Rhodamin, Car- bopyronin, Bordipyrromethen, Perylen und Oxazin, ausgewählt sein. Bevorzugt sind Oxazin, Rhodamin und Carbopyronin aufgrund ihrer guten photophysikalischen Eigenschaften.
In der erfindungsgemäßen Verbindung liegt mindestens ein Fluorophor vor. Dabei kann bei einer Mehrzahl von Fluorophoren jeder Fluorophor aus der oben definierten Gruppe unabhängig von den anderen Fluorophoren ausgewählt werden. Beispielsweise können zwei Fluorophore eingesetzt werden, von denen einer von einem Metallion beeinflusst werden kann und der andere von diesem Metallion unabhängig ist. In diesem Fall kann der vom Metallion unabhängige Fluorophor für eine ratiometrische quantitative Analyse des Metallions eingesetzt werden. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform weist die Verbindung der vorliegenden Erfindung genau einen Fluorophor auf. Darüber hinaus ist der Begriff „Linker" gemäß der vorliegenden Erfindung nicht besonders eingeschränkt und umfasst Molekülfragmente beziehungsweise funktionelle Gruppen, die die erfindungsgemäße Verbindung an mindestens eine andere Verbindung oder mindestens eine funktionelle Gruppe einer Verbindung koppelt. Dies dient dazu, die Fluoreszenzsonde an einen spezifischen Bestandteil einer Probe zu binden. Dabei kann der Linker beispielsweise über Aminreaktionen, Thiolreaktionen, Car- boxylatreaktionen, Hydroxyreaktionen, Aldehyd- oder Ketonreaktionen, Reaktionen von aktivem Wasserstoff, photochemische Reaktionen oder Cycloadditionen in die erfindungsgemäße Verbindung eingeführt sein (vgl.„Bioconjugation Techniques" von Greg T. Hermanson, 2. Edition, Academic Press 2008).
Die in einer Aminreaktion verwendeten Verbindungen oder funktionellen Gruppen zur Bereitstellung von Linkern sind nicht besonders eingeschränkt und können beispielsweise Isothiocyanate, Isocyanate, Acylazide, NHS-Ester, Sulfonylchloride, Aldehyde, Glyoxale, Epoxide, Oxirane, Carbonate, Aryliermittel, Imidoester, Car- bodiimide, Anhydride, Fluorphenylester, Hydroxymethylphosphinderivate oder guani- dinierte Amine sein.
Beispiele für funktionelle Gruppen oder Verbindungen, mit denen ein Linker durch eine Thiolreaktion bereitgestellt werden kann, sind Halogenacetyle, Alkylhalogenid- derivate, Maleimide, Aziridine, Acryloylderivate, Arylierungsmittel, Thioldisulfidaus- tauschmittel, wie beispielsweise Pyridyldisulfid, TNB-Thiol oder Disulfidreduktions- mittel, oder Vinylsulfonderivate. Zudem kann ein Linker mittels Thiolreaktion im Rahmen einer dativen Metall-Thiol-Bindung, von nativer chemischer Ligation oder von Cisplatin-Modifizierung von Methionin und Cystein in die erfindungsgemäße Verbindung eingeführt sein.
Zudem unterliegen die in einer Carboxylatreaktion verwendeten funktionellen Gruppen oder Verbindungen für die Bereitstellung eines Linkers keiner besonderen Einschränkung und können aus Diazoalkanen, Diazoacetylverbindungen, Car- bonyldiimidazolen oder Carbodiimiden ausgewählt sein. Die in einer Hydroxyreaktion benutzten funktionellen Gruppen oder Verbindungen zur Bereitstellung von Linkern sind nicht besonders eingeschränkt und können beispielsweise Epoxide, Oxirane, Carbonyldiimidazole, N.N'-Disuccinimidylcarbonate oder N-Hydroxysuccinimidylchlorformate, Halogenkohlenwasserstoffe oder Isocya- nate sein. Zusätzlich kann der Linker mittels Hydroxyreaktion durch Oxidation mit Periodat oder enzymatische Oxidation eingeführt sein.
Die durch Aldehyd- oder Ketonreaktionen bereitgestellten Linker unterliegen auch keiner besonderen Einschränkung und können mittels Reaktion von Hydrazinderiva- ten, Schiff-Base-Formation, reduktiver Aminierung oder Mannich-Kondensation bereitgestellt werden.
Zudem kann der Linker beispielsweise durch Reaktionen von aktivem Wasserstoff mit Diazoniumderivaten oder im Rahmen von Mannichkondensationen oder lodierungs- reaktionen erhalten werden.
Des Weiteren kann der Linker zum Beispiel durch photochemische Reaktionen von Arylaziden und halogenierten Arylaziden, Benzophenonen, Anthraquinonen, Dia- zoverbindungen, Diazirinderivaten oder Psoralen-Verbindungen bereitgestellt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann der Linker durch Verwendung von Cycloadditionsreaktionen erhalten werden, wobei zum Beispiel eine Diels-Alder-Reaktion, eine Komplexbildung mit Boronsäurederivaten oder Klick-Chemie durch Cu1-geförderte Azid-Alkin [3+2]-Cycloaddition verwendet werden kann.
Einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung entsprechend ist der Linker aus einer Gruppe, bestehend aus Biotin, Propargyl, Tetrazin, Methyl-Tetrazin, Halogen-Alkan (Halo-Tag-Ligand), Benzylguanin (SNAP-Tag-Ligand) und Derivaten davon, ausgewählt. In der erfindungsgemäßen Verbindung liegt mindestens ein Linker vor. Dabei kann bei einer Mehrzahl von Linkern jeder Linker aus der oben definierten Gruppe unabhängig von den anderen Linkern ausgewählt werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist die Verbindung der vorliegenden Erfindung genau einen Linker auf.
Die Probe, die mit dem Linker der erfindungsgemäßen Verbindung markiert werden kann, ist nicht besonders eingeschränkt. Beispielsweise kann sie ein Protein oder ein Antikörper sein. Die Bindung zwischen Linker und Probe kann dabei über eine kova- lente oder eine starke Affinitätsbindung, wie z.B. Biotin/Streptavidin, Antikörper, Fab-Fragmente oder Nanobodies, erfolgen.
Erfindungsgemäß ist der Substituent R3 aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxyg- ruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt. Durch die Wahl des Substituenten R3 lässt sich die Reaktivität der benachbarten Amino- und Carboxylgruppe steuern. Daher kann je nach erwünschter Reaktivität ein entsprechender Substituent aus der oben aufgeführten Liste verwendet werden. Bevorzugt ist R3 aus H oder einer Ci- bis C3-Alkylgruppe ausgewählt. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform ist R3 H.
In der erfindungsgemäßen Verbindung ist n eine natürliche Zahl von 0 bis 6, beispielsweise 1 bis 4. Nach einer spezifischen Ausführungsform ist n 1 oder 4.
Der Substituent X ist in der erfindungsgemäßen Verbindung eine Einfachbindung oder ein Substituent gemäß der Formel (X-1 ).
Formel (X-1 )
Figure imgf000010_0001
Dabei können mehrere R4 unabhängig voneinander vorliegen. Erfindungsgemäß ist R4 aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer haloge- nierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt. Die Wahl des Substituenten R4 ist bedingt durch die erwünschte Reaktivität der Verbindung. So können beispielsweise Substituenten verwendet werden, die einen Einfluss auf die Elektronendichte in der chelatbildenden Gruppe nehmen und damit die Bindungsaffinität, -kinetik und -Spezifität beeinflussen. Zu diesen Substituenten gehören z.B. eine Carboxygruppe, eine Carbonylgruppe, ein Halogen oder eine halogenierte Ci- bis C3-Alkylgruppe. Weiterhin kann über die Wahl des Substituenten die Löslichkeit der Fluoreszenzsonde beeinflusst werden. So kann beispielsweise eine Carboxygruppe, eine Aminogruppe oder eine Hydroxygruppe gewählt werden, wenn die Fluoreszenzsonde in einem polaren Lösemittel gelöst werden soll. Wird hingegen ein unpolares Lösemittel verwendet, so kann der Substituent zum Beispiel eine Ci- bis C3-Alkylgruppe sein. Zudem ist die Verwendung von Substituenten möglich, die zusätzliche Bindungsstellen für Metallionen bieten und somit die Zähnigkeit erhöhen wie z.B. eine Carboxygruppe oder eine Aminogruppe. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist R4 aus H oder einer Ci- bis C3-Alkylgruppe ausgewählt. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform ist R4 H.
Der erfindungsgemäß verwendete Ausdruck„chelatbildende Gruppe" bezeichnet einen mehrzähnigen Liganden, der mindestens zwei Koordinationsstellen eines Metallions einnimmt. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann die Verbindung mit einem Metallion einen Komplex bilden. Bevorzugt ist das Metallion aus einer Gruppe, bestehend aus Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Fe3+, Mn2+ und Co +, ausgewählt. Die Position, mit der die erfindungsgemäße Verbindung einen Komplex mit einem Metallion bilden kann, ist nicht besonders eingeschränkt, solange zumindest ein Teil der chelatbildenden Gruppe mit dem Metallion einen Komplex bildet.
Durch die Komplexierung eines Metallions mit der chelatbildenden Gruppe kann die Fluoreszenz des Fluorophors der erfindungsgemäßen Verbindung beeinflusst werden, wodurch dieser entweder aktiviert oder deaktiviert werden kann. Somit erfolgt durch die Komplexbildung der Verbindung mit einem Metallion, abhängig von der Wahl des Metallions und des Fluorophors, eine intramolekulare Aktivierung oder Deaktivierung der Fluoreszenz.
In der Verbindung der vorliegenden Erfindung ist Y eine chelatbildende Gruppe gemäß Formel (Y-1 ) oder Formel (Y-2).
Figure imgf000012_0001
Formel (Y-1) Formel (Y-2)
In Formel (Y-1) können mehrere R5 und R6 unabhängig voneinander vorliegen und sind unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Sulfonatgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt. Die Wahl der Substi- tuenten R5 und R6 ist bedingt durch die erwünschte Reaktivität der Verbindung. So können beispielsweise Substituenten verwendet werden, die einen Einfluss auf die Elektronendichte in der chelatbildenden Gruppe nehmen und damit die Bindungsaffinität, -kinetik und -Spezifität beeinflussen. Zu diesen Substituenten gehören z.B. eine Carboxygruppe, eine Carbonylgruppe, ein Halogen oder eine halogenierte Ci- bis C3-Alkylgruppe. Weiterhin kann über die Wahl des Substituenten die Löslichkeit der Fluoreszenzsonde beeinflusst werden. So kann beispielsweise eine Carboxygruppe, eine Aminogruppe, Sulfonatgruppe, Phosphatgruppe oder eine Hydroxygruppe gewählt werden, wenn die Fluoreszenzsonde in einem polaren Lösemittel gelöst werden soll. Wird hingegen ein unpolares Lösemittel verwendet, so kann der Substituent zum Beispiel eine Ci- bis C3-Alkylgruppe sein. Zudem ist die Verwendung von Substituenten möglich, die zusätzliche Bindungsstellen für Metallionen bieten und somit die Zähnigkeit erhöhen wie z.B. eine Carboxygruppe oder eine Aminogruppe. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der Formel (Y-1 ) sind R5 und R6 unabhängig voneinander aus H oder einer Ci- bis C3-Alkylgruppe ausgewählt.
In der obenstehenden Formel (Y-1 ) kann ein Komplex mit einem Metallion entweder über einen der Substituenten R5 und R6 und/oder über mindestens eins der Stickstoffatome des Bipyridylrings gebildet werden. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Komplexierung über die Stickstoffatome des Bipyridylrings. Einer alternativen Ausführungsform entsprechend wird eine Komplexbildung durch die Substituenten R5 und R6 an das Metallion erreicht. Insbesondere kann im Falle der Verwendung einer Carboxygruppe als R5 und/oder R6 Ca2+ oder Zn2+ durch die erfindungsgemäße Verbindung komplexiert werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform entspricht Y der Formel (Y-1-1 ).
Formel (Y-1-1 )
Figure imgf000013_0001
In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung hat Y eine Struktur der Formel (Y-1-1 ), ist n 1 , R3 H und X eine Einfachbindung, so dass die erfindungsgemäße Verbindung eine Struktur gemäß der folgenden Formel (2) aufweist:
Formel (2)
Figure imgf000014_0001
In der erfindungsgemäßen Verbindung, welche die alternative Struktur der chelatbil- denden Gruppe mit der Formel (Y-2) aufweist, sind R7 und R8 unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus einem Pyridyl-, Pyrimidinyl-, Pyrazinyl-, Pyridizinyl-, Isoquinolinyl-, Imidazolyl-, Quinolyl-, Bis(phenantrolin)yl-, Carboxy-, Carboxyester-, und Kronenether-Rest oder Derivaten davon, ausgewählt. Dabei unterliegt die Auswahl von R7 und R8 aus der oben aufgeführten Gruppe keiner Einschränkung, insofern die beiden Substituenten R7 und R8 einen mehrzähnigen Liganden bilden können. R7 und R8 können dabei gleich oder voneinander verschieden sein. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind R7 und R8 gleich. Besonders bevorzugt sind R7 und R8 jeweils ein Pyridylrest.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung entspricht die cheiatbildende Gruppe Y der Formel (Y-2-1 ). Formel (Y-2-1)
Figure imgf000015_0001
In einer spezifischen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindung entspricht Y der Formel (Y-2-1 ), ist n 1 oder 4, R3 H und X eine Einfachbindung, so dass die Verbindung eine Struktur gemäß der folgenden Formel (3) oder (4) aufweist:
Figure imgf000015_0002
Formel (3) Formel (4)
Einer weiteren Ausführungsform entsprechend stellt die Erfindung einen Komplex bereit, der die zuvor genannte Verbindung und mindestens ein Metallion umfasst. Dabei ist das Metallion nicht besonders eingeschränkt, solange es mit der chelatbil- denden Gruppe der erfindungsgemäßen Verbindung einen Komplex bilden kann. Dabei soll die Bindung zwischen Metallion und chelatbildender Gruppe bevorzugt reversibel erfolgen. Durch eine solche Reversibilität kann ein schnelles An- und Ab- schalten der Fluoreszenzsonde erfolgen, was eine verbesserte Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht. Dabei kann die Fluoreszenzsonde anhand ihrer Fluoreszenzaktivität folgendermaßen unterteilt werden: Turn-On Sonden werden durch die Komplexbildung mit dem Metallion aktiviert und Turn-Off Sonden durch die Komplexbildung mit dem Metallion deaktiviert.
Die Ratenkonstanten für den Zerfall des Komplexes aus Metallion und Fluoreszenzsonde ist nicht besonders eingeschränkt, solange ein schnelles An- und Abschalten der Fluoreszenzsonde ermöglicht wird. Gemäß einer spezifischen Ausführungsform zerfällt der Komplex einer Turn-Off Sonde mit einer Ratenkonstanten von kd < 20 s_1, bevorzugt von kd< 15 s und besonders bevorzugt von kd < 10 s_1.
Bei einer Turn-On Sonde hingegen kann der Komplex mit einer Ratenkonstanten von kd = 0,01 bis 20 s 1, bevorzugt von kd = 0,05 bis 15 s_1 und besonders bevorzugt von kd= 0,1 bis 10 s_1 zerfallen. Sowohl bei Turn-Off als auch bei Turn-On Sonden kann die Assoziationsrate durch Wahl der Metallionenkonzentration willkürlich kontrolliert bzw. optimiert werden, die von den Eigenschaften der jeweiligen Sonden abhängen. Ein Vorteil von Turn-On Sonden besteht darin, dass der Anteil der ausgeschalteten Sonden leichter kontrolliert werden kann. Turn-Off-Sonden besitzen den Vorteil, dass die Schaltung lediglich spezifisch durch die Metall-Komplexierung erfolgen kann. Bei Turn-On-Sonden kann auch durch spontane thermisch getriebene Konformationsänderung eine kurzzeitige Schaltung in die fluoreszierende Form erfolgen.
Bevorzugt ist das Metallion aus der Gruppe, bestehend aus Na+, K+, Mg2+, Ca2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Fe3+, Mn2+ und Co2+, ausgewählt. Dabei führt die Komplexierung von Na+, K\ Mg2+, Ca2+ und Zn + bevorzugt zu einem Anschalten, also Aktivieren, der Fluoreszenzsonde und die Komplexierung von Cu2+, Ni2+, Fe3+, Mn2+ und Co2+ zu einem Ausschalten, also Deaktivieren, der Fluoreszenzsonde. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist das Metallion aus Ca2+, Zn2+, Cu2+, Ni2+, Fe3+, Mn2+ oder Co2+ ausgewählt. Der Vorteil dieser Metallionen besteht unter anderem darin, dass sie einen stabilen Komplex mit beispielsweise EDTA bilden können. EDTA kann somit zu einer Lösung, die den Komplex gemäß der vorliegenden Erfindung enthält, hinzuge- geben werden, so dass das Metallion aus dem Komplex entfernt und in einem EDTA-Komplex gebunden wird, wodurch ein Schalten der Sonde ermöglicht wird. Wird also die Fluoreszenzsonde durch das Metallion aktiviert, d.h. ist sie im„angeschalteten" Zustand, wird sie durch die Zugabe von einem Komplexbildner, wie z.B. EDTA, deaktiviert, d.h.„ausgeschaltet", da der Komplexbildner das Metallion binden kann. Wird hingegen die Fluoreszenzsonde durch das Metallion deaktiviert, d.h. ist sie im„ausgeschalteten" Zustand, wird sie durch die Zugabe von einem Komplexbildner, wie z.B. EDTA, aktiviert, d.h.„angeschaltet", da der Komplexbildner das Metallion binden kann. Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das Metallion Cu2+, da dieses die Fluoreszenz der erfindungsgemäßen Verbindung besonders effizient deaktivieren kann.
Gemäß eines zweiten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie bereit, umfassend die Schritte:
(i) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe;
(ii) Markieren der Probe mit der vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verbindung;
(iii) Einstellen von reversibler Komplexbildung zwischen einem Metallion und der chelatbildenden Gruppe der in Schritt (ii) verwendeten Verbindung durch Einstellen einer geeigneten Metallionenkonzentration;
(iv) Aufnehmen einer Vielzahl von Fluoreszenzbildern;
(v) Nachbearbeitung der Fluoreszenzbilder (Lokalisation einzelner Punktabbildungsfunktionen); und
(vi) Erzeugen eines hochaufgelösten Fluoreszenzbildes durch Kombination der Fluoreszenzbilder aus Schritt (v).
Unter dem Begriff „Anschalten" wird erfindungsgemäß„Aktivieren" einer Fluoreszenzsonde verstanden. Hingegen bedeutet der Begriff „Ausschalten" erfindungsgemäß„Deaktivieren" der Fluoreszenzsonde.
Der erfindungsgemäß verwendete Begriff „Markierung" oder„Markieren" kennzeichnet ein zielgerichtetes Binden der Fluoreszenzsonde an die zu untersuchende Probe mittels des Linkers.
Die zu untersuchende Probe ist nicht besonders eingeschränkt. Beispielsweise können Proteine oder Antikörper mit der erfindungsgemäßen Verbindung markiert werden.
Das Verfahren gemäß eines zweiten Aspekts der Erfindung kann beispielsweise für hochauflösende Einzelmoleküllokalisationsmikroskopie verwendet werden.
Im Schritt (ii) des Verfahrens wird die Fluoreszenzsonde unter Auswahl eines geeigneten Linkers zur spezifischen Markierung von Probenbestandteilen genutzt, z.B. durch kovalente Kopplung an Zielstrukturen, wie beispielsweise Proteine. Ein Beispiel für eine Markierung einer Zielstruktur mit der erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonde ist in Figur 1 gezeigt.
Die Probe kann auf ein Mikroskop gebracht werden, das mit einem rauscharmen, bildgebenden Detektor, z.B. einem CCD- oder CMOS-Sensor, ausgestattet ist, mit dem die Punktabbildungsfunktionen einzelner Moleküle abgebildet werden können.
In Schritt (iii) des Verfahrens wird der zuvor definierte, erfindungsgemäße Komplex gebildet. Dabei wird die Metallionenkonzentration, bspw. die Cu2+-Konzentration, so eingestellt, dass die Fluoreszenzsonden durch reversible Reaktion mit den Metallionen zufällig an- und ausgeschaltet werden, wobei sich die Mehrzahl der Fluoreszenzsonden im Auszustand befindet, so dass sich die Punktabbildungsfunktionen der verbliebenen Sonden nur wenig überlagern.
Alternativ kann die Metallionenkonzentration auch so eingestellt werden, dass die Mehrzahl der Sonden angeschaltet ist. Dann besteht die Möglichkeit, die Intensitätsfluktuationen der einzelnen Sonden mit einer korrelativen Methode (SOFI - su- per-resolution fluctuation imaging) zu analysieren, die wiederum zu höher aufgelösten mikroskopischen Abbildungen führt. Das Prinzip dieser Schaltbarkeit ist für eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Figur 2 gezeigt.
Die Erzeugung der hochaufgelösten Aufnahme der Schritte (iv) bis (vi) kann beispielsweise nach bereits publizierten Verfahren (vgl. zum Beispiel M. Schwering et al., Angewandte Chemie International Edition, 2011 , 50, 2940-2945) erfolgen: Durch Anregung bei geeigneter Wellenlänge wird die Fluoreszenz der Sonden angeregt und das reversible Schalten der einzelnen Fluoreszenzsonden zeitaufgelöst in Bildstapeln aufgezeichnet. In jedem Bild werden die einzelnen Punktabbildungsfunktionen mittels bekannter Algorithmen mit hoher räumlicher Präzision lokalisiert und die Daten zur Rekonstruktion eines hochaufgelösten Bildes verwendet. Bei diesem Verfahren spielt der Abbildungsmodus keine Rolle, so dass beliebige in der hochauflösenden Ein- zelmoleküllokalisationsmikroskopie etablierte Verfahren genutzt werden können, angefangen mit der einfachen Abbildung einer Ebene, wie in der Tota- Ien-Internen-Reflektion-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) oder der Lichtblattmikroskopie, oder Verfahren zur dreidimensionalen Abbildung, wie die Zwei-Ebenen-Abbildung (dual plane imaging), die Astigmatismus-Methode oder das Doppelhelix-Verfahren, um die wichtigsten Beispiele zu nennen.
Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung in dem Verfahren zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie kann der Schaltprozess von der Anregung entkoppelt werden, weil dieser Prozess durch die Konzentration der Metallionen kontrolliert wird. Daher kann die Anregung auf die Maximierung der Photonenausbeute und/oder auf die Kompatibilität mit lebenden Zellen optimiert werden. Zudem sind in der erfindungsgemäßen Verwendung die technischen Anforderungen an die Mikroskope erheblich geringer als beispielsweise STORM oder PALM, da lediglich die Anregung der Fluoreszenzsonde und ein geeigneter Detektor erforderlich sind.
Gemäß eines dritten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren für Multi- plexing in der Fluoreszenzmikroskopie bereit, umfassend die Schritte:
(i) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe; (ii) Markieren der Probe mit der vorstehend definierten erfindungsgemäßen Verbindung (Marker A);
(iii) Markieren der Probe mit einem fluoreszenzfähigen Marker B;
(iv) Aufnahme von mindestens einem Fluoreszenzbild, wobei einer der Marker aktiviert ist und der jeweils andere Marker deaktiviert ist;
(v) Deaktivierung des aktivierten Markers und Aktivierung des deaktivierten Markers;
(vi) Aufnahme von mindestens einem Fluoreszenzbild; und
(vii) Überlagerung der Aufnahmen der Schritte (iv) und (vi).
In dem vorstehend definierten Verfahren gemäß eines dritten Aspekts der Erfindung kann die erfindungsgemäße Verbindung als Marker A zunächst zur spezifischen Markierung von Probenbestandteilen genutzt werden, z.B. durch kovalente Kopplung an Zielstrukturen wie beispielsweise Proteine.
Im Schritt (iii) dieses Verfahrens wird außerdem mindestens ein anderer Probenbestandteil mit einem fluoreszenzfähigen Marker B markiert. Dieser Marker B ist nicht besonders eingeschränkt. Er kann z.B. mit dem gleichen oder einem spektral ähnlichen Fluoreszenzfarbstoff wie der Marker A ausgestattet sein, der aber über einen anderen Mechanismus im Vergleich zur erfindungsgemäßen Verbindung geschaltet wird. Das Markieren der Probe mit diesem Marker B kann beispielsweise über eine kovalente Bindung erreicht werden. Der Schaltmechanismus des Markers B ist nicht besonders eingeschränkt und kann aus Fotozerstörung, Aktivierung der Fluoreszenz durch ein Metallion, Löschung der Fluoreszenz durch andere Reagenzien oder Aktivierung der Fluoreszenz durch andere Reagenzien ausgewählt sein. Durch die Kombination der erfindungsgemäßen Verbindung als Marker A, dessen Fluoreszenz chemisch durch das Einstellen der Metallionenkonzentration eingestellt werden kann, mit dem Marker B, dessen Fluoreszenz über einen anderen Mechanismus gesteuert werden kann, ist es möglich, die Anzahl der Abbildungskanäle im Multiplexing zu erhöhen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren für Multiplexing in der Fluoreszenzmikroskopie kann die Markierung der Probe mit den Markern A und B auch in umgekehrter Reihenfolge durchgeführt werden.
Zudem können zusätzliche Teile der Probe mit mindestens einem weiteren fluoreszenzfähigen Marker markiert werden, dessen Fluoreszenz, wie bei Marker B, über einen anderen Mechanismus als die des Markers A gesteuert werden kann. Dabei unterliegt dieser Marker denselben Einschränkungen wie Marker B hinsichtlich seiner Eigenschaften. Durch den Einsatz weiterer Marker kann die Anzahl der Abbildungskanäle erhöht werden.
Im Schritt (iv) wird mindestens ein Bild der Bestandteile aufgenommen, die mit dem aktivierten Marker A oder mit dem aktivierten Marker B markiert sind. Dabei kann der Marker A oder der Marker B bereits vor der Markierung der Probe aktiviert worden sein oder aktiviert werden, wenn er die Probe bereits markiert.
Die Fluoreszenzaktivität bzw. -inaktivität der erfindungsgemäßen Verbindung wird über die Bildung des zuvor definierten, erfindungsgemäßen Komplexes gesteuert. Dabei kann die Metallionenkonzentration so eingestellt werden, dass alle Marker A zunächst ausgeschaltet sind und keine Fluoreszenz zeigen, während die Marker B angeschaltet sind. Alternativ kann der Marker A zunächst aktiviert und der Marker B deaktiviert sein. Die Fluoreszenzdeaktivierung des Markers B kann z.B. durch Fotozerstörung oder durch Zugabe eines geeigneten Reagenzes erfolgen.
Nach der Bildaufnahme im Schritt (iv) erfolgt im Schritt (v) die Deaktivierung des aktivierten Markers und die Aktivierung des deaktivierten Markers.
Anschließend kann im Schritt (vi) bei identischer Anregung und Detektion mindestens ein zweites Bild aufgenommen werden, in dem der im Gegensatz zu Schritt (iv) andere Marker aktiviert ist.
Die beiden Bilder aus Schritt (iv) und (vi) der markierten Strukturen können vorteilhafterweise ohne Korrektur auf chromatische Aberrationen direkt zu einem„Mehr- farbenbild" im Schritt (vii) des erfindungsgemäßen Verfahrens überlagert werden.
Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens für Multiplexing in der Fluoreszenzmikroskopie sind unter anderem die Unabhängigkeit dieses Verfahrens von der Anregung und der Detektion und die Verwendbarkeit in jedem beliebigem Fluoreszenzmikroskop, auch in hochauflösenden Techniken, wie der strukturierten Beleuchtung (structured Illumination microscopy - SIM) oder Stimulier- ten-Emissions-Depletions-(STED-)Mikroskopie, mit denen höhere Auflösungen erreicht werden können.
Spektrales Multiplexing ist nahezu konkurrenzlos in der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie. Allerdings ist die Implementierung in der STED-Mikroskopie eher aufwendig. Hier erreicht man zurzeit maximal drei spektral verschiedene Kanäle. Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonden ist, dass diese in Kombination mit dem spektralen Multiplexing eingesetzt werden können. Für herkömmliche Fluoreszenzmikroskope mit bis zu fünf spektralen Kanälen ist somit die serielle Abbildung von bis zu zehn Kanälen möglich, wenn lediglich ein Schaltprozess mit fünf verschiedenen Farbstoffen eingesetzt wird. Werden weitere Schaltprozesse hinzugenommen (z.B. mit anderen Metallionen), so kann pro Schaltprozess (ein Satz Fluoreszenzsonden mit fünf verschiedenen Farbstoffen) eine Steigerung um fünf weitere Abbildungskanäle erfolgen. Für die hochauflösende Methode der STED-Mikroskopie ist die Rechnung ähnlich: Ein Schaltprozess verdoppelt die Anzahl verschiedener Kanäle, jeder weitere Schaltprozess erhöht die Anzahl um die entsprechende Anzahl spektraler Kanäle. Insbesondere bei der STED-Mikroskopie können die schaltbaren erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonden zur einfachen Implementierung von Multiplexing verwendet werden.
Gemäß eines vierten Aspekts stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum quantitativen Nachweis von Metallionen bereit, das die folgenden Schritte umfasst:
(i) Bereitstellen einer Lösung eines Metallions;
(ii) Zugabe der erfindungsgemäßen Verbindung;
(iii) Messen der Fluoreszenzaktivität; und (iv) Bestimmung der Metallionenkonzentration aufgrund der im Schritt (iii) gemessenen Fluoreszenzaktivität.
Im Schritt (ii) des oben definierten Verfahrens wird der erfindungsgemäße Komplex gebildet und dessen Fluoreszenzverhalten zur Bestimmung der Metallionenkonzentration genutzt. Dabei kann die erfindungsgemäße Fluoreszenzsonde als Indikator im Schritt (ii) direkt einer Lösung zugegeben werden. Durch Messen der Farbstoffabsorption und der Fluoreszenzintensität (Schritt (iii)) kann die Metallionenkonzentration anhand einer Kalibrierkurve der Intensität oder alternativ durch ratiometrische Messungen bei Sonden, die mehr als ein Fluorophor enthalten, im Schritt (iv) bestimmt werden (Homogene Analyse). Außerdem kann die erfindungsgemäße Fluoreszenzsonde an bestimmte Probenbestandteile kovalent über den Linker gekoppelt werden (Heterogene Analyse). Hierdurch kann die lokale Änderung der Metallionenkonzentration an diesen Bestandteilen verfolgt werden. Beide Verfahren funktionieren auch zeitaufgelöst - können also zur Bestimmung der Änderung der Metallionenkonzentration eingesetzt werden.
Gemäß eines fünften Aspekts stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindung zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere für hochauflösende Einzelmoleküllokalisationsmikrosko- pie, für Multiplexing in der Fluoreszenzmikroskopie oder für den quantitativen Nachweis von Metallionen bereit. Dabei können die erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
Die Figuren zeigen:
Figur 1 : Beispiel für eine Markierung einer Zielstruktur mit der erfindungsgemäßen Verbindung unter Verwendung der etablierten Streptavidin-Biotin-Bindung.
Figur 2: Schematische Darstellung der Komplexierung von Kupferionen durch ein Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Verbindung und das reversible„Schalten" der Fluoreszenz im Ensemble-Experiment durch Zugabe von Cu2+ bzw. EDTA. Figur 3: Synthesebeispiel einer künstlichen Aminosäure, die beispielsweise als Grundgerüst der erfindungsgemäßen Verbindung dienen kann.
Figur 4: Funktionalisierung der in Figur 3 dargestellten künstlichen Aminosäure mit einem Fluorophor und einem Linker. Die linke Spalte zeigt beispielhaft das Prinzip der Funktionalisierung, während die mittlere Spalte verschiedene Fluorophore und die rechte Spalte unterschiedliche Linker aufführt, die für die Funktionalisierung der künstlichen Aminosäure benutzt werden können.
Figur 5: Beispielhafte Syntheseroute auf dem Weg zu einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verbindung. Die Synthese geht von kommerziell erhältlichen Aminosäuren aus und liefert verschieden funktionalisierte Derivate, i) Picolylbro- mid-Hydro-bromid, 5 M Natronlauge, Raumtemperatur, 5 Stunden; ii) R-NFfe, HBTU, DIPEA, DMF, Raumtemperatur, 12 Stunden; iii) Trifluoressigsäure, Raumtemperatur, 5 Stunden.
Figur 6: Beispielhafte Syntheseroute zum fertigen, mit Atto565 und Biotin markierten Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonde: i) Atto565-Azid, Natriumascorbat, CuS04, DMF, 40 °C, 3 Stunden; ii) Trifluoressigsäure, Raumtemperatur, 5 Stunden; iii) Biotinamidohexansäure-NHS, DIPEA, DMF, 40 °C, 3 Stunden. Die Aufreinigung nach Schritt i) und iii) erfolgt mittels HPLC.
Figur 7: Ausführungsbeispiel einer erfindungsgemäßen Fluoreszenzsonde markiert mit Atto565-Azid und Biotinamidohexansäure.
Figur 8: TIR-Fluoreszenzaufnahmen (561 nm Anregung) einer HeLa-Zelle, deren Mikrotubuli über Anti-a-Tubulin mit einer Verbindung des Synthesebeispiels 1 unter Verwendung des Fluorophors Cy3B und dem Linker PEGe-Biotin markiert wurden. Figur 8a) zeigt die Summierung der Bildfolgen der Zelle und Figur 8d) einen Ausschnitt daraus. Figuren 8b) und 8e) zeigen entsprechende hochaufgelöste Bilder, die auf der Basis der Bildfolge mit dem Programm rapidSTORM 2.21. (vgl. Experimen- talteil) rekonstruiert wurden. In der Überlagerung des Mikrographen und der Rekonstruktion (Figur 8c)) und in dem Intensitätsquerschnitt (Figur 8f)) lässt sich eine Verbesserung der Auflösung um das ca. Vierfache erkennen.
Figur 9: Fluoreszenzspektren von Verbindung 1b des Synthesebeispiels 2 bei steigender Kupferkonzentration (Figur 9a)). Zeitaufgelöste Messung der Fluoreszenzintensität. Nach Zugabe von CuSÜ4 erfolgt eine sehr schnelle Fluoreszenzlöschung. Zugabe von EDTA stellt die Fluoreszenz wieder vollständig her (Figur 9b).
Figur 10: Mit Verbindung 1a des Synthesebeispiels 2 markierte menschliche He- La-Zellen. Verwendet wurden anti-Tubulin Primärantikörper, anti-Maus-Biotin Sekundärantikörper, Streptavidin und 1a (Figur 10a)). Wiederholte Zugabe von CuSÜ4 und EDTA ermöglichte mehrere Schaltzyklen (Figur 10b)).
Figur 11 : Markierung von T-Zell-Rezeptorclustern mit 1a des Synthesebeispiels 2. Oben: Fixierte Jurkat T-Zelle, gefärbt mit Atto488-Phalloidin (Figur 11a)) und mit an- ti-pZAP70-Biotin, Streptavidin und 1a (Figur 11b)); Mitte (Figur 11c)): Zeitserie der markierten Zelle in Anwesenheit von CuSÜ4. Die Sonden 1a sind nicht alle zur gleichen Zeit angeschaltet, sondern„blinken" dynamisch; Unten (Figur 11d)): Überlagerung des herkömmlichen Summenbildes (nebelartige Strukturen) mit dem hochaufgelösten Bild aus der Software rapidStorm 2.21 (punktförmige Strukturen). Die Strukturen des hochaufgelösten Bildes (die Punkte in Figur 11d)) sind deutlich feiner. Entlang der Linie eingezeichnet in Figur 11 d) ist das Intensitätsprofil dargestellt (Figur 11e; die punktförmigen Strukturen entsprechen der inneren Kurve und die nebelartigen Strukturen der äußeren Kurve)). Zu erkennen ist die deutlich gesteigerte Auflösung durch Verwendung der„blinkenden" Sonden und der Lokalisationssoftware anhand der Kurven in Figur 11e): Die schmale Kurve des Intensitätsprofils resultiert aus dem hochaufgelösten Bild, welches mithilfe der vorliegenden Erfindung erhalten wurde, und die breite Kurve ergibt sich mittels einer konventionellen Methode.
Figur 12: Immunofluoreszenz-Aufnahmen von regulär markierten Mikrotubuli in fixierten Heia-Zellen. Färbung durch regulär fluoreszenzmarkierte Anti-a-Tubulin Anti- körper (ohne schaltbare Sonde). Figur 12a): Einzelbild und zugehöriger Intensitätsquerschnitt durch ein Filament; Figur 12b): Summenbild über eine Zeitserie von 2000 Aufnahmen; Figur 12c): Rekonstruiertes Bild der rapidSTORM-Software aus der gleichen Zeitserie - mangels Schaltprozess kann keine hochauflösende Information generiert werden.
Figur 13: Chemisches Multiplexing: menschliche HeLa-Zellen wurden wie in Figur 10 beschrieben mit anti-Tubulin, anti-Maus-Biotin, Streptavidin und 1a des Synthesebeispiels 2 markiert. Zusätzlich wurde mit Atto565-Phalloidin markiert. Zugabe von CuS04 schaltet 1a aus, so dass nur das mit Phalloidin markierte Aktin sichtbar ist (Figur 13a)). Nach Photozerstörung der ersten Struktur und Zugabe von EDTA kann die mit 1a markierte Struktur wieder„angeschaltet" und abgebildet werden (Figur 13b)). Aus beiden Bildern kann ein Falschfarbenbild erzeugt werden, obwohl beide Strukturen mit demselben Farbstoff markiert waren (Figur 13c)).
Die nachstehenden Beispiele dienen als weitere Erläuterungen der vorliegenden Erfindung, ohne dass diese darauf beschränkt ist.
Beispiele
Die Implementierung der drei funktionellen Gruppen, d.h. des Fluorophors, des Linkers und der chelatbildenden Gruppe, kann zum Beispiel auf der Basis einer künstlichen Aminosäure gelöst werden. Alternativ können auch kommerziell erhältliche Aminosäuren als Ausgangsverbindung für die Synthese der erfindungsgemäßen Verbindung dienen.
I. Synthese der Fluoreszenzsonde
1 ) Svnthesebeispiel 1 ausgehend von einer künstlichen Aminosäure
Als Basis für die erfindungsgemäße Verbindung kann eine künstliche Aminosäure dienen, welche bereits eine Bindungsstelle für ein Metallion, insbesondere Cu2+, trägt und an der Carboxy- und der Aminofunktion jeweils mit einem Fluorophor bzw. einem Linker funktionalisiert werden kann. Als künstliche Aminosäure kann zum Beispiel BpyAla benutzt werden, deren Synthese in Drienovskä et al., Chem. Sei. 2015, 6, 770-776, aufgezeigt ist. Die Reaktion ist in Figur 3 dargestellt.
Die in Figur 3 gezeigte künstliche Aminosäure enthält bereits eine chelatbildende Gruppe und kann, wie in Figur 4 dargestellt, zudem mit einem Fluorophor und einem Linker funktionalisiert werden. Die linke Spalte der Figur 4 zeigt beispielhaft das Prinzip der Funktionalisierung, während die mittlere Spalte verschiedene Fluorophore und die rechte Spalte unterschiedliche Linker aufführt, die beispielsweise für die Funktionalisierung der künstlichen Aminosäure benutzt werden können.
2) Synthesebeispiel 2 ausgehend von einer kommerziellen Aminosäure
Alternativ zu künstlichen Aminosäuren können auch kommerziell erhältliche Aminosäuren als Basis für die erfindungsgemäße Verbindung dienen. Ein Beispiel für die Synthese von Ausführungsbeispielen der erfindungsgemäßen Verbindung ist in den Figuren 5 bis 7 dargestellt. Wie in Schema 1 der Figur 5 gezeigt, können zwei kommerziell erhältliche, an der α-Aminogruppe BOC-geschützte, Aminosäuren (BOC-Lysin, BOC-Amino-Alanin) verwendet werden, um daran Bis(pyridin-2-ylmethyl)amin) als chelatbildende Gruppe aufzubauen (Verbindung 2a,b). Dies erfolgt in 5M Natronlauge mit 2-(Bromomethyl)pyridin-Hydrobromid für fünf Stunden bei Raumtemperatur mit nachträglicher Aufreinigung auf Kieselgel. Daraufhin wird die freie Carboxygruppe verwendet, um verschiedene Funktionalitäten einzuführen, wie z.B. eine Propargylgruppe (3a,b), ein H-Tetrazin (4a,b) sowie ein Chloralkan-Linker (Halo-Tag, (synthetisiert nach Los et al., ACS Chemical Biology 2008, 6, 373-382.), 5a,b). Die Funktionalitäten werden jeweils als Amine eingesetzt und durch //7-s/'fi/-Aktivierung der Carbonsäure mittels HBTU in trockenem DMF mit DIPEA als Base für 12 Stunden bei Raumtemperatur eingeführt. Die Propargylgruppe kann beispielsweise zur Farbstoffmarkierung via kupferkatalysierter Click-Reaktion mit Azid-markierten Farbstoffen oder Azid-markierten Linkern benutzt werden, Tetra- zin- sowie Chloralkan können der spezifischen Markierung von Zielstrukturen in Zel- len dienen.
Ausgehend von Verbindung BOC-3a,b wird die Synthese von Verbindung 1a,b durchgeführt (vgl. Schema 2 in Figur 6). Dazu wird zuerst die Alkingruppe in Gegenwart von CuSO4 und Natriumascorbat mit einem Äquivalent des Azid-Derivats eines Farbstoffs in DMF bei 40 °C für drei Stunden zur Reaktion gebracht und mittels HPLC aufgereinigt (Gerät„HP Series 1100" der Firma Agilent, Säule„Hypersil ODS" der Firma Säulentechnik Knauer, Laufmittel 1 : H2O, 10 mM Triethylammoniumacetat, Laufmittel 2: 75% Acetonitril, 25% H2O, 10 mM Triethylammoniumacetat; linearer Gradient in 30 Minuten von 100% LM1 nach 100% LM2). Danach wird das Amin mit Trifluoressigsäure für fünf Stunden bei Raumtemperatur entschützt und mit einem Biotinaminohexansäure-NHS-Aktivester in trockenem DMF mit DIPEA als Base für drei Stunden bei Raumtemperatur gekoppelt. Nach Aufreinigung mittels HPLC liegt die fertige Verbindung vor (vgl. Schema 3 in Figur 7).
Verwendete Chemikalien:
BOC-Lysin-OH Sigma-Aldrich 5456
(A/-BOC-yß-amino)-Alanin-OH Sigma-Aldrich 662836
2-(Bromomethyl)pyridin-Hydrobromid Sigma-Aldrich 491047
HBTU Sigma-Aldrich 12804
DMF, wasserfrei Sigma-Aldrich 227056
DIPEA Sigma-Aldrich 387649
Natriumhydroxid pSigma-Aldrich 221465
Ascorbinsäure Sigma-Aldrich A5960
Propargylamin Sigma-Aldrich P50900
Tetrazin-Amin, HCO2H-Salz SICHEM SC-1190
CuSO4-Lösung 0.1 M Sigma-Aldrich 35185
Trifluoressigsäure Carl Roth P088.1
Biotin-Amidohexansäure-NHS Sigma-Aldrich B2643
Atto565-Azid Atto-Tec ad565-101
Acetonitril Sigma-Aldrich 34998
Triethylamin Sigma-Aldrich T0886 Essigsäure Sigma-Aldrich A6283
II. Anwendunqsbeispiele in der Fluoreszenzmikroskopie 1 ) Hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie Beispiel 1 :
Die Bildfolgen in a) bis f) in Figur 8 zeigen beispielhaft TIR-Fluoreszenzauf nahmen (561 nm Anregung) einer HeLa-Zelle, deren Mikrotubuli mit einer Verbindung gemäß des Synthesebeispiels 1 markiert wurden. Die Zellen wurden in Kammerdeckgläsern mit 8 Kammern (LabTek der Firma Nunc) mit 150 pm dickem Glasboden über Nacht zu je 10000 Zellen/cm2 anwachsen gelassen. Danach wurden sie mit 3.7% Formaldehyd und 0.05% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei 37 °C fixiert und permeabi- lisiert und danach viermal gründlich mit PBS gewaschen. Danach erfolgte eine Blockierung mit Inkubationspuffer (eine Lösung von 2% BSA in PBS) für eine Stunde, gefolgt von der Inkubation der Antikörpers, verdünnt in Inkubationspuffer zu etwa 10 pg/mL. Nach jedem Inkubationsschritt wurde viermal gründlich mit PBS gewaschen. Nach Inkubation von 10 pg/mL Streptavidin in Inkubationspuffer für 20 Minuten wurde dreimal gründlich mit PBS gewaschen und mit BpyAla (Synthesebeispiel 1 ) gekoppelt an Cy3B und Biotin (siehe Figur 4), in einer Konzentration von 109 M in Inkubationspuffer für 30 Minuten inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen an einem TIRF/Weitfeld-Mikroskop (Nikon „TiE" Mikroskop, Nikon „TIRF-Illuminator", Nikon „Apo TIRF 100x Oil 1.49" Objektiv, TOPTICA „MLE-LFA" Laserquelle, Anregung bei 561 nm, Cairn Research„OptoSplit III" Strahlteiler, Andor„iXon+ 897 Ultra" emCCD-Kamera, Filter von AHF Analysentechnik) im TIRF-Modus untersucht. Die fixierten und markierten Zellen befanden sich in einem PBS-Puffer, der 16 μΜ CuS04 enthielt, so dass die Sonden durch reversible Bindung und Dissoziation von Cu2+ Ionen in unregelmäßigen Abständen zwischen einem flu- oreszenten und einem gelöschten Zustand schalteten. Die Bildfolgen (4000 Bilder, 25 ms/Bild, Anregungsleistung 1 ,1 mW) wurden einerseits summiert, um ein herkömmliches TIR-Fluoreszenzbild (Figur 8a)) der Zelle bzw. einen Ausschnitt (Figur 8d)) daraus zu erhalten. Außerdem wurde die Bildfolge mit dem Programm rapidSTORM 2.21 aus der Arbeitsgruppe Sauer (Wolter et al. Nature Methods, 9 1040-1041 (2012); http://www.super-resolution.biozentrum.uni-wuerzburg.de/research_topics/rapidstorm, 12.7.2016) analysiert, um daraus entsprechende hochaufgelöste Bilder zu rekonstruieren (Figur 8b) und 8e)). In der Überlagerung des Mikrographen und der Rekonstruktion (Figur 8c)) und in dem Intensitätsquerschnitt (Figur 8f)) lässt sich eine Verbesserung der Auflösung um das ca. Vierfache erkennen.
Die Bildverarbeitung erfolgte mit Origin 9.1 und mit den frei verfügbaren Programmen ImageJ Ver. 1.50g und InkScape Ver. 0.91.
Verwendete Reagenzien und Antikörper:
CuSO4-Lösung, 0.1 M Sigma-Aldrich 35185
EDTA, Dinatriumsalz Sigma-Aldrich E4884
Paraformaldehyd Sigma-Aldrich 158127
Triton X-100 Fluka 93426
PBS, ohne CaCb und MgCb, steril Sigma-Aldrich D8537
Rinderserumalbumin (BSA) Fluka 05471 anti-a-Tubulin, monoklonal, Maus Sigma Aldrich T8203 anti-Maus-Biotin, polyklonal, Ziege Sigma-Aldrich B7264
Streptavidin, rekombinant Sigma-Aldrich S0677
Beispiel 2: Fluoreszenzverhalten von 1b bei Zugabe von CuSO4-Lösung
Fluoreszenzspektren von Verbindung 1b des Synthesebeispiels 2 bei steigender Kupferkonzentration (Figur 9a)). Es wurden die Fluoreszenzspektren einer 500 nM Lösung von 1b in PBS (schwarz) und nach Zugabe kleiner Äquivalente einer Cu- SO4-Lösung bis zu einer Konzentration von 8.3 μΜ (grau) aufgenommen (Spektro- meter„Cary Eclipse" der Firma Agilent). In einer zeitaufgelösten Messung der Fluoreszenzintensität wurde eine 500 nM Lösung von 1b in PBS vermessen. Nach Zugabe von einem Äquivalent CuSO4 erfolgt eine schnelle Vermischung mittels Pipette, was zu einer sehr schnellen Fluoreszenzlöschung führt. Zugabe von einem Äquivalent EDTA stellt die Fluoreszenz wieder vollständig her (Figur 9b)). Die Verbindung 1b des Synthesebeispiels 2 zeigt gute Fluoreszenzlöschung durch Cu2+-lonen. Die Löschung erfolgt sehr schnell und reversibel. Durch Zugabe eines Komplexbildners wie EDTA kann die ursprüngliche Fluoreszenz wiederhergestellt werden (vgl. Figur 9).
Der Biotin-Linker von 1a,b kann zur Konjugation an biotinylierte Antikörper verwendet werden. Dazu wurden, wie in Figur 10 gezeigt, menschliche HeLa-Zellen mit an- ti-Tubulin, anti-Maus-Biotin, Streptavidin und 1a markiert. Die Zellen wurden in Kammerdeckgläsern mit 8 Kammern (LabTek der Firma Nunc) mit 150 pm dickem Glasboden über Nacht zu je 10000 Zellen/cm2 anwachsen gelassen. Danach wurden sie mit 3.7% Formaldehyd und 0.05% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten bei 37 °C fixiert und permeabilisiert und danach viermal gründlich mit PBS gewaschen. Danach erfolgte eine Blockierung mit Inkubationspuffer (eine Lösung von 2% BSA in PBS) für eine Stunde, gefolgt von der Inkubation der Antikörper, verdünnt in Inkubationspuffer zu etwa 10 pg/mL. Nach jedem Inkubationsschritt wurde viermal gründlich mit PBS gewaschen. Nach Inkubation von 10 pg/mL Streptavidin in Inkubationspuffer für 20 Minuten wurde dreimal gründlich mit PBS gewaschen und 1b in einer Konzentration von 10"9 M in Inkubationspuffer für 30 Minuten inkubiert. Nach viermaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen an einem TIRF/Weitfeld-Mikroskop (Nikon„TiE" Mikroskop, Nikon „TIRF-Illuminator", Nikon „Apo TIRF 100x Oil 1.49" Objektiv, TOPTICA „MLE-LFA" Laserquelle, Anregung bei 561 nm, Caim Research„OptoSplit III" Strahlteiler, Andor„iXon+ 897 Ultra" emCCD-Kamera, Filter von AHF Analysentechnik) im Weitfeld-Modus untersucht. Deutlich sind die Mikrotubuli in der Zelle erkennbar. Wiederholtes Zugeben von CuS04 und EDTA schaltet 1a an und aus. Dieser Vorgang ist mehrmals wiederholbar. Für das Experiment wurde die Probe auf dem Mikroskop fixiert. Die Zugabe von CuS04 (100 μΜ) und EDTA (1 ni ) erfolgte mittels Eppendorf-Pipetten. Nach jedem Schaltzyklus (CuS04 und EDTA) wurde mit Hilfe von Spritzen die Flüssigkeit mehrmals vorsichtig entfernt und durch PBS ersetzt. Danach erfolgte der nächste Schaltzyklus. Die Bildverarbeitung erfolgte mit den frei verfügbaren Programmen ImageJ Ver. 1.50g und InkScape Ver. 0.91.
Verwendete Reagenzien und Antikörper:
CuS04-Lösung, 0.1 M Sigma-Aldrich 35185 EDTA, Dinatriumsalz Sigma-Aldrich E4884 Paraformaldehyd Sigma-Aldrich 158127 Triton X-100 Fluka 93426
PBS, ohne CaCfc und MgCfc, steril Sigma-Aldrich D8537 Rinderserumalbumin (BSA) Fluka 05471 anti-a-Tubulin, monoklonal, Maus Sigma Aldrich T8203 anti-Maus-Biotin, polyklonal, Ziege Sigma-Aldrich B7264 Streptavidin, rekombinant Sigma-Aldrich S0677
Beispiel 3:
In Figur 11 ist die Verwendung des chemischen Schalters für die hochaufgelöste Lokalisationsmikroskopie demonstriert. Sie zeigt die Markierung von T-Zell-Rezeptorclustern mit 1a des Synthesebeispiels 2. Hier wurde pZAP70 in Re- zeptorclustern fixierter Jurkat T-Zellen markiert. Die Zellen wurden in Kammerdeckgläsern (8 Kammern LabTek der Firma Nunc, 150 pm Glasdicke) zu je 5000 Zellen/cm2 auf die Glasoberfläche gesetzt, die vorher mit Poly-L-Lysin und an- ti-CD3-Antikörpern beschichtet wurden (siehe Abraham et al., J.lmmunol. 2012, 189, 1898-1910.). Nach fünf Minuten wurde vorsichtig mit 3.7% Formaldehyd und 0.05% Triton X-100 in PBS fixiert, mit PBS gewaschen und mit 10 pg/mL anti-pZAP70-Biotin Antikörpern in Inkubationspuffer (2% BSA in PBS) für eine Stunde inkubiert. Danach wurde dreimal mit PBS gewaschen und 10 pg/mL Streptavidin sowie 10-10 M At- to488-Phalloidin in Inkubationspuffer für 20 Minuten inkubiert. Nach gründlichem Waschen mit PBS wurden 1a in Inkubationspuffer bei einer Konzentration von 10"9 M für 30 Minuten inkubiert und erneut gründlich mit PBS gewaschen. Die Sonden blinken in Anwesenheit von 50 μΜ CuS04 in PBS. Von den so präparierten Zellen wurden Videos von 5000 Bildern bei einer Belichtungszeit von 20 ms bei 561 nm Anregung aufgenommen. Diese wurden mit dem Lokalisationsalgorithmus (rapidStorm 2.21) verarbeitet. In Figur 11 d) ist die Überlagerung des hochaufgelösten Lokalisa- tionsbildes (punktförmige Strukturen) mit dem herkömmlichen Summen-Fluoreszenzbild (nebelartige Strukturen) dargestellt. Zusätzlich ist die Kontur der betrachteten Zelle in weiß dargestellt. Ein Cluster ist hervorgehoben. Hier sieht man deutlich die etwa 3-4-fach höhere Auflösung des Lokalisationsansatzes in Figur 11 e). Die Bildverarbeitung erfolgte mit Origin 9.1 und mit den frei verfügbaren Programmen ImageJ Ver. 1.50g und InkScape Ver. 0.91.
Verwendete Reagenzien
poly-L-Lysin Sigma-Aldrich P8920 anti-Human-CD3 BD Biosciences 347340
PBS, ohne CaCfc und MgCte, steril Sigma-Aldrich D8537
Rinderserumalbumin (BSA) Fluka 05471 anti-Phospho-ZAP70-Biotin Bioss bs3479r
Streptavidin, rekombinant Sigma-Aldrich S0677
CuSO4-Lösung, 0.1M Sigma-Aldrich 35185
Atto488-Phalloidin Atto-Tec ad488-81
Verqleichsbeispiel ohne schaltbare Sonde
Immunofluoreszenz-Aufnahmen von regulär markierten Mikrotubuli in fixierten Heia-Zellen (vgl. Figur 12). Färbung durch regulär fluoreszenzmarkierten TMR-Anti-a-Tubulin Antikörper (ohne schaltbare Sonde). Präparation der Zellen, Mikroskopsetup, Analysesoftware analog zu Beispiel 1. Figur 12a): Einzelbild und zugehöriger Intensitätsquerschnitt durch ein Filament; Figur 12b): Summenbild über eine Zeitserie von 2000 Aufnahmen; Figur 12c): Rekonstruiertes Bild der ra- pidSTORM-Software aus der gleichen Zeitserie - mangels Schaltprozess kann keine hochauflösende Information generiert werden.
2) Multiplexinq Beispiel 4:
Chemisches Multiplexing wurde an einer doppelt markierten Zelle demonstriert (vgl. Figur 13). Dabei wurde das Aktin-Cytoskelett mit Atto565-Phalloidin und Mikrotubuli mit 1a des Synthesebeispiels 2 gefärbt. HeLa Zellen wurden zu 10000 Zellen/cm2 in ein Kammerdeckglas (LabTek, 8 Kammern der Firma Nunc) gesetzt und über Nacht anwachsen gelassen. Dann wurde mit 3.7% Formaldehyd und 0.05% Triton X-100 in PBS für 10 Minuten fixiert und danach gründlich viermal mit PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann mit anti-a-Tubulin (10 g/mL) in Inkubationspuffer (2% BSA in PBS) für eine Stunde inkubiert und gründlich mit PBS gewaschen. Danach wurde anti-Maus-Biotin zu 10 pg/mL in Inkubationspuffer für eine Stunde inkubiert und danach wieder gründlich mit PBS gewaschen. Dann wurde Streptavidin (10 pg/mL) in Inkubationspuffer für 20 Minuten inkubiert, gefolgt von gründlichem Waschen mit PBS und Inkubation von 1a (10-9 M) und Atto565-Phalloidin (10-10 M) in Inkubationspuffer für 30 Minuten. Nach mehrmaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen in 50 μΜ CuS04-Lösung in PBS an einem TIRF/Weitfeld-Mikroskop (vgl. Beispiel 2) bei Anregung mit 561 nm mikroskopiert. In Anwesenheit von CuSÜ4 ist 1a ausgeschaltet und nur das Aktin ist sichtbar und wird abgebildet (Figur 13 a)). Nach Photozerstörung und Zugabe von 200 μΜ EDTA in PBS sind die Mikrotubuli sichtbar (Figur 13 b)). Das daraus generierte Falschfarbenbild in Figur 13 c) ist bei nur einer Detektionsfarbe entstanden, es handelt sich beide Male um den Farbstoff Atto565. Die Bildverarbeitung erfolgte mit den frei verfügbaren Programmen ImageJ Ver. 1 .50g und InkScape Ver. 0.91.
Verwendete Reagenzien und Antikörper:
Paraformaldehyd Sigma-Aldrich 158127
Triton X-100 Fluka 93426
PBS, ohne CaCfe und MgCte, steril Sigma-Aldrich D8537
Rinderserumalbumin (BSA) Fluka 05471 anti-a-Tubulin, monoklonal, Maus Sigma Aldrich T8203 anti-Maus-Biotin, polyklonal, Ziege Sigma-Aldrich B7264
Streptavidin, rekombinant Sigma-Aldrich S0677
Atto565-Phalloidin Atto-Tec ad-565-81
CuS04-Lösung, 0.1 M Sigma-Aldrich 35185
EDTA, Dinatriumsalz Sigma-Aldrich E4884

Claims

Patentansprüche
1. Verbindung, umfassend mindestens eine chelatbildende Gruppe, mindestens einen Linker und mindestens einen Fluorophor, dargestellt durch die Formel (1):
Formel (1),
Figure imgf000035_0001
wobei
jeweils eine der Gruppen R1 und R2 mindestens einen Fluorophor umfasst und die jeweils andere der Gruppen R1 und R2 mindestens einen Linker umfasst; R3 aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer ha- logenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt ist; n eine natürliche Zahl von 0 bis 6 ist;
X eine Einfachbindung oder ein Substituent gemäß der Formel (X-1) ist;
Formel (X-1),
Figure imgf000035_0002
wobei
mehrere R4 unabhängig voneinander vorliegen können und jeweils aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Amino- gruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt sind;
Y eine chelatbildende Gruppe gemäß Formel (Y-1) oder Formel (Y-2), ist
Figure imgf000036_0001
Formel (Y-1 ) Formel (Y-2) wobei mehrere R5 und R6 unabhängig voneinander vorliegen können und R5 und R6 unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus H, einer Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer halogenierten Ci- bis C3-Alkylgruppe, einer Carboxygruppe, einer Carbonylgruppe, einer Aminogruppe, einer Sulfonatgruppe, einer Phosphatgruppe, einer Hydroxygruppe und einem Halogen, ausgewählt sind; und
R7 und R8 unabhängig voneinander aus einer Gruppe, bestehend aus einem Pyridyl-, Pyrimidinyl-, Pyrazinyl-, Pyridizinyl-, Isoquinolinyl-, Imidazolyl-, Quinolyl-, Bis(phenantrolin)yl-, Carboxy-, Carboxyester-, und Kronenether-Rest oder Derivaten davon, ausgewählt sind; und
wobei der Linker aus einer Gruppe, bestehend aus Biotin, Propargyl, Tetrazin, Methyl-Tetrazin, Halogen-Alkan, Benzylguanin und Derivaten davon, ausgewählt ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 , wobei der mindestens eine Fluorophor aus einer Gruppe, bestehend aus Derivaten von Xanthen, Acridin, Cyanin, Cumarin, Rhodamin, Silizium-Rhodamin, Carbopyronin, Bordipyrromethen, Perylen und Oxazin, ausgewählt ist.
Verbindung gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei Y der Formel (Y-1-1) entspricht.
Formel (Y-1-1)
Figure imgf000036_0002
4. Verbindung gemäß Anspruch 3, wobei X eine Einfachbindung, n 1 und R3 H ist.
5. Verbindun gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei Y der Formel (Y-2-1) entspricht.
Formel (Y-2-1)
Figure imgf000037_0001
6. Verbindung gemäß Anspruch 5, wobei X eine Einfachbindung, n 1 oder 4 und R3 H ist.
7. Komplex, umfassend die Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 und mindestens ein Metallion.
8. Verfahren zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie, umfassend die Schritte:
(i) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe;
(ii) Markieren der Probe mit der Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis
6;
(iii) Einstellen von reversibler Komplexbildung zwischen einem Metallion und der chelatbildenden Gruppe der in Schritt (ii) verwendeten Verbindung durch Einstellen einer geeigneten Metallionenkonzentration;
(iv) Aufnehmen einer Vielzahl von Fluoreszenzbildern;
(v) Nachbearbeitung der Fluoreszenzbilder (Lokalisation einzelner Punktabbildungsfunktionen); und
(vi) Erzeugen eines hochaufgelösten Fluoreszenzbildes durch Kombination der Fluoreszenzbilder aus Schritt (v).
9. Verfahren für Multiplexing in der Fluoreszenzmikroskopie, umfassend die Schritte: (i) Bereitstellen einer zu untersuchenden Probe;
(ii) Markieren der Probe mit der Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 (Marker A);
(iii) Markieren der Probe mit einem fluoreszenzfähigen Marker B;
(iv) Aufnahme von mindestens einem Fluoreszenzbild, wobei einer der Marker aktiviert ist und der jeweils andere Marker deaktiviert ist;
(v) Deaktivierung des aktivierten Markers und Aktivierung des deaktivierten Markers;
(vi) Aufnahme von mindestens einem Fluoreszenzbild; und
(vii) Überlagerung der Aufnahmen der Schritte (iv) und (vi).
Verfahren zum quantitativen Nachweis von Metallionen, umfassend die Schritte:
(i) Bereitstellen einer Lösung eines Metallions;
(ii) Zugabe der Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6;
(iii) Messen der Fluoreszenzaktivität; und
(iv) Bestimmung der Metallionenkonzentration aufgrund der in Schritt (iii) gemessenen Fluoreszenzaktivität.
11. Verwendung der Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Erhöhung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie, für Multiplexing in der Fluoreszenzmikroskopie oder für den quantitativen Nachweis von Metallionen.
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