DE102012210055B4

DE102012210055B4 - Nachweis der Viabilität biologischer Proben

Info

Publication number: DE102012210055B4
Application number: DE102012210055.5A
Authority: DE
Inventors: Detlev Goj; Ulf-Georg Bickmeyer; Guido Schramm
Original assignee: Alfred Wegener Insitut fuer Polar und Meeresforschung
Current assignee: Alfred Wegener Insitut fuer Polar und Meeresforschung
Priority date: 2012-06-14
Filing date: 2012-06-14
Publication date: 2017-03-02
Anticipated expiration: 2032-06-15
Also published as: EP2861606A1; US20150132788A1; WO2013186187A1; DE102012210055A1

Abstract

Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit einer oder mehrerer biologischen Proben, umfassend a) das Bereitstellen der zu untersuchenden biologischen Probe(n), b) die Inkubation der unter a) bereitgestellten biologischen Probe(n) mit Ageladine A, c) die UV-Anregung der unter b) erhaltenen inkubierten biologischen Probe mit UV-Licht einer Wellenlänge von 370 nm, und d) das Erfassen von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Anteilen der gemäß c) UV-angeregten biologischen Probe(n) im Bereich zwischen 410 – 480 nm.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Verwendung und ein Kit zum Nachweis der Viabilität (Lebensfähigkeit) biologischer Proben.
Verfahren zur Beurteilung der biologischen Viabilität (Lebensfähigkeit) sind im Stand der Technik bekannt, wie beispielsweise für die Zellviabilität (Zelllebensfähigkeit, Lebendzellzahl), die in der Mikrobiologie den Anteil lebender Zellen in einer Zellpopulation bezeichnet. Viabilitätsnachweise basieren auf Eigenschaften lebender Zellen wie Endozytose, enzymatische Aktivität, Unversehrtheit der Zellmembran oder Vermehrung. Da jede Methode Schwächen aufweist, werden teilweise fluoreszierende Doppelfärbungen zum gleichzeitigen Nachweis von Apoptose und Nekrose durchgeführt, wie z. B. die Vital-Fluoreszenz-Doppelfärbung mit Propidiumiodid (PI) und Annexin V (siehe unten). Doppelt gefärbte Zellen mit Annexin V und PI zeigen tote Zellen an, während einfach PI-gefärbte Zellen als nekrotisch und einfach Annexin V-gefärbte Zellen als apoptotisch klassifiziert werden. Die Verfahren zum Nachweis der biologischen Viabilität (Lebensfähigkeit) weisen also entweder lebende oder tote Zellen nach.
Der Begriff „lebend” bezeichnet hierbei in der Biologie bestimmte Eigenschaften von Lebewesen, die diese als „lebend” von unbelebten und toten Systemen in der Natur abgrenzen. Auf alle lebenden Organismen („Lebewesen”) müssen zumindest auf der Ebene der Zelle alle Kennzeichen zutreffen. Tote Organismen wiesen in ihrer Vergangenheit alle Kennzeichen auf. Latentes Leben haben Organismen, die zwar nicht alle Kennzeichen aufweisen, also toten Organismen oder unbelebten Gegenständen ähnlich sind, jederzeit aber zu lebenden Organismen werden können, z. B. Sporen von Bakterien oder Pilzen). Unbelebte Gegenstände zeigen zur Zeit ihrer Existenz nicht alle Kennzeichen. Daneben gibt es hypothetische Frühstadien der Entwicklung des Lebens sowie rezente Grenzformen des Lebens, wie z. B. Viren. Drei wesentliche Eigenschaften haben sich aber herauskristallisiert, die für alle Lebewesen im Rahmen dieses Textes als Definitionskriterien gelten sollen: 1) Stoffwechsel (Metabolismus) während zumindest einer Lebensphase, was eine Kompartimentierung durch eine Wand oder Membran bedingt; 2) Fähigkeit zur Selbstreproduktion; und 3) die mit der Selbstreproduktion verbundene genetische Variabilität als Bedingung evolutionärer Entwicklung. Lebewesen werden somit in der Biologie als organisierte genetische Einheiten definiert, die zu Stoffwechsel, Fortpflanzung und Evolution fähig sind, also die Kriterien des Lebendigen erfüllen.
Die oben genannten Verfahren zum Nachweis der biologischen Viabilität (Lebensfähigkeit), die entweder lebende oder tote Zellen nachweisen, sind in bestimmten Fällen bisher nicht anwendbar, so dass im Stand der Technik noch auf in-vivo Verfahren zurückgegriffen wird, wie dies bei medizinisch relevanten Parasiten-Systemen der Fall ist. Beispielsweise werden mikroskopisch kleine Eier (Ova) des Parasiten Trichuris suis (Schweinepeitschenwurm), welcher zu der Gattung der Helminthen gehört, für medizinische Zwecke produziert. Diese Eier werden in einem unreinen und nicht embryonierten Zustand aus Schweinen gewonnen, unter kontrollierten Bedingungen aufgereinigt und zur Embryonierung gebracht. In spezifizierten Mengen (Dosierungen) und in einer Phosphat-gepufferten Salinenlösung dienen diese Eier als Medikament zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen. Dieser Einsatz in der Humanmedizin beruht auf Studien der University of Iowa (Iowa City, USA) und die Einnahme der Eier des Schweinepeitschenwurms (Trichuris suis ova) hat beim Menschen einen positiven Effekt auf die Remission oder Rezidivprophylaxe bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen. Der Therapieansatz fußt auf der Annahme, dass das bei Autoimmunerkrankungen überschießende Immunsystem die Darmwand nicht mehr angreifen würde, wenn man ihm eine andere Aufgabe stellt. Diese Therapie, z. B. für Patienten mit Morbus Crohn und Colitis ulcerosa, ist auch unter dem Namen TSO bekannt, wobei TSO für Trichuris Suis Ova steht, die Eier des Schweine-Peitschenwurmes (Trichuris suis). TSO ist somit ein Therapeutikum, das die mit bloßem Auge nicht erkennbaren und nur grob einen zwanzigstel Millimeter kleinen Eier des Schweine-Peitschenwurmes enthält. Jede Dosis des Therapeutikums, das als Rezeptur-Arzneimittel hergestellt wird, enthält 2500 in Flüssigkeit aufgeschwemmte Eier. Die Eier des Schweine-Peitschenwurms sind für den Menschen harmlos, da sie im Menschen als nicht natürlicher Wirt nur kurz überleben und sich dort auch nicht mehr vermehren können, und nach der Ingestion treten auch keine Symptome wie Bauchschmerzen auf. Die Eier werden – sterilisiert, aber nicht abgetötet – in einer neutralen Suspension geschluckt und setzen sich dann im Bereich des Zwölffingerdarms ab. Sie überleben dort etwa 14 Tage, lösen sich dann von der Darmwand und werden verdaut. Sporadisch kann es sein, dass gelegentlich ein kleiner Wurm schlüpft. Dieser stirbt aber sofort wieder ab und verkümmert, weil er im falschen Wirt ist.
Auf welche Weise bei der Bio-Immuntherapie mit TSO die Eier von Trichuris suis bei Crohn- und Colitis-Patienten im Darm wirken, ist noch nicht endgültig geklärt. Es wird aber angenommen, dass die Eier das Immunsystem so stimulieren, dass die für Morbus Crohn und Colitis ulcerosa typischen Störungen im Immunsystem ausgeglichen werden. Für Patienten mit Darmentzündung ist etwa eine überschießende Immunantwort der T-Helferzellen vom Typ 1 (TH-1-Zellen) typisch, möglicherweise eine pathologische Reaktion auf physiologisch sich im Darmlumen befindliche Stoffe. Wurmeier regulieren dagegen das entzündungshemmende TH-2-Zellsystem in die Höhe. Die Viabilität (Lebensfähigkeit) der Eier des Schweine-Peitschenwurmes ist somit für die Qualität und Wirksamkeit des Therapeutikums von entscheidender Bedeutung und muss im Herstellungs- und Gewinnungsprozess nachgewiesen werden. Die Zucht des Schweine-Peitschenwurmes ist allerdings aufwändig. In beinahe sterilen Hausschweinen müssen die Peitschenwürmer drei Monate lang heranreifen. Dann werden die Ausscheidungen der Tiere aufgefangen und die nun trächtigen (embryonierten) Würmer können separiert gewonnen werden. Ein Schwein liefert so etwa 1 Million Wurmeier. Für eine immunologisch wirksame Einzeldosis werden je 2.500 Eier benötigt. Bevor nun die Eier des Schweine-Peitschenwurmes als Medikament vom Herstellungsleiter zur Herstellung immunologisch wirksamer Einzeldosen freigegeben werden können, müssen daher Proben aus jeweils einer homogenen Produktionscharge auf ihre Lebensfähigkeit (Viabilität) überprüft werden. Dies geschieht im Stand der Technik bisher in einem aufwändigen Verfahren, bei dem die Proben zurück in das Schwein als natürlichen Wirt dieses Parasiten verbracht werden. Dort entwickeln sich dann aus den Eiern im Darm des Schweines innerhalb von ca. 3 Monaten neue Würmer, die wiederum erneut Eier produzieren und damit ihre Viabilität nachweisen. Gemäß der gesetzlichen Vorgaben müssen Tiere, die Teil eines Herstellungsprozesses von Arzneimitteln waren, nach erfülltem Nutzen getötet werden, womit dieser Viabilitätstest nicht nur Kosten- und Zeitaufwendig ist, sondern auch ethisch bedenklich.
Es bestand daher die Aufgabe, einen wirtschaftlichen und technisch möglichst einfachen und verlässlichen Viabilitätstest, insbesondere als ein allgemein anwendbares in-vitro Verfahren zur Beurteilung der Viabilität (Lebensfähigkeit) von biologischen Proben, bereitzustellen, das die Nachteile des Standes der Technik vermeidet. Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung bestand im Besonderen auch darin, ein geeignetes Verfahren, eine geeignete Verwendung und einen geeigneten Kit zum Nachweis der Viabilität (Lebensfähigkeit) biologischer Proben anzugeben, das den Einsatz von Fluoreszenzfarbstoffen erlaubt und auch zum Ersatz von in-vivo Methoden des Standes der Technik geeignet ist.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wurde nun gefunden, dass degenerierte Eier des Trichuris suis (Schweine-Peitschenwurm) innerhalb ihrer Membran einen niedrigen pH-Wert, viable, also lebensfähige Eier jedoch einen hohen pH-Wert aufweisen. Die vorliegende Erfindung schlägt daher in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung vor, die Viabilität der Eier des Schweine-Peitschenwurms anstatt mit dem aufwendigen in-vivo Reinfektionstest in Schweinen durch den Einsatz von Ageladin A zu ersetzen. Die erfindungsgemäßen Versuche zur Färbung der Trichuris suis Eier mit dem pH-sensitiven Vitalfarbstoff Ageladin A verliefen erfolgreich und zeigten, dass Ageladin A unter UV-Anregung mittels Multiphotonenmikroskopie in degenerierten Eiern des Trichuris suis fluoresziert. Die Methode ermöglicht damit eine Differenzierung zwischen viablen und nichtviablen Nematodeneiern und ist darüber hinaus allgemein für in-vitro Verfahren zur Beurteilung der Viabilität (Lebensfähigkeit) einer Vielzahl von biologischen Proben geeignet.
Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) einer oder mehrerer biologischen Proben, umfassend a) das Bereitstellen der zu untersuchenden biologischen Probe(n); b) die Inkubation der unter a) bereitgestellten biologischen Probe(n) mit Ageladine A; die UV-Anregung der unter b) erhaltenen inkubierten biologischen Probe mit UV-Licht einer Wellenlänge von 370 nm; und d) das Erfassen von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Anteilen der gemäß c) UV-angeregten biologischen Probe(n) im Bereich zwischen 410–480 nm.
Das pyrrole-immidazole Alkaloid Ageladin A ist ein Naturstoff aus dem Meeresschwamm Agelas clathrodes, auch bekannt unter dem Namen Elefantenohr-Schwamm, und kann mittlerweile auch in einem synthetischen Verfahren gewonnen werden. Ageladin A zeigt eine Fluoreszenz im blau-grünen Bereich in Abhängigkeit vom pH-Wert. Es ist bromiert und erleichtert eine Membran-Durchdringung in Zellmaterialien, wodurch eine unschädliche Färbung der Zellen ermöglicht wird. Die höchste Fluoreszenz durch Ageladine A zeigt sich im Bereich pH 4 und nimmt ab bei steigendem pH-Wert.
Die DE 10 2007 034 886 A1 beschreibt bereits ein optisches Messverfahren zur Ermittlung des pH-Werts eines Mediums durch – Zugabe von Ageladine A als fluoreszierender pH-Wert-Indikator in das Medium, – Fluoreszenzanregung des pH-Wert-Indikators durch Bestrahlung des pH-Wert-Indikators mit Licht zumindest einer ausgewählten Wellenlänge und – Detektion der emittierten Fluoreszenzintensitäten des pH-Wert-Indikators als Maß für den pH-Wert des Mediums.
Die DE 10 2007 034 886 A1 beschreibt den Einsatz von Ageladine nur allgemein als pH-Indikator. Demgegenüber ist die Eignung von Ageladine für den Einsatz als Viabilitätstest sowie pH-Messungen zum Zwecke eines Viabilitätstests in der DE 10 2007 034 886 A1 nicht erwähnt. Mit der US-Patentschrift US 6800765 B2 ist bereits ein Viabilitätstest mit pH-sensitiven Farbstoffen im Stand der Technik bekannt. Die US 6800765 B2 betrifft hierbei Systeme, einschließlich Zusammensetzungen und Verfahren, zum Messen des pH-Wertes, insbesondere in Zellen, Organellen und anderen Proben zur Prüfung der Zellviabilität, wobei die Zusammensetzungen ein pH-sensitives fluoreszierendes Agens und fluorogene 2',7'-Dialkylfluorescein-Derivate und zugehörige nicht-fluoreszierende Vorläuferverbindungen umfassen. Die Zusammensetzungen erlauben Quotientenmetrische Messungen im Anregungsspektrum und dem Emissionsspektrum. Die beschriebenen Verfahren umfassen dabei das Hinzufügen einer Vorläuferverbindung zu einer Zellprobe, Inkubieren der Zellprobe, um den freien Indikator freizusetzen, Beleuchten der Zellprobe, und Nachweisen der Fluoreszenz-Antwort des freien Indikators. Ein Viabilitätstest unter Verwendung von Ageladine oder für Zellen, Gewebe und Organismen, die ansonsten pH-Indikatoren schwer aufnehmen und längere Zeit inkubiert werden müssen und somit einen pH-Indikator wie z. B. Ageladine erfordern, der auch bei längerer Inkubationszeit nicht toxisch ist, wird jedoch weder von der DE 10 2007 034 886 A1 noch von der US 6800765 B2 beschrieben.
Insbesondere finden sich in der DE 10 2007 034 886 A1 und der US 6800765 B2 auch keine Hinweise auf die erfindungsgemäße Anwendung von Ageladine in einem Viabilitätsnachweis speziell bei Peitschenwurmeiern, bei denen ein weiteres Problem besteht, nämlich dass das Einbringen von pH-Indikatoren in diese Eier generell schwierig ist und nur mit dem auch bei langer Inkubationszeit nicht zell-toxischen Ageladine gelingt.
Die Eignung von Ageladine in einem Viabilitätsnachweis bei biologischen Proben, beispielsweise bei medizinisch relevante Parasiten-Systeme wie speziell bei Peitschenwurmeiern, bei denen das Problem besteht, dass das Einbringen von pH-Indikatoren schwierig ist, die sich also gegebenenfalls gar nicht oder nur unzureichend bzw. nur unter langen und/oder verschärften Inkubationsbedingungen anfärben lassen, ist daher überraschend.
Die Erfindung betrifft daher auch ein erfindungsgemäßes Verfahren unter Verwendung von Ageladine zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) von biologischen Proben, das sich dadurch auszeichnet, dass die biologischen Proben durch übliche, andere als Ageladine A, Fluoreszenzfarbstoffe nur schwierig, d. h. beispielsweise gar nicht oder nur unzureichend bzw. nur unter langen und/oder verschärften Inkubationsbedingungen intrazellulär anfärbbar sind.
Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung von Ageladine sind solche Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) von biologischen Proben, die sich dadurch auszeichnen, dass die biologischen Proben aus biologischen Präparaten entstammen, die in lebensfähiger Form zur Herstellung von Arzneimitteln und/oder Therapeutika dienen. Solche biologischen Präparate können beispielsweise medizinisch relevante Parasiten-Systeme, insbesondere speziell biologische Präparate aus Peitschenwurmeiern, sein. Die Erfindung ist jedoch nicht auf solche medizinisch relevante Parasiten-Systeme beschränkt, sondern umfasst allgemein Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) von biologischen Proben, die sich dadurch auszeichnen, dass die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (niederen) Organismen, insbesondere Mikroorganismen, parasitäre und nicht-parasitäre Organismen, Zellen, Einzellern oder Zellverbänden, Geweben, Organellen, Spermien, Eizellen und Ovarien. Bevorzugt ist die biologische Probe aber ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus parasitären und nicht-parasitären Organismen und Ovarien solcher parasitären und nicht-parasitären Organismen. In einem besonders bevorzugten erfindungsgemäßen dienen die Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) von biologischen Proben, wobei als biologische Probe Ovarien parasitärer und/oder nicht-parasitärer Würmer ausgewählt sind, vorzugsweise Ovarien parasitärer und/oder nicht-parasitärer Würmer, die in lebensfähiger Form zur Herstellung von Arzneimitteln und/oder Therapeutika dienen. Besondere Bedeutung kommt hierbei erfindungsgemäßen Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) von biologischen Proben zu, bei denen als biologische Probe Ovarien parasitärer Würmer, vorzugsweise Ovarien von Helminthen, besonders bevorzugt Ovarien des Schweinepeitschenwurms (Trichuris suis), ausgewählt sind.
Besonders vorteilhaft lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) von solchen biologischen Proben einsetzen, bei denen eine nachlassende Lebensfähigkeit (Viabilität) der biologischen Proben mit einer Veränderung des intra-zellulären pH-Wertes, vorzugsweise mit einer Erniedrigung des intra-zellulären pH-Wertes, und besonders bevorzugt mit einer Erniedrigung des intra-zellulären pH-Wertes in den sauren pH-Bereich, einhergeht.
In den vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) von biologischen Proben wird erfindungsgemäß Ageladine A eingesetzt. Die vorliegende Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von Agedaline A in einem Verfahren oder Kit zur Beurteilung und/oder zum Nachweis der Lebensfähigkeit (Viabilität) von einer oder mehreren biologischen Probe(n) mittels Fluoreszenz, vorzugsweise von biologischen Proben, die durch übliche, andere als Ageladine A, Fluoreszenzfarbstoffe nur schwierig, d. h. beispielsweise gar nicht oder nur unzureichend bzw. nur unter langen und/oder verschärften Inkubationsbedingungen, intra-zellulär anfärbbar sind.
Ageladine A ist ein pH-sensitiver Membran-permeabler Fluoreszenzfarbstoff. Die Veränderung des intrazellulären pH-Wertes spielt für eine Reihe von Erkrankungen eine wichtige Rolle, insbesondere Krebszellen zeigen einen dysregulierten pH-Wert. Für das Monitoring von Endosomen, Lysosomen und andere Organellen sind pH-abhängige membrangängige Fluoreszenz-Indikatoren ebenfalls geeignet.
Der Naturstoff Ageladine A zeigt eine Reihe von Eigenschaften, die ihn zu einem hervorragenden pH-Sensor machen: hohe Membranpermeabilität: nur 15 min Inkubation für Zellen; sehr weiter Bereich von pH 4–pH 9; alle Experimente können mit gängigem Laborgerät ausgeführt werden; Stabilität; Ageladine A ist nicht toxisch, daher auch bei empfindlichen Zellen (z. B. PC12) und langer Inkubation anwendbar; Ageladine A neigt kaum zum Ausbleichen, auch bei längeren Inkubationszeiten. Ageladine A kann in folgenden Anwendungen eingesetzt werden: Fluoreszenzmikroskopie (lebende Zellen, Gewebe und sogar ganze Tiere), Gefrierschnitte, und ggf. auch Flow-Cytometrie.
Bei dem bioaktiven marinen Naturstoff Ageladine A (chemische Formel C₁₀H₇N₅Br₂) handelt es sich um ein Pyrrol-Imidazol Alkaloid, das beispielsweise aus Schwämmen der Gattung Agelas isoliert werden kann (vergleiche M. Fujita et al.: ”Ageladine A: An Antiangiogenetic Matrixmetalloproteinase Inhibitor from Marine Sponge Agelas nakamurai”, J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 15700–15701 und Supporting Information S.I. 1–15). Ageladine A kann mittlerweile auch vollständig synthetisiert werden (vergleiche M. Meketa et al.: ”Total Synthesis of Ageladine A, an Angiogenesis Inhibitor from the Marine Sponge Agelas nakamurai” Org. Lett. 2006, 8, 7, 1443–1446; Publikation von S. Shengule et al.: ”Concise Total Synthesis of the Marine Natural Product Ageladine A”, Org. Lett. 2006, 8, 18, 4083–4084; und M. Meketa et al.: ”A New Total Synthesis of the Zinc Matrixmetalloproteinase Inhibitor Ageladine A Featuring a Biogenetically Patterned 6[pi]-2-Azatriene Electrocyclization”, Org. Lett. 2007, 9, 5, 853–855). Ageladine A steht somit der Öffentlichkeit in unbegrenztem Umfang zur Verfügung. Ageladine A hat nach UV-Anregung eine ausgeprägte Fluoreszenz im Grünbereich. Weiterhin wird Ageladine A in der wissenschaftlichen Literatur zu verschiedenen Themen diskutiert, wie beispielsweise bei: Bickmeyer, U.; Grube, A.; Klings, K.W.; Köck, M. Ageladine A, a pyrrole-imidazole alkaloid from marine sponges, is a pH sensitive membrane permeable dye, Biochem. Biophys. Res. Commun. 2008 373, 419–422. Erratum in: Biochem Biophys Res Commun. 2009 Jun 12; 383(4): 519. Bickmeyer, U.; Heine, M.; Podbielski, I.; Münd, D.; Köck, M.; Karuso, P. Tracking of fast moving neuronal vesicles with ageladine A. Biochem Biophys Res Commun. 2010, 402, 489–494. Parks, S.K.; Chiche, J.; Pouyssegur, J. pH control mechanisms of tumor survival and growth. J Cell Physiol. 2011 226, 299–308. Webb, B.A.; M; Chimenti, M; Jacobsen, M.P; Barber, D.L.: Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nature Reviews Cancer 2011, 11, 671–677.
Der Fachmann kann anhand von im Stand der Technik bekannten Informationen zur Ageladine A die vorliegende Erfindung ohne besondere Schwierigkeiten an seine im jeweiligen Einzelfall konkreten Anforderungen anpassen und durchführen. So beschreibt beispielsweise die DE 10 2007 034 886 A1 , deren Offenbarung hiermit ausdrücklich für Zwecke der vorliegenden Erfindung inkorporiert wird, ein Verfahren wie unter der Anwendung von Ageladine A als fluoreszierendem pH-Wert-Indikator, pH-Wert-Messungen von Lösungen und pH-Wert-Messungen innerhalb lebender Zellen, Geweben und ganzen Organismen als Medium durchgeführt werden können. So ist eine Fluoreszenz-Färbung von Zellen und Geweben durch Inkubation dieser Medien mit Ageladine A möglich. Vorteilhafterweise kann eine in-vivo- oder in-vitro-Inkubation von Zellen, Geweben oder kompletten Organismen als Medium in einer den fluoreszierenden pH-Wert-Indikator enthaltenden Lösung erfolgen. Durch eine derartige einfache, schnelle und biologische Färbung können gemäß der DE 10 2007 034 886 A1 beispielsweise saure Gewebsanteile (Verdauungsorgane) in lebenden Organismen markiert und unter dem Fluoreszenz-Mikroskop leicht erkannt werden. Ageladine A kann deshalb als äußerst intensiver Zellfarbstoff angewendet werden, der gleichzeitig als pH-Wert-Indikator pH-Wert-Änderungen reproduzierbar anzeigt. Qualitative pH-Wert-Anzeigen und quantitative pH-Wert-Messungen innerhalb lebender Systeme können durch die Verwendung von Ageladine A stark vereinfacht werden.
Die Wasserstoffkonzentration oder der pH-Wert ist ein extrem wichtiger Parameter in biologischen und chemisch/technischen Systemen. Viele chemische und biologische Reaktionen erfordern eine genaue Regelung des pH-Werts für einen korrekten Ablauf. Im Rahmen von optischen Messungen werden pH-Wert-Indikatoren verwendet, bei denen es sich um Farbstoffe handelt, deren detektierbare optische Eigenschaften, wie Extinktion (Absorption) oder Fluoreszenz, sich mit Veränderung des pH-Werts ebenfalls ändern. Somit zeigen pH-Wert-Indikatoren durch ihren Farbton und ihre Farbintensität den aktuellen pH-Wert der Lösung an. Die größte Empfindlichkeit von Indikatoren auf kleine Änderungen des pH-Werts liegt vor, wenn die Gleichgewichtskonstante (pKa) zwischen den sauren und basischen Formen des Indikators nahe dem Wert des zu untersuchenden Mediums, in der Regel eine Lösung, liegt.
Die vorliegende Erfindung macht sich die pH-Wert-abhängigen Eigenschaften von Agedaline A vorteilhaft zunutze, um die Lebensfähigkeit (Viabilität) von biologischen Proben, insbesondere von solchen biologischen Proben, zu beurteilen, bei denen eine nachlassende Lebensfähigkeit (Viabilität) der biologischen Proben mit einer Veränderung des intra-zellulären pH-Wertes, vorzugsweise mit einer Erniedrigung des intra-zellulären pH-Wertes, und besonders bevorzugt mit einer Erniedrigung des intra-zellulären pH-Wertes in den sauren pH-Bereich, einhergeht.
Hierbei ist von Vorteil, dass Ageladine A eine besonders hohe Empfindlichkeit der emittierten Fluoreszenzintensität im physiologisch relevanten Bereich zwischen pH 6 und pH 8 aufzeigt. Somit kann Ageladine A als pH-Wert-Indikator besonders gut für physiologische pH-Wert-Messungen zur Beurteilung bzw. zum Nachweis der Lebensfähigkeit (Viabilität) von biologischen Proben eingesetzt werden. Vorteilhafterweise können zur Beurteilung bzw. zum Nachweis der Lebensfähigkeit (Viabilität) entnommene physiologische Proben (in-vitro), aber auch lebende Zellen, Gewebe und ganze Organismen (in-vivo) mit Ageladine A als fluoreszierendem pH-Wert-Indikator inkubiert und durch die Fluoreszenz im Grünbereich auf diese Art gefärbt werden. Dies ermöglicht über Messungen des pH-Werts in-vivo und in-vitro in einem weiten Bereich die Erkennung von unphysiologischen und daher schädlichen pH-Wertveränderungen im zu testenden Organismus insbesondere die Erkennung saurer Gewebe in Organismen, durch die Fluoreszenz-Eigenschaften von Ageladine A, und in der Folge somit auch die erfindungsgemäße Beurteilung bzw. den erfindungsgemäßen Nachweis der Lebensfähigkeit (Viabilität) der zu testenden Organismen. Die Fluoreszenz im Grünbereich nimmt mit sinkendem pH-Wert deutlich zu. Die intensiven Färbungen erweisen sich als stabil über Stunden bis zu Tagen.
Ageladine A eignet sich hierbei überraschenderweise ganz besonders vorteilhaft zur Beurteilung bzw. zum Nachweis der Lebensfähigkeit (Viabilität) von solchen biologischen Proben wie Ovarien parasitärer Würmer, vorzugsweise Ovarien von Helminthen, besonders bevorzugt Ovarien des Schweinepeitschenwurms (Trichuris suis). Damit stellt die Erfindung ein gegenüber dem in-vivo Verfahren des Standes der Technik, das den Nachweis der Viabilität von Ovarien des Schweinepeitschenwurms an lebenden Schweinen führt, ein erheblich vereinfachtes und aus wirtschaftlicher, ethischer und praktischer Sicht äußerst ansprechendes, preiswertes effizientes und verlässliches Verfahren zum Nachweis der Viabilität zur Verfügung.
Die Erfindung betrifft daher in einer weiteren Ausgestaltung auch ein Kit zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) einer oder mehrerer biologischen Proben, umfassend Agedaline A, vorzugsweise in Form einer Stammlösung, als Fluoreszenzfarbstoff zum Anfärben von zu testenden biologischen Probe(n), und besonders bevorzugt adaptiert zur Verwendung in Verbindung mit biologischen Proben in einem Objektträger mit Vertiefungen, in einer Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen oder in einem Mikrofluidchip.
Das erfindungsgemäße Kit zur Beurteilung der Lebensfähigkeit (Viabilität) einer oder mehrerer biologischen Proben kann in bevorzugten Ausführungen weiterhin wenigstens eine der folgenden Komponenten umfassen und ist in besonders bevorzugten Ausführungen zur Verwendung in Verbindung mit biologischen Proben in einem Objektträger mit Vertiefungen, in einer Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen oder in einem Mikrofluidchip adaptiert. Neben Agedaline A kann das erfindungsgemäße Kit beispielsweise noch wenigstens eine der folgenden Komponenten umfassen: a) ein Kulturmedium zur Inkubation der zu testenden biologischen Probe(n); b) ein Puffermedium; c) ein, ggf. gepuffertes, Waschmedium; d) einen Fluoreszenz-Kalibrierungsstandard; e) eine positive und/oder eine negative Kontrolle; f) ggf. einen oder mehrere Objektträger mit Vertiefungen und ein oder mehrere Deckgläschen; g) ggf. eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen oder einen Mikrofluidchip; und h) ggf. Instruktionen zur Verwendung des Kits in Einzel-, Gruppen- und/oder Hochdurchsatztests.
Weitere Vorteile und vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind den nachfolgenden Beispielen und den Ansprüchen entnehmbar. Alle in der Beschreibung, den nachfolgenden Beispielen und den Ansprüchen dargestellten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination miteinander erfindungswesentlich sein.
Im Folgenden soll nun die Funktionsweise der Erfindung anhand von Beispielen näher beschrieben werden, jedoch ohne die Erfindung hierdurch in ihrem Umfang beschränken zu wollen. Der Umfang der Erfindung ist in den Patentansprüchen definiert und wird durch die obige ausführliche Beschreibung gestützt. Die Beispiele dienen der weiteren Erläuterung.
Beispiele
Nachweis der Viabilität mittels Ageladine A am Beispiel von Eiern des Peitschenwurms
1) Einleitung:
Grundlagen: Das Alklaoid Ageladine ist in alkalischem Milieu ungeladen, während es in saurem protoniert wird und damit geladen vorliegt (Bickmeyer et al. 2010 BBRC). Im geladenen Zustand ist Ageladine Membran–impermeabel, während es im ungeladenen Zustand sehr schnell viele Zellmembranen überwindet. Dies liegt auch wesentlich an der doppelten Bromierung des Moleküls, die bei ähnlichen marinen Alkaloiden die Membrangängigkeit deutlich erhöht (Bickmeyer et al. 2004 Toxicon). Die Eier des Peitschenwurms nehmen Farbstoffe normalerweise sehr schlecht auf, bedingt durch die Bromierung ist die Aufnahme Ageladines sehr schnell. Ageladine fluoresziert verstärkt bei sinkendem pH (Bickmeyer et al. 2008 BBRC). Eier, deren Sauerstoff und/oder Energieversorgung sich aus irgendwelchen Gründen verschlechtert, verlangsamen ihre Transportprozesse und können den pH Wert nicht mehr gut regulieren und säuern dabei an. Diese Ansäuerung wird mit sehr großer Wahrscheinlichkeit von Ageladine mit einer Verstärkung der Fluoreszenz beantwortet. Auf diese Art können Eier, deren Stoffwechsel gestört ist oder die bereits sterben, deutlich von gesunden Eiern unterschieden werden.
Dieser Test ist damit höchst empfindlich zur Unterscheidung von gesunden und bereits geschädigten Eiern. Gänzlich tote Eier sollten den Farbstoff durch nicht vorhandene Schutzprozesse sehr gut aufnehmen und stark leuchten.
Eine Vorschrift der optischen Kontrolle zur Festlegung der Qualität der Eier viabel vs. embryoniert bzw. zu deren Abgrenzung kann anhand einschlägiger Kriterien, und anhand der Biologie von Trichuris suis, für die technischen (z. B. pharmazeutischen) und/oder rechtlichen (z. B. zulassungsrechtlichen) Anforderungen im jeweiligen Fall zutreffend erstellt werden. Ebenso kann die Festlegung bzw. Definition eines Schwellenwertes erfolgen: Leuchtintensität im Vergleich zum Hintergrund (Rauschen). Eine Computergesteuerte Auswertung ist möglich. Eine Korrelation zwischen viablen TSO (Motility Test, Pig Infektivity Test und Schlupftest nach Abromeit) und den Ageladine-gefärbten Eiern kann gleichfalls erstellt werden, ebenso wie die Festlegung einer eindeutigen Definition: embryoniert in Abgrenzung zu viabel.
2) Material und Methoden:
2.1 Bezugsfirmen:

Alfred-Wegener-Institut für Polar- und Meeresforschung (AWI), D-27570
Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, D-22331 Hamburg
Gibco BRL Life Technologies GmbH, D-76339 Eggenstein
Haereus Instruments GmbH, D-63450 Hanau
IKA^®-Werke GmbH & Co. KG, D-79219 Staufen
Leica Mikrosysteme Vertrieb GmbH, D-64625 Bensheim
Merck KG, D-64271 Darmstadt
Nunc Thermo Electron LED GmbH, D-63505 Langenselbold
Ovamed GmbH, D-22885 Barsbüttel
Sigma-Aldrich Chemie GmbH, D-82039 Deisenhofen

2.2 Geräte:

Tubes, Pipettenspitzen etc. Eppendorf/Nunc
Pipetten: 1–10 μl, 100–1000 μl Eppendorf
Multi-Photonen-Mikroskop SP5 MP Leica
Objektiv HC PL FLUOTAR 10.0× 0.30 DRY Leica
Biofuge 13 Haereus
LabDancer IKA

2.3 Chemikalien:

Ageladine A (AWI): (bromiertes Pyrrol-Imidazol-Alkaloid)
Alle sonstigen, nicht aufgeführten Chemikalien wurden über Merck bezogen.

2.4 Lösungen, Puffer und Medien etc:

DPBS (Ca/Mg) pH 7.4 (Gibco)

2.5 Versuchstiere:
Embryonierte Eier von Trichuris suis (TSO) nach Spezifikation der Ovamed GmbH. Die Nematodeneier werden in einem Phosphat-Puffer pH 5 mit Zusatz von Kaliumsorbat bei 4–8°C im Kühlschrank gehältert. Für die Versuche wurden die TSO mehrfach in 1× DPBS gewaschen (Umpufferrung) und auf eine Konzentration von 1000 TSO/ml eingestellt. 2.6 Histologie: 2.6.1 Fluoreszenz:

Substanz Anregung (Wellenlänge Licht in nm) Bandpassfilter (Wellenlänge in nm)

Ageladine A 370 410–480
2.6.2 Nachweis Ageladine A:
Ageladine Stammlösung: 10 mM in MeOH (90%): 1 μl Ageladine wurde mit 1000 μl TSO Suspension (siehe 2.5) in 1,5-ml Tubes vereint. Der Inhalt wurde durch leichtes Schütteln gemischt und für 10 min. bei RT °C im Dunkeln inkubiert.
3) Durchführung:
Die TSO wurden nach der Färbung mit Ageladine A (s. 2.6.2) drei mal in DPBS gewaschen. 10 μl der Proben wurden auf Objektträgern mit Vertiefung platziert und mit Deckgläschen gedeckelt. Die Objektträger wurden unter dem Mikroskop Leica SP5 MP mit und ohne UV-Anregung beobachtet.
4) Ergebnisse:
Nach Inkubation mit Ageladine A zeigt ein geringer Prozentsatz der unter dem Mikroskop beobachteten TSO unter Anregung mit einer Wellenlänge von 370 nm im Bereich zwischen 410–480 nm Fluoreszenz. Ein Quotient, welcher das Verhältnis von fluoreszierenden zu nicht fluoreszierenden TSO festlegt, wurde dennoch nicht bestimmt. Bei UV-Anregung der genannten Wellenlänge konnte keine Autofluoreszenz beobachtet werden (s. ).
: Ageladine färbt Eier des Peitschenwurms (siehe Durchlichtbild). Gezeigt werden drei mikroskopische Aufnahmen (Vergrößerung 10-fach) von zufällig ausgewählten, identischen und embryonierten Eiern des Peitschenwurms Trichuris suis: zu erkennen sind larvale Strukturen, umhüllt von einer ovalen Eihülle. Die TSO auf den Bildern links und mittig mit grüner Fluoreszenz nach Anregung mit Licht der Wellenlänge 370 nm und mit unterschiedlichem Hintergrund; das Bild rechts ohne UV-Anregung. TSO sind durchschnittlich 25 μm breit und 70 μm lang; ein Maßstab wird nicht gezeigt.
Des Weiteren wurden ausgewählte Eier in begrenzter Anzahl unter dem Durchlichtmikroskop qualitativ nach morphologischen Kriterien bewertet und als „gut” (embryoniert, viabel) oder „schlecht” (nicht embryoniert, erkennbare große Vakuolen, Verdau) terminiert und auf dem Computermonitor lokalisiert (Blindproben-Bestimmung). Die zeigt ein Beispiel: Vier von insgesamt 14 TSO bekamen das Qualitätsmerkmal „gut”. Defekte Eier wurden graphisch mit weißen Pfeilen markiert. Die Kontrolle der gleichen TSO bei UV-Anregung zeigt eine hohe Übereinstimmung zwischen den markiertem und den fluoreszierenden Eiern. Ein zusätzliches Ei zeigt Färbung durch Ageladine A (roter Pfeil).
: Ageladine färbt im Besonderen Eier mit Fehlern (optische Blindprobe):
zeigt mikroskopische Aufnahmen (10×) von identischen Eiern von Trichuris suis (links mit UV-Anregung, rechts ohne): Weiße Pfeile auf beiden Bildern zeigen auf TSO, die zuvor nach morphologischen Kriterien als nicht embryoniert oder als defekt klassifiziert wurden. Im Vergleich dazu ein fluoreszierendes Ei (mit rotem Pfeil), das nach optischer Kontrolle als „gut” bezeichnet wurde. Ein Maßstab wird nicht gezeigt.

Claims

Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit einer oder mehrerer biologischen Proben, umfassend a) das Bereitstellen der zu untersuchenden biologischen Probe(n), b) die Inkubation der unter a) bereitgestellten biologischen Probe(n) mit Ageladine A, c) die UV-Anregung der unter b) erhaltenen inkubierten biologischen Probe mit UV-Licht einer Wellenlänge von 370 nm, und d) das Erfassen von fluoreszierenden und nicht-fluoreszierenden Anteilen der gemäß c) UV-angeregten biologischen Probe(n) im Bereich zwischen 410 – 480 nm.
Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von biologischen Proben nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die biologischen Proben aus biologischen Präparaten entstammen, die in lebensfähiger Form zur Herstellung von Arzneimitteln und/oder Therapeutika dienen.
Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von biologischen Proben nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die biologische Probe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (niederen) Organismen, insbesondere Mikroorganismen, parasitäre und nicht-parasitäre Organismen, Zellen, Einzellern oder Zellverbänden, Geweben, Organellen, Spermien, Eizellen und Ovarien, wobei die biologische Probe vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus parasitäre und nicht-parasitäre Organismen und Ovarien solcher parasitäre und nicht-parasitäre Organismen.
Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von biologischen Proben nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Probe Ovarien parasitärer und/oder nicht-parasitärer Würmer ausgewählt sind, vorzugsweise Ovarien parasitärer und/oder nicht-parasitärer Würmer, die in lebensfähiger Form zur Herstellung von Arzneimitteln und/oder Therapeutika dienen.
Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von biologischen Proben nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als biologische Probe Ovarien parasitärer Würmer, vorzugsweise Ovarien von Helminthen, besonders bevorzugt Ovarien des Schweinepeitschenwurms, ausgewählt sind.
Verfahren zur Beurteilung der Lebensfähigkeit von biologischen Proben nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass eine nachlassende Lebensfähigkeit der biologischen Proben mit einer Veränderung des intra-zellulären pH-Wertes, vorzugsweise mit einer Erniedrigung des intra-zellulären pH-Wertes, und besonders bevorzugt mit einer Erniedrigung des intra-zellulären pH-Wertes in den sauren pH-Bereich, einhergeht.
Verwendung von Agedaline A in einem Verfahren oder Kit zur Beurteilung und/oder zum Nachweis der Lebensfähigkeit von einer oder mehreren biologischen Probe(n) mittels Fluoreszenz, vorzugsweise von biologischen Proben, die Proben durch übliche, andere als Ageladine A, Fluoreszenzfarbstoffe nur schwierig intra-zellulär anfärbbar sind.
Kit zur Beurteilung der Lebensfähigkeit einer oder mehrerer biologischen Proben, umfassend Agedaline A, vorzugsweise in Form einer Stammlösung, als Fluoreszenzfarbstoff zum Anfärben von zu testenden biologischen Probe(n), und besonders bevorzugt adaptiert zur Verwendung in Verbindung mit biologischen Proben in einem Objektträger mit Vertiefungen, in einer Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen oder in einem Mikrofluidchip.
Kit zur Beurteilung der Lebensfähigkeit einer oder mehrerer biologischen Proben nach Anspruch 8, weiterhin umfassend wenigstens eine der folgenden Komponenten, vorzugsweise adaptiert zur Verwendung in Verbindung mit biologischen Proben in einem Objektträger mit Vertiefungen, in einer Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen oder in einem Mikrofluidchip: a) ein Kulturmedium zur Inkubation der zu testenden biologischen Probe(n), b) ein Puffermedium, c) ein, ggf. gepuffertes, Waschmedium, d) einen Fluoreszenz-Kalibrierungsstandard, e) eine positive und/oder eine negative Kontrolle, f) ggf. einen oder mehrere Objektträger mit Vertiefungen und ein oder mehrere Deckgläschen, g) ggf. eine Mikrotiterplatte mit einer Vielzahl von Vertiefungen oder in einem Mikrofluidchip, h) ggf. Instruktionen zur Verwendung des Kits in Einzel-, Gruppen- und/oder Hochdurchsatztests.