DE102006057548A1

DE102006057548A1 - Histologische Färbezusammensetzung für Endoskope

Info

Publication number: DE102006057548A1
Application number: DE102006057548A
Authority: DE
Inventors: Akira Yamamoto; Yusuke Iimori; Mae Koyama; Mariko Ishiguro; Mizue Saze
Original assignee: Pentax Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2005-12-06
Filing date: 2006-12-06
Publication date: 2007-06-28
Also published as: GB2433117A; GB2433117B; FR2894253B1; GB0624459D0; FR2894253A1; US20070077202A1

Abstract

Die Erfindung betrifft eine histologische Färbezusammensetzung für Endoskope. Die Färbezusammensetzung enthält einen oder mehrere Farbstoffe, die aus Monascus gewonnen sind. Die Färbezusammensetzung bildet ein Mittel, das die Oberfläche eines Darmtraktlumens unter Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich besonders scharf hervortreten lässt. Die Färbezusammensetzung kann durch Licht einer bestimmten Wellenlänge zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung angeregt werden. Es ist biologisch sicher und für die Endoskopie geeignet.

Description

Die Erfindung betrifft eine histologische Färbezusammensetzung, die in der Diagnose zusammen mit einem Endoskop verwendet wird.

Diagnosetechniken unter Verwendung eines Endoskops sind weit verbreitet und werden in der Magen-Darm-Endoskopie im oberen und unteren Darmtrakt und insbesondere zur Diagnose von Erkrankungen wie Krebs, peptischem Ulcer, peptischer Colitis und dergleichen angewandt. Die Erfassung histologischer Anomalien anhand einer endoskopischen Untersuchung wird üblicherweise mittels eines Endoskops (Vergrößerung von etwa 10 bis 500) unter sichtbarem Licht ohne Verwendung eines Färbemittels durchgeführt. Demgegenüber gibt es auch ein Verfahren, das als Farbstoffsprühendoskopie bezeichnet wird und bei dem die Oberfläche des Gewebes mit einer Farbstoff enthaltenden Lösung besprüht und durch ein Endoskop betrachtet wird. Bei dieser Farbstoffsprühendoskopie kann die Gestalt der Oberfläche des Darmtraktlumens klar und deutlich beobachtet und auch ein geschädigter Körperteil sehr geringer Größe anhand einer Farbtonänderung einfach erfasst werden. Als Endoskop werden bei dieser Farbstoffsprühendoskopie ein mit sichtbarem Licht arbeitendes Endoskop und ein Fluoreszenzendoskop eingesetzt.

Der Farbstoff, der in der Farbstoffsprühendoskopie hauptsächlich eingesetzt wird, ist beispielsweise Indigokarmin zum Färben eines Darmtraktlumens unter sichtbarem Licht und Fluorescein zur Fluoreszenzfärbung.

Für die Diagnose ist es wichtig, nicht nur die Gewebeoberfläche im lebenden Körper, sondern auch das Gewebeinnere zu beobachten. In einem üblichen Verfahren zum Betrachten des Gewebeinneren im lebenden Körper wird ein sehr kleiner, durch Biopsie erhaltener Teil des Gewebes in einem Labor dünn geschnitten, dann gefärbt und betrachtet. Bei der In-situ-Betrachtung des Inneren von biologischen Geweben kommen häufig ein MRI-Verfahren, ein PET-Verfahren, ein CT-Verfahren, ein mit weichen Röntgenstrahlen arbeitendes Verfahren und dergleichen zur Anwendung, um den gesamten Körper zu beobachten. Für die Magen-Darm-Endoskopie wurde ein Endoskop vermarktet, das die Eigenfluoreszenzreaktion von biologischem Gewebe nutzt. Wird biologisches Gewebe mit Licht einer bestimmten Wellenlänge bestrahlt, so wird von den endogenen Gewebesubstanzen Eigenfluoreszenzstrahlung erzeugt. Anhand des Unterschiedes in Intensität und spektraler Verteilung können so ein normaler Körperteil und ein geschädigter Körperteil voneinander unterschieden werden.

In der üblichen endoskopischen Betrachtung ist es jedoch unvermeidbar, den befallenen Zielbereich empirisch zu beurteilen. Hierzu wird ein Gewebefragment herausgeschnitten und in einem Labor durch Techniken wie der histologischen Färbung separat untersucht. Dagegen ist es mit einem kürzlich entwickelten konfokalen Endoskop möglich, das Gewebeinnere zu beobachten, ohne das Gewebe herausschneiden zu müssen. Ein solches konfokales Endoskop arbeitet in der Weise, dass durch eine vor einem Detektor angeordnete Lochblende, auch als Pinhole oder Raumfilter bezeichnet, nur Licht erfasst wird, das an einer Gewebefläche reflektiert wird, auf die gerade fokussiert ist. Auf diese Weise erhält man ein deutliches Bild. Üblicherweise wird in einer solchen konfokalen Optik ein Fluoreszenzbild einer mit einer Fluoreszenzsubstanz gefärbten Probe in der Weise betrachtet, dass die gefärbte Probe mit Laserlicht abgetastet wird. Demzufolge wird ein Fluoreszenzfarbstoff benötigt. Ein konfokales Endoskop, das mit einem solchen konfokalen System arbeitet, hat sowohl eine herkömmliche Beobachtungsoptik als auch eine konfokale Beobachtungsoptik. Es hat demnach den Vorteil, dass es die Durchmusterung oder das Screening des Zielbereichs und die optische Betrachtung anhand von optisch dünnen Gewebeschnitten weniger invasiv als bisher in situ ermöglicht, ohne Zellen exzidieren zu müssen.

Als Fluoreszenzfarbstoff, der zu dieser interstitiellen Beobachtung mittels eines konfokalen Endoskops verwendet wird, sind aus der Literatur Fluorescein und Acriflavin bekannt (Gastroenterology 2004, Vol. 127, Nr. 3, Seiten 706-713). Nach dieser Literatur wird eine große Menge an Fluorescein intravenös verabreicht. Erreicht das Fluorescein das Darmtraktgewebe, so wird die interstitielle Beobachtung mittels des konfokalen Endoskops vorgenommen. Wird als Farbstoff Acriflavin verwendet, so wird dieser vor der interstitiellen Beobachtung direkt auf den Darmtrakt gesprüht. Jedoch gibt die vorstehend zitierte Literatur ebenfalls an, dass man mit Acriflavin kein klares gefärbtes Bild erhält, so dass Fluorescein besser verwendbar zu sein scheint als Acriflavin.

Jedoch besteht das Problem, dass der Fluoresceinfarbstoff, der üblicherweise in der Farbstoffsprühendoskopie eingesetzt wird, ernste Nebenwirkungen hat. Auch die Nebenwirkungen von Acriflavin auf den lebenden Körper sind problematisch, da es antibiotisch ist. In der Farbstoffsprühendoskopie, insbesondere in der konfokalen Endoskopie, besteht deshalb eine Nachfrage nach Farbstoffen, die imstande sind, Zellen in kurzer Zeit zu färben, die Gestalt der Gewebefläche, die für die Betrachtung unter Verwendung einer sichtbares Licht oder Fluoreszenzanregungslicht abgebenden Lichtquelle bestimmt ist, scharf hervortreten zu lassen und das Gewebeinnere zu färben.

Es ist Aufgabe der Erfindung, ein Färbemittel anzugeben, das die Gestalt der Oberfläche eines Verdauungstraktlumens oder dergleichen unter sichtbarem Licht besonders scharf hervortreten lässt, durch Licht einer bestimmten Wellenlänge zur Abgabe von Fluoreszenzstrahlung anregbar sowie biologisch sicher und für die Endoskopie geeignet ist.

Die Erfindung löst diese Aufgabe durch die Gegenstände der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Im Hinblick auf die Sicherheit, das Färbevermögen unter sichtbarem Licht sowie das Fluoreszenzfärbevermögen haben die Erfinder besonderes Augenmerk auf natürliche Farbstoffe gelegt. Nach umfangreichen Untersuchungen haben sie überraschenderweise herausgefunden, dass Farbstoffe, die aus Monascus gewonnen sind, durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet sind: sie weisen ausgezeichnetes Färbevermögen unter sichtbarem Licht auf. Sie geben Fluoreszenzstrahlung ab, deren Wellenlänge verschieden von der des Anregungslichtes ist. Sie sind nicht nur als Färbe mittel in der herkömmlichen Endoskopie verwendbar, sondern auch als Fluoreszenzfarbstoffe zur interstitiellen Färbung in der konfokalen Endoskopie. Sie ermöglichen lebhaft gefärbte Bilder, die geeignet sind, sehr kleine, geschädigte Körperbereiche zu erfassen. Sie färben nur das Zytoplasma, jedoch nicht den Zellkern, was deutlich macht, dass sie eine sehr geringe zelluläre Mutagenität aufweisen. Die Erfindung beruht auf diesen Erkenntnissen.

Die Erfindung stellt eine für die Endoskopie geeignete histologische Färbezusammensetzung bereit, die ein oder mehrere Farbstoffe enthält, die aus Monascus gewonnen sind.

Die Erfindung stellt ferner ein Diagnoseverfahren unter Verwendung eines Endoskops bereit. Dieses Verfahren beinhaltet die Verabreichung einer Zusammensetzung, die ein oder mehrere Elemente enthält, die aus Farbstoffen ausgewählt sind, die aus Monascus gewonnen sind. Dieses Verfahren beinhaltet ferner das Beobachten des mit dieser Zusammensetzung gefärbten Gewebes mittels eines Endoskops.

Die Erfindung sieht ferner die Verwendung eines oder mehrerer Elemente, die aus Farben ausgewählt sind, welche aus Monascus gewonnen sind, in der Herstellung eines für die Endoskopie bestimmten Färbemittels vor.

Mit der erfindungsgemäßen histologischen Färbezusammensetzung ist es möglich, gleichzeitig die Oberfläche des Zielbereichs sowie das Gewebeinnere unter sichtbarem Licht oder mit einem konfokalen Endoskop, d.h. ohne das Gewebe entfernen zu müssen, zu visualisieren. Die histologische Färbezusammensetzung ist besonderes gut handhabbar, da sie über den Verdauungstrakt verabreicht werden kann. Da außerdem ein natürlicher Farbstoff verwendet wird, ist die Zusammensetzung für den menschlichen Körper sehr sicher.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher beschrieben. Darin zeigen:

1 ein Absorptions- und Fluoreszenzspektrum der Monascus-Farbe (rot);

2 eine fotografische Aufnahme, die das Beobachtungsergebnis eines mit Monascus-Farbe (rot) gefärbten Rattendickdarms zeigt (Objektiv mit 63-facher Vergrößerung), wobei in 1) ein Bild eines Oberflächenteils, in 2) ein Bild in einer Tiefe von 5,98 μm, in 3) ein Bild in einer Tiefe von 11,96 μm und in 4) ein Bild in einer Tiefe von 17,94 μm gezeigt ist;

3 ein Schnittbild des mit Monascus-Farbe (rot) gefärbten Rattendickdarms (Objektiv mit 10-facher Vergrößerung);

4 unter sichtbarem Licht aufgenommene endoskopische Bilder des mit Monascus-Farbe (rot) gefärbten Rattendünndarms, wobei das obere Bild ein gefärbtes Bild und das untere Bild ein ungefärbtes Bild ist;

5 eine fotografische Aufnahme, die das Beobachtungsergebnis des mit Monascus-Gelb gefärbten Rattendickdarms zeigt (Objektiv: Immersionslinse mit 63-facher Vergrößerung);

6 eine fotografische Aufnahme, die das Beobachtungsergebnis des mit Monascus-Rot gefärbten Rattendickdarms zeigt (Immersionsobjektiv mit 63-facher Vergrößerung);

7 einen Graphen, der die Änderung der Fluoreszenzintensität von Monascus-Gelb bei verschiedenen pH-Werten zeigt;

8 eine fotografische Aufnahme, die das Beobachtungsergebnis des mit Fluorescein gefärbten Rattendickdarms zeigt;

9 eine fotografische Aufnahme, die das Bild eines gefärbten Mausdickdarms 1 Minute nach Besprühen mit Monascus-Gelb zeigt;

10 eine fotografische Aufnahme, die ein Bild des entfernten, mit Monascus-Geld gefärbten Mausdickdarms zeigt;

11 eine fotografische Aufnahme, die das Bild des gefärbten Mausdickdarms 10 Minuten nach Besprühen mit Monascus-Gelb zeigt;

12 eine fotografische Aufnahme, die das Bild des gefärbten Darms 60 Minuten nach Besprühen mit Monascus-Gelb zeigt;

13 eine fotografische Aufnahme, die den Dickdarm im gefärbten Zustand bei Perfusion von Monascus-Gelb durch das Herz der Maus zeigt;

14 eine fotografische Aufnahme, die den Dickdarm bei Perfusion von Fluoresceinnatrium durch das Herz der Maus zeigt;

15 eine fotografische Aufnahme, die das Bild des mit Xanthomonasin A gefärbten Mausdickdarms zeigt (Objekt mit 20-facher Vergrößerung);

16 eine fotografische Aufnahme, die das Bild des mit Xanthomonasin A gefärbten Mausdickdarms zeigt (Immersionslinse mit 63-facher Vergrößerung);

17 eine fotografische Aufnahme, die ein Bild des wie üblich mit Hämatoxylin-Eosin gefärbten Mausdickdarms zeigt (Objektiv mit 40-facher Vergrößerung);

18 eine fotografische Aufnahme, die den mit Xanthomonasin A fluoreszenzgefärbten Mausdickdarm zeigt (Objektiv mit 63-facher Vergrößerung);

19 eine unter einem konfokalen Mikroskop vorgenommene fotografische Aufnahme des mit Xanthomonasin A gefärbten Mausdickdarms (1 Minute nach der Färbung); und

20 eine unter einem konfokalen Mikroskop vorgenommene fotografische Aufnahme des mit Xanthomonasin A gefärbten Mausdickdarms (10 Minuten nach der Färbung).

Beschreibung eines bevorzugten Ausführungsbeispiels

Die Erfindung betrifft medizinische Endoskope, z.B. Endoskope für den Magen-Darm-Trakt, für die Atmungsorgane, für die Gefäße, für die Gelenke, für das Baufell, etc. Unter diesen Endoskopen sind solche, die für den Magen-Darm-Trakt bestimmt sind, besonders bevorzugt. Als mit sichtbarem Licht arbeitendes Endoskop im Sinne der Erfindung ist im Folgenden jedes Endoskop zu verstehen, das zur Beobachtung unter sichtbarem Licht verwendet wird, z.B. ein herkömmliches Endoskop, ein vergrößerndes Endoskop (10- bis 200-fache Vergrößerung), und ein farbstoffsprühendes Endoskop. Unter einem Fluoreszenzendoskop im Sinne der Erfindung ist ein Endoskop zu verstehen, das die durch Bestrahlung mit Anregungslicht erzeugte Fluoreszenzstrahlung nutzt, z.B. ein vergrößerndes Fluoreszenzendoskop. Unter einem konfokalen Endoskop im Sinne der Erfindung ist ein Endoskop mit einem konfokalen System zu verstehen. Dieses konfokale Endoskop hat sowohl eine übliche Beobachtungsoptik als auch eine konfokale Beobachtungsoptik.

Die für ein Endoskop bestimmte histologische Färbezusammensetzung nach der Erfindung umfasst ein oder mehrere Elemente, die aus Farbstoffen ausgewählt sind, welche aus Monascus gewonnen sind. Mit Monascus ist Ascomycota Monascus gemeint. Dabei unterliegt Monascus keinen besonderen Beschränkungen, sofern er zur Gattung Monascus gehört. Beispiele hierfür sind Monascus pilosus, Monascus anka, Monascus perpureus und dergleichen. Die aus Monascus gewonnenen oder abgeleiteten Farben beinhalten solche, die durch die folgenden Formeln (1) bis (5) dargestellt sind; Ankaflavin (dargestellt durch Formel (1), worin R¹ = C₇H₁), Monascin (Formel (1), worin R¹ = C₅H₁₁), Monascorubrin (Formel (2), worin R² = C₇H₁₅), Rubropunctatin (Formel (2), worin R² = C₅H₁₁), Monascorubramin (Formel (3), worin R³ = C₇H₁₅; R⁶ = H), Rubropunctamin (Formel (3), worin R³ = C₅H₁₁), Rubropunctalysin (Formel (3), worin R³ = C₅H₁₁; R⁶ = (CH₂)₄CH(NH)COOH), und Xanthomonasin oder Derivate davon (Formel (4) oder (5), worin R⁴ und R⁵ C₅H₁₁ oder C₇H₁₅ sind). Die Färbezusammensetzung nach der Erfindung enthält vorzugsweise eine oder mehrer der vorstehend genannten Substanzen. Xanthomonasin in Formel (4) oder (5) ist Xanthomonasin A, wenn R⁴ und R⁵ durch C₅H₁₁ gegeben sind, oder Xanthomonasin B, wenn R⁴ und R⁵ durch C₇H₁₅ gegeben sind.

worin R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ jeweils eine C1- bis C11-Alkylgruppe, vorzugsweise C₅H₁₁ oder C₇H₁₅ darstellen und R⁶ ein Wasserstoffatom oder – (CH₂)_nCH(NH₂)COOH darstellt, worin n eine Zahl von 2 bis 6, vorzugsweise 4 ist.

Die Färbezusammensetzung nach der Erfindung enthält vorzugsweise als oben beschriebene Komponenten eines oder mehrere Elemente, die aus Ankaflavin, Monascorubirin, Monascorubramin und Xanthomonasin oder deren Derivate ausgewählt sind.

Diese aus Monascus gewonnenen Farben sind rote oder gelbe Farbstoffe. Traditionellerweise werden se in Japan in Fischbällchen sowie in aromatisiertem Oktopus und in China in fermentierten Nahrungsmitteln wie Koshu (eine Art Portwein) und Beni Tofu (Quark aus roten Bohnen) eingesetzt. Schon dies zeigt, dass diese Farbstoffe im Hinblick auf ihre Sicherheit unbedenklich sind. Bei oraler Gabe an Mäuse ist der LD₅₀-Wert von Monascus-Farben nicht kleiner als 20 g/kg. Die Wirkdosis ohne Schädigungseffekt bei Mehrfachgaben (13 Wochen) beträgt 1,25 g/kg/Tag.

Die aus Monascus gewonnenen Farben kann man durch Extraktion von Monascus-Mikroorganismen beispielsweise mit wasserhaltigem Ethanol, wasserhaltigem Propylenglykol oder saurem Ethanol mit Salzsäure bei Raumtemperatur bis zu einer etwas höheren Temperatur erhalten.

Handelsübliche Produkte dieser aus Monascus gewonnenen Farbstoffe sind beispielsweise Sun Red M, Sun Red MA, Sun Red MR und Sun Yellow Nr. 1244 von San-Ei Gen F.F.I, Inc.; Monasco A, Monasco G, Monasco Z, Monasco RX, TR Red MP, TS Yellow M und TS Yellow MP von Taisho Technos Co., Ltd.; Monasco RedAL450RA und Monasco Yellow S von KIRIYA Chemical Co., LTD.; KCRedMR und KCRedMY-2 von Kobe Chemical Co., LTD.; und Monascus Colors von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.

Im Hinblick auf das Färbevermögen und die Lebhaftigkeit des gefärbten Bildes liegt der Gehalt des aus Monascus gewonnenen Farbstoffs in der erfindungsgemäßen histologischen Färbezusammensetzung vorzugsweise bei 0,01 bis 70 Masse-%, noch besser bei 0,01 bis 50 Masse-% und am besten bei 0,01 bis 20 Masse-%.

Die histologische Färbezusammensetzung nach der Erfindung kann in flüssiger Form, in Körnchenform, in Tablettenform und dergleichen verwendet werden. Zur Verbreitung im Darmtrakt oder zur submukösen Verabreichung ist die histologische Färbezusammensetzung vorzugsweise flüssig. Zur oralen Verabreichung liegt sie vorzugsweise in Form einer Flüssigkeit, in Form von Körnchen oder in Form von Tabletten vor.

Abhängig von der Darreichungsform kann die histologische Färbezusammensetzung nach der Erfindung mit verschiedenen Inhaltsstoffen vermischt werden. Beispielsweise kann sie mit einem Viskosemittel, einem Eindickmittel, einem oberflächenaktiven Stoff, einem Süßungsmittel, einem Konservierungsmittel, einem Geruchsstoff, einem Mittel zum Einstellen des pH-Wertes, mit Wasser und dergleichen vermischt werden.

Das pH-Mittel dient beispielsweise dazu, den pH-Wert auf 5 bis 9 einzustellen. Beispiele hierfür sind Salzsäure, Phosphorsäure, Zitronensäure, Malinsäure, Essigsäure und deren Salze, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumbicarbonat und Natriumpyrophosphat.

Die histologische Färbezusammensetzung kann mit Ethanol, Wasser und dergleichen vermischt werden. Liegt die Zusammensetzung in Form von Tabletten vor, so können Tabletteninhaltsstoffe wie ein Binder, ein Zersetzungsmittel und dergleichen verwendet werden.

Die histologische Färbezusammensetzung nach der Erfindung ist im Stande, Gewebe rot oder in einer rotähnlichen Farbe bzw. gelb bzw. in einer gelbähnlichen Farbe zu färben. Sie ist deshalb als Mittel geeignet, die Gewebeoberfläche bei der Betrachtung eines herkömmlichen, mit sichtbarem Licht arbeitenden Endoskops zu färben. Das hier eingesetzte Endoskop ist ein herkömmliches Endoskop oder ein vergrößerndes Endoskop. Mit ihm kann eine endoskopische Betrachtung unter sichtbarem Licht mit einer 10- bis 500-fachen Vergrößerung vorgenommen werden.

Der aus Monascus gewonnene Farbstoff sendet bei Anregung mit Licht im Bereich der Wellenlänge von 487 nm starke Fluoreszenzstrahlung im Bereich der Wellenlänge von 514 nm aus. Dementsprechend wird die Farbe als Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt, der dazu dient, bei einer mittels eines Fluoreszenzendoskops oder eines konfokalen Endoskops vorgenommenen Beobachtung die Gewebeoberfläche zu färben.

Indem der aus Monascus abgeleitete Farbstoff auf dem Lumen des Verdauungstraktes verteilt wird, kann er leicht in das Gewebe eindringen und ist deshalb geeignet, als interstitiell färbender Fluoreszenzfarbstoff zusammen mit einem konfokalen Endoskop verwendet zu werden. Als konfokales Endoskop wird beispielsweise ein Endoskop verwendet, das eine Beobachtungstiefe von 250 μm aufweist (Beobachtungsfeld 500 μm × 500 μm; 500-fache Vergrößerung). Dieses konfokale Endoskop kann ein gesetzt werden, um ein Fluoreszenzfarbstoff-Schnittbild von innerem Gewebe (z.B. bis zu einer Tiefe von 250 μm) zu erzeugen, nachdem die erfindungsgemäße histologische Färbezusammensetzung verteilt oder oral verabreicht worden ist.

Hat das konfokale Endoskop sowohl eine herkömmliche Beobachtungsoptik als auch eine konfokale Beobachtungsoptik, so wird der betroffene Zielbereich unter normalem Licht mit bloßem Auge betrachtet. Anschließend wird die Oberfläche und das Innere des in dem Verdauungstrakt liegenden Zielbereichs mittels der konfokalen Beobachtungsoptik untersucht, indem ein Fluoreszenzfarbstoff-Schnittbild des Gewebes (z.B. bis zu einer Tiefe von 250 μm) beobachtet wird, ohne das Gewebe herausschneiden zu müssen. So können die Form der Zelle und der Nucleus am lebenden Gewebe beobachtet werden. So können Erkrankungen des Verdauungstrakts, wie z.B. ein präcanceröser Zustand, Krebs, ein Geschwür, eine geschwürige Colitis und dergleichen, schnell und sicher, weniger invasiv als bisher und mit einer deutlich verbesserten Genauigkeit diagnostiziert werden.

In der endoskopischen Untersuchung kann die erfindungsgemäße histologische Zusammensetzung dem Verdauungstraktlumen direkt zugeführt oder submukös oder oral verabreicht werden.

Beispiele

Im Folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen im Einzelnen beschrieben. Jedoch ist die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1
Es wurde eine Vielzahl natürlich vorkommender Farbstoffe im Hinblick auf ihre Absorptionsspektren und Fluoreszenzanregungsspektren vermessen, um Fluoreszenzsubstanzen zu identifizieren. Die vermessenen Farbstoffe wurden abgesehen von dem gelben Monascus-Farbstoff von Wako Pure Chemical Industries, Ltd., erworben. Die Messungen wurden wie folgt durchgeführt: jeder Farbstoff wurde in einer Konzentration von 1 bis 0,1 mg/ml in Wasser gelöst, um eine Lösung herzustellen. Die Wellenlänge, bei die maximale Absorption des Farbstoffs auftrat, wurde bestimmt, indem der Absorptionsgrad mittels eines Spektrofotometers (BioSpec-1600 von SHIMADZU CORPORATION) in einem Wellenlängenbereich von 200 bis 600 nm durchgehend gemessen wurde. Dann wurde jeder Farbstoff mit Licht derjenigen Wellenlänge, bei der das Absorptionsmaximum auftrat, als Anregungslicht bestrahlt. Mittels eines Fluoreszenzspektrofotometers (RF-1500 von SHIMADZU CORPORATION) wurde die Wellenlänge des senkrecht zur Achse des Anregungslichtes erfassten Streulichtes bestimmt, bei der die maximale Fluoreszenzabsorption auftrat.
Wie in Tabelle 1 angegeben, wurde für Monascus-Gelb und Monascus-Rot statt des Anregungslichtes, das zur Erzeugung der Fluoreszenzstrahlung (Streulicht) verwendet wurde, eine Stokes-Verschiebung zu größeren Wellenlängen hin beobachtet. Eine solche Stokes-Verschiebung wurde abgesehen von den Monascus-Farben für keinen anderen Farbstoff beobachtet. 1 zeigt das Absorptions- und das Fluoreszenzspektrum für Monascus-Rot. Als Monascus-Rot wurde ein von Wako Pure Chemical Industries, Ltd. hergestellter Farbstoff und für Monascus-Gelb ein von KIRIYA Chemical Co., LTD., hergestellter Farbstoff verwendet. Tabelle 1

*: Stokes-Verschiebung = Wellenlänge bei Fluoreszenzmaximum-Wellenlänge bei Anregungsmaximum

Beispiel 2
Ein mit einer Formalinlösung fixierter Rattendickdarm wurde in quadratische Stücke der Größe 5 × 5 mm geschnitten und mit einer phosphatgepufferten physiologischen Kochsalzlösung (137 mmol/l NaCl; 8,1 mmol/l Na₂HPO₄; 2,7 mmol/l KCl; 1,5 mmol/l KH₂PO₄; im Folgenden als PBS(–) abgekürzt) gespült. Das Gewebe wurde dann in einer wässrigen Lösung (10 mg/ml) des roten Monascus-Farbstoffs angeordnet (Monascus-Farbstoff von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), dort eine Minute lang belassen und dann zehn Sekunden lang mit PBS(–) gespült. Anschließend wurde das Gewebe mit einer Formalinlösung fixiert und unter einem konfokalen Mikroskop (TCS SP2 von Leica; im Folgenden ist mit dem in den Beispielen verwendeten konfokalen Mikroskop dieses Endoskop gemeint) betrachtet. Dabei wurde das Gewebe bei einer Anregung mit einem Ar-Laser der Wellenlänge 488 nm anhand der Fluoreszenzstrahlung in einem Wellenlängenbereich von 500 bis 535 nm betrachtet. 2 zeigt mit dem konfokalen Mikroskop aufgenommene Mikrofotografien. Diese Mikrofotografien sind Schnittbilder, die ausgehend von der Oberflächenschicht nach innen in Abständen von etwa 6 μm aufgenommen wurden. Wie in 2 gezeigt, ist der Dickdarm gefärbt. Es wurde also festgestellt, dass ein farbiges Fluoreszenzbild des im Inneren gefärbten Gewebes erzeugt werden konnte.
Vergleichsbeispiel 1
Wurden die natürlich vorkommenden Farbstoffe wie Annatto-Farbstoff, Beerenschalen-Farbstoff, Rüben-Rot und Koschenille-Farbstoff, die keine Fluoreszenzstrahlung aussenden, eingesetzt und in gleicher Weise wie in Beispiel 2 unter dem konfokalen Mikroskop betrachtet, so erhielt man kein farbiges Fluoreszenzbild.
Beispiel 3
Aus dem in Beispiel 2 gefärbten Dickdarm wurde eine dünn geschnittene Probe hergestellt. Diese Probe wurde unter dem konfokalen Mikroskop bei Anregung durch einen Ar-Laser der Wellenlänge 488 nm anhand der Fluoreszenzstrahlung in einem Wellenlängenbereich von 500 bis 535 nm betrachtet. Dabei stellte sich heraus, dass ein Bild erzeugt werden konnte, in dem der Dickdarm ausgehend von dem Lumen bis zur bindegewebigen Umhüllung (mit Ausnahme der submukösen Schicht) gleichmäßig gefärbt war, wie 3 zeigt. Aus der Aufnahme nach 3 geht hervor, dass die Färbung mit dem Monascus-Farbstoff bis zu einer Tiefe von 500 bis 1000 μm oder mehr reicht.
Beispiel 4
Es wurde ein mit einer Formalinlösung fixierter Rattendünndarm in quadratische Stücke der Größe 10 × 10 mm geschnitten, mit einer wässrigen Lösung (10 mg/ml) des Monascus-Farbstoffs (rot) (Monascus-Farbstoff von Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) belegt und dann unter einem mit sichtbarem Licht arbeitenden Endoskop betrachtet. Wie in 4 gezeigt, wurde so der Dünndarm in Rot gefärbt. Durch diese Färbung konnte beispielsweise die Form der Zotten, die in einem nicht-gefärbten Bild nur schwer zu erkennen ist, lebhafter, d.h. deutlicher dargestellt werden.
Beispiel 5
Es wurde ein Färbetest an einem Rattendickdarm mit einer wässrigen Lösung (6 mg/ml) des gelben Monascus-Farbstoffs (Monasco Yellow S von KIRIYA Chemical Co., LTD.) und mit einer wässrigen Lösung (10 mg/ml) des roten Monascus-Farbstoffs (Monasco Red 9000P von KIRIYA Chemical Co., LTD.) durchgeführt. Der formalinfixierte Rattendickdarm wurde als Probe in jede der Farblösungen 1 Minute lang eingetaucht und unter dem konfokalen Mikroskop betrachtet. Die in den 5 und 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Färbelösungen sowohl des roten Monascus-Farbstoffs als auch des gelben Monascus-Farbstoffs in das Gewebeinnere eindrangen und eine starke Fluoreszenz zeigten. Es stellte sich heraus, dass nur das Zytoplasma gefärbt und damit lebhaft dargestellt war, während der Zellkern nicht gefärbt war.
Beispiel 6
Bei einer In-vivo-Färbung stellt das Färbevermögen bei verschiedenen pH-Werten einen wichtigen Faktor dar. Deshalb wurde der Einfluss des pH-Wertes auf das Fluoreszenzverhalten des gelben Monascus-Farbstoffs (Monasco Yellow S von KIRIYA Chemical Co., LTD.) untersucht. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt. Die Fluoreszenzintensität zeigte bei Messungen in Pufferlösungen mit den pH-Werten 4,65, 5,00, 6,00, 6,80, 7,00, 7,40, 8,00 und 9,30 keine signifikanten Änderungen. Demnach stellte sich heraus, dass das Fluoreszenzverhalten des gelben Monascus-Farbstoffs von dem pH-Wert weitgehend unbeeinflusst ist.
Vergleichsbeispiel 2
Der Rattendickdarm wurde unter dem konfokalen Mikroskop in gleicher Weise wie in Beispiel 2 und 5 betrachtet, abgesehen davon, dass anstelle des Monascus-Farbstoffs der Farbstoff Fluorescein verwendet wurde, das auf einen pH-Wert von 9 eingestellt war. Das in 8 dargestellte Ergebnis zeigt, dass das Gewebe zwar gefärbt war, die Fluoreszenzintensität des Fluoresceins jedoch einen stärkeren Hintergrund verursachte, was die Beobachtung erschwerte.
Beispiel 7
Die Färbewirkung, die durch das Verteilen des gelben Monascus-Farbstoffs an dem Verdauungstraktlumen im menschlichen Körper zu erzielen war, wurde nach folgendem Verfahren bestimmt.
Es wurde gelber Monascus-Farbstoff (Monacco Yellow von KIRIYA Chemical Co., LTD.) durch den Anus in eine Maus (acht Wochen alt, männlich) injiziert. Eine Minute später wurde der Dickdarm entfernt und seine Färbung unter dem konfokalen Mikroskop (von Leica) betrachtet.
Das Schleimhautgewebe auf der Oberfläche des Mausdickdarms war ausgezeichnet gefärbt, da der Farbstoff gut verteilt war (vergl. 9). Die Zellen, die in dem Schleimhautgewebe an dem Dickdarm vorhanden sind, enthalten zusätzlich zu Zylinderepithelzellen und Becherzellen Fibroblasten und weiße Blutzellen in der Lamina propria mucosa. Dabei waren die zytoplasmatischen Komponenten in diesen Zellen mit dem gelben Monascus-Farbstoff gefärbt. Dagegen wiesen die Schleimhautkomponenten in den Becherzellen sowie die Kerne sämtlicher Zellen nur geringe Färbbarkeit auf.
Diese Ergebnisse entsprachen denen in einem mikroskopischen Bild (10), das man erhielt, wenn das Gewebe des entfernten Dickdarms in vitro gefärbt wurde.
Beispiel 8
In lebenden Mäusen wurden die Dickdärme in gleicher Weise wie im Beispiel 7 mit dem gelben Monascus-Farbstoff (Monasco Yellow von KIRIYA Chemical Co., LTD.) gefärbt. Die Mäuse wurden dann 10 und 60 Minuten nach dem Färben im Hinblick darauf betrachtet, ob sich die Färbung mit der Zeit geändert hatte. Diese Beobachtung wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 7 durchgeführt. Diejenigen Stellen, die durch den gelben Monascus-Farbstoff gut gefärbt waren, zeigten keine Änderungen mit der Zeit, die nach Verabreichung des Farbstoffs an die Mäuse vergangen war. Jedoch hatte die Helligkeit der von dem Gewebe abgegebenen Fluoreszenzstrahlung abgenommen, als die Beobachtung 60 Minuten nach der Verabreichung vorgenommen wurde (11 und 12).
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse zusammengefasst, indem dort die gut gefärbten Stellen der Dickdarmschleimhaut angegeben sind. Tabelle 2

–: nicht gefärbt; N/A: nicht anwendbar; +: gefärbt

Vergleichsbeispiel 3
Unterschied im Fluoreszenzpegel
In dem konfokalen Mikroskop (von Leica) kann die spektrale Empfindlichkeit so reguliert werden, dass die angezeigten Fluoreszenzhelligkeiten auf gleichen Pegel eingestellt sind. Diese Mikroskopfunktion kann genutzt werden, um eine relative Abschätzung der Fluoreszenzintensitäten der einzelnen Proben vorzunehmen, die unterschiedliche Helligkeitspegel aufweisen.
Die Fluoreszenzhelligkeit einer mit Fluoresceinnatrium behandelten Probe relativ zu der einer mit dem gelben Monascus-Farbstoff behandelten Probe betrug nach zehn Minuten das 0,74-Fache und nach 60 Minuten das 0,84-Fache, wenn eine Berechung auf Grundlage einer spektralen Empfindlichkeit derart angestellt wurde, dass sich die gleiche Fluoreszenzhelligkeit ergab.
Somit lässt sich feststellen, dass bei Färben der Probe mit Fluoreszenzfarbstofflösungen gleicher Konzentration die Fluoreszenzhelligkeit des Dickdarmgewebes bei Färben mit gelbem Monascus-Farbstoff höher als bei Färben mit Fluoresceinnatrium war.
Beispiel 9
Es wurde ein Färbetest mit gelbem Monascus-Farbstoff (1 mg/ml, 2 ml) durch Perfusion durch das Herz einer Maus durchgeführt. Dabei ergab sich, dass das Dickdarmgewebe ausgezeichnet gefärbt war. Bei diesem Perfusionsverfahren war die Farbstoffpermeabilität höher als in dem Verfahren, in dem das herausgeschnittene Gewebe gefärbt wurde (Beispiel 2), oder in dem Verfahren, in dem die Farbstoffe durch den Anus injiziert wurden (Beispiel 7). Betrachtete man sich das Lumen unter dem konfokalen Mikroskop, so ergab sich, dass das Zytoplasma nahezu aller die Schleimhaut bildenden Zellen gut gefärbt war, während die Mukuskomponenten der Becherzellen und die Zellkerne nur schwer färbbar waren (13). Dies bedeutet, dass die gut gefärbten Stellen die gleichen wie in den Beispielen 7 und 8 waren.
Vergleichsbeispiel 4
Fluoresceinnatrium (1 mg/ml) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 9 untersucht.
Dabei ergab Fluoresceinnatrium ein Bild gleicher Färbung wie in Beispiel 9. Dies bedeutet, dass viele derjenigen Zellen, die das Schleimhautgewebe bilden, gut gefärbt waren, während der Mukusanteil der Becherzellen nicht gefärbt war. Die Zellkerne konnten im Hinblick auf ihre Färbung nicht beurteilt werden (14).
Diese Ergebnisse entsprachen denjenigen Ergebnissen, die man in den Bildern erhielt, die sich beim Färben nach dem oben beschriebenen Verfahren zum Verteilen des Farbstoffs ergaben. Die Perfusionsfärbung brachte im Hinblick auf den Färbebereich, die Färbedichte, etc. bessere Ergebnisse.
Was die Beobachtung des Zellzustands und die Form des Zellkerns betrifft, so ist festzustellen, dass der Monascus-Farbstoff (gelb) bessere Daten als Fluoresceinnatrium liefert.
Beispiel 10
Der gelbe Monascus-Farbstoff wurde einer Hochgeschwindigkeits-Flüssigchromatografie (SCL10A von SHIMADZU CORPORATION) unterzogen. Seine Hauptbestandteile, d.h. Xanthomonasin A und Xanthomonasin B, wurden extrahiert und gereinigt.
Der gelbe Monascus-Farbstoff wurde in eine ODS-Säule (Wakosil 25C18) eingebracht und dann mit einer mobilen Phase aus 20% Acetonitril/Wasser separiert. Anhand des resultierenden Chromatogramms wurden die Komponenten in den einzelnen Spitzen oder Peaks rückgewonnen, mit einem Verdampfer konzentriert und dann unter den oben beschriebenen Bedingungen nochmals einer Chromatografie unterzogen. Jeder Bruchteil wurde dann im Hinblick auf Reinheit und Masse mittels einer Flüssigchromatografie-Massenspektrometrie-Kopplung, kurz LC-MS (Acquity UPLC-ZQ von Waters) analysiert. Diejenigen Bruchteile, die in dem Chromatogramm eine einzelne Spitze aufwiesen und die gleiche Masse wie Xanthomonasin A (oder Xanthomonasin B) hatten, wurden konzentriert und als gereinigtes Xanthomonasin A (bzw. Xanthomonasin B) identifiziert.
Beispiel 11
Unter Verwendung des in Beispiel 10 erhaltenen gereinigten Xanthomonasins A wurde ein Färbetest an einem Mausdickdarm durchgeführt.
Eine Maus (ddY, neun Wochen alt, männlich) wurde anästhesiert. 100 μl Xanthomonasin A (zentrifugierte und getrocknete Probe; 10 mg/ml Kochsalzlösung) wurde über eine Injektionsnadel in das Dickdarmlumen injiziert, um dieses zu färben.
Nach fünf Minuten wurde der Dickdarm der Maus herausgeschnitten. Unter dem konfokalen Mikroskop (TCS SP2) wurde ein konfokales Bild des Dickdarms aufgenommen und betrachtet.
15 zeigt das durch ein Objektiv mit 20-facher Vergrößerung aufgenommene Bild. 16 zeigt das durch ein Immersionsobjektiv mit 63-facher Vergrößerung aufgenommene Bild. Dabei waren die Verstärkungswerte 348,2 V und 339,7 V. Mit Xanthomonasin A erhielt man sehr lebhafte Schnittbilder.
Beispiel 12
Das in Beispiel 10 erhaltene gereinigte Xanthomonasin A wurde in einem an einem Mausdickdarm vorgenommenen Färbetest verwendet und diente der Beobachtung eines Gefrierschnitts.
Eine Maus (ddY, elf Wochen alt, männlich) wurde anästhesiert. 100 μl Xanthomonasin A (zentrifugiert und getrocknete Probe, 10 mg/ml Kochsalzlösung) wurde über eine Injektionsnadel zur Färbung in das Dickdarmlumen injiziert.
Nach fünf Minuten wurde der Dickdarm der Maus herausgeschnitten, gefroren und in einer OCT-Zusammensetzung eingebettet. Der so erhaltene Gefrierschnitt wurde in dünne Scheiben geschnitten, die jeweils eine Dicke von 6 μm, 10 mg/ml Kochsalzlösung) wurde über eine Injektionsnadel zur Färbung in das Dickdarmlumen injiziert.
Nach fünf Minuten wurde der Dickdarm der Maus herausgeschnitten, gefroren und in einer OCT-Zusammensetzung eingebettet. Der so erhaltene Gefrierschnitt wurde in dünne Scheiben geschnitten, die jeweils eine Dicke von 6 μm hatten. Die dünnen Scheiben wurden dann unter Hämatoxylin-Eosin-Färbung betrachtet. Außerdem wurden sie im Hinblick auf die Fluoreszenzstrahlung auch unter Färbung mit Xanthomonasin A betrachtet.
17 zeigt das durch ein Objektiv mit 40-facher Vergrößerung aufgenommene Bild, das bei Färbung mit Hämatoxylin-Eosin erhalten wurde. 18 zeigt das durch ein Objektiv mit 63-facher Vergrößerung aufgenommene Fluoreszenzbild, das man bei Färbung mit Xanthomonasin A erhielt.
Aus den beiden Färbebildern geht hervor, dass Epithelzellen durch Xanthomonasin A sehr gut gefärbt waren. Auch eine muskuläre Platte war sehr gut gefärbt. Der Verstärkungswert lag in einem Bereich von 300 bis 500 V, was auf ein ausgezeichnetes Färbevermögen hinweist.
Beispiel 13
Es wurden Mäuse (ddY, neun Wochen alt, männlich) anästhesiert. 100 μl Xanthomonasin A (zentrifugiert und getrocknete Probe, 1 mg/ml Kochsalzlösung) wurden über eine Injektionsnadel zur Färbung jeweils in den Dickdarm injiziert.
Die Dickdärme wurden nach einer bzw. zehn Minuten herausgeschnitten. Die Proben wurden unter dem konfokalen Mikroskop (TCS SP2) betrachtet.
19 zeigt das konfokale Bild des herausgeschnittenen Dickdarms 1 Minute nach der Färbung. 20 zeigt das konfokale Bild des Dickdarms 10 Minuten nach der Färbung. Die beiden Bilder zeigen, dass mit der Zeit Unterschiede im Färbeverhalten und der Permeation auftraten. Im Hinblick auf die gefärbten Stellen waren jedoch die beiden Bilder identisch. Es konnte festgestellt werden, dass die Sichtbarkeit verbessert war, wenn der Dickdarm 10 Minuten lang gefärbt wurde.

Claims

Verwendung eines oder mehrerer Elemente, die aus Farbstoffen ausgewählt sind, die aus Monascus gewonnen sind, in der Herstellung eines Färbemittels für ein Endoskop.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der die aus Monascus gewonnenen Farbstoffe ein oder mehrere Elemente umfassen, die aus Verbindungen ausgewählt sind, die durch die folgenden Formeln (1) bis (5) dargestellt sind:
worin R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ jeweils eine C1- bis C11-Alkylgruppe darstellen und R⁶ ein Wasserstoffatom oder -(CH₂)_nCH(NH₂)COOH darstellt, wobei n eine Zahl von 2 bis 6 ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, bei der die aus Monascus gewonnenen Farbstoffe ein oder mehrere Elemente sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Ankaflavin, Monascin, Monascorubrin, Rubropunctatin, Monascorubramin, Rubropunctatin, Rubropunctalysin und Xanthomonasin besteht.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das Endoskop ein zu medizinischen Zwecken eingesetztes Endoskop ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der das Endoskop ein mit sichtbarem Licht arbeitendes Endoskop, ein Fluoreszenzendoskop oder ein konfokales Endoskop ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bestimmt für eine orale Verabreichung, eine direkte Verabreichung an einen Verdauungstrakt oder eine submuköse Verabreichung.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bestimmt zum Färben der Oberfläche eines Verdauungstraktlumens und/oder des Inneren von Zellen in einem Verdauungstraktlumen.
Histologische Färbezusammensetzung für ein Endoskop, umfassend ein oder mehrere Elemente, die aus Farbstoffen ausgewählt sind, die aus Monascus gewonnen sind.
Färbezusammensetzung nach Anspruch 8, bei der die aus Monascus gewonnenen Farbstoffen ein oder mehrere Elemente umfassen, die aus Verbindungen ausgewählt sind, die durch die folgenden Formeln (1) bis (5) dargestellt sind:
worin R¹, R², R³, R⁴ und R⁵ jeweils eine C1- bis C11-Alkylgruppe darstellen und R⁶ ein Wasserstoffatom oder -(CH₂)_nCH(NH₂)COOH darstellt, wobei n eine Zahl von 2 bis 6 ist.
Färbezusammensetzung nach den Ansprüchen 8 oder 9, bei der die aus Monascus gewonnenen Farbstoffe ein oder mehrere Elemente sind, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Ankaflavin, Monascin, Monascorubrin, Rubropunctatin, Monascorubramin, Rubropunctatin, Rubropunctalysin und Xanthomonasin besteht.
Färbezusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei das Endoskop ein zu medizinischen Zwecken eingesetztes Endoskop ist.
Färbezusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 11, wobei das Endoskop ein mit sichtbarem Licht arbeitendes Endoskop, ein Fluoreszenzendoskop oder ein konfokales Endoskop ist.
Färbezusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 12, bestimmt für eine orale Verabreichung, eine direkte Verabreichung an einen Verdauungstrakt oder eine submuköse Verabreichung.
Färbezusammensetzung nach einem der Ansprüche 8 bis 13, bestimmt zum Färben der Oberfläche eines Verdauungstraktlumens und/oder des Inneren von Zellen in einem Verdauungstraktlumen.