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Die
Erfindung bezieht sich auf den Nachweis des menschlichen Vascular
Endothelial Growth Factor, und insbesondere auf ein Mittel zum Nachweis dieses
Botenstoffes, ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Mittels,
eine Verwendung eines Inhibitors des Vascular Endothelial Growth
Factors zur Herstellung eines Mittels zum Nachweis, die Verwendung
eines solchen Mittels sowie Verfahren zum Nachweis des menschlichen
Vascular Endothelial Growth Factors.
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Bei
vielen Krankheiten spielt der Botenstoff Vascular Endothelial Growth
Factor eine große Rolle; er wird teilweise in der Literatur
auch als Vascular Epithelial Growth Factor bezeichnet. Die übliche
Abkürzung für diesen Botenstoff ist VEGF; sie
wird nachfolgend auch hier verwendet.
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VEGF
tritt bei Krankheiten immer dann z. T. in erhöhtem Maße
auf, wenn Blutgefäße ausgebildet werden. Dies
kann beispielsweise bei Augenkrankheiten der Fall sein, z. B. bei
der feuchten Altersmakuladegeneration, aber auch bei bestimmten
Tumoren, z. B. Darmkrebs.
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In
der Literatur zeigte sich, daß VEGF als Frühindikator
dienen kann, da er zu einem Zeitpunkt vorliegt, zu denen das (unerwünschte)
Wachstum noch nicht eingetreten ist. Exemplarisch soll dies am Beispiel
der feuchten Altersmakuladegeneration erläutert werden.
Bei der Makuladegeneration tritt ein Funktionsverlust der Netzhaut
im Bereich der Makula Lutea, dem Punkt des schärfsten Sehens
ein. Ausgangspunkt der Krankheit sind dabei Unterstützungsstrukturen
der Hornhaut, die unter und in der Netzhaut flächige Gefäßmembranen
bilden, welche zu Blutungen neigen (daher das Adjektiv „feucht").
Die Bildung der Gefäße wird durch den VEGF angeregt, der
deshalb in den betroffenen Bereichen in erhöhter Konzentration
vorliegt.
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Bisherige
kurative Maßnahmen für die Makuladegeneration
(wiederholte Photocoagulation oder Intravitreous Injection) sind
mit erheblichem Aufwand und Risiko verbunden und können
vor allem nicht präemptiv eingesetzt werden. Zur Diagnose
ist derzeit die Fluoreszenzangiographie Standard. Sie erlaubt es
zu erfassen, ob Gefäße in die Netzhaut eingewachsen
sind. Die Diagnose ist somit erst möglich, wenn das Einwachsen
der Gefäße und damit die Netzhautschädigung
erfolgt ist. Es ist deshalb von Interesse, eine Frühdiagnostik
vorzunehmen.
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Hier
setzt beispielsweise die
WO 2006/073314 A1 an, die Fluoreszenz-gelabelte
Marker als Liganden nachweist, die mit Rezeptoren aus der Vascularisierungskette
reagieren. Problematisch ist hierbei jedoch, daß die Aussage
auf Existenz solcher Rezeptoren mit der Aktivierung der Vascularisierung,
also der tatsächlichen Gefäßbildung,
wenig zu tun hat, da die detektierten Rezeptoren auch in normalen
Endothelzellen, also ohne Gefäßwachstum vorhanden
sind. Prinzipiell könnte man fluoreszenzgelabelte Marker
gegen Membranproteine entwickeln, die nach Auslösung des
Vascularisierungsprozesses ggf. überexprimiert werden.
Jedoch ist dann bereits der Vascularisierungsprozess ausgelöst.
Der Nachweis wäre also zu spät. Man muß also
eine Aussage über die Existenz von blockierten, also aktivierten,
Rezeptoren treffen, was bei Nachweis von Liganden nur indirekt über
das Nichtvorhandensein von Fluoreszenz-Liganden möglich
ist. Das Ausmaß der Blockierung und damit der Aktivierung
der Vascularisierung ist nur schwierig zu messen, da keine Aussage über
das Reservoir an vorhandenen Rezeptoren möglich ist, man
also nicht weiß, von welchem Ausgangswert die Fluoreszenz
abnahm. Ein dunkles Fluoreszenzbild, das grundsätzlich
auf das Nichtvorhandensein von Fluoreszenz-Liganden hinweisen könnte,
kann weiter z. B. auch an einer zu unempfindlichen Aufnahme oder
einer zu geringen Markerkonzentration liegen. Somit ist dieses Meßprinzip,
das eigentlich mit einem einfachen apparativen Aufbau auskäme,
hinsichtlich Nachweisgenauigkeit und Detektionssicherheit nachteilig.
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Die
US 6371615 B1 schlägt
vor, Autofluoreszenz zu erfassen und die spezifische Autofluoreszenz-Signatur
des Augenhintergrunds flächenhaft zu vermessen, mit dem
Ziel, auf das Vorhandensein von einigen, für den Krankheitsfortschritt
kennzeichnenden Stoffen zu schließen. Zwar ist die Signatur
sichtbarer Stoffe sehr molekülspezifisch, jedoch wurde
ein für die Detektion unerläßlicher Schwellwert
der Intensität oder Verteilung der Autofluoreszenz bislang nicht
bestimmt. Es ist auch nicht erkennbar, wie er ermittelt werden könnte.
Darüber hinaus ist der meßtechnische Aufbau sehr
aufwendig.
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Ähnliche
Probleme stellen sich bei Anwendungen außerhalb des Auges,
beispielsweise bei Tumoren. Hier tritt noch die Schwierigkeit hinzu,
daß man anders als am Auge in der Regel keinen optischen
Zugang zum zu untersuchenden Gewebe hat.
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Zum
Nachweis von Substanzen sind in der Zellbiologie diverse, molekulare,
fluoreszenzgelabelte Marker Standard, die mit diversen Meßmethoden nachgewiesen
werden können. Unter dem Begriff „fluoreszenzgelabelt"
oder „gelabelt" wird dabei die Bindung eines Fluorophors
an eine Substanz verstanden. Darunter kommt eine Vielzahl an Bindungsmöglichkeiten
in Frage, insbesondere eine kovalente Bindung, eine Komplexbildung,
etc.
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Ein
grundliegendes Prinzip zum Nachweis solcher fluoreszenzgelabelter
Marker, z. B. bei der Aggregation von Molekülen wie Proteinen
in Zellen, ist der Hetero Fluorescence Resonance Energy Transfer,
der auch als hetero-FRET bezeichnet wird und beispielsweise in Lackowicz, „Principles
of fluorescence microscopy", Plenum Publishers, 1999, beschrieben
ist. Dabei werden zwei Farbstoffe unterschiedlicher Klassen als
Liganden an den Marker gebunden. Der eine Farbstoff wird optisch
angeregt und überträgt aufgrund seiner unmittelbaren
Nähe zum zweiten Farbstoff Schwingungsenergie und damit
die Anregung auf den zweiten Farbstoff, welcher dann in einem anderen
Spektralbereich optisch emittiert. Die Übertragung der
Schwingungsenergie (Resonance Energy) kann dabei nur erfolgen, wenn
die beiden Farbstoffe sehr nahe beieinander liegen, also beide als
Liganden an den Marker gebunden sind. Ungebundene Farbstoffe können
den Energieübertrag nicht ausführen, und es tritt
dann keine Abstrahlung von Fluoreszenzstrahlung durch das zweite
Fluoreszenzmolekül auf.
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Dieses
Nachweisprinzip wurde erweitert zur sogenannten homo-FRET, bei der
zwei Farbstoffe der gleichen Molekülklasse verwendet werden,
auch hier tritt eine Schwingungsenergieübertragung auf das
zweite am Marker gebundene Fluoreszenzmolekül auf. Dieser
Ansatz ist beispielsweise von Gautier et al., „homo-FRET
Microscopy in Living Cells to Messure Monomer-Dimer Transitions
of GFP-Tagged Proteins", Biophysical Journal, 80, 2001, p. 3000–3008,
beschrieben. Der Vorteil dieses Ansatzes liegt darin, daß für
die Farbstoffe nur eine Molekülklasse oder sogar nur ein
Farbstoff benötigt wird, man also nicht unterschiedliche
Farbstoffe braucht. Die homo-FRET mißt also im Endeffekt
die Lebensdauer einer Fluoreszenzanistropie, was in der bereits zitierten
Veröffentlichung von Gautier et al. über eine zeitaufgelöste
Detektion erfolgte. Eine Phasenmessung beschreibt Clyton
et al., „Dynamic Fluorescence Anisotrophy Imaging Microscopy
in the Frequency Domgin (rFLIM)", Biophysical Journal, 83, 2002,
p. 1631–1649.
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Sowohl
für homo-FRET als auch für hetero-FRET ist es
bekannt, die Weber-Rotverschiebung zur Normierungszwecken heranzuziehen.
Dies ist beispielsweise in Squire et al., "Red-edge anisotropy microscopy
enables dynamic imaging of homo-FRET between green fluorescent Proteins
in cells", J. Struct. Biol., 2005, 147(1), p. 62–69.
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Die
genannten Literaturstellen befassen sich mit dem grundsätzlichen
Nachweis von Markern, offenbaren jedoch nicht einen Einsatz am Menschen, da
es gegenwärtig keine geeigneten klinisch aussagekräftigen
Marker gibt.
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Hier
setzt die Erfindung an. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, einen Nachweis
für den VEGF zu schaffen.
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Diese
Aufgabe wird mit einem Mittel zum Nachweis des menschlichen VEGF
gelöst, das einen Inhibitor des VEGF umfaßt, an
den ein Fluorophor gebunden ist. Die Erfindung setzt also als Marker eine
Kombination aus einem pharmazeutisch wirksamen Stoff, der als Inhibitor
des VEGF wirkt, mit einem Fluorophor ein und erhält dadurch
auf überraschend einfache Weise einen Marker für
VEGF. Das erfindungsgemäße Vorgehen eröffnet
es dabei, vorzugsweise einen Wirkstoff zu verwenden, der bereits
für die Anwendung am Menschen zugelassen ist. An diesen
Inhibitor wird nun ein Fluorophor gebunden, wobei es sehr vorteilhaft
ist, daß es auch hier bereits für den Einsatz
am Menschen zugelassene Fluorophore gibt. Die Kombination von jeweils
für sich zugelassenen Stoffen erreicht mit überraschend
geringem Aufwand ein Mittel zum Nachweis des menschlichen VEGF,
dessen zu erwartende Kosten und Risiken bei der Arzneimittelzulassung
sowohl in klinischen Phase I als auch in klinischen Phasen II und
III deutlich reduziert ist, wenn die entsprechenden klinischen Phasen
für die Einzelkomponenten des Markers, d. h. für
Inhibitor und Fluorophor, schon erfolgreich abgeschlossen sind.
Vorteile ergeben sich aber auch, wenn ein noch nicht zugelassener
Inhibitor und/oder ein noch nicht zugelassener Fluorophor verwendet werden,
da man dann mit den Kosten der erforderlichen Studien sowohl die
Zulassung der Einzelsubstanz als auch die Zulassung der Kombination
erreicht.
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Inhibitoren
des VEGF werden bereits in Wirkstoffen zur Behandlung der feuchten
Altersmakuladegeneration eingesetzt. Beispiele für solche
Inhibitoren sind Ranibizumab, Pegaptanib oder Bevacizumab. Für
solche Inhibitoren muß überhaupt kein Zulassungsverfahren
mehr durchgeführt werden, weshalb deren Verwendung besonders
bevorzugt ist. Dies gilt ganz grundsätzlich natürlich
für den Einsatz schon zugelassener Inhibitoren.
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Analoges
gilt hinsichtlich der Fluoreszenz-Farbstoffe, da als zugelassene
Fluorophore bereits Fluoreszenzfarbstoffe, wie Fluorescein oder
Indocyaningrün, bekannt und zugelassen sind. Es ist deshalb
eine Weiterbildung bevorzugt, bei der solche zugelassenen Substanzen
verwendet werden bzw. das Fluorophor diese Substanzen aufweist.
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Zur
hetero-FRET werden, wie bereits erläutert, Fluorophore
unterschiedlicher Stoffklassen verwendet. Es ist deshalb ein Gemisch
für das Mittel bevorzugt, bei dem an den Indikator jeweils
ein Fluorophor erster Art sowie ein Fluorophor zweiter Art gebunden
ist. Die Fluorophore können beispielsweise Fluorescein
oder Indocyningrün sein.
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Die
erfindungsgemäße Erkenntnis erlaubt es auf einfache
Weise, ein Mittel zum Nachweis des menschlichen VEGF herzustellen,
so daß erfindungsgemäß auch eine Verwendung
eines Inhibitors des VEGF zur Herstellung eines solchen Mittels
vorgesehen ist, wobei an den Inhibitor ein Fluorophor gebunden wird.
Auch hier können Inhibitor und Fluorophor die bereits oben
erwähnten Substanzen umfassen. Natürlich ist es
auch hier günstig, zur Anwendbarkeit von hetero-FRET als
Nachweismethode ein Teil des Inhibitors an ein Fluorophor erster
Art und ein Teil des Inhibitors an ein Fluorophor zweiter Art zu binden.
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Analoges
gilt für ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels zum
Nachweis des menschlichen VEGF, bei dem an einen Inhibitor des VEGF
ein Fluorophor gebunden wird. Auch hier sind die geschilderten Ausbildungen
hinsichtlich des Inhibitors, des Fluorophors bzw. der Bildung eines
Gemisches möglich und vorteilhaft.
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Das
geschilderte Mittel kann vorzugsweise als medizinisches Diagnosemittel
eingesetzt werden. Somit wird eine Substanz, die eigentlich als
pharmakologisch wirksames therapeutisches Mittel entwickelt und
vorzugsweise auch zugelassen wurde, nun für ein als medizinisches
Diagnosemittel eingesetzt. Die Verwendung kann dabei insbesondere
die altersbedingte Makuladegeneration oder Darmtumoren betreffen.
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Die
Erfindung erlaubt weiter, den menschlichen VEGF in einem Verfahren
nachzuweisen, bei dem ein Mittel der vorher beschriebenen Art einer
zuvor entnommenen Probe zugegeben wird und an der Probe ein Meßwert
für die Bindung des Mittels an den VEGF mittels Fluorescence
Resonance Energy Transfer ermittelt wird. Das Verfahren sieht also
die Verwendung des Mittels zum in vitro Nachweis des VEGF vor.
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Analog
ist natürlich auch ein in vivo Nachweis möglich,
so daß einem Patienten ein Mittel der geschilderten Art
injiziert wird und in vivo eines zu untersuchenden Gewebes mittels
Fluorescence Resonance Energy Transfer ein Meßwert für
die Bindung des Mittels an den VEGF bestimmt wird. Auch ist eine in
vivo Anwendung nicht auf die beschriebenen Ausführungsbeispiele
am Auge eingeschränkt, sondern kann beispielsweise auch
im Rahmen einer endoskopischen Untersuchung, z. B. bei der Diagnose
von Darmkrebs, vorgenommen werden.
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Das
erfindungsgemäße Vorgehen hat den Vorteil, daß neben
einer deutlich einfacheren Zulassung des Diagnosemittels für
die Anwendung am Menschen auch zugleich sichergestellt ist, daß für
mit Hilfe des erfindungsgemäßen Diagnosemittels
erkannte Erkrankungen auch gleich ein Therapeutikum zur Verfügung
steht, da der zur Herstellung des Diagnosemittels verwendete Inhibitor
eingesetzt werden kann.
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Die
erfindungsgemäße VEGF-Diagnose erlaubt weiter
eine frühzeitige Diagnose und Therapie zu einem Zeitpunkt,
bevor physiologische Ausfälle in Erscheinung treten, die
Wirkung von VEGF also bereits negative Folgen zeitigte.
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Die
eingangs geschilderten Ansätze zum Nachweis der feuchten
Altersmakuladegeneration haben, wie bereits erläutert,
Probleme damit, einen Vergleichswert zu schaffen, der es erlaubt
festzustellen, ob VEGF nicht im untersuchten Gewebe vorliegt. Hier
läßt sich das erfindungsgemäße
Verfahren nun einfach weiterbilden, wenn ein Mittel der genannten Art
verwendet wird, das unter Verwendung eines Fluorophors gewonnen
wird bzw. ein Fluorophor aufweist, dessen Anregungs- und Emissionsspektrum sich überlappen.
In der Weiterbildung ist dann vorgesehen, daß ein Vergleichswert
für die Bindung des Inhibitors an VEGF mit einer Anregungswellenlänge
ermittelt wird, die über der Wellenlänge des Schnittpunktes
von Anregungs- und Emissionsspektrum des Fluorophors liegt und bei über
dem Meßwert liegendem Vergleichswert auf das Nichtvorhandenensein
des VEGF im untersuchten Gewebe geschlossen wird.
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Die
Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen
sowie der beiliegenden Zeichnungen erläutert. In den Zeichnungen
zeigen:
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1 eine
vereinfachte Darstellung eines Mittels zum Nachweis des VEGF,
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2 Anregungs-
und Emissionsspektren des Mittels der 1,
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3 zeitliche
Ablenkverhalten, die beim Mittel der 1 auftreten
können,
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4 Rotationen
von Dipolmomenten, die beim Mittel der 1 während
des Nachweis auftreten können,
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5 eine
Schemadarstellung eines Anregungs- und eines Emissionsspektrums,
die für eine Vergleichsmessung ausgenutzt werden,
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6 eine
Nachweisvorrichtung zum Nachweis des VEGF unter Verwendung des Mittels
der 1 durch Ausnutzung der hetero-FRET,
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7 eine
Nachweisvorrichtung ähnlich der 6,
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8 eine
Nachweisvorrichtung ähnlich der 6, jedoch
zur Ausnutzung des homo-FRET und
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9 eine
Vorrichtung ähnlich der 8.
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Zum
Nachweis von VEGF bei Erkrankungen, die eine gesteigerte Blutgefällbildung
mitsichbringen, beispielsweise bei der feuchten Altersmakuladegeneration
wird ein Mittel für einen molekularspezifischen Nachweis,
der das Krankheitsstadium molekularspezifisch anzeigenden dimeren
Signalstoffe, des VEGF, eingesetzt. Der molekularspezifische Nachweis
besteht darin, daß das Mittel zum einen an den dimeren
Signalstoff bindet und zum anderen Fluoreszenzeigenschaften aufweist,
die im gebundenen Zustand eine Fluoreszenzmessung oder sogar Abbildung
ermöglicht. Dabei binden zwei Diagnosemittelmoleküle
an den VEGF und zeigen dann (und nur dann) bestimmte Fluoreszenzeigenschaften.
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Es
wird ausgenutzt, daß der dimere Signalstoff, also VEGF,
mehrere Bindungsstellen für den Inhibitor aufweist. Somit
sind an ein Botenstoffmolekül mindestens zwei Inhibitoren
und jeweils zwei Farbstoffmoleküle gebunden. Diesen Zustand
zeigt schematisch 1. Bezugszeichen 1 bezeichnet
in 1 den dimeren Signalstoff VEGF, der ein Gewicht
von 40 kD hat. An ihm sind zwei Moleküle des Diagnosemittels 2 angebunden,
die jeweils aus einem Inhibitor 3 und einem Fluorophor 4 bzw. 4' aufgebaut
sind.
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Das
Diagnosemittel wurde hergestellt, indem der Fluorophor bzw. die
Fluorophore (auf diesen Unterschied wird nachfolgend noch eingegangen)
an den Inhibitor gebunden werden. Als Inhibitor kommen grundsätzlich
alle Substanzen in Frage, die zum Inhibieren der Wirksamkeit des
dimeren Signalstoffes an diesen binden. Beispiele für bekannte
Inhibitoren sind Ranibzizumab, Pegaptanib oder Bevacizumab. Ihre
grundsätzliche Funktionsweise sowie ihr Aufbau ist beispielsweise
in der Veröffentlichung Kowanetz/Ferrara, „Vascular
Endothelial Growth Factor Signaling Pathways: Therapeutic Perspective",
Clin. Cancer Res. 2006, 12(17), p5018–5022, beschrieben.
Aufgrund des relativ hohen Molekülgewichtes von typisch
150 kD ist die Bindung des Fluorophors an den Inhibitor unkritisch,
da letzterer viele mögliche Bindungsstellen aufweist.
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Als
Fluorophor kommen insbesondere bereits für die Anwendung
am Menschen zugelassene Substanzen, wie beispielsweise Fluorescein
oder Indocyaningrün in Frage. Ob unterschiedliche Farbstoffe
verwendet werden, hängt im wesentlichen vom Nachweisverfahren
ab, mit dem man VEGF mit Hilfe des Diagnosemittels einsetzen möchte.
Verwendet man hetero-FRET, wird das Diagnosemittel ein Gemisch umfassen,
das aus dem Inhibitor mit daran gebundenem ersten Farbstoff sowie
dem Inhibitor mit daran gebundenem zweiten Farbstoff besteht. Diese Situation
ist in 1 dargestellt, bei der unterschiedliche Fluorophore 4 und 4' verwendet
werden. Die Fluorophore wirken dann bei der hetero-FRET als Donor-Farbstoff
bzw. Akzeptor-Farbstoff. Der Nachweis gelingt somit nur in dem in 1 gezeigten
Zustand, wenn also zwei Diagnosemittelmoleküle an ein VEGF-Molekül
angelagert sind.
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2 zeigt
schematisch die Anregungs- und Emissionsspektren des Diagnosemittels
der 1. Die Kurve 5 stellt das Anregungsspektrum
des Donor-Farbstoffes, also des Fluorophors 4 dar. Ein durch
optische Beleuchtungsstrahlung in diesem Spektralbereich angeregter
Fluorophor 4 emittiert in einem Spektrum, das als Emissionsspektrum 6 in 2 eingetragen
ist, welche die Intensität I der Strahlung als Funktion
der Wellenlänge λ zeigt. Das Emissionsspektrum 6 des
Donor-Farbstoffes überlappt mit einem Anregungsspektrum 7,
das der als Akzeptor-Farbstoff wirkende Fluorophor 4' hat.
Dieser wiederum emittiert in dem Emissionsspektrum 8, das
noch einmal ins Rote verschoben ist. Eine Anregung im Spektralbereich
des Anregungsspektrums 5 führt also dann (und
nur dann) zu einer Emission im Bereich des Emissionsspektrums 8,
wenn sich Donor-Farbstoff 4 und Akzeptor-Farbstoff 4' in
eng benachbartem Abstand zueinander befinden. Dieser geringe Abstand,
der in 1 mit d bezeichnet ist, liegt nur dann vor, wenn
die jeweiligen Moleküle, d. h. Verbindungen aus Inhibitor 3 mit
Fluorophor 4 bzw. Inhibitor 3 mit Fluorophor 4',
beide am dimeren Signalstoff VEGF angedockt sind. Nur dann ist der
Abstand so gering, daß die im Anregungsspektrum 5 eingestrahlte
Beleuchtungsstrahlung zu einer Emission im Emissionsspektrum 8 führt.
Jegliche Emission in diesem Spektralbereich zeigt also an, daß VEGF
mit zwei daran angebundenen Diagnosemittelmolekülen vorliegt.
Diagnosemittelmoleküle die hingegen nicht an VEGF gebunden
sind, haben keine Fluorophore 4 bzw. 4' im Abstand
d, so daß die Übertragung vom Emissionsspektrum 6 in
das Anregungsspektrum 7 dort nicht funktioniert. Der Nachweis
ist also hochspezifisch.
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Zum
Nachweis von VEGF wird also das Verhältnis von Emission
ohne Bindung, also z. B. Emission im Emissionsspektrum 6 und
z. B. Emission mit Bindung, also Emission im Emissionsspektrum 8 ermittelt. Überschreitet
das Verhältnis einen gewissen Mindestwert, liegt VEGF vor.
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Da
die Bindungswahrscheinlichkeiten des Diagnosemittels für
ein Molekül mit Fluorophor 4 gegenüber
der eines Moleküls mit Fluorophor 4' im wesentlichen
gleich ist, trägt aber nur die Hälfte der VEGF-Moleküle,
an die zwei Diagnosemittelmoleküle gebunden sind, zur Signalgebung
bei, da an die andere Hälfte statistisch gesehen zwei Diagnosemittelmoleküle gebunden
sind, die identische Fluorophore haben. Die geschilderte Spektralverschiebung
tritt dann so nicht auf.
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Eine
Steigerung der Nachweisempfindlichkeit erreicht man, wenn als Nachweismethode
nicht hetero-FRET, sondern homo-FRET verwendet wird. Das Diagnosemittel
besteht dann aus dem Inhibitor mit nur einem Farbstoff. Die Fluorophore 4 und 4' der 1 sind
also identisch.
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Dann
erfolgt der Nachweis über homo-FRET, beispielsweise über
eine Lebensdauermessung. Die Lebensdauer der Fluoreszenzstrahlung
ist dann deutlich verlängert, wie der bereits eingangs
erwähnte Artikel von Gautier et al. schildert. 3 zeigt
entsprechende Lebensdauerkurven, indem die Intensität I über
der Zeit t aufgetragen ist. Die Lebensdauerkurve 9 ohne
FRET fällt dabei viel schneller ab als die Lebensdauerkurve 10,
die vorliegt, wenn FRET auftritt. Damit FRET auftritt, muß natürlich
ein Energieübertrag zwischen zwei Fluorophoren erfolgen,
die in Diagnosemittelmolekülen vorhanden sind, welche beide
an VEGF gebunden sind. Insofern ist die Situation wie bei dem zuvor
erwähnten hetero-FRET-basierten Nachweis.
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Alternativ
zu einer Intensitätsmessung kann auch eine Phasenmessung
erfolgen, die im bereits genannten Artikel von Clyton et al. geschildert
ist. Auf die genannten Artikel von Gautier et al. und Clyton et al.
wird deshalb hier voll bezugnehmend verwiesen, soweit Aufbau und
Funktion des homo-FRET-Nachweises betroffen sind.
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Weiter
kann eine Polarisationsanistropie ausgenutzt werden, die bei Bindung
zweier Diagnosemittelmoleküle an den VEGF auftritt. 4 zeigt exemplarisch
die Lagen der Dipolmomente. 11 sei
das Dipolmoment bei Anregung. Ohne FRET wird das Dipolmoment des
Farbstoffes aufgrund Molekülrotation z. B. in die Dipolmomentlage 12 rotiert;
mit FRET hingegen sehr viel weiter in die Dipolmomentlage 13.
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Unter
voller Bezugnahme auf die bereits erwähnten Artikel werden
nun die erforderlichen Aufbauten für den geschilderten
FRET-basierten Nachweis von VEGF geschildert.
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6 zeigt
schematisch den Aufbau einer Nachweisvorrichtung 17 unter
Ausnutzung der hetero-FRET am Auge 18 bzw. an der Retina
des Auges 18. Die Strahlungsquelle emittiert in einem Spektralbereich,
der im zuvor erwähnten Anregungsspektrum 5 liegt.
Diese spektrale Eigenschaft der Beleuchtungsstrahlung ist gegebenenfalls
durch einen geeigneten Anregungsfilter 20 sichergestellt. Über
einen nicht näher bezeichneten teildurchlässigen
Umlenkspiegel wird die Beleuchtungsstrahlung auf das Auge 18 und
dort auf die Retina gerichtet. Ein Bild der Retina wird durch den
teildurchlässigen Spiegel hindurch gewonnen, wobei die
Strahlung bei der Abbildung durch einen Dichroid 21 in
zwei Spektralbereiche aufgeteilt wird. Es handelt sich hierbei um
die Spektralbereiche der Emissionsspektren 6 und 8. Geeignete
Emissionsfilter 22 und 23 stellen sicher, daß auf
nachgeordnete Empfänger 24 und 25 nur
die Strahlung aus dem jeweiligen Spektralbereich bei der Abbildung
fällt. Ein Vergleich der Signale des Empfängers 24,
der die Strahlung aus dem Spektralbereich des Emissionsspektrums 6 erhält,
sowie des Empfängers 25, der die Strahlung aus
dem Spektralbereich des Emissionsspektrums 8 empfängt,
erlaubt eine Aussage, ob VEGF mit daran gebundenen Diagnosemittelmolekülen
in der Probe vorliegt.
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Der
Aufbau gemäß 6 ist vergleichsweise einfach,
da nur eine Anregungswellenlänge bzw. nur ein Spektralbereich
für die Beleuchtungsstrahlung benötigt wird.
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Ein
Vorteil ist weiter, daß die Abbildung der Retina bzw. des
interessierten Bereiches am Auge 18 (oder einem anderen
zu untersuchenden Objekt) bereits die erforderliche Ortsinformation
enthält, so daß im Bild die fluoreszierenden Stellen
eindeutig dem Nachweis von VEGF zugeordnet werden können.
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7 zeigt
eine Bauweise ähnlich der 6, jedoch
ist die hier dargestellte Nachweisvorrichtung 32 für
die Ausnutzung der homo-FRET ausgebildet. Bauteile, die in der Nachweisvorrichtung 32 der 7 hinsichtlich
Aufbau und/oder Funktion denen der Nachweisvorrichtung 17 aus 6 entsprechen,
sind mit denselben Bezugszeichen versehen und werden deshalb gegebenenfalls
nicht noch einmal erläutert.
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Die
Nachweisvorrichtung
32 weist eine Strahlungsquelle
33 auf,
die bei mindestens einer Wellenlänge emittiert. Diese emittierte
Beleuchtungsstrahlung wird durch einen Polarisator
26 geleitet,
der eine Polarisationsrichtung vorgibt. Über den teildurchlässigen
Spiegel wird die Strahlung auf das Auge geleitet. Dabei kann ein
Doppelbrechungskompensator
40 Anwendung finden, der Doppelbrechung von
Cornea und Netzhaut kompensiert. Ein solcher Doppelbrechungskompensator
27 ist
beispielsweise in der
US 50303709 beschrieben,
die einen fixen Doppelbrechungskompensator schildert. Ein variabler,
d. h. einstellbarer Kondensator ist aus der
US 2002051333 A2 bekannt
und kann ebenfalls verwendet werden. Der Offenbarungsgehalt beider
Druckschriften wird hinsichtlich des Doppelbrechungskondensators,
dessen Aufbau, Anwendung, Funktion und Vorteilen hier vollumfänglich
einbezogen.
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Fluoreszenzstrahlung
am Auge wird dann über einen gegebenenfalls polarisierenden
Strahlteiler 29, dem ein Emissionsfilter 28 (mit
Filtereigenschaften zur Selektion des Emissionsspektrums 6 der 2)
vorgeordnet ist, wiederum auf zwei Empfänger 24, 25 abgebildet,
denen entsprechende Analysatoren 30 und 31 vorgeschaltet
sind.
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Die
Nachweisvorrichtung 32 wertet damit eine Polarisationsanistropie über
das Verhältnis aus Dipolmomentenlage 12 und Dipolmomentenlage 13 der 4 aus.
Abhängig von diesem Verhältnis wird das Vorhandensein
von VEGF in der abgebildeten Probe ermittelt.
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8 zeigt
schematisch eine Nachweisvorrichtung 32 zur Detektion von
homo-FRET auf Basis einer Lebensdauermessung. Die Strahlungsquelle 33 ist
nun als gepulste Quelle ausgebildet, die gepulste Beleuchtungsstrahlung
auf das Auge 18 leitet. Falls erforderlich kann die Strahlungsquelle 33 in
einem gewünschten Spektralbereich emittieren, kann. Ein
Teil der gepulsten Strahlung wird über einen Strahlteiler 34 auf
einen Empfänger 35 geleitet, dessen Signale von
einem Impulskorrelator 36 ausgelesen werden. Der restliche
Teil der Beleuchtungsstrahlung gelangt auf das Auge 18 und
regt dort Fluoreszenz an. Die Fluoreszenzstrahlung wird über
einen Emissionsfilter zu einem Empfänger 38 geleitet, dessen
Signale ebenfalls vom Impulskorrelator 36 ausgelesen werden.
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Eine
nachgeordnete Auswerteeinheit mißt nun die Lebensdauer
und ermittelt daraus, ob homo-FRET auftrat. Da in der hier für 8 geschilderten
Ausführungsform nur ein einziger Strahl zur Anregung des
Auges bereitgestellt wird, um eine höhere Anregungsenergie
in der Beleuchtungsstrahlung realisieren zu können, ist
dem Auge 18 noch eine Scaneinheit 40 vorgeordnet,
die den interessierenden Bereich der Probe abscannt, in dem die
Lage des Beleuchtungsspots auf der Probe verstellt wird. Durch Einsatz
entsprechender hochenergetischer Beleuchtungsquellen und einer entsprechenden
Abbildungsoptik sowie eines entsprechenden flächigen Empfängers 38 kann
natürlich auch ohne Scannen gearbeitet werden; die Scaneinheit 40 entfällt
dann.
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9 zeigt
einen Aufbau zum Nachweis von homo-FRET mittels Phasenmessung. Elemente
der entsprechenden Nachweisvorrichtung 32, die Elementen
bereits geschilderter Nachweisvorrichtungen entsprechen, sind wiederum
mit demselben Bezugszeichen versehen und werden gegebenenfalls nicht noch
einmal erläutert.
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Die
Strahlung der Lichtquelle 33 wird nun, z. B. mittels eines
Modulators 41, mit einer Frequenz moduliert, beispielsweise
indem der Strom der Lichtquelle vom Modulator 41 entsprechend
verändert wird. Der Modulator 41 gibt ein Signal über
die Modulation an einen frequenz- und phasensensitiven Signalfilter,
der beispielsweise als Lock-in-Detektor 42 realisiert sein
kann. Der Lock-in-Detektor 42 wertet das Signal des Sensors 38 aus
und ermittelt die Phasenverschiebung, die die Fluoreszenzstrahlung
im abgebildeten Auge 18 gegenüber der Beleuchtungsstrahlung
hat. Die nachgeschaltete Auswerteeinheit empfängt dann
ein Signal über Korrelationsamplitude und Phase, wodurch
letztlich die Phasenmessung erfolgt.
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Bei
der Nachweisvorrichtung der 7 ist die
Meßgröße also die Polarisationsanistropie,
die beispielsweise durch die Differenz zwischen Intensität
bei paralleler und senkrechter Polarisation dividiert durch die
Summe aus der Intensität der parallel polarisierten Strahlung
sowie der doppelten Intensität der senkrecht polarisierten
Strahlung gewonnen werden kann. Bei der Nachweisvorrichtung gemäß 8 ist
die Meßgröße hingegen die Lebensdauer, bei
der Nachweisvorrichtung gemäß 9 die
Phase.
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Die
Bindung des Diagnosemittels an VEGF als Ursache der aufgenommenen
Fluoreszenzstrahlung kann daran erkannt werden, daß die
Meßgröße über einen bestimmten
Schwellwert liegt. In bevorzugten Weiterbildungen ist es jedoch
auch möglich, einen Null-Wert zur Referenzierung zu gewinnen,
der ein Maß über die Fluoreszenz gibt, die ohne
Bindung des Diagnosemittels an VEGF entsteht. Für eine
solche Referenzierung wird die Weber-Rotverschiebung eingesetzt
(in der englischsprachigen Literatur auch als Weber Red Shift bezeichnet).
Diese Verschiebung bedeutet, daß die emittierte Fluoreszenzstrahlung
regelmäßig langwelliger ist, als die Beleuchtungsstrahlung,
die als Anregungsstrahlung die Emission auslöst. 5 zeigt
exemplarisch das entsprechende Anregungsspektrum 14 sowie
das demgegenüber rotverschobene Emissionsspektrum 15. Regt
man bei einer Wellenlänge λ1 an, kann die emittierte
Anregungsstrahlung sämtlich im FRET-Prozeß zur
Erzeugung von Emissionsstrahlung im Emissionsspektrum 15 ausgenutzt
werden. Das Emissionsspektrum 15 ist unterhalb der Wellenlänge λ1
Null, so daß für keine Anteile des Emissionsspektrums 15 die Anregungswellenlänge
bereits langwelliger ist, als die zu emittierende Emissionswellenlänge
(was aufgrund der unvermeidlichen Rotverschiebung nicht ginge).
Verlängert man jedoch die Anregungswellenlänge
beispielsweise auf die Wellenlänge λ2, gibt es merkliche
Anteile des Emissionsspektrums 15, die kurzwelliger sind,
als die Anregungswellenlänge. In diesen Bereichen ist somit
eine Emission von Fluoreszenzstrahlung nicht möglich. Die
Emissionsintensität ist also deutlich reduziert.
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Ganz
grundsätzlich ist zur Anregung nur der Spektralbereich
des Anregungsspektrums 14 verfügbar, der eine
Wellenlänge gleich oder größer der Anregungswellenlänge
hat. Es zeigt sich dabei, daß die Anregungseffizienz mit
dem Integral des Anregungsspektrums für Wellenlängen
oberhalb der Anregungswellenlänge (z. B. λ2) verknüpft
ist. Nun fällt die Fläche 16, die dieses
Integral beschreibt, mit steigender Anregungswellenlänge
schneller ab, als die Anregungsintensität selbst.
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Diesen
Effekt macht sich eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen
Nachweises von VEGF zu Nutze, da bei ausreichend hoher Anregungswellenlänge λ2
so gut wie überhaupt keine Emissionsstrahlung im Spektrum 15 mehr
auftreten kann. Sämtliche Fluoreszenzstrahlung, die dann noch
aufgesammelt wird und im Bild erscheint, rührt somit von
Primärfluoreszenz der verwendeten Farbstoffe, von anderen
Fluoreszenzeffekten her oder beruht auf einer prinzipiell nicht
perfekten Abseparierung der Anregungsstrahlung aus dem Fluoreszenzbild,
nicht jedoch auf den FRET-Effekt.
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Beleuchtet
man also das Objekt mit einer Wellenlänge λ2,
die z. B. oberhalb der Schnittlinie zwischen Anregungsspektrum 14 und
Emissionsspektrum 15 liegt, kann die im Bild aufgenommene Strahlung
nur zu einem vernachlässigbaren Anteil vom FRET-Effekt
herrühren, also durch an VEGF gebundene Diagnosemittelmoleküle
verursacht sein. Die Einstrahlung von Beleuchtungsstrahlung bei
solchen Wellenlängen führt also zu einem Signal,
das zur Referenzierung und als Null-Wert verwendet werden kann.
Die geschilderten Nachweisvorrichtungen können deshalb
so ausgebildet sein, daß sie bei zwei Wellenlängen
Beleuchtungsstrahlung einstrahlen. Die Strahlungsquellen bzw. Filter
sind deshalb dann passend ausgebildet. Natürlich ist eine
derartige Ausgestaltung optional und nicht zwingend, da auch für
bestimmte Zwecke eine einfache Schwellwertüberwachung ohne
Referenzierung auf einen Null-Wert genügen kann.
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Das
erfindungsgemäße Konzept zum VEGF-Nachweis verwendet
also insbesondere folgende Vorgehensweisen:
Der Nachweis des
VEGF-Dimers im Blut oder Gewebe erfolgt über einen fluoreszenzgelabelten
Inhibitor für VEGF, vorzugsweise einen Pharmawirkstoff,
der das Dimer an zwei Stellen bindet. Der Nachweis der Bindungen
an das Dimer erfolgt über Energietransfer der Fluorophore,
entweder in Form der hetero-FRET oder in Form der homo-FRET. Dabei
kann das Verhältnis der Intensitäten von Primär-
und Sekundärfluoreszenzemission bei Fluoreszenzanregung
des primären Farbstoffes ermittelt werden, also hetero-FRET
ausgenutzt werden. Alternativ ist es auch möglich, eine
Fluoreszenzlebensdauermessung, eine Messung der Änderung
der Fluoreszenzanistropie oder eine Phasenmessung auszuführen,
gegebenenfalls jeweils bei verschiedenen Wellenlängen zur Referenzierung
bzw. Normierung im homo-FRET-Fall.
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Ein
erstes erfindungsgemäßes Verfahren kann also vorsehen:
Labeln
eines VEGF-Inhibitors oder Wirkstoffes mit einem Fluoreszenzfarbstoff
und Labeln desselben Inhibitors mit einem anderen Fluoreszenzfarbstoff,
so daß das Diagnosemittel ein Gemisch von Inhibitormolekülen
mit daran gebundenem ersten Fluorophor und Inhibitormolekülen
mit daran gebundemem zweiten Fluorophor aufweist. Anschließend
wird das so erhaltene Diagnosemittel entweder in vivo an die entsprechende
zu diagnostizierende Stelle gebracht, z. B. durch Einspritzen (in
die Blutbahn intravenös oder intravitral), oder das Diagnosemittel
wird mit einer zuvor entnommenen Probe in vitro vermischt.
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Anschließend
erfolgt eine Anregung bei einer ersten Wellenlänge, die
die Anregungswellenlänge für den ersten Farbstoff
ist. Die Aufnahme der Fluoreszenzstrahlung aus der Probe erfolgt
dann entweder durch eine Bildaufnahme oder durch Abscannen eines
Bereiches/Volumens, wenn ein bildgebender Nachweis erwünscht
ist. Bei homogenen in-vitro-Proben genügt in der Regel
eine nicht-abbildende Aufnahme der Fluoreszenzstrahlung. Zur Analyse
des Bildes wird die entsprechende Meßgröße
(entweder der zuvorgeschilderte Anistropiequotient oder Lebensdauer
bzw. Phase) ermittelt.
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Die
Datenausgabe kann beispielsweise in Form eines Grauwertbildes oder
eines Falschfarbenbildes erfolgen, wobei Bereiche, die einen besonderen
Schwellwert der Fluoreszenzintensität überschreiten
oder unterschreiten, markiert werden können. Gegebenenfalls
erfolgt auch eine Überlagerung mit einer klassischen Abbildung
des Objektes, also einer Abbildung die nicht auf die Besonderheiten
der VEGF-Bindung mit dem Diagnosemittel abgestimmt ist. Dazu kann
die entsprechende Abbildung in der Nachweisvorrichtung integriert
sein. Dieses geschilderte, erste Verfahren nutzt die hetero-FRET
zum Nachweis und verwendet in der Nachweisvorrichtung z. B. die
für 6 bereits geschilderte Wellenlängentrennung.
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Ein
zweites Verfahren hingegen nutzt homo-FRET zum Nachweis. Wiederum
wird der Inhibitor mit einem Fluoreszenzfarbstoff derart umgesetzt, daß der
Fluorophor an den Inhibitor gebunden ist. Im Unterschied zum ersten
Verfahren ist jedoch nur noch ein Fluorophor erforderlich. Es liegt
also ein Diagnosemittel vor, das den Inhibitor mit daran gebundenem
Fluorophor aufweist. Ein Gemisch des Inhibitors mit daran gebundenen
verschiedenen Fluorophoren ist nicht mehr erforderlich. Die Schritte
der Herstellung des Diagnosemittels und des Einbringens des Diagnosemittels
geschehen wie bei den bereits beschriebenen Verfahren.
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Anschließend
wird das Diagnosemittel wieder mit der Probe in Verbindung gebracht,
wie bereits zum ersten Verfahren geschildert.
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Das
zweite Verfahren sieht den Nachweis der Bindung des Diagnosemittels
an VEGF mittels Auswertung der Polarisationsanistropie bei homo-FRET
vor. Ein gegebenenfalls vorgesehener Doppelbrechungskompensator
wird deshalb, wie im zitierten
US-Patent 2002051333 A2 beschrieben, in die
Stellung für maximale Kompensation der Doppelbrechung von
Cornea und Netzhaut gedreht. Anschließend erfolgt die polarisierte
Fluoreszenzanregung sowie die Bildaufnahme der Fluoreszenzintensität
bei unterschiedlichen Polarisationen. Aus den Meßwerten
wird die Polarisationsanistropie r durch die Gleichung r = (I
parallel – I
senkrecht)/(I
parallel + 2I
senkrecht) berechnet. Übersteigt
die Fluoreszenzanistropie einen bestimmten Schwellwert, der beispielsweise
an dem reinen fluoreszenzgelabelten Inhibitor (also ohne Gegenwart
von VEGF) ermittelt werden kann, wird auf eine erhöhte
VEGF-Konzentration geschlossen.
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FRET
führt bei Anwesenheit von VEGF etwa zu einer Verdoppelung
der Lebensdauer und zu einer Veränderung der Anistropie.
Die Anisotropie nimmt ab, falls – durch die Bindung des
floureszenzgelabelten Markers an VEGF- die Anisotropieerniedrigung aufgrund
der Verlangsamung der Rotationsdiffusion durch die Anisotropieerniedrigung
aufgrund der Verlängerung der Lebensdauer durch Energietransfer überkompensiert
wird. Dies ist bei Markern, die wesentlich leichter als das VEGF
sind, der Fall. Diesem Sachverhalt wird durch den Anisotropie-Referenzwert
des reinen Diagnosemittels (entweder in vivo am gesunden Auge oder
in vitro) Rechnung getragen.
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Ein
drittes Verfahren zum Nachweis beruht auf dem zweiten Verfahren,
setzt jedoch einen an der relevanten Probe aktuell bestimmten Referenzwert ein,
der unter Ausnutzung der bereits beschriebenen Weber-Rotverschiebung
ermittelt wird. Dabei wird das Anistropieverhältnis auch
für die zweite, längere Wellenlänge bestimmt
und der Quotient aus den beiden Anistropieverhältnissen
analysiert. Ist der Quotient nahe 1 (oder die Differenz nahe Null)
dann hat keine Bindung des Diagnosemittels mit VEGF stattgefunden.
Falls der Quotient wesentlich von 1 (oder die Differenz von Null)
abweicht, also das Anistropieverhältnis bei der kürzeren
Wellenlänge größer ist, ist das Diagnosemittel
an VEGF gebunden in der Probe vorhanden.
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Ein
viertes Verfahren nutzt, wie das zweite und dritte Verfahren auch,
homo-FRET für den Nachweis. Die Schritte der Herstellung
des Diagnosemittels und des Einbringens des Diagnosemittels geschehen
wie bei den bereits beschriebenen Verfahren.
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Allerdings
wird nun nicht die Polarisationsanistropie bei der Bildaufnahme
ermittelt, sondern es erfolgt eine phasensensitive Analyse. Dazu
erfolgt die Fluoreszenzanregung mit einer periodisch oszillierenden
Intensität der Beleuchtungsstrahlung. Für das
aufgenommene Bild wird eine Korrelationsamplitude zwischen der periodisch
oszillierenden Anregung und dem Fluoreszenzsignal bei einer festen Phasenverschiebung
bestimmt. Anschließend wird die Phasenverschiebung geändert
und die Messung solange wiederholt, bis im Fluoreszenzbild für
einen gegebenen Ort minimale und maximale Intensität erreicht
wurde. Aus dem Maximum der Korrelationsamplitude bestimmt man dann
die Phasenverschiebung zwischen Beleuchtungsstrahlung und Emissionsstrahlung
für jeden Ort. Liegt diese Phasenverschiebung über
einem bestimmten Schwellwert, der experimentell für das
reine Diagnosemittel zuvor bestimmt wurde, ist eine erhöhte
VEGF-Konzentration gegeben, da homo-FRET bei Anwesenheit von VEGF
zu einer Verdoppelung der Lebensdauer und damit der Phasenverschiebung
führt.
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In
einem fünften Verfahren kann der Ansatz des vierten Verfahrens
wiederum um die Normierung mittels Ausnutzung der Weber-Rotverschiebung kombiniert
werden, um den Referenzwert als Null-Wert zu bestimmen. Der Vergleich
erfolgt also nicht mit einem an dem reinen Diagnosemittel bestimmten
Wert, sondern mit einer Phasenverschiebung, die mit längerwelliger
Beleuchtungsstrahlung ermittelt wird.
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Ein
sechstes Verfahren nutzt zum homo-FRET-basierten Nachweis der Bindung
des Diagnosemittels an VEGF die Lebensdauermessung. Die Schritte
der Herstellung des Diagnosemittels und des Einbringens des Diagnosemittels
geschehen wie bei den bereits beschriebenen Verfahren 2 bis 5. Die Beleuchtung
zu Fluoreszenzanregung erfolgt nun jedoch gepulst, um die Lebensdauer
für jeden Meßpunkt in der Probe zu ermitteln.
Um für jeden Punkt eine geeignete statistische Auswertung
vornehmen zu können, ist dabei vorzugsweise eine Wiederholung
der gepulsten Anregung für jeden Bildpunkt vorgesehen.
Liegt die Lebensdauer über einem zuvor bestimmten Vergleichswert,
der bei den reinen Diagnosemittel erhalten wurde, wird auf das Vorhandensein
von VEGF am jeweiligen Bildpunkt geschlossen.
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Dieses
sechste Verfahren kann zu einem siebten Verfahren dahingehend abgewandelt
werden, daß der Vergleichswert unter Ausnutzung der Weber-Rotverschiebung
gewonnen wird, also durch Beleuchtung der Probe bei einer längeren
Wellenlänge, wie zuvor bereits erläutert.
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Natürlich
kann in allen geschilderten Verfahren die Auswertung bei einem ortsauflösenden
Bild über das Bild gemittelt oder auch pixelweise bzw.
gemittelt über bestimmte Bildbereiche erfolgen, um im Bild
Abschnitte zu identifizieren, in denen VEGF vorliegt.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt
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-
Zitierte Patentliteratur
-
- - WO 2006/073314
A1 [0006]
- - US 6371615 B1 [0007]
- - US 50303709 [0053]
- - US 2002051333 A2 [0053, 0071]
-
Zitierte Nicht-Patentliteratur
-
- - Lackowicz, „Principles
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- - Gautier et al., „homo-FRET Microscopy in Living Cells
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Journal, 80, 2001, p. 3000–3008 [0011]
- - Clyton et al., „Dynamic Fluorescence Anisotrophy
Imaging Microscopy in the Frequency Domgin (rFLIM)", Biophysical
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- - Squire et al., "Red-edge anisotropy microscopy enables dynamic
imaging of homo-FRET between green fluorescent Proteins in cells",
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- - Kowanetz/Ferrara, „Vascular Endothelial Growth Factor
Signaling Pathways: Therapeutic Perspective", Clin. Cancer Res.
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