DE69839149T2 - Methode und vorrichtung zum nachweis oder zur quantifizierung von kohlenhydrate enthaltenden verbindungen - Google Patents

Methode und vorrichtung zum nachweis oder zur quantifizierung von kohlenhydrate enthaltenden verbindungen Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 zur Bestimmung von Kohlehydrat in einer Probe, beispielsweise den Einsatz dieser Liganden mit dem Fluorescence Resonance Energy Transfer (Förster-Transfer, FRET) zur Messung von Kohlenhydrat, z. B. freier Kohlenhydrate oder von Kohlenhydraten einer kohlenhydrathaltigen Verbindung.
  • Zum bisherigen Stand der Technik zählen
    • US 5342789 D. L. Meadows und J. S. Schultz, Analytica Chimica Acta, Band 280, Ausgabe 1, 2. August 1993, SS 21–30, „Design, manufacture and characterization of an optical fiber glucose affinity sensor based an an homogeneous fluorescence energy transfer assay system",
    • US 5628310 , sowie Joseph R. Lakowicz und Badri Maliwal, Analytica Chimica Acta, Band 271, Ausgabe 1, 8. Januar 1993, SS 155–164, „Optical sensing of glucose using phasemodulation fluorimetry".
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Methode zur Bestimmung eines Kohlenhydrats in einer Probe geliefert, die folgendes umfasst:
    Bereitstellung eines Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3,
    Bereitstellung eines eine Markierung, ein Trägermolekül und eine Kohlenhydrat-Funktionsgruppe umfassenden Glykokonjugats,
    Herbeiführung eines Kontakts zwischen dem genannten Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 und dem Glykokonjugat mit der genannten Probe,
    Ermittlung des Umfangs der Bindung des genannten Kohlenhydratbindungsliganden mit dem genannten Glykokonjugat,
    Korrelation der Bindung des genannten Kohlenhydratbindungsliganden und des Glykokonjugats mit dem Anteil an Kohlenhydrat in der genannten Probe, bei welcher das Trägermolekül die Bindung zwischen der Kohlenhydrat-Funktionsgruppe und dem Kohlenhydratbindungsliganden nicht beeinträchtigt.
  • Die Markierung, falls vorhanden, kann eine Substanz sein, mit der die Detektion des Glykokonjugats möglich ist, z. B. eine radioaktive Markierung, eine floureszierende Markierung, ein Enzym, eine auf dem Naheffekt beruhende, Signal erzeugende Markierungsfunktionsgruppe, beispielsweise eine FRET-Komponente, eine homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz-Komponente (Homogeneous Time Resolved Fluorescence, HTRF), eine LOCI-Komponente (Luminescent Oxygen Channeling Assay), Biotin oder Avidin, andere funktionell ähnliche Stoffe, eine von einem Antikörper erkannte Antikörper-Funktionsgruppe, ein Antikörper oder ein Antikörper bindender Teil eines Antikörpers.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen wird die Bestimmung in Gegenwart des vom Kohlenhydrat verdrängten Glykokonjugats und des reversibel an den Kohlenhydrat gebundenen Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 durchgeführt.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen zählen zur Probe eine Körperflüssigkeit, eine Urinprobe, eine Blutprobe, eine Plasmaprobe, Intrazellularflüssigkeit, interstitielle Flüssigkeit oder ein Zellhomogenat oder -extrakt.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen wird mit der Methode der Glukosespiegel einer aus subkutanen Körperflüssigkeiten, intrakutanen Körperflüssigkeiten oder Blut bestehenden Probe gemessen.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist das Kohlenhydratanalyt ein Monosaccharid, ein Disaccharid, ein Polysaccharid, Glukose, ein Kohlenhydrat, welches Bestandteil anderer Molekular- oder Supramolekularstrukturen ist, beispielsweise ein Makromolekül wie z. B. eine Kohlenhydrat-Funktionsgruppe eines Glykoproteins.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das Glykokonjugat ein oder mehrere glykosylierte Serumalbumine, nach Möglichkeit Human- oder Bovin-Serumalbumine, die in der Lage sind, sich an Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 zu binden.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 ein Lektin, beispielsweise Concanavalin mit der Maximalvalenz 3.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen gehen der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 und das Glykokonjugat eine reversible Bindung ein.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen gehen der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 und das Glykokonjugat über den gesamten Bereich der in Körperflüssigkeiten auftretenden Kohlenhydratkonzentrationen eine reversible Bindung ein; physiologische Konzentrationen von Kohlenhydrat in der getesteten Körperflüssigkeit, z. B. 0,05 mg/ml bis 5,0 mg/ml oder 0,5 mg/ml bis 5 mg/ml Kohlenhydrate, beispielsweise Glukose.
  • Ebenso wird in der vorliegenden Erfindung eine Methode zur Bestimmung eines Kohlenhydrats in einer Probe geliefert, die folgendes umfasst:
    • a) Herstellung des Kontakts zwischen der Probe und einem spezifischen Bindungspaar, das aus einem ersten Bindungsglied und einem zweiten Bindungsglied besteht, wobei das erste Bindungsglied einen an eine erste Energie absorbierende FRET-Komponente gekoppelten Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 umfasst, wobei das zweite Bindungsglied ein Glykokonjugat ist, das ein Trägermolekül, ein Kohlenhydrat und eine zweite Energie absorbierende FRET-Komponente umfasst, wobei der Energiepegel des erregten Zustands der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente mit dem Energiepegel des erregten Zustands der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente überlappt, und wobei der Kohlenhydratbindungsligand und das Glykokonjugat miteinander dergestalt eine reversible Bindung eingehen können, dass das in der Probe vorhandene Kohlenhydrat das Glykokonjugat verdrängen und mit dem Kohlenhydratbindungsliganden eine reversible Bindung eingehen kann, sowie
    • b) Bestimmung des Ausmaßes, in welchem ein nicht-radiativer FRET-Transfer zwischen der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente und der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente erfolgt, wodurch das Kohlenhydrat in der Probe bestimmt wird, in welcher das Trägermolekül die Bindung zwischen der Kohlenhydrat-Funktionsgruppe und dem Kohlenhydratbindungsliganden nicht beeinträchtigt.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen wird die Bestimmung in Gegenwart des vom Kohlenhydrat verdrängten Glykokonjugat und des reversibel an das Kohlenhydrat gebundenen Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 durchgeführt.
  • Die Energieübertragung kann beispielsweise durch Messung einer oder mehrerer folgender Werte festgestellt werden: Donor Quenching, Spenderlebensdauer, z. B. Verkürzung der erregten Spenderlebensdauer, sensibilisierte Akzeptoremission, Entpolarisierung von Fluoreszenz. Sie kann auch durch Feststellung des Verhältnisses zweier Parameter gemessen werden, beispielsweise des Verhältnisses eines Spenderparameters zum Akzeptorparameter, des Verhältnisses von Spendefluoreszenz zu Akzeptorfluoreszenz, oder Entpolarisierung von Fluoreszenz relativ zur Erregung.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen besteht die Bestimmung in einer Messung des Energietransfers als Funktion der Fluoreszenz-Intensitäten der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente und der zweiten Energie absorbierenden FET-Komponente.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen besteht die Methode aus dem Vergleich des Ergebnisses von Schritt (b) mit einem aus einem Kalibrierungsschritt erzielten FRET-Wert.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen zählen zur Probe eine Körperflüssigkeit, eine Urinprobe, eine Blutprobe, eine Plasmaprobe, Intrazellularflüssigkeit, interstitielle Flüssigkeit oder ein Zellhomogenat oder -extrakt.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen wird mit der Methode der Glukosespiegel einer aus subkutaner Körperflüssigkeit, intrakutaner Körperflüssigkeit oder Blut bestehenden Probe gemessen.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist das Kohlenhydratanalyt ein Monosaccharid, ein Disaccharid, ein Polysaccharid, Glukose, ein Kohlenhydrat, welches Bestandteil anderer Mo lekular- oder Supramolekularstrukturen ist, beispielsweise ein Makromolekül, z. B. eine Kohlenhydrat-Funktionsgruppe eines Glykoproteins.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das Glykokonjugat ein oder mehrere glykosylierte Serumalbumine, nach Möglichkeit Human- oder Bovin-Serumalbumine, die in der Lage sind, sich an Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 zu binden.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 ein Lektin, beispielsweise Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen binden sich der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 und das Glykokonjugat reversibel über den gesamten Bereich der in Körperflüssigkeiten auftretenden Kohlenhydratkonzentrationen; physiologische Konzentrationen von Kohlenhydrat in der getesteten Körperflüssigkeit, z. B. 0,05 mg/ml bis 5,0 mg/ml oder 0,5 mg/ml bis 5 mg/ml Kohlenhydrate, beispielsweise Glukose.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen sind die ersten und zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponenten Fluorophore; während des nicht-radiativen FRET-Vorgangs wird aus der aus Fluoresceinen, Rhodaminen, BODIPYs, Zyaninfarbstoffen und Phycobiliproteinen bestehenden Gruppe mindestens eines der Flurophore ausgewählt und der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 wie auch das Glykokonjugat mit einem Fluorophor markiert; der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 wird mit einem Fluorophor markiert, welcher der Akzeptor ist, während das Glykokonjugat mit einem Fluorophor markiert wird, der im nicht-radiativen FRET-Vorgang der Spender ist.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist das erste Bindungsmitglied des spezifischen Bindungspaares Fluorophor-markiertes Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3, das zweite Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares ist Fluorophor-markiertes glykosyliertes Serumalbumin, das in der Lage ist, mit Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3 eine Bindung einzugehen, wobei der nicht-radiative FRET-Vorgang durch Messung des Verhältnisses der den beiden Fluorophoren zurechenbaren Lichtemissionen festgestellt werden kann.
  • Obwohl nicht Teil der vorliegenden Erfindung, kann das spezifische Bindungspaar in ein Mikrodialysegefäß platziert und dann dem Subjekt subkutan implantiert werden; das spezifi sche Bindungspaar kann verkapselt und dann dem Subjekt subkutan implantiert werden; das spezifische Bindungspaar kann mit einer Trägersubstanz, beispielsweise mit Öl, in das Glykose eindringen kann, gemischt und dann dem Subjekt z. B. durch subkutane Injektion implantiert werden; das spezifische Bindungspaar kann dem Subjekt in die Haut tätowiert werden; das spezifische Bindungspaar kann an einer festen Halterung befestigt werden, die dann dem Subjekt implantiert wird, wobei die Halterung das spezifische Bindungspaar nach der Implantation am gewünschten Ort festhält; oder zumindest ein Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares kann auf einer festen Halterung angebracht werden, was beispielsweise für den wiederholten Kontakt mit Proben von Körperflüssigkeiten von Nutzen ist; das spezifische Bindungspaar kann an einer festen Halterung angebracht werden, an der eine Membran dergestalt befestigt ist, dass sie das spezifische Bindungspaar bedeckt, wobei die Membran eine Porengröße aufweist, die den Durchfluss des spezifischen Bindungspaares von der Halterung zur Körperflüssigkeit verhindert, den Durchfluss des Kohlenhydrats zwischen Körperflüssigkeit und Halterung jedoch zulässt.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen sind die Bestandteile des spezifischen Bindungspaares chemisch verändert, damit sie mit den Zellen des Subjekts eine Bindung eingehen können;
    In bestimmten Ausführungsbeispielen wird das spezifische Bindungspaar in einer immunisolierende Kapsel oder Mikrokapsel verkapselt. So kann das spezifische Bindungspaar beispielsweise in einem Hydrogelkern, d. h. einen Alginat- oder Agarosekern verkapselt werden, der von einer immunisolierenden Membran, z. B. einer Polyaminosäuremembran oder einer Polylysinmembran umgeben ist. Für den Einsatz mit den in diesem Dokument beschriebenen Sensoren und Methoden eignen sich besonders aus WO 96/28029 hergestellte Verbundstoff-Mikrokapseln.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen wird das spezifische Bindungspaar beleuchtet und die Energieübertragung wird beispielsweise durch die Haut des Subjekts überwacht.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist eine Energie absorbierende FRET-Spenderkomponente mit einem Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt, während ein Energie absorbierender FRET-Akzeptor mit dem Glykokonjugat gekoppelt ist. In anderen Ausführungsbeispielen ist eine Energie absorbierende FRET-Akzeptorkomponente mit einem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt, während ein Energie absorbierender FRET-Spender mit dem Glykokonjugat gekoppelt ist.
  • Ebenso beinhaltet die vorliegende Erfindung eine in-vivo-Methode zur Bestimmung des Kohlenhydratspiegels in einem Subjekt, die folgendes umfasst:
    • a) Platzierung eines Sensors in Kontakt mit dem in der Körperflüssigkeit des Subjekts vorhandenen Kohlenhydrat dergestalt, dass der Sensor die Haut des Subjekts nicht mehr durchdringt und damit eine nicht-invasive Überwachung des genannten Kohlenhydrats in den Körperflüssigkeiten des genannten Subjekts erlaubt, wobei der Sensor ein erstes Bindungsglied und ein zweites Bindungsglied umfasst, wobei das erste Bindungsglied einen an eine erste Energie absorbierende FRET-Komponente gekoppelten Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 umfasst, wobei das zweite Bindungsglied ein Glykokonjugat enthält, das ein Trägermolekül, ein Kohlenhydrat und eine zweite Energie absorbierende FRET-Komponente umfasst, wobei der Energiepegel des erregten Zustands der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente mit dem Energiepegel des erregten Zustands der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente überlappt, und wobei der Kohlenhydratbindungsligand und das Glykokonjugat miteinander dergestalt eine reversible Bindung eingehen können, dass in der Probe vorhandenes Kohlenhydrat das genannte Glykokonjugat verdrängen und mit dem genannten Kohlenhydratbindungsliganden eine reversible Bindung eingehen kann, sowie
    • b) nicht-invasive Überwachung des Ausmaßes, in welchem ein nicht-radiativer Fluoreszenz-Energietransfer zwischen der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente und der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente erfolgt, wodurch das genannte Kohlenhydrat im genannten Subjekt quantifiziert wird, in welchem das Trägermolekül die Bindung zwischen der Kohlenhydrat-Funktionsgruppe und dem Kohlenhydratbindungsliganden nicht beeinträchtigt.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen erfolgt die Bestimmung in Gegenwart des vom Kohlenhydrat verdrängten Glykokonjugats und des reversibel an den Kohlenhydrat gebundenen Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3.
  • Die Energieübertragung kann beispielsweise durch Messung einer oder mehrerer folgender Werte festgestellt werden: Donor Quenching, Spenderlebensdauer, z. B. Verkürzung der erregten Spenderlebensdauer, sensibilisierte Akzeptoremission, Entpolarisierung von Fluoreszenz. Sie kann auch durch Feststellung des Verhältnisses zweier Parameter gemessen werden, beispielsweise des Verhältnisses eines Spenderparameters zum Akzeptorparameter, z. B. des Verhältnisses von Spendefluoreszenz zu Akzeptorfluoreszenz, oder Entpolarisierung von Fluoreszenz relativ zur Erregung.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen besteht die Bestimmung in einer Messung der Energieübertragung als Funktion der Fluoreszenz-Intensitäten der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente und der zweiten Energie absorbierenden FET-Komponente.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen besteht die Methode aus dem Vergleich des Ergebnisses von Schritt (b) mit einem aus einem Kalibrierungsschritt erzielten FRET-Wert.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen wird mit der Methode der Glukosespiegel in der subkutanen Körperflüssigkeit, intrakutanen Körperflüssigkeit oder im Blut gemessen.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist das Kohlenhydratanalyt ein Monosaccharid, ein Disaccharid, ein Polysaccharid, Glukose, ein Kohlenhydrat, welches Bestandteil anderer Molekular- oder Supramolekularstrukturen ist, beispielsweise ein Makromolekül z. B. eine Kohlenhydrat-Funktionsgruppe eines Glykoproteins.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das Glykokonjugat ein oder mehrere glykosylierte Serumalbumine, nach Möglichkeit Human- oder Bovin-Serumalbumine, die in der Lage sind, sich an Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 zu binden.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 ein Lektin, beispielsweise Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen binden sich der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 und das Glykokonjugat reversibel über den gesamten Bereich der in Körperflüssigkeiten auftretenden Kohlenhydratkonzentrationen; physiologische Konzentrationen von Kohlenhydrat in der getesteten Körperflüssigkeit, z. B. 0,05 mg/ml bis 5,0 mg/ml oder 0,5 mg/ml bis 5 mg/ml Kohlenhydrate, beispielsweise Glukose.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen sind die ersten und zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponenten Fluorophore; aus der aus Fluoresceinen, Rhodaminen, BODIPYs, Zyaninfarbstoffen und Phycobiliproteinen bestehenden Gruppe wird mindestens einer der Flurophore ausgewählt; während des nicht-radiativen FRET-Vorgangs wird der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 wie auch das Glykokonjugat mit einem Fluorophor markiert; der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 wird mit einem Fluorophor markiert, welcher der Akzeptor ist, während das Glykokonjugat mit einem Fluorophor markiert wird, der im nicht-radiativen FRET-Vorgang der Spender ist.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist das erste Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares das Fluorophor-markierte Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3, das zweite Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares ist Fluorophor-markiertes glykosyliertes Serumalbumin, das in der Lage ist, mit Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3 eine Bindung einzugehen, wobei der nicht-radiative FRET-Vorgang durch Messung des Verhältnisses der den beiden Fluorophoren zurechenbaren Lichtemissionen festgestellt werden kann.
  • Obwohl nicht Teil der vorliegenden Erfindung, kann das spezifische Bindungspaar in ein Mikrodialysegefäß platziert und dann dem Subjekt subkutan implantiert werden; das spezifische Bindungspaar kann verkapselt und dann dem Subjekt subkutan implantiert werden; das spezifische Bindungspaar kann mit einer Trägersubstanz, beispielsweise Öl, in das Glykose eindringen kann, gemischt und dann dem Subjekt z. B. durch subkutane Injektion implantiert werden; das spezifische Bindungspaar kann dem Subjekt in die Haut tätowiert werden; das spezifische Bindungspaar kann an einer festen Halterung befestigt werden, die dann dem Subjekt implantiert wird, wobei die Halterung das spezifische Bindungspaar nach der Implantation am gewünschten Ort festhält; das spezifische Bindungspaar kann an einer Halterung angebracht werden, an der eine Membran dergestalt befestigt ist, dass sie das spezifische Bindungspaar bedeckt, wobei die Membran eine Porengröße aufweist, die den Durchfluss des spezifischen Bindungspaares von der Halterung zur Körperflüssigkeit verhindert, den Durchfluss des Kohlenhydrats zwischen Körperflüssigkeit und Halterung jedoch zulässt.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen sind die Bestandteile des spezifischen Bindungspaares chemisch verändert, damit sie mit den Zellen des Subjekts eine Bindung eingehen können; In bestimmten Ausführungsbeispielen wird der Sensor in einer immunisolierenden Kapsel oder Mikrokapsel verkapselt. So kann der Sensor beispielsweise in einem Hydrogelkern, d. h. einem Alginat- oder Agarosekern verkapselt werden, der von einer immunisolierenden Membran, z. B. einer Polyaminosäuremembran oder einer Polylysinmembran umgeben ist. Für den Einsatz mit den in diesem Dokument beschriebenen Sensoren und Methoden eignen sich besonders aus WO 96/28029 hergestellte Verbundstoff-Mikrokapseln.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen wird das spezifische Bindungspaar beleuchtet und die Energieübertragung wird beispielsweise durch die Haut des Subjekts überwacht.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist eine Energie absorbierende FRET-Spenderkomponente mit einem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt, während ein Energie absorbierender FRET-Akzeptor mit dem Glykokonjugat gekoppelt ist. In anderen Ausführungsbeispielen ist eine Energie absorbierende FRET-Akzeptorkomponente mit einem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt, während ein Energie absorbierender FRET-Spender mit dem Glykokonjugat gekoppelt ist.
  • In einem weiteren Aspekt umfasst die Erfindung einen Sensor für die nicht-invasive Bestimmung eines Kohlenhydrat-, beispielsweise des Glukosespiegels in einem Subjekt. Der Sensor kann in einem Subjekt in-vitro oder in-vivo verwendet werden.
  • Auf diese Weise ist in der vorliegenden Erfindung ebenso ein Sensor für die nicht-invasive Bestimmung eines Kohlenhydratspiegels in einem Subjekt vorgesehen, wobei der Sensor ein spezifisches Bindungspaar umfasst, das aus einem ersten Bindungsglied und einem zweiten Bindungsglied besteht,
    wobei das erste Bindungsglied einen an eine erste Energie absorbierende FRET-Komponente gekoppelten Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 umfasst,
    wobei das zweite Bindungsglied ein Glykokonjugat enthält, das ein Trägermolekül, ein Kohlenhydrat und eine zweite Energie absorbierende FRET-Komponente umfasst;
    wobei der Energiepegel des erregten Zustands der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente mit dem Energiepegel des erregten Zustands der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente überlappt, und
    wobei der Kohlenhydratbindungsligand und das Glykokonjugat miteinander dergestalt eine reversible Bindung eingehen, dass das in der Probe vorhandene Kohlenhydrat das Glykokonjugat verdrängen und mit dem Kohlenhydratbindungsliganden eine reversible Bindung eingehen kann, in welcher das Trägermolekül die Bindung zwischen der Kohlenhydrat-Funktionsgruppe und dem Kohlenhydratbindungsliganden nicht beeinträchtigt.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen wurde der Sensor auf, in oder unter die Haut des Subjekts platziert, wobei die Platzierung nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist.
  • Die Energieübertragung kann beispielsweise durch Messung eines oder mehrerer der folgenden Werte festgestellt werden: Donor Quenching, Spenderlebensdauer, z. B. Verkürzung der erregten Spenderlebensdauer, sensibilisierte Akzeptoremission, Entpolarisierung von Fluoreszenz. Sie kann auch durch Feststellung des Verhältnisses zweier Parameter gemessen werden, beispielsweise des Verhältnisses eines Spenderparameters zum Akzeptorparameter, des Verhältnisses von Spendefluoreszenz zu Akzeptorfluoreszenz, oder der Entpolarisierung von Fluoreszenz relativ zur Erregung.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist das Kohlenhydratanalyt ein Monosaccharid, ein Disaccharid, ein Polysaccharid, Glukose, ein Kohlenhydrat, welches Bestandteil anderer Molekular- oder Supramolekularstrukturen ist, beispielsweise ein Makromolekül oder eine Kohlenhydrat-Funktionsgruppe eines Glykoproteins.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen umfasst das Glykokonjugat ein oder mehrere glykosylierte Serumalbumine, nach Möglichkeit Human- oder Bovin-Serumalbumine, die in der Lage sind, sich an Glukosebindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 zu binden.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 ein Lektin, beispielsweise Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen binden sich der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 und das Glykokonjugat reversibel über den gesamten Bereich der in Kör perflüssigkeiten auftretenden Kohlenhydratkonzentrationen; physiologische Konzentrationen von Kohlenhydrat in der getesteten Körperflüssigkeit, z. B. 0,05 mg/ml bis 5,0 mg/ml oder 0,5 mg/ml bis 5 mg/ml Kohlenhydrate, beispielsweise Glukose.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen sind die ersten und zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponenten Fluorophore; aus der aus Fluoresceinen, Rhodaminen, BODIPYs, Zyaninfarbstoffen und Phycobiliproteinen bestehenden Gruppe wird mindestens einer der Flurophore ausgewählt, der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 wie auch das Glykokonjugat werden im nicht radiativen FRET-Vorgang mit einem Fluorophor markiert; der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 wird mit einem Fluorophor markiert, welcher der Akzeptor ist, während das Glykokonjugat mit einem Fluorophor markiert wird, der im nicht-radiativen FRET-Vorgang der Spender ist.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist das erste Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares das Fluorophor-markierte Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3, das zweite Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares ist Fluorophor-markiertes glykosyliertes Serumalbumin, das in der Lage ist, mit Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3 eine Bindung einzugehen, wobei der nicht-radiative FRET-Vorgang durch Messung des Verhältnisses der den beiden Fluorophoren zurechenbaren Lichtemissionen festgestellt werden kann.
  • Obwohl nicht Teil der vorliegenden Erfindung, kann das spezifische Bindungspaar in ein Mikrodialysegefäß platziert und dann dem Subjekt subkutan implantiert werden; das spezifische Bindungspaar kann verkapselt und dann dem Subjekt subkutan implantiert werden; das spezifische Bindungspaar kann mit einer Trägersubstanz, beispielsweise Öl, in das Glykose eindringen kann, gemischt und dann dem Subjekt z. B. durch subkutane Injektion implantiert werden; das spezifische Bindungspaar kann dem Subjekt in die Haut tätowiert werden; das spezifische Bindungspaar kann an einer Halterung befestigt werden, die dann dem Subjekt implantiert wird, wobei die Halterung das spezifische Bindungspaar nach der Implantation am gewünschten Ort festhält; oder zumindest ein Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares kann an einer festen Halterung angebracht werden, was beispielsweise für den wiederholten Kontakt mit Proben von Körperflüssigkeiten von Nutzen ist; das spezifische Bindungspaar kann an einer Halterung angebracht werden, an der eine Membran dergestalt befestigt ist, dass sie das spezifische Bindungspaar bedeckt, wobei die Membran eine Porengröße aufweist, die den Durchfluss des spezifischen Bindungspaares von der Halterung zur Körperflüssigkeit verhindert, den Durchfluss des Kohlenhydrats zwischen Körperflüssigkeit und Halterung jedoch zulässt.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen sind die Bestandteile des spezifischen Bindungspaares chemisch verändert, damit sie mit den Zellen des Subjekts eine Bindung eingehen können; In bestimmten Ausführungsbeispielen wird der Sensor in einer immunisolierender Kapsel oder Mikrokapsel verkapselt. So kann der Sensor beispielsweise in einem Hydrogelkern, d. h. einem Alginat- oder Agarosekern verkapselt werden, der von einer immunisolierenden Membran, z. B. einer Polyaminosäuremembran oder einer Polylysinmembran umgeben ist. Für den Einsatz mit den in diesem Dokument beschriebenen Sensoren und Methoden eignen sich besonders aus WO 96/28029 hergestellte Verbundstoff-Mikrokapseln.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen wird das spezifische Bindungspaar beleuchtet und die Energieübertragung wird beispielsweise durch die Haut des Subjekts überwacht.
  • In bestimmten Ausführungsbeispielen ist eine FRET-Spenderkomponente mit einem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt, während ein Energie absorbierender FRET-Akzeptor mit dem Glykokonjugat gekoppelt ist. In anderen Ausführungsbeispielen ist eine FRET-Akzeptorkomponente mit einem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt, während ein Energie absorbierender FRET-Spender mit dem Glykokonjugat gekoppelt ist.
  • Die Erfindung umfasst Vorrichtungen zur Bestimmung von Kohlenhydrat, z. B. Glukose, in einer Probe, beispielsweise in Blut, Urin oder Extrazellularflüssigkeit entweder durch in-vivo- oder in-vitro-Methoden. Das Kohlenhydrat kann bestimmt werden, indem die hier beschriebenen Recktanten (beispielsweise ein mit zwei FRET-Komponenten gekoppeltes spezifisches Bindungspaar) mit dem in einer Körperflüssigkeit vorhandenen Kohlenhydrat, z. B. Glukose, in Kontakt gebracht werden, wobei die Herstellung des Kontakts nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Recktanten können beispielsweise in, auf oder unter die Haut platziert und die Glukosespiegel bestimmt worden sein. Die Recktanten können in ein Organ oder Gefäß eingeführt worden sein, wo sie der Glukose ausgesetzt waren. In einer Ausführung konnten die Recktanten in, auf oder unter die Haut platziert und die Glukose durch Beleuchtung der Haut mit der Erregungswellenlänge des Energie absorbierenden FRET-Spenders bestimmt worden sein. Die Energieübertragung zwischen den beiden Energie absorbierenden FRET-Komponenten wird mit einem Fluorimeter festgestellt. Das Fluorimeter misst das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten der Energie absorbierenden FRET-Komponenten bei den beiden Wellenlängen bei Höchstemission oder das Quenching der Fluoreszenz des Energie absorbierenden Spenders bei Höchstemission als eine Funktion der Glukosekonzentration. Fluoreszenz kann mit einem Fluorimeter auf Filterbasis oder Monochrometer-Basis gemessen werden.
  • In-vivo-Sonsoren der Erfindung können so abgeändert werden, dass sie zur Überwachung von Veränderungen des Kohlenhydratspiegels, beispielsweise des Glukosespiegels, positive Rückmeldung liefern. Wenn z. B. im Fall von Glukoseüberwachung der Blutzuckerspiegel zu hoch ist, wird zur Bekämpfung der Abweichung Insulin, beispielsweise durch eine implantierte Pumpe verabreicht, wobei der Verabreichungsschritt nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Ist der Blutzuckerspiegel jedoch zu niedrig, dann kann ein Signal oder Alarm ausgelöst werden, mit dem die Notwendigkeit der Glukosezufuhr angezeigt wird.
  • Bei einer der in-vitro-Ausführungen dieser Erfindung werden die Recktanten an einer festen Halterung (z. B. einem Stab) befestigt, die zur Bestimmung von Glukose in Körperflüssigkeitsproben wie Blut, Urin und Extrazellularflüssigkeit mithilfe eines Fluorimeters verwendet wird.
  • Ein spezifisches Bindungspaar, wie dieser Begriff hier verwendet wird, besteht aus einem ersten Bindungsglied und einem zweiten Bindungsglied. Das erste und der zweite Bindungsglied können miteinander eine reversible Bindung eingehen. Das erste Bindungsglied enthält einen, vorzugsweise an eine Energie absorbierende FRET-Komponente gekoppelten Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3. Das zweite Bindungsglied umfasst ein Kohlenhydrat, das vorzugsweise an ein Trägermolekül und an eine Energie absorbierende FRET-Komponente gekoppelt ist.
  • Eine Energie absorbierende FRET-Komponente, wie dieser Begriff hier verwendet wird, ist eine Substanz, die im Prozess der nicht-radiativen Energieübertragung entweder Spender oder Akzeptor sein kann. Sowohl der Spender wie auch der Akzeptor absorbieren Energie. Die Funktion des Spenders besteht in der Absorption von Energie bei einer ersten Wellenlänge und in der Übertragung der absorbierten Energie durch nicht-radiative Energieübertragung an das Akzeptormolekül. Die Funktion des Akzeptors besteht in der Absorption der vom Spender übertragenen Energie. Die absorbierte Energie kann auf verschiedene Weise abgeleitet werden, zum Beispiel durch Emission der Energie bei einer zweiten Wellenlänge, Ableitung als Wärmeenergie oder Übertragung der Energie auf die Umgebung. Die Absorption durch den Akzeptor kann durch einen Akzeptor-Parameter, beispielsweise eine sensibilisierte Akzeptor-Emission oder durch einen Spenderparameter, zum Beispiel durch Quenching der Spender-Fluoreszenz gemessen werden. Zu den Anforderungen der Energie absorbierende FRET-Komponenten zählen, dass zwischen beiden eine ausreichende Überlappung des Energiezustands besteht, damit eine nicht-radiative Energieübertragung eintreten kann. Außerdem tritt eine nicht-radiative Energieübertragung nur dann ein, wenn sich die beiden in unmittelbarer Nähe zueinander befinden (die halbe Energieübertragung zwischen einem einzelnen Spender- und Akzeptormolekül erfolgt, wenn die intermolekulare Distanz gleich R0 ist).
  • Ein Energie absorbierender FRET-Spender, wie dieser Begriff hier verwendet wird, ist eine Substanz, die Energie bei einer ersten Wellenlänge absorbiert. Die absorbierte Energie erzeugt im Spender einen erregten Zustand. Wenn der Spender den erregten Zustand verlässt, kann dies durch Abgabe von Energie bei der Emissionswellenlänge, durch Abfuhr von Energie in Form von Wärme an seine Umgebung oder durch Übertragung der absorbierten Energie mittels nicht-radiativer Energieübertragung an einen Energie absorbierenden FRET-Akzeptor erfolgen.
  • Ein Energie absorbierender FRET-Akzeptor, wie dieser Begriff hier verwendet wird, ist eine Substanz, die die vom Energie absorbierenden FRET-Spender übertragene nicht-radiative Energie absorbiert. Die absorbierte Energie erzeugt im Akzeptor einen erregten Zustand. Wenn der Akzeptor den erregten Zustand verlässt, kann dies durch Emission der absorbierten Energie bei einer zweiten Wellenlänge, durch Ableitung der Energie als Wärme oder durch Abgabe von Energie an die Umgebung erfolgen.
  • Spezifisch, wie dieser Begriff hier verwendet wird, beschreibt die Bindungen an eine bestimmte Funktionsgruppe mit einer höheren Affinität als verwandte Funktionsgruppen. Zum Beispiel eine Bindung höherer Affinität an Glukose oder Mannose enthaltende Kohlenhydrate im Vergleich zu anderen Kohlenhydraten, die keine Glukose oder Mannose enthalten.
  • Reversibel wie dieser Begriff hier verwendet wird, beschreibt eine Interaktion, die in jede der beiden Richtungen erfolgen kann. Beispielsweise geht in einer Reaktion vorwärts das Glykokonjugat eine Bindung mit einem Kohlenhydratbindungsliganden der Maximalvalenz 3 ein, in einer umgekehrten Reaktion wird das Glykokonjugat vom Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 freigegeben. Die reversible Eigenschaft der Interaktion sollte bei jener Konzentration beibehalten werden, bei der die Messung vorgenommen wird, und vorzugsweise über den ganzen Konzentrationsbereich hinweg, bei dem das Kohlenhydrat gemessen werden soll, zum Beispiel über den unter physiologischen Bedingungen herrschenden Konzentrationsbereich.
  • Bestimmung, wie dieser Begriff hier verwendet wird, umfasst die Feststellung des Vorhandenseins oder Nichtvorhandenseins eines Kohlenhydrats in einer Probe oder die Quantifizierung des in einer Probe vorhandenen Kohlenhydrats.
  • Subjekt, wie dieser Begriff hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Menschen oder ein Versuchstier, beispielsweise ein Nagetier wie z. B. Maus oder Ratte, Hund, Schwein, Kuh, Schaf, Ziege oder auf einen nicht-menschlichen Primaten. Das Subjekt kann an einem Defekt, beispielsweise einem genetischen oder Autoimmundefekt des Kohlenstoff-Stoffwechsels leiden.
  • Physiologische Konzentration, wie dieser Begriff hier verwendet wird, ist die sowohl im Normalzustand wie auch in pathologischen Zuständen auftretende Konzentration von Kohlenhydrat. So bezieht sich beispielsweise die physiologische Konzentration von Glukose auf den Bereich der in normalen, hypoglykämischen und hyperglykämischen Patienten auftretenden Glukosespiegeln.
  • Die Bestimmung der Glukosekonzentration findet Anwendung im klinischen Bereich bei der täglichen Überwachung des Blutzuckerspiegels von Personen, bei denen die Homöostase der Glukose nicht aufrechterhalten wird (z. B. bei Diabetes, Hypoglykämie oder Hyperglykämie) sowie zusätzlich zu anderer biomedizinischer Forschung. Sensoren dieser Erfindung sind in der Lage, nicht nur einen breiten Bereich an Glukosekonzentrationen (z. B. von 0,05 mg/ml bis 5,0 mg/ml oder von 0,5 bis 5,0 mg/ml) sondern auch einen breiten Bereich anderer Kohlenhydratkonzentrationen festzustellen.
  • Darüber hinaus sind die hier beschriebenen Methoden und Vorrichtungen nicht invasiv und erfordern zur Vornahme von Messungen nicht die tägliche Ruptur der Haut. Invasive Methoden werden mit einem erheblichen Risiko des Eintritts ernsthafter Infektionen bei Patienten in Verbindung gebracht. Dies gilt vor allem bei Diabetespatienten, die eine geringere Widerstandskraft gegen Infektionen aufweisen.
  • Die hier offen gelegten in-vivo-Sensoren sind nach der Implantation nicht-invasiv, wobei die Implantation selbst nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Da sich Recktanten nicht ansammeln und nicht verbraucht werden, sind die Vorrichtungen der Erfindung zuverlässig, über lange Zeiträume hinweg wiederverwendbar und verbessern die Therapie für Diabetespatienten erheblich. Außerdem bestehen für die hier beschriebenen Vorrichtungen eine Anzahl klinischer Anwendungen und Forschungsanwendungen bei der Bestimmung anderer Verbindungen und Liganden, z. B. bei Antikörper-Antigen-Interaktionen, Rezeptor-Ligand-Interaktionen, Enzym-Substrat-Interaktionen.
  • Andere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden detaillierten Beschreibung und den Ansprüchen offensichtlich.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 Ein Schaubild, in dem die Absorption- und Emissionsspektren eines Energie absorbierenden Spenders und eines Energie absorbierenden Akzeptors dargestellt sind.
  • 2 Eine schematische Darstellung der nicht-radiativen Energieübertragung zwischen zwei Energie absorbierenden FRET-Komponenten.
  • 3 Ein Schaubild, in dem die Bindungsgenetik von monovalentem Concanavalin A dargestellt ist.
  • 4 Ein Schaubild, in dem die Bindungsgenetik von bivalentem Sukzinyl-Concanavalin A dargestellt ist.
  • 5 Eine schematische Darstellung der reversiblen Bindung zwischen spezifischen Bindungspaaren bei Vorhandensein von Glukose.
  • 6 Eine schematische Darstellung der Verwendung von FRET zur Bestimmung von Glukose.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
  • Auf dem Naheffekt basierende Signalerzeugungsmethode
  • Zu den Naheffektmethoden zählen jene, bei denen ein Signal erzeugt wird, sobald eine Funktionsgruppe der ersten Markierung auf dem ersten Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares in unmittelbare Nähe zu einer Funktionsgruppe der zweiten Markierung auf einem zweiten Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares gebracht wird. Zu den Beispielen von Naheffektmethoden zählen folgende:
  • Fluorescence Resonance Energy Transfer (Förster-Transfer, FRET)
  • Die Erfindung umfasst Methoden zur Bestimmung eines Kohlenhydrats in einer Probe (z. B. Blut, Urin, Extrazellularflüssigkeit) sowie für die Durchführung von Kohlenhydratbestimmungen nützliche Vorrichtungen. Bei bestimmten Methoden der Erfindung wird zur Feststellung des Umfangs der Bindung zwischen Bindungsgliedern eines spezifischen Bindungspaares das FRET-Verfahren eingesetzt. Bindungsglieder des spezifischen Bindungspaares sind ein Glykokonjugat und ein Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3, der in Konkurrenz zu einem Kohlenhydratanalyt mit dem Glykokonjugat eine reversible Bindung eingeht. Sowohl der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 als auch das Glykokonjugat sind an die Energie absorbierende FRET-Komponenten gekoppelt. Eine Interaktion zwischen dem spezifischen Bindungspaar resultiert darin, dass die beiden Energie absorbierenden FRET-Komponenten in dieselbe Nachbarschaft verbracht werden. Eine nicht-radiative Energieübertragung zwischen den beiden Energie absorbierenden FRET-Komponenten resultiert in einem FRET-Vorgang. Kohlenhydratanalyt in der Probe konkurrenziert mit dem Glykokonjugat um die Bindung an den Kohlenhydratliganden mit der Maximalvalenz 3. Die Verdrängung des Glykokonjugats verursacht eine Abnahme des FRET und ermöglicht die Bestimmung des Analyts.
  • Sobald ein Molekül ein Photon Energie absorbiert, tritt es in einen erregten Zustand ein; damit das Molekül in den Ruhezustand zurückkehrt, muss die überschüssige Energie durch radiative oder nicht-radiative Prozesse entfernt werden. Radiative Prozesse beinhalten die direkte E mission von Licht in Form von Fluoreszenz. Fluoreszenz, wie der Begriff hier verwendet wird, umfasst sowohl die schnelle Fluoreszenz als auch die Phosphoreszenz. Nicht-radiative Prozesse beinhalten Methoden zum Verlassen des erregten Zustands, bei denen keine direkte Lichtabgabe durch den Spender involviert ist. Zu den nicht-radiativen Prozessen zählen die Ableitung von Energie in Form von Wärme an die Umgebung, die Nutzung der absorbierten Energie zur Förderung chemischer Reaktionen oder die Übertragung von Energie auf ein benachbartes Molekül. Das absorbierende Molekül tritt in einen erregten Zustand ein und vernichtet die Energie auf ähnliche Weise über radiative und nicht-radiative Prozesse. Eine Übertragung der Energie von einem Molekül auf ein zweites Molekül tritt ein, wenn eine ausreichende Überlappung des Energiezustands besteht und wenn die Entfernung zwischen dem einen Energie absorbierenden Spender und dem einen Energie absorbierenden Akzeptor in der Größenordnung von R0 liegt, wie unten definiert.
  • FRET ist in 1 als Diagramm dargestellt. Die Absorption und Emission des Energie absorbierenden Spenders ist mit A(D) bzw. E(D) bezeichnet, während die Absorption und Emission des Energie absorbierenden Akzeptors mit A(A) bzw. E(A) bezeichnet ist. Damit die Übertragung der Energie zwischen den beiden Komponenten stattfinden kann, ist der Bereich der Überlappung des Energiezustandes zwischen der Spenderemission und der Akzeptorabsorption von Bedeutung. Beim FRET-Vorgang wird eine Probe mit einer Wellenlänge beleuchtet, die den Energie absorbierenden Spender, nicht jedoch den Energie absorbierenden Akzeptor erregt, oder die den Energie absorbierenden Spender in einem viel höherem Ausmaß als den Energie absorbierenden Akzeptor erregt. Eine Erregung des Energie absorbierenden Spenders bei Wellenlänge I führt zur Emission von Energie bei Wellenlänge II, nicht jedoch bei Wellenlänge III, der Emissionswellenlänge des Energie absorbierenden Akzeptors. Sowohl der Energie absorbierende Spender als auch der Akzeptor sollten Energie bei ein und derselben Wellenlänge absorbieren und bei unterschiedlichen Wellenlängen abgeben.
  • FRET ist ein quantenmechanisches Alles- oder Nichts-Ereignis, daher wird Energie von einem individuellen Energie absorbierenden Spender an einen individuellen Energie absorbierenden Akzeptor entweder übertragen oder nicht. Eine Energieübertragung tritt nur dann ein, wenn die Absorptions- und Emissionsspektren des Energie absorbierenden Spenders und des Energie absorbierenden Akzeptors überlappen. Sobald der Energie absorbierende Akzeptor (A) seinen erregten Zustand verlässt, wird die abgegebene Energie im Verhältnis zur einfallenden Energie gedreht oder entpolarisiert. Daher lässt sich FRET als Abnahme der Fluoreszenzin tensität bei II (d. h. als abnehmende Emission des Energie absorbierenden Spenders), als Auftreten von sensibilisierter Fluoreszenzintensität bei III (d. h. als erhöhte Emission des Energie absorbierenden Akzeptors) und als Entpolarisierung der Fluoreszenz im Verhältnis zur einfallenden Energie nachweisen.
  • FRET manifestiert sich auch in der Lebensdauer, während welcher der Energie absorbierende Spender in erregtem Zustand verbleibt. Üblicherweise verkürzt eine Energieübertragung die Lebensdauer des Energie absorbierenden Spenders. Fluoreszenz ist ein Gleichgewichtprozess, dessen Länge von der Dauer abhängt, in welcher die Energie absorbierende FRET-Komponente in einem erregten Zustand verbleibt. Es ist dies das Ergebnis der Konkurrenz zwischen der Geschwindigkeit, mit welcher die Energie absorbierende FRET-Komponente, angetrieben von der einfallenden Energie, in den erregten Zustand eintritt, sowie die Summe der Geschwindigkeiten, bei welchen die Energie absorbierende FRET-Komponente den erregten Zustand verlässt. Daher verkürzt die Hinzufügung alternativer Methoden zum Verlassen des erregten Zustands, z. B. durch nicht-radiative Energieübertragung, die Lebensdauer der Energie absorbierenden FRET-Komponente.
  • Eine häufig auftretende Form der nicht-radiativen Energieübertragung ist die Übertragung zwischen Singulett-Zuständen. Eine nicht-radiative Energieübertragung zwischen zwei Energie absorbierenden FRET-Komponenten in derselben Nachbarschaft ist in 2 dargestellt. Ein Energie absorbierender Spender (D) absorbiert ein Photon Energie, das die Verteilung der Ladung des Spenders vom Ruhezustand in einen erregten Zustand verändert. Die Ladungsverteilung des erregten Zustands lässt sich als Dipol darstellen, bei dem eine Seite des Moleküls positiv geladen, die andere Seite des Moleküls hingegen negativ geladen ist. Neben der Emission von Licht kann das Energie absorbierende Spendermolekül durch Energieübertragung vom Energie absorbierenden Spender an den Energie absorbierenden Akzeptor (A), z. B. durch Erzeugung eines entgegengesetzt geladenen Dipols im Energie absorbierenden Akzeptormolekül, das daraufhin in einen erregten Zustand eintritt, in seinen Ruhezustand zurückkehren. Eine Vorbedingung für die Energieübertragung, z. B. durch dipol-induzierte Dipol- oder Energieübertragung besteht darin, dass sich der Energie absorbierende Akzeptor in derselben Nachbarschaft wie der Energie absorbierende Spender befindet. Der Energie absorbierende Akzeptor kann durch Emission der absorbierten Energie bei einer anderen Wellenlänge oder durch nicht-radiative Energieübertragung in seinen Ruhezustand zurückkehren.
  • Bei der Bestimmung eines Analyts auf FRET-Basis wird eine Probe oder eine Mischung mit einer Wellenlänge beleuchtet, die den Energie absorbierenden Spender, nicht jedoch den Energie absorbierenden Akzeptor erregt, oder die den Energie absorbierenden Spender in einem viel höheren Umfang als den Energie absorbierenden Akzeptor erregt. Die Probe wird meist bei zwei separaten Wellenlängen überwacht: bei der Emissionswellenlänge des Energie absorbierenden Spenders und bei der Emissionswellenlänge des Energie absorbierenden Akzeptors. Falls der Energie absorbierende Spender und der Energie absorbierende Akzeptor nicht ausreichend nahe zu einander positioniert sind, tritt nur minimaler FRET ein und die Emission findet nur bei der Wellenlänge des Energie absorbierenden Spenders statt. Sind jedoch der Energie absorbierende Spender und der Energie absorbierende Akzeptor ausreichend nahe zueinander, findet ein FRET statt. Das Ergebnis dieser Interaktion kann aus einer Abnahme der Lebensdauer des Energie absorbierenden Spenders, einem Quenching der Fluoreszenz des Energie absorbierenden Spenders und einer Verstärkung der Fluoreszenzintensität des Energie absorbierenden Akzeptors bestehen. Der Wirkungsgrad der Energieübertragung Et für einen einzelnen Energie absorbierenden Spender und einen einzelnen Energie absorbierenden Akzeptor fällt mit der Zunahme der Entfernung R zwischen einem einzelnen Energie absorbierenden Spender- und einem einzelnen Energie absorbierenden Akzeptormolekül rasch ab; das Verhältnis wird durch folgende Gleichung dargestellt: Et = 1/[1 + (R/R0)6]wobei R die Entfernung zwischen Energie absorbierendem Spender und Energie absorbierendem Akzeptor und R0 die Entfernung für die halbe Übertragung darstellt. R0 ist ein Wert, der von der Überlappungsintegrale des Energie absorbierenden Spenderemissionspektrums und des Energie absorbierenden Akzeptorerregungsspektrums, vom Refraktionsindex, von der Quantenausbeute des Spenders wie auch von der Ausrichtung des Spenderemissions- und des Akzeptorabsorptionsmoments abhängt. Forster, T., Z Natuforsch. 4A, 321–327 (1949); Forster, T., Disc. Faraday Soc. 27, 7–17 (1959).
  • Fluoreszenz lässt sich durch zeitaufgelöste Methoden wie Taktimpuls-, Impuls- oder Phasenmodulationsmethoden feststellen.
  • Bei der Taktimpulsmethode wird die Probe durch einen kurzen Energieimpuls erregt; die Fluoreszenz wird in einem ausgewählten Zeitraum nach dem anfänglichen Impuls festgestellt.
  • Wenn beispielsweise zwei Fluorophore Energie absorbieren und die absorbierte Energie in Form von Fluoreszenz abgeben und einer der Fluorophore eine Fluoreszenzlebensdauer von 10 ns aufweist, während der zweite Fluorophor eine Fluoreszenzlebensdauer von 50 ns aufweist, ist es möglich, die Fluoreszenz separater Fluorophore selektiv festzustellen. Eine Detektion zum Zeitpunkt von 20 ns nach dem ersten Energieimpuls erlaubt im Prinzip die Detektion des Fluorophors mit der längeren Lebensdauer, d. h. des Fluorophors mit einer Fluorsezenzlebensdauer von 50 ns.
  • Bei der Impulsmethode wird die Probe mit einem kurzen Energieimpuls erregt und anschließend der zeitabhängige Abfall der Fluoreszenzintensität gemessen. Wird beispielsweise der Fluoreszenzabfall des Energie absorbierenden Spenders gemessen, dann hängt die Geschwindigkeit des Abfalls von der Energieübertragung ab. Wenn der Energie absorbierende Spender seine Energie an einen Energie absorbierenden Akzeptor mittels nicht-radiativer Energieübertragung überträgt, ist die Geschwindigkeit des Abfalls des Energie absorbierenden Spenders höher als beim Abfall des Energie absorbierenden Spenders durch Übertragung radiativer Energie.
  • Die Phasenmodulation ist eine Methode, bei der die Probe mit einer sinusförmigen modulierten Energie erregt und sowohl die Phasenverschiebung als auch die Amplitude des fluoreszierenden Lichts im Verhältnis zur einfallenden Energie für die Berechnung der Lebensdauer verwendet wird. Wird beispielsweise die Probe mit einem bei einer bestimmten Frequenz sinusförmig modulierten Licht erregt, dann wird die Emission aufgrund der Verzögerung zwischen Absorption und Emission in der Phase relativ zur einfallenden Energie verzögert. Diese Phasenverzögerung und Amplitudenmodulation finden bei der Berechnung der Fluoreszenzlebensdauer Ansatz.
  • Energie absorbierende FRET-Komponenten
  • Eine Energie absorbierende FRET-Komponente ist ein Spender oder Akzeptor nicht-radiativer Energie. Sowohl Spender- als auch Akzeptormoleküle absorbieren Energie. Die Funktion des Spendermoleküls besteht in der Absorption von Energie bei einer ersten Wellenlänge und in der Übertragung der absorbierten Energie durch nicht-radiative Energieübertragung an das Akzeptormolekül. Die Funktion des Akzeptormoleküls besteht in der Absorption der vom Spendermolekül übertragenen Energie. Absorption ermöglicht die Detektion von Energieübertragung, beispielsweise durch Messung der Akzeptoremission bei einer zweiten Wellenlänge. Eine Anforderung der Energie absorbierende FRET-Komponenten besteht darin, dass zwischen beiden Molekülen eine ausreichende Überlappung des Energiezustands besteht, damit eine nicht-radiative Energieübertragung stattfinden kann.
  • Bevorzugte FRET-Komponenten sind imstande, Energie bei einer ersten Wellenlänge zu absorbieren und Energie als Fluoreszenz bei einer zweiten Wellenlänge abzugeben. Die FRET-Komponenten sollten über Energiezustands-Wellenlängen in einem Bereich verfügen, der Hintergrundrauschen durch etwaige in der Probe vorhandene Verschmutzungen vermeidet. Darüber hinaus sollten die in biologischen Proben verwendeten FRET-Komponenten eine Fluoreszenz aufweisen, die vom Wasser nicht gelöscht wird, da die meisten biologischen Messungen in einer wässrigen Lösung stattfinden.
  • Die Beziehung zwischen Energie absorbierenden Spender- und Akzeptorkomponenten ist in 1 und 2 dargestellt. Der Energie absorbierende Spender absorbiert Energie bei einer ersten Wellenlänge und tritt in einen erregten Zustand ein. Wenn der Energie absorbierende Spender den erregten Zustand verlässt, kann er Energie über die nicht-radiative Energieübertragung übertragen. Falls mit dem Energie absorbierenden Akzeptor ausreichende Überlappung besteht, kann die Energie vom Energie absorbierenden Spender auf den Energie absorbierenden Akzeptor übertragen werden. Anschließend tritt der Energie absorbierende Akzeptor durch Absorption der vom Energie absorbierenden Spender abgegebenen Energie in den erregten Zustand ein. Bevorzugte Energie absorbierende Akzeptoren geben Energie in Form von fluoreszierendem Licht ab, welches gegenüber der einfallenden Energie gedreht oder entpolarisiert wird und daher nach Verlassen des erregten Zustands einen FRET auslöst. Die Diagrammdarstellung in 1 bildet FRET als Abnahme der Fluoreszenzintensität bei II (d. h. als abnehmende Emission des Energie absorbierenden Spenders), als Auftreten von Fluoreszenzintensität bei III (d. h. als erhöhte Emission des Energie absorbierenden Akzeptors) und als Entpolarisierung der Fluoreszenz im Verhältnis zur einfallenden Energie ab.
  • Eine FRET-Komponente ist mit jedem Bindungsglied eines spezifischen Bindungspaares gekoppelt, z. B. an einen Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 und an ein Glykokonjugat. Die Interaktion zwischen spezifischen Bindungspaaren ist für die Zusammenführung der beiden Energie absorbierenden FRET-Spender- und Akzeptorkomponenten verantwortlich. Eine Interaktion zwischen dem spezifischen Bindungspaar sorgt dafür, dass die beiden Energie absorbierende FRET-Komponenten zusammengebracht werden. Energieüber tragung findet zwischen dem Energie absorbierenden FRET-Spender und dem Energie absorbierenden FRET-Akzeptor statt; der FRET wird daher z. B. als Abnahme der Fluoreszenzintensität bei II (d. h. als abnehmende Emission des Energie absorbierenden Spenders), als Auftreten von sensibilisierter Fluoreszenzintensität bei III (d. h. als erhöhte Emission des Energie absorbierenden Akzeptors) und als Entpolarisierung der Fluoreszenz im Verhältnis zur einfallenden Energie nachgewiesen. Wenn hingegen keine Interaktion zwischen dem spezifischen Bindungspaar stattfindet, werden der Energie absorbierende FRET-Spender und der Energie absorbierende FRET-Akzeptor nicht nahe genug aneinander liegen, um eine wirksame Energieübertragung zu erlauben. Das Vorhandensein von Kohlenhydrat aus einer Probe konkurrenziert mit dem Glykokonjugat um die Bindung an den Kohlenhydratliganden mit der Maximalvalenz 3. Aus diesem Grund wird der Bindungsort auf dem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 durch das Kohlenhydrat besetzt und hindert das Glykokonjugat an der Bindung, was zum Fehlschlag des FRET führt.
  • Beispiele geeigneter Energie absorbierender FRET-Komponenten sind Fluorophore, z. B. NDB, Dansyl, Pyrin, Anthrazin, Rhodamin, Fluoreszenz und Indocarbocyanin sowie deren Derivate.
  • Zu den als Energie absorbierende FRET-Spender/-Akzeptorpaare nützlichen Farbstoffen zählen beispielsweise Indocarbocyanin↔Indocarbocyanin, z. B. Cy3.5↔Cy5.5, Cy5↔Cy7, BODIPY (576/589)↔HBODIPY (650/665), Fluorescein↔Rhodamin, NBD N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-3-yl)↔Rhodamin, Fluoreszein↔Eosin, Fluorescein↔Erythrosin, Dansyl↔Rhodamin, Acridinorange↔Rhodamin, Pyrin↔Fluorescein, 7-Aminoactinomycin-D↔Fluorescein, 7-Aminoactinomycin-D↔Phycoerythrin, Fluorescein↔R-Phycoerythrin, Ethidiummonoazid↔Fluorescein, Ethidiummonoazid↔R-Phycoerythrin. Viele der oben genannten Farbstoffe sind im Handel erhältlich oder können durch Einsatz von Methoden, die Personen mit Kenntnis der Technik vertraut sind, synthetisch zusammengestellt werden.
  • Energie absorbierende FRET-Komponenten können mithilfe des in US-Patent 5,342,789 beschriebenen FRET-Systems auf ihre Eignung als Energie absorbierende FRET-Spender oder -Akzeptoren getestet werden. So können beispielsweise Substanzen bestimmt werden, indem Glukose als Analyt, Concanavalin A als Ligand und zu BSA konjugierte Glukose als Glykokonjugat verwendet werden. Die Energie absorbierende Spender- oder die Energie absorbierende Akzeptorkomponente kann entweder an das Glykokonjugat oder an den Liganden ge koppelt werden. Wird die Energie absorbierende Spenderkomponente an das Glykokonjugat gekoppelt, dann muss die Energie absorbierende Akzeptorkomponente an den Liganden gekoppelt werden. Wird die Energie absorbierende Akzeptorkomponente an das Glykokonjugat gekoppelt, dann muss die Energie absorbierende Spenderkomponente an den Liganden gekoppelt werden. Das Auftreten von FRET ist Indikation für eine Überlappung des Energiezustands und der nicht-radiativen Energieübertragung zwischen den beiden Komponenten. Das aus der Kombination eines Komponentenpaares resultierende FRET-Niveau sollte dem Glukoseanteil der Probe entsprechen. Dies kann getestet werden, indem ein Komponentenpaar einer Serie von Proben mit bekannten Glukoseanteilen ausgesetzt wird. Die daraus resultierende FRET-Reaktion sollte dem Glukoseanteil entsprechen.
  • Homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (Homogeneous Time Resolved Fluorescence, HTRF)
  • Homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF) bezieht sich auf eine Methode zur Messung von Bestandteilen eines Systems ohne vorherige Heraustrennung der Bestandteile aus dem System. Das Grundkonzept von HTRF basiert auf FRET, wobei die Interaktion von zwei Biomolekülen, beispielsweise eines Glykokonjugats und eines Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3, von denen jedes an eine Signal generierende Funktionsgruppe auf Naheffektbasis z. B. an einen Spender- und einen Akzeptor-Fluorophor gekoppelt ist, durch Überwachung der Fluoreszenz-Energieübertragung vom erregten Spender-Fluorophor zum Akzeptor-Fluorophor gemessen werden kann, wenn sich die beiden Biomoleküle in unmittelbarer Nähe zueinander befinden. Das Fluoreszenzsignal der HTRF wird mit einer Zeitverzögerung gemessen und eliminiert auf diese Weise Störsignale.
  • Zu geeigneten Beispielen eines Spender-Fluorophors in der HTRF zählen Chelate oder -Kryptate der Seltenen Erden, z. B. Terbium, Europium, Dysprosium, Samarium oder Neodymium, vorzugsweise Europiumkryptat [(Eu)k]. Zu den geeigneten Beispielen eines Akzeptor-Fluorophors in der HTRF zählen Allophycocyanin z. B. XL665, Allophycocyanin B, Phycocyanin C, Phycocyanin R oder Phthalocyanine.
  • Das aus Europiumkryptat [(Eu)k] und XL665 bestehende FRET-Paar weist eine Reihe spezieller Eigenschaften auf; so ist beispielsweise [(Eu)k] innerhalb eines pH-Bereichs von 3 bis 8 stabil und besitzt eine lange Lebensdauer, wodurch für Messungen die herkömmliche Ausrüstung, z. B. ein Mikroplatten-Fluorometer ausreicht. Kryptat verursacht eine Anreicherung des Eu3+ Fluorophors, der anschließend Energie auf XL665 überträgt, wenn sich die beiden Komponenten in unmittelbarer Nähe zueinander befinden. Kryptat wirkt auch als Schutz von Eu3+ gegen das Fluoreszenz-Quenching. Das Akzeptor-Molekül in HTRF, nämlich XL665, ist ein stabilisiertes Allophycocyanin-Molekül, das vom [(Eu)k] übertragene Energie akzeptiert.
  • Luminescent Oxygen Channeling Assay (LOCI)
  • Luminescent Oxygen Channeling Assay (LOCI) beinhaltet eine fotochemische Reaktion, die durch die Interaktion von zwei auf dem Naheffekt basierenden, Signal generierenden Markierungsfunktionsgruppen-Komponenten des Systems erzeugt wird. Die erste Komponente, ein Photosensitizer z. B. ein Phthalocyanin enthaltender Photosensitizer, erzeugt nach Bestrahlung Singulett-Sauerstoff. Bei der zweiten Komponente handelt es sich um eine fotochemisch aktivierbare chemilumineszente Verbindung, z. B. Olefin, das mit dem Singulett-Sauerstoff reagiert und eine verzögerte Lumineszenzemission einleitet.
  • Photosensitizer erzeugen Singulett-Sauerstoff nach Bestrahlung z. B. Bestrahlung mit Licht. Zu den Beispielen fotoaktivierbarer Photosensitizer zählen Farbstoffe und aromatische Verbindungen. Beispiele chemisch aktivierter Photosensitizer sind Enzyme und Metallsalze. Die Photosensitizer-Verbindung sollte Energie, z. B. Licht im Wellenlängenbereich von 200–1100 nm absorbieren; die Lebensdauer des erzeugten erregten Zustands muss ausreichend lang sein, um eine Energieübertragung auf den Sauerstoff zu erlauben. Beispiele von Photosensitizern sind in N. J. Turro, „Molecular Photochemistry", Seite 132, W. A. Benjamin Inc., N. Y. 1965 enthalten.
  • Fotochemisch aktivierbare chemilumineszente Verbindungen, die nach direkter Erregung mit Licht oder durch Reaktion mit Singulett-Sauerstoff eine chemische Reaktion unterlaufen, bilden ein metastabiles Reaktionsprodukt, das mit der Abgabe von Licht zerfällt, normalerweise innerhalb des Wellenlängenbereichs von 250–1200 nm. Der Großteil der fotochemisch aktivierbaren chemilumineszenten Verbindungen emittiert normalerweise bei Wellenlängen über 300–550 nm. Zu den Beispielen fotochemisch aktivierbarer chemiluminszenter Verbindungen, die mit Singulett-Sauerstoff reagieren, zählen Olefine, z. B. Enolether, Enamine, Dioxine, Arylimidazole, Luminol, Luciferin und Aquaphorin.
  • Kohlenhydratbindungsligand mit Maximalvalenz 3
  • Ein Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3, wie dieser Begriff hier verwendet wird, ist ein Ligand, der sich vorzugsweise reversibel an ein Kohlenhydrat binden kann. Der Ligand sollte das Kohlenhydrat über einen oder mehrere bestimmte(n) Bindungsort(e) auf besondere und reversible Weise in einer Kohlenhydratkonzentration binden, bei der Messungen vorgenommen werden sollen. Valenz bezieht sich auf die Anzahl der Kohlenhydrat-Bindungsorte; so wird beispielsweise mit Valenz von 2 eine Art bezeichnet, die zwei Kohlenhydrate-Bindungsorte aufweist. Der Ligand weist möglichst wenige Kohlenhydrat-Bindungsorte auf, vorzugsweise drei oder weniger. In bestimmten Ausführungsbeispielen verfügt der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 über lediglich einen Kohlenhydrat-Bindungsort. In bestimmten Ausführungsbeispielen verfügt der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 über lediglich einen Kohlenhydrat-Bindungsort und ist ein monomeres Molekül, beispielsweise ein monomeres Lektin-Molekül. Bevorzugte Kohlenhydratverbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 sind jene, die von natürlich auftretenden Molekülen wie Lektinen abgeleitet sind.
  • Der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 ist ein Bindungsglied eines spezifischen Bindungspaares und interagiert mit dem an das Glykokonjugat, das zweite Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares gekoppelte Kohlenhydrat. Der Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 ist an eine Energie absorbierende FRET-Komponente gekoppelt. Die Energie absorbierende FRET-Komponente kann Spender oder Akzeptor von Energie sein. Ist eine Energie absorbierende FRET-Spenderkomponente an einen Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt, dann ist der Energie absorbierender FRET-Akzeptor an das Glykokonjugat gekoppelt. Ist der Energie absorbierende FRET-Akzeptor an den Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt, dann ist der Energie absorbierende FRET-Spender an das Glykokonjugat gekoppelt.
  • Die Interaktion zwischen dem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 und dem Glykokonjugat bringt die Energie absorbierende FRET-Komponenten zusammen und erlaubt die nicht-radiative Energieübertragung sowie FRET. Bei Vorhandensein von Kohlenhydrat in der Probe gibt es eine Konkurrenz zwischen dem Glykokonjugat und dem Kohlenhydrat um die Bindung an den Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3. Da der/die Bindungsort(e) am Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 durch Kohlenhydratmoleküle besetzt werden, werden Glykokonjugatmoleküle verdrängt oder an der Bindung gehindert. Das hindert die Energie absorbierenden FRET-Komponenten daran, näher aneinander zu rücken, und führt zum Fehlschlag der Energieübertragung zwischen den Komponenten.
  • Unter den Beispielen für Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 findet sich eine Familie von Proteinen, die als Lektine bezeichnet werden. Lektine besitzen die Fähigkeit, mit Kohlenhydraten reversibel zu reagieren. Die Interaktion hängt vom Lektin und von der Spezifizität des Lektins für bestimmte Kohlenhydrat-Funktionsgruppen ab. Bei den meisten Lektinen handelt es sich um häufig als Tetramere oder Dimere existierende oligomere Proteine. Beispiele von Lektinen sind in Tabelle I aufgeführt. Tabelle I: Merkmale von Lektinen
    Lektin Kohlenhydrat-Bindungsorte Polypeptide Molekulargewicht
    Abrus precatorius Agglutinin 2 α 33.000 126.000–135.000
    β 36.000
    β1 37.500
    Abrus precatorius Toxin A 1 α 31.000 60.000–62.500
    α1 32.500
    3 35.500
    Abrus precatorius Toxin C 1 α 29.000 64.000–66.600
    β 36.000
    Adenia digitata (Modeccin) - α 25.000–28.000 57.000–63.000
    β 31.000–35.000
    Adenia digitata (Modeccin 6B) - α 27.000 57.000
    β 31.000
    Aleuria aurantia 2 α 31.000 72.000
    Amphicarpaea bracteata - α 28.500 135.000
    β 36.000
    γ 32.000
    Anguilla anguilla 2 α 18.000–23.000 38.000-44.000
    Arachis hypogaea 4h (hochgestellt!!!!) α 25.000–28.000 98.000–111.000
    Bauhinia purpurea - α 44.000 195.000
    Carcinoscorpius rotunda cauda - α 27.000 420.000
    β 28.000
    Canavalia ensiformis 4 26.500 106.000
    Crotalaria juncea - α 31.000 120.000
    Cytisus sessilfolius - - 110.000
    Datura stramonium 2 α 40.000 86.000
    β 46.000
    Dioclea grandiflora - α 25.000–26.000 100.000
    Dolichos biflorus 2 (II) α 27.300 110.000–120.000
    (I) β 27.700
    Erythrina cristagalli 2 α 26.000 56.800
    β 28.000
    Erythrina indica 2 α 30.000kl 66.000–68.000kl
    β 33.000
    Evonymus europaea - α 35.500 126.700
    Glycine max 4 α 30.000 120.000
    Griffonia simplicifolia I - α 32.000 114.000
    β 33.000
    Griffonia simplicifolia II 4 α 30.000 113.000
    Griffonia simplicifolia IV α 27.000 56.600
    β 29.000
    Helix pomatia 6 α 13.000 79.000
    Hura crepitans (Samen, GalNAc) - α 31.000 120.000
    Lathyrns satiuus - α 4.400 49.000
    β 19.000
    Lathyrus tingitarus - α 5.000 50.000
    β 20.000
    Lens culinaris A 2 α 5.710 46.000
    β 17.572
    B α 5.700 46.000
    β 17.000
    Limaxflavus - α 22.000 44.000
    Limulus polyphemus - α 18.000 (42.000)8-12
    β 24.000
    Lotus tetragonolobus A 4 α 27.800 120.000
    B 2 α 27.000 58.000
    2 α 27.800 117.000
    Lycopersicon α 71.000–74.000 71.000–74.000
    esculentum A und B α 10.000 40.000–46.000
    β 12.000
    Macrotyloma axillare - α 10.000 108.000
    β 12.000
    Momordica charantia 2 α 27.000–29.000 115.000–129.000
    β 30.000-36.000
    Onobrychis vicilafolia - α 26.509 53.000
    Oryza sativa 4 α 18.000–19.000 38.000
    Pisum sativum A (I) 2 α 5.753 50.000
    β 17.000
    B (II) α1 5.700 50.000
    β 17.000
    Phaseolus lunatus 1/Kette α 31.000 (62.000)2-4
    α1 31.000
    β 31.000
    Phaseolus vulgaris - α 31.000 126.000
    β 17.000
    - 150.000 E4
    Phytolacca Pa-1 - α 22.000 (22.000)n
    americana Pa-2 α 28.000–31.000 28.000–30.000
    Pa-3 α 25.000 25.000
    Pa-4 α 21.000
    Pa-5 α 19.000
    Psophcarpus B1 - α 29.000 58.000
    tetragonolobus B2 β 29.000 58.000
    B3 γ 29.000 58.000
    Ricinus communis 4 α 29.500–33.000 120.000
    Agglutinin β 34.000
    Ricinus communis toxin 2 α 29.500–31.000 63.000
    β 34.000
    Solanum tuberosum 2 α 50.000 100.000
    Sophora japonica - α 32.500 132.800
    β 32.500
    Triticum vulgaris 4(2)2 α 21.600 43.200
    Ulex europeus I - α 29.000 60.000–68.000
    β 31.000
    Ulex europeus II - α 23.000–25.000 105.000
    Vicia cracca (Man) 2 α 5.759 44.000
    β 17.500
    Vicia cracca
    I(GalNAc) - α 33.000 114.000
    II (GalNAc) - 125.000
    Vicia ervilia - α 4.700 53.000
    β 21.000
    Vicia faba 2 α 5.571 52.542
    α 20.700
    Vicia sativa - α 6.000 40.000
    β 14.000
    Vicia graminea - α 26.000 105.000
    Vicia villosa A4 α 33.600 110.000–120.000
    A3B β 21.000
    A2B2 94.000
    AB3
    B4 108.000
    Viscus album (Lektin II Viscumin) - α 29.000 60.000
    β 34.000
    Wistaria floribunda Agglutinin 1/Kette α 28.000–32.000 (60.000)1-4
    Wistaria floribunda Mitogen - α 32.000 66.000
  • Beispiele einiger natürlich vorkommender Lektine mit eine Valenz unter 4 sind in Tabelle I in Fettdruck aufgeführt; zu ihnen zählen Lens culinaris A, Pisum sativatum A (I), Vicia cracca und Vicia faba, Wistaria floribunda (Irwin et al, 1986, The lectins, Academic Press, Inc.). Diese Lektine haben eine Spezifizität für Glukose und Mannose und können auf ihre Eignung als Bindungsglieder des spezifischen Bindungspaares in der unten beschriebenen Art getestet werden.
  • Ein Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 kann aus einem oligomeren Protein, durch Modifikation (Deaktivierung) eines Bindungsorts oder durch Reduktion der Anzahl der Kohlenhydrat-Bindungsorte mit Untereinheiten im Molekül erzeugt werden. So kann beispielsweise ein Tetramer z. B. durch Anwendung von chemischen Methoden oder Photomarkierungsmethoden in ein Dimer oder Monomer umgewandelt werden. Solche Moleküle werden hier als „untereinheitreduzierte Moleküle" bezeichnet. Daher enthalten bevorzugte Kohlenhydratverbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 untereinheitreduzierte Molekülen wie Lektine. Bevorzugte Lektine mit der Maximalvalenz 3 sind monovalente monomere Lektine, z. B. monomeres Concanavalin A.
  • Concanavalin A, ein multivalentes Mitglied der Lektin-Familie, kann in untereinheitreduzierter Form vorgesehen werden. Bei einem physiologischen pH besteht Concanavalin A hauptsächlich aus Tetrameren, während sich das Tetramer unterhalb von pH 6,0 dissoziiert und Dimere bildet (Wang et al., (1975) J. Biol. Chem. 250: 1490–1502).
  • Verfahren zur Zubereitung von Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3 oder von Concanavalin-A-Derivaten mit der Maximalvalenz 3 sind im gegenwärtigen Stand der Technik bekannt. So können beispielsweise zur Dissoziierung von nativem Concanavalin A in dimere Moleküle chemische Änderungsverfahren angewendet werden. In der Methode von Gunther et al., (1973), PNAS, 70: 1012–1016 ist die Sukzinylierung von Concanavalin A durch Reaktion von Concanavalin A mit Bernsteinsäureanhydrid beschrieben. Diese Reaktion erzeugt das Sukzinylderivat von Concanavalin A (Sukzinyl-Concanavalin A), das unter physiologischen Bedingungen als bivalentes Dinier existiert.
  • Mithilfe der von Tanaka et al, (1981), J. Biochem, 98: 1643–1646 beschriebenen Methode kann ein monovalentes Concanavalin A erzeugt werden. Die Methode beinhaltet eine photochemische Reaktion von tetramerem Concanavalin A mit Chloracetamid und Methyl-α-D-mannopyranosid, gefolgt von Bestrahlung durch eine Quecksilberdampf-Hochdrucklampe. Durch diese Reaktion wird eine Alkylierung an einem oder zwei Tryptophanrückständen pro Untereinheit von Concanavalin A eingeleitet; sie ist auch für die Dissoziierung von tetramerem Concanavalin A in monovalente, bei physiologischem pH stabile Monomere verantwortlich.
  • Eine Photoaffinität-Markierungsreaktion, in der natives Concanavalin A mit p-Azidophenyl-α-D-mannopyranosid markiert und mit Hydroquinon unter Ultraviolettbestrahlung (UV) behandelt wird, ist in Beppu et al., (1975), J. Biochem. 78: 1013–1019 beschrieben. Das erzeugte Concanavalin-A-Derivat existiert bei pH 5,0 als monovalentes Dinier, dimerisiert bei pH 7,0 jedoch zu einem bivalenten Tetramer.
  • Monovalente Derivate von Concanavalin A können auch durch eine Kombination aus chemischen und Photoaffinitätsmarkierungsmethoden erzeugt werden. So wird beispielsweise die Erzeugung von monovalentem Sukzinyl-Concanavalin A wie folgt beschrieben: Das native Concanavalin A Tetramer wird durch eine Reaktion von nativem Concanavalin A mit Bernsteinsäureahydrid in ein dimeres Sukzinyl-Concanavalin A Concanavalin A Derivat um gewandelt, Gunther et al., 1973, PNAS, 70, 1012–1016. Das daraus entstehende Sukzinyl-Concanavalin A wird als Startmaterial für die Photoaffinitätsmarkierung mit p-Azidophenyl-α-D-mannopyranosid und Hydroquinon verwendet, gefolgt von einer UV-Bestrahlung zur Erzeugung von monovalentem Sukzinyl-Concanavalin A, Beppu et al., 1976, J. Biochem. 79: 1113–1117.
  • In der Methode von Fraser et al., 1976, PNAS, 73: 790–794 ist die Produktion des monovalenten Derivats von Concanavalin A durch leichte Modifizierung der chemischen und Photoaffinitäts-Markierungsverfahren beschrieben. Beispielsweise durch zweimalige Sukzinylierung oder Acetylierung von nativem Concanavalin A, gefolgt von der UV-Bestrahlung des Sukzinyl-Concanavalin-A-Derivats oder des Acetyl-Concanavalin-A-Derivats bei vorhandenem p-Azidophenyl-α-D-mannopyranosid und Hydroquinon. Bei dieser Reaktion entsteht monomeres Sukzinyl-Concanavalin A bzw. monomeres Acetyl-Concanavalin A. Dieselbe Methode kann zur Erzeugung anderer monovalenter Concanavalin-A-Derivate angewendet werden.
  • Monovalente Formen von Concanavalin A wurden auch durch proteolytische Digestion von metallarmem Concanavalin A mithilfe von Pepsin und Trypsin, Wands et al., (1976) PNAS, 73: 2118–2122, oder mithilfe von Chymotrypsin, Thomasson et al., (1975), 67: 1545–1552, zubereitet.
  • In Frage kommende Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 können mithilfe des in US-Patent U.S. 5,342,789 beschriebenen FRET-Systems getestet werden. So kann beispielsweise ein in Frage kommender Kohlenhydratbindungsligand mit der Maximalvalenz 3 mithilfe eines Kohlenhydrats, z. B. Glukose als Analyt und dem zu BSA konjugierten Zucker als Glykokonjugat bestimmt werden. Energie absorbierende FRET-Komponenten wie fluoreszierende Farbstoffe, Rhodamin und Fluorescein können an das spezifische Bindungspaar angekoppelt werden. Das Auftreten des FRET ist ein Indikator für die Interaktion zwischen dem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 und dem Glykokonjugat, wodurch die Energie absorbierenden FRET-Komponenten in unmittelbare Nähe zueinander gebracht werden und eine erfolgreiche Energieübertragung stattfindet.
  • Zur genauen Bewertung einer Wechselwirkung zwischen dem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 und dem Glykokonjugat sollte das zu Glykokonjugat konjugierte Kohlenhydrat auf der Basis der Spezifizität des Kohlenhydratbindungsliganden mit der Ma ximalvalenz 3 ausgewählt werden. So sollte beispielsweise zur Überprüfung der Interaktion des bivalenten Sukzinyl-Concanavalin A als Bindungsligand mit der Maximalvalenz 3 Glukose oder Mannose als das zu Glykokonjugat konjugierte Kohlenhydrat verwendet werden, da Concanavalin A bekannterweise eine hohe Affinität für beide besitzt. Aus diesem Grund werden hier spezifische Bindungspaare offen gelegt, die nicht nur für die Bestimmung von Glukose nützlich sind, sondern auch andere Implikationen für die Untersuchung von Vorhandensein und Konzentration anderer Kohlenhydrate haben.
  • Die Umkehr der Bindungskinetik von Concanavalin A für ein Glykokonjugat ist in 3 dargestellt. Als Energie absorbierende FRET-Komponenten wurden fluoreszierende Farbstoffe Cy5 und Cy7 verwendet. Das Glykokonjugat wurde an Cy5 gekoppelt, während das monovalente Concanavalin A an Cy7 gekoppelt wurde. Die spezifischen Bindungspaare wurden unter Beisein von 500 mg/dL Glukoselösung inkubiert. Mit der Abnahme des FRET durch die konkurrenzierende Bindung von Glukose an das Concanavalin A erhöht sich das Emissionsverhältnis Cy5/Cy7. Zum Zeitpunkt Null ist der einzige Bindungsort des monovalenten Concanavalin A vom Glykokonjugat besetzt, daher befinden sich die Farbstoffe Cy5 und Cy7 nahe beieinander und ermöglichen die nicht-radiative Energieübertragung sowie eine hohe Wahrscheinlichkeit von FRET. Im Lauf der Zeit hemmt die Analyt-Glukose durch Konkurrenz die Bindung des Glykokonjugats an das monovalente Concanavalin A. In der Folge werden eine Reduktion des FRET und ein zunehmendes Emissionsverhältnisses Cy5/Cy7 beobachtet.
  • Ähnliche Studien der kinetischen Bindung wurden mit bivalentem sukzinyliertem Concanavalin A durchgeführt, wie in 4 dargestellt. 4. In diesem Experiment wird Fluorescein an glykosyliertes Rinderserumalbumin (FGB) gekoppelt, während BODIPY an Sukzinyl-Concanavalin A gekoppelt wird. Die kinetischen Profile des Diagramms sind ähnlich denen des monovalenten Concanavalin A und belegen damit, dass die beiden Bindungsorte des bivalenten Concanavalin A im Lauf der Zeit von der Glukose auf konkurrierende Weise besetzt werden.
  • Liganden mit Maximalvalenz 3 sind vorteilhaft, da die geringere Anzahl an Bindungsorten die Anhäufung reduziert. Die Glukoseanalyte müssen nur mit einer minimalen Anzahl von Gly-kokonjugaten jedes einzelnen Concanavalin A mit Maximalvalenz 3 konkurrieren. Dadurch wird Leistung und Empfindlichkeit des FRET-Systems verbessert.
  • Glykokonjugat
  • Ein Glykokonjugat, wie es in diesem Dokument beschrieben wird, ist ein Kohlenhydrat, eine Markierung, z. B. eine FRET-Komponente und ein Trägermolekül. Das Kohlenhydrat sollte das gleiche wie das Analyt sein. In FRET-basierenden Anwendungen ist die Markierung eine FRET-Komponente. In bestimmten Ausführungsbeispielen sind sowohl Kohlenhydrat als auch FRET-Komponente an ein Trägermolekül gebunden. Das Glykokonjugat geht eine spezifische und reversible Bindung zu einem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 ein.
  • Ein Glykokonjugat ist eines der Bindungsglieder des spezifischen Bindungspaares. Es geht mit dem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3, dem zweiten Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares, eine reversible Bindung ein. Eine Energie absorbierende FRET-Komponente wird an das Glykokonjugat gekoppelt und kann entweder Spender oder Akzeptor von Energie sein. Ist der Energie absorbierende FRET-Spender an ein Glykokonjugat gekoppelt, dann ist der Energie absorbierende FRET-Akzeptor an den Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt. Ist der Energie absorbierende FRET-Akzeptor an das Konjugat gekoppelt, dann ist der Energie absorbierende FRET-Spender an den Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 gekoppelt.
  • Das Kohlenhydratanalyt sollte durch Konkurrenz die Bindung des Glykokonjugats an den Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 hemmen. Zu den Beispielen zählen Kohlenhydrate wie Glukose, Fructose, Saccharose, Mannose, Monosaccharide und Oligosaccharide.
  • Das Trägermolekül sollte zu den in der Probe vorhandenen Substanzen nicht-reaktiv sein, es sollte einen Ort anbieten, an dem das Kohlenhydrat gebunden werden kann, und einen weiteren Ort anbieten, an dem die FRET-Komponente gebunden werden kann. Außerdem sollte das Trägermolekül die Bindung zwischen dem konjugierten Kohlenhydrat und dem Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 nicht stören. Zu den geeigneten Trägern zählen Proteine wie Rinder- oder Humanserumalbumin, β-Laktoglobulin, Immunoglobuline, Antikörper, der Proteinteil von Glykoproteinen oder der Lipidteil von Glykolipiden, die die vom Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 erkannte Kohlenhydrat-Funktionsgruppe enthalten, sowie synthetische Polymere, an denen das Kohlenhydrat kova lent gekoppelt ist. Methoden zur Kopplung von FRET-Komponenten an Trägermoleküle sind den Personen mit Kenntnis des Standes der Technik bekannt (Hermanson, 1996, Bioconjugate Techniques, Academic Press, Inc).
  • Ein Glykokonjugat kann unter Einsatz des in US-Patent U.S. 5,342,789 beschriebenen FRET-Systems getestet werden. So kann beispielsweise ein in Frage kommendes Glykokonjugat mit Glukose als Analyt und FRET-markiertem Concanavalin A als eines der Bindungsglieder des spezifischen Bindungspaares getestet werden. Rhodamine und Fluorescein können als Energie absorbierende FRET-Komponenten eingesetzt werden. Nach Interaktion zwischen dem Glykokonjugat und dem Concanavalin A erfolgt in FRET eine Energieübertragung zwischen den Energie absorbierenden FRET-Komponenten. Findet jedoch zwischen dem Glykokonjugat und dem Concanavalin A keine Interaktion statt, dann befinden sich die Energie absorbierenden FRET-Komponenten nicht in einer für die Energieübertragung geeigneten Entfernung; ein FRET wird nicht eintreten.
  • FRET-basierte Messung von Glukosekonzentrationen
  • Glukosemessungen unter Verwendung des Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 und des Glykokonjugats basieren auf der reversiblen Bindung des Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 an freie Glukose oder an das Glykokonjugat, wie in 5 dargestellt. Bei Nichtvorhandensein von Glukose belegt das Glykokonjugat den Bindungsort am Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3. Bei Vorhandensein von Glukose wird das Glykokonjugat verdrängt und der Bindungsort von der Glukose besetzt.
  • Der Einsatz von FRET zur Messung von Glukosekonzentrationen in Lösungen ist in 6 als Diagramm dargestellt. Das spezifische Bindungspaar umfasst ein Glykokonjugat (G), das Glukose zu einem Trägermolekül konjugiert hat, und eine kovakent gekoppelte Energie absorbierende FRET-Komponente, beispielsweise einen Fluorophor. Bei dem zweiten Bindungsglied handelt es sich um einen Glukosebindungsliganden mit der Maximalvalenz von 3 (L) und hoher Spezifizität für Glukose (z. B. Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3 oder Concanavalin-A-Derivate mit der Maximalvalenz 3), der kovalent an eine Energie absorbierende FRET-Komponente, beispielsweise an einen Fluorophor angekoppelt ist. Die Energie absorbierende FRET-Komponente am Glykokonjugat ist meist nicht dieselbe Energie absorbierende FRET-Komponente an dem Glukosebindungsliganden mit der Maximalvalenz von 3.
  • Eine der Energie absorbierenden FRET-Komponenten ist ein Energie absorbierender FRET-Spender (D), die andere ein Energie absorbierender FRET-Akzeptor (A). Für die Zwecke dieser Darstellung wurde der Energie absorbierende FRET-Spender (D) an das Glykokonjugat (G), der Energie absorbierende FRET-Akzeptor (A) wurde an den Glukosebindungsliganden (L) mit der Maximalvalenz 3 platziert. Die Beziehung zwischen dem spezifischen Bindungspaar ist unten dargestellt: DG + AL → DG – LA, wobei DG für den Energie absorbierenden Spender-Glukosekomplex steht, AL für den Energie absorbierenden Akzeptor, den Glukosebindungsliganden mit Maximalvalenz 3, und DG – LA für die Beziehung zwischen der Glukose des Glykokonjugats und dem Glukosebindungsliganden mit Maximalvalenz 3. Nach Vereinigung befinden sich die beiden Bindungsglieder des spezifischen Bindungspaares nahe genug aneinander, um die Energieübertragung zwischen dem Energie absorbierenden FRET-Spender und dem Energie absorbierenden FRET-Akzeptor möglich zu machen.
  • Durch das Vorhandensein freier Glukose (F) findet ein konkurrierender Hemmer Eingang in die Formel, da die freie Glukose mit der konjugierten Glukose um den Glukosebindungsliganden mit Maximalvalenz 3 im Wettbewerb steht. Die Glukosekonzentration verhält sich umgekehrt proportional zu den Glukosebindungsliganden mit Maximalvalenz 3, die für die Glykokonjugatbindung zur Verfügung stehen. Bei Erhöhung der Glukosekonzentration nimmt daher die Anzahl der für die Glykokonjugat Bindung zur Verfügung stehenden Glukosebindungsliganden mit Maximalvalenz 3 ab, da der Bindungsort (oder die Bindungsorte) des Glukosebindungsliganden mit Maximalvalenz 3 durch die Glukose belegt ist (sind). Bei relativ niedrigen Konzentrationen von Glukose bleibt die Effizienz der nicht-radiativen Energieübertragung zwischen den Energie absorbierenden FRET-Komponenten hoch, da die Interaktion zwischen den spezifischen Bindungspaaren nicht wesentlich berührt wird. Im Gegensatz dazu bleibt bei hohen Konzentrationen von Glukose die Effizienz der nicht-radiativen Energieübertragung zwischen den Energie absorbierenden FRET-Komponenten hoch, da die Interaktion zwischen den spezifischen Bindungspaaren nicht wesentlich berührt wird. Auf diese Weise ist es möglich, eine zuverlässige und wiederholbare Bestimmung von Glukose in einer Probe zu erhalten.
  • Die Methoden der Erfindung sind für die Bestimmung von Glukosekonzentrationen in einem physiologischen Bereich nützlich, der bei Normalpersonen und bei Personen mit einem Glukose-Ungleichgewicht (d. h. Patienten mit Diabetes, Hyperglykämie oder Hypoglykämie) auftritt. Der Auswertungsbereich umfasst Glukosekonzentrationen von 0,05 mg/ml bis 5,0 mg/ml oder von 0,5 bis 5,0 mg/ml. Die Messungen werden mit entsprechenden Probevolumen von Einzelpersonen (z. B. 10–100 μl) vorgenommen; die Recktanten sind stabil und wiederverwendbar.
  • Im Rahmen der Erfindung gibt es verschiedene Vorrichtungen, die für die Ermittlung von Glukosekonzentrationen im Blut mithilfe von in-vivo- oder in-vitro-Methoden geeignet sind. Diese Vorrichtungen können über längere Zeiträume hinweg (z. B. einen Monat, zwei oder sechs Monate oder länger) aktiv bleiben, bevor sie ausgetauscht werden müssen.
  • Obzwar sie nicht Teil der vorliegenden Erfindung sind, ist bei in-vivo-Ausführungsbeispielen die kutane Messung von Glukose vorgesehen, indem die Recktanten (d. h. das an die Energie absorbierende FRET-Komponenten gekoppelte spezifische Bindungspaar) mit der Glukose in Kontakt gebracht werden. Die Recktanten können in, auf oder unter die Haut platziert werden. Alternativ können die Recktanten in ein Organ oder ein Gefäß (beispielsweise eine Vene oder Arterie) eingeführt werden, wo sie der Glukose im Körper ausgesetzt sind. In einem Ausführungsbeispiel können die Recktanten in, auf oder unter die Haut platziert und können beispielsweise auf Glukose überwacht werden, indem sie die Haut mit einer Wellenlänge beleuchten, die den Energie absorbierenden Spender in erregten Zustand versetzt. Die absorbierte Energie wird an einen Energie absorbierenden Akzeptor übertragen und durch FRET evaluiert, z. B. durch Messung der Wellenlänge der Emissionsmaxima der beiden Energie absorbierenden FRET-Komponenten. Werden beispielsweise Fluorescein und BODIPY als Energie absorbierender FRET-Spender bzw. Energie absorbierender FRET-Akzeptor eingesetzt dann werden die Fluoreszenz-Intensitäten bei 520 nm und 590 nm, FI520 bzw. FI590 gemessen (entsprechend den jeweiligen Wellenlängen der Emissionsmaxima dieser fluoreszierenden Farbstoffe). Das Maß der Energieübertragung und der Wirkungsgrad der Energieübertragung zwischen den fluoreszierenden Farbstoffen werden von einem Fluorimeter festgestellt. Es wird das Verhältnis der Fluoreszenzintensitäten bei den beiden Wellenlängen der Höchstemission (z. B. FI520/FI590) oder das Quenching der Fluoreszenz des Energie absorbierenden Spenders bei Höchstemission als eine Funktion der Glukosekonzentration gemessen.
  • Obwohl nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung, können die Recktanten innerhalb eines Stützmaterials in den Körper eingeführt werden, welches die Recktanten in der gewünschten Position hält. So können beispielsweise die Recktanten in ein Mikrodialysegefäß oder in Mikrokapseln mit einem Durchmesser von etwa 1 mm 50–100 mm verkapselt werden. Der verkapselte Glukosesensor kann intrakutan in den Körper implantiert werden. In einem anderen Verfahren können Recktanten mit einem Trägermaterial, beispielsweise Silikon- oder Fluorkohlenstoffölen gemischt und subkutan injiziert werden. Die Recktanten können auch auf die Haut tätowiert werden oder in einem transkutanen Pflaster enthalten sein. Alternativ können die Recktanten dergestalt verändert werden, dass sie nach subkutaner Injektion in die Zellstruktur eingebunden werden und unter der Haut in situ verbleiben. So lässt sich beispielsweise das Albumin des Glykokonjugats so verändern, dass es eine Zellen bindende reaktive Gruppe enthält.
  • Jede beliebige in-vivo-Vorrichtung, bei der Recktanten mit Glukose in Berührung kommen, kann so abgeändert werden, dass sie eine Insulinpumpe enthält. Bei Feststellung eines unangemessen hohen Blutzuckerspiegels kann die Pumpe dem Patienten Insulin injizieren, wiewohl die Injektion nicht Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist.
  • in-vitro-Ausführungsbeispiele der Erfindung beinhalten auch die Anwendung der Recktanten an einer Probe von dem Körper entnommenem Blut oder anderen Körperflüssigkeiten (z. B. Urin, Extrazellularflüssigkeit), in denen Glukose enthalten ist. Die Glukose wird festgestellt und quantifiziert, indem die Recktanten mit der Glukose enthaltenden Körperflüssigkeit einem Fluorimeter ausgesetzt werden.
  • In einem weiteren Ausführungsbeispiel können die Recktanten an einem festen Substrat (beispielsweise einem Stab) befestigt oder in eine Kammer (beispielsweise ein Mikrodialysegefäß) eingefüllt werden. Die Recktanten können auch in einer Füllkartusche enthalten sein, die eine entsprechende Menge der Recktanten in das Blut oder in eine andere Glukose enthaltende Körpersubstanz abgeben kann.

Claims (30)

  1. Eine Methode zur Bestimmung eines Kohlenhydrats in einer Probe, bestehend aus: Bereitstellung eines Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3, Bereitstellung eines eine Markierung, ein Trägermolekül und eine Kohlenhydrat-Funktionsgruppe enthaltenden Glykokonjugats, Herbeiführung eines Kontakts zwischen dem genannten Kohlenhydratbindungsliganden und dem Glykokonjugat mit der genannten Probe, Ermittlung des Umfangs der Bindung des genannten Kohlenhydratbindungsliganden mit dem genannten Glykokonjugat, Korrelation der Bindung des genannten Kohlenhydratbindungsliganden und des genannten Glykokonjugats mit dem Anteil an Kohlenhydrat in der genannten Probe, bei welcher das Trägermolekül die Bindung zwischen der Kohlenhydrat-Funktionsgruppe und dem Kohlenhydratbindungsliganden nicht beeinträchtigt.
  2. Die Methode des Anspruchs 1, bei welcher die Ermittlung den Einsatz eine auf dem Naheffekt basierende Signal generierende Funktionsgruppe umfasst.
  3. Eine Methode zur Bestimmung eines Kohlenhydrats in einer Probe, bestehend aus: a) Herstellung des Kontakts zwischen der Probe und einem spezifischen Bindungspaar, das aus einem ersten Bindungsglied und einem zweiten Bindungsglied besteht, wobei das erste Bindungsglied einen an eine erste Energie absorbierende FRET-Komponente gekoppelten Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 umfasst, wobei das zweite Bindungsglied ein Glykokonjugat ist, das ein Trägermolekül, ein Kohlenhydrat und eine zweite Energie absorbierende FRET-Komponente umfasst, wobei der Energiepegel des erregten Zustands der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente mit dem Energiepegel des erregten Zustands der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente überlappt, und wobei der Kohlenhydratbindungsligand und das Glykokonjugat miteinander dergestalt eine reversible Bindung eingehen können, dass in der Probe vorhandenes Kohlenhydrat das Glykokonjugat verdrängen und mit dem Kohlenhydratbindungsliganden eine reversible Bindung eingehen kann, und b) Bestimmung des Ausmaßes, in welchem ein nicht radiativer FRET-Transfer zwischen der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente und der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente erfolgt, wodurch das in der Probe vorhandene Kohlenhydrat bestimmt wird, in welcher das Trägermolekül die Bindung zwischen der Kohlenhydrat-Funktionsgruppe und dem Kohlenhydratbindungsliganden nicht beeinträchtigt.
  4. Die Methode des Anspruchs 1 oder 3, in welcher eine Probe aus einer Gruppe gewählt wird, die aus einer Urinprobe, einer Blutprobe, einer Plasmaprobe, aus Intrazellularflüssigkeit, interstitieller Flüssigkeit oder einem Zellhomogenat oder -extrakt besteht.
  5. Die Methode des Anspruchs 1 oder 3, bei welcher der Kohlenhydratbindungsligand ein Lektin ist.
  6. Die Methode des Anspruchs 1 oder 3, bei welcher der Kohlenhydratbindungsligand und das Glykokonjugat über den Bereich der in Körperflüssigkeiten auftretenden Kohlenhydratkonzentrationen eine reversible Bindung eingehen.
  7. Die Methode des Anspruchs 3, bei welcher die erste und die zweite Energie absorbierende FRET-Komponente Fluorophore sind.
  8. Die Methode des Anspruchs 3, bei welcher das erste Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares Fluorophor-markiertes Concanavalin A mit Maximalvalenz 3 ist; das zweite Bindungsglied des spezifischen Bindungspaares Fluorophor-markiertes glykolysiertes Serumalbumin ist, das mit Concanavalin A mit Maximalvalenz 3 bindungsfähig ist, und bei welcher der nicht-radiative Fluorescence Resonance Energy Transfer durch Messung des Verhältnisses der den beiden Fluorophoren zuschreibbaren Lichtemissionen festgestellt werden kann.
  9. Die Methode des Anspruchs 3, bei welcher das spezifische Bindungspaar in eine immunisolierender Kapsel oder Mikrokapsel verkapselt wird.
  10. Die Methode des Anspruchs 3, bei welcher das spezifische Bindungspaar beleuchtet und die Energieübertragung überwacht wird.
  11. Die Methode des Anspruchs 3, bei welcher eine Energie absorbierende FRET-Spenderkomponente mit einem Kohlenhydratbindungsliganden gekoppelt wird, während ein Energie absorbierender FRET-Akzeptor mit dem Glykokonjugat gekoppelt wird.
  12. Die Methode des Anspruchs 3, bei welcher eine Energie absorbierende FRET-Akzeptorkomponente mit einem Kohlenhydratbindungsliganden gekoppelt wird, während ein Energie absorbierender FRET-Spender mit dem Glykokonjugat gekoppelt wird.
  13. Eine in-vivo-Methode zur Feststellung der Kohlenhydratkonzentration in einem Subjekt, bestehend aus: nicht-invasiver Bestimmung des Ausmaßes, in welchem ein nicht-radiativer Fluoreszenz-Energietransfer zwischen der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente und der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente erfolgt, wobei ein Sensor in Kontakt mit dem in der Körperflüssigkeit des Subjekts vorhandenen Kohlenhydrat dergestalt platziert ist, dass der Sensor nach seiner Platzierung am richtigen Ort die Haut des Subjekts nicht mehr durchdringt und damit eine nicht-invasive Überwachung des genannten Kohlenhydrats in den Körperflüssigkeiten des genannten Subjekts erlaubt, wobei der Sensor ein erstes Bindungsglied und ein zweites Bindungsglied umfasst, wobei das erste Bindungsglied einen an eine erste Energie absorbierende FRET-Komponente gekoppelten Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 umfasst, wobei das zweite Bindungsglied ein Glykokonjugat enthält, das ein Trägermolekül, ein Kohlenhydrat und eine zweite Energie absorbierende FRET-Komponente umfasst; wobei der Energiepegel des erregten Zustands der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente mit dem Energiepegel des erregten Zustands der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente überlappt, und wobei der Kohlenhydratbindungsligand und das Glykokonjugat miteinander dergestalt eine reversible Bindung eingehen, dass in der Probe vorhandenes Kohlenhydrat das genannte Glykokonjugat verdrängen und mit dem genannten Kohlenhydratbindungsliganden eine reversible Bindung eingehen kann, und wodurch das Kohlenhydrat im genannten Subjekt quantifiziert wird, in welchem das Trägermolekül die Bindung zwischen der Kohlenhydrat-Funktionsgruppe und dem Kohlenhydratbindungsliganden nicht beeinträchtigt.
  14. Die Methode des Anspruchs 3 oder 13, bei welcher die Methode aus dem Vergleich des Ergebnisses von Schritt (b) mit einem aus einem Kalibrierungsschritt erzielten FRET-Wert besteht.
  15. Die Methode des Anspruchs 13, bei welcher mit der Methode der Glukosespiegel in der subkutanen Körperflüssigkeit, intrakutanen Körperflüssigkeit oder im Blut gemessen wird.
  16. Die Methode des Anspruchs 1, 3 oder 13, bei welcher das Kohlenhydratanalyt aus einer Gruppe gewählt wird, die aus einem Monosaccharid, einem Disaccharid, einem Polysaccharid, aus Glukose und aus einem Kohlenhydrat besteht, welches Bestandteil anderer Molekular- oder Supramolekularstrukturen ist.
  17. Die Methode des Anspruchs 1, 3 oder 13, in welcher Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3 der Kohlenhydratbindungsligand ist.
  18. Die Methode des Anspruchs 17, bei welcher die Kohlenhydrat-Funktionsgruppe des Glykokonjugats Glukose oder Mannose enthält.
  19. Die Methode des Anspruchs 13, bei welcher der Sensor in einer immunisolierenden Kapsel oder Mikrokapsel verkapselt wird.
  20. Die Methode des Anspruchs 13, bei welcher das spezifische Bindungspaar beleuchtet und die Energieübertragung durch die Haut des Subjekts überwacht wird.
  21. Die Methode des Anspruchs 1, 3 oder 13, bei welcher das Trägermolekül aus einer aus Proteinen, β-Laktoglobulin, Immunoglobulinen, Antikörpern und synthetischen Polymeren bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
  22. Die Methode des Anspruchs 21, bei welcher das Trägermolekül aus Rinder- oder Humanserumalbumin besteht.
  23. Die Methode des Anspruchs 1, 3 oder 13, bei welcher das Trägermolekül kovalent an die Kohlenhydrat-Funktionsgruppe gekoppelt und die daraus resultierende Kombination aus einer aus glykosyliertem Serumalbumin, Glykoproteinen, Glykolipiden und synthetischen Polyme ren mit einer kovalent gekoppelten Kohlenhydrat-Funktionsgruppe bestehenden Gruppe ausgewählt wird.
  24. Die Methode des Anspruchs 1, 3 oder 13, bei welcher das Trägermolekül mit den in der Probe vorhandenen Stoffen nicht-reaktiv ist.
  25. Ein Sensor für die nicht-invasive Bestimmung eines Kohlenhydratspiegels, beispielsweise des Glukosespiegels in einem Subjekt, wobei der Sensor ein spezifisches Bindungspaar umfasst, das aus einem ersten Bindungsglied und einem zweiten Bindungsglied besteht, wobei das erste Bindungsglied einen an eine erste Energie absorbierende FRET-Komponente gekoppelten Kohlenhydratbindungsliganden mit der Maximalvalenz 3 umfasst, wobei das zweite Bindungsglied ein Glykokonjugat enthält, das ein Trägermolekül, ein Kohlenhydrat und eine zweite Energie absorbierende FRET-Komponente umfasst; wobei der Energiepegel des erregten Zustands der ersten Energie absorbierenden FRET-Komponente mit dem Energiepegel des erregten Zustands der zweiten Energie absorbierenden FRET-Komponente überlappt, und wobei der Kohlenhydratbindungsligand und das Glykokonjugat miteinander dergestalt eine reversible Bindung eingehen können, dass das in der Probe vorhandene Kohlenhydrat das Glykokonjugat verdrängen und mit dem Kohlenhydratbindungsliganden eine reversible Bindung eingehen kann, in welcher das Trägermolekül die Bindung zwischen der Kohlenhydrat-Funktionsgruppe und dem Kohlenhydratbindungsliganden nicht beeinträchtigt.
  26. Der Sensor des Anspruchs 25, in welchem Concanavalin A mit der Maximalvalenz 3 der Kohlenhydratbindungsligand ist.
  27. Der Sensor des Anspruchs 25, bei welchem der Sensor in einer immunisolierenden Kapsel oder Mikrokapsel verkapselt wird.
  28. Der Sensor des Anspruchs 25, bei welchem das spezifische Bindungspaar beleuchtet und die Energieübertragung überwacht wird.
  29. Der Sensor des Anspruchs 25, bei welchem der genannte Sensor zur Überwachung von Veränderungen des Kohlenhydrats positive Rückmeldungen macht.
  30. Der Sensor des Anspruchs 25, bei welchem das spezifische Bindungspaar in einen von einer immunisolierenden Membran umgebenen Hydrogelkern verkapselt wird.
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