ES2593683T3 - Sondas conjugadas y detección óptica de analitos - Google Patents
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Abstract
Una matriz para detectar analitos con un sensor de imágenes, comprendiendo la matriz: - un sensor de imágenes digital óptico semiconductor de óxido metálico complementario (CMOS) que comprende como su capa superior una capa de pasivación transparente; y - una pluralidad de sondas de conjugados unidas covalentemente con dicha capa de pasivación transparente; donde al menos un conjugado de la pluralidad de conjugados comprende un resto de sonda de unión a diana acoplado covalentemente con un polímero.
Description
Puede detectarse un polinucleótido diana usando nucleótidos marcados (por ejemplo, marcador de dNTPfluorescente para marcaje directo; dNTP-biotina o dNTP-digoxigenina para marcaje indirecto) incorporados en ADN amplificado durante la amplificación por PCR. Para el ADN marcado indirectamente, la detección se lleva a cabo por fluorescencia u otra estreptavidina conjugada con enzima o anticuerpos anti-digoxigenina. El método de PCR
5 típicamente emplea detección de los polinucleótidos detectando marcador incorporado en los complementos de nuevas síntesis para las dianas polinucleotídicas. Para este fin, puede usarse cualquier marcador que pueda incorporarse en ADN a medida que se sintetiza, por ejemplo, fluoro-dNTP, biotina-dNTP o digoxigenina-dNTP, como se ha descrito anteriormente. La amplificación por PCR realizada usando uno o más cebadores universales en solución proporciona la opción de detectar las dianas amplificados en localizaciones en el soporte sólido detectando los cebadores universales. Por lo tanto, cuando se use más de un cebador universal, pueden detectarse diferencialmente cadenas diana de diferentes fuentes en el soporte sólido.
Los ejemplos adicionales de marcadores fluorescentes adecuados incluyen fluoresceína (FITC), 5,6-carboximetil fluoresceína, Texas red, nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-il (NBD), cumarina, cloruro de dansilo, rodamina, 4' -6-diamino
15 2-fenilinodol (DAPI), y los colorantes de cianina Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7. Con frecuencia, los marcadores fluorescentes son fluoresceína (5-carboxifluoresceína-N-hidroxisuccinimida éster) o rodamina (5,6-tetrametil rodamina). En ocasiones los marcadores fluorescentes para codificación multicolor combinatoria son FITC y los colorantes de cianina Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7. La absorción y emisión máximas, respectivamente, para estos fluorescentes son: FITC (490 nm; 520 nm), Cy3 (554 nm; 568 nm), Cy3.5 (581 nm; 588 nm), Cy5 (652 nm: 672 nm), Cy5.5 (682 nm; 703 nm) y Cy7 (755 nm; 778 nm), permitiendo de este modo su detección simultánea.
En ocasiones se usan nucleótidos marcados para marcadores de detección ya que pueden incorporarse directamente durante la síntesis. Los ejemplos de marcadores de detección que pueden incorporarse en ADN o ARN amplificado incluyen análogos de nucleótidos tales como BrdUrd (Hoy y Schimke, Mutation Research 290:217-230 25 (1993)), BrUTP (Wansick et al., J. Cell Biology 122:283-293 (1993)) y nucleótidos modificados con biotina (Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 78:6633 (1981)) o con haptenos adecuados tales como digoxigenina (Kerkhof, Anal. Biochem. 205:359-364 (1992)). Son nucleótidos marcados con fluorescencia fluoresceína-isotiocianato-dUTP, Cianina-3-dUTP y Cianina-5-dUTP (Yu et al., Nucleic Acids Res.., 22:3226-3232 (1994)). Un marcador de detección análogo de nucleótido útil para ADN es BrdU (BUDR trifosfato, Sigma), y un marcador de detección análogo de nucleótido útil para ARN es biotina-16-uridina-5'-trifosfato (biotina-16-dUTP, Boehringer Mannheim). La fluoresceína, Cy3 y Cy5 pueden unirse a dUTP para marcaje directo. Cy3.5 y Cy7 están disponibles como conjugados de avidina
o anti-digoxigenina para detección secundaria de sondas marcadas con biotina o digoxigenina.
En una realización, la invención se usa para detectar la unión de una estructura molecular con la ruta de señal. En
35 esta realización, se propaga una señal a través de la ruta de señal. A medida que se propaga, se acopla con la estructura unida y se modula. El análisis de la respuesta modulada indica unión.
En otra realización, la invención puede usarse para identificar unión secundaria. Por ejemplo, la unión primaria puede ser la unión de un anticuerpo con la superficie conductora. La unión secundaria puede implicar la medición de la unión entre el anticuerpo inmovilizado y su antígeno en solución. Después de haberse detectado la unión primaria como se ha descrito en el párrafo anterior, la solución que contiene el anticuerpo se añade al dispositivo de bioensayo y la respuesta se mide de nuevo. La respuesta se compara con la respuesta de unión primaria. Un cambio indicaría que se ha producido un acontecimiento de unión.
45 En otra realización, la invención puede usarse en un formato de matriz. El dispositivo sensor o sistema biosensor tendrá múltiples sitios direccionables, cada uno de los cuales tiene unido a él un anti-ligando específico. Después de suministrar solución al dispositivo, se medirán y caracterizarán las respuestas de unión en cada sitio. Un dispositivo de este tipo puede usarse para medir y/o identificar la presencia de secuencias de ácido nucleico específicas en una muestra. En cada uno de los sitios direccionables se une una secuencia nucleica única como el anti-ligando. Tras la exposición a la muestra, se unirán secuencias complementarias en sitios apropiados. La respuesta en cada sitio indicará si se ha unido una secuencia. Dicha medición también indicarán si la secuencia unida es perfectamente coincidente con la secuencia anti-ligando o si hay uno o múltiples desapareamientos. Esta realización también puede usarse para identificar proteínas y clases de proteínas.
55 En otra realización, la presente invención puede usarse para generar una curva patrón o curva de valoración que se usaría posteriormente para determinar la concentración desconocida de un analito o ligando particular. Por ejemplo, podría unirse un anticuerpo al dispositivo sensor o sistema biosensor. El dispositivo podría exponerse a varias concentraciones diferentes del ligando y medirse la respuesta para cada concentración. Dicha curva también se conoce por los expertos en la materia como una curva de respuesta a dosis. Puede exponerse una muestra desconocida al dispositivo y medirse la respuesta. Su respuesta puede compararse con la curva patrón para determinar la concentración del ligando en la muestra desconocida.
Con frecuencia es deseable determinar ciertas cualidades de una molécula dada. Los ejemplos incluyen determinar la clase a la que pertenece una proteína, o qué tipo de polimorfismo es un gen dado u otra secuencia de ácido 65 nucleico. Esto puede realizarse de varias maneras. Las proteínas se clasifican con frecuencia por número y tipos de homologías estructurales, o subestructuras particulares que se encuentran en las mismas o similares clases de
proteínas. Por ejemplo, las proteínas G habitualmente halladas en membranas celulares y que median en las rutas de transducción de señal entre el ambiente extracelular y el ambiente intracelular siempre tienen una estructura que atraviesa la membrana celular siete veces. Dicha estructura es prácticamente definitiva de una proteína G. Otras clases de proteínas tienen homologías estructurales similares, y como tal, cualquier método que pueda distinguir una 5 clase de proteínas de otra basándose en estas homologías es de enorme utilidad en muchos de los campos de investigación biomédica. Dado que las propiedades dieléctricas de una molécula dada se determinan completamente por la geometría de la distribución de carga de dicha molécula, y dado además que la mayoría de las proteínas tienen una estructura o geometría única, entonces cada proteína puede determinarse de forma única midiendo las propiedades dieléctricas de la proteína. Por lo tanto una simple identificación dieléctrica, tal como las generadas por la presente invención, puede servir para identificar de forma única una proteína dada, y además, puede permitir la clasificación de la proteína en algunas clases previamente conocidas de proteínas. Puede añadirse un refinamiento adicional a la metodología de clasificación usando un grupo de antiligandos en el dispositivo de bioensayo que son específicos para subestructuras particulares de una proteína dada. Por ejemplo, puede utilizarse un grupo de anticuerpos que son específicos para subestructuras particulares tales como dominios, para la
15 determinación de la existencia o ausencia de dichas subestructuras. Por lo tanto, puede caracterizarse cualquier proteína dada determinando tanto la presencia como la ausencia de ciertas subestructuras así como las propiedades dieléctricas de la proteína en sí misma. Refinamientos adicionales de esta estrategia de clasificación pueden incluir mirar la temperatura, pH, fuerza iónica, así como otros efectos ambientales en las propiedades anteriormente mencionadas.
También pueden caracterizarse ácidos nucleicos siguiendo un paradigma similar. Por ejemplo, puede saberse que un gen dado tiene una cierta secuencia de pares de bases. Con frecuencia en la naturaleza habrá pequeñas variaciones en esta secuencia. Por ejemplo, en el gen que codifica un canal de transporte iónico de cloruro en muchas membranas celulares hay mutaciones de pares de bases individuales habituales, o cambios. Dichos
25 cambios conducen a una enfermedad llamada fibrosis quística en seres humanos. Por lo tanto la caracterización de una secuencia de ácido nucleico dada con respecto a pequeñas variaciones es de enorme importancia. Dichas variaciones se denominan con frecuencia polimorfismos, y dichos polimorfismos se detectan en la actualidad formando cadenas complementarias para cada uno de los polimorfismos conocidos. Puesto que cualquier gen dado puede tomar la forma de uno cualquiera de cientos incluso miles de polimorfismos, es con frecuencia una tarea ardua generar cadenas complementarias para cada polimorfismo. Usando la invención descrita en el presente documento, puede detectarse unión o hibridación no complementaria y distinguirse midiendo muchas de las mismas propiedades físicas que se han descrito en el párrafo anterior: las propiedades dieléctricas del acontecimiento de hibridación puede caracterizarse y correlacionarse con datos conocidos, determinando de este modo el tipo de hibridación que se ha producido, bien incompleta o bien completa. Por lo tanto, con un antiligando comprendido por
35 una secuencia de ácido nucleico dada, pueden detectarse cientos de polimorfismos diferentes (como ligandos) por la caracterización del acontecimiento de unión. Un experto en la materia apreciará que son posibles refinamientos adicionales, tales como modificar las condiciones de rigurosidad para alterar el proceso de hibridación, o variar la temperatura y determinar el punto de fusión, lo que actúa como otro indicador de la naturaleza del proceso de hibridación.
En una realización, pueden caracterizarse interacciones de fármaco-receptor para determinar si un acontecimiento de unión dado da como resultado que el receptor se active o desactive, o alguna otra forma de efecto alostérico. Por ejemplo, puede usarse un receptor dado como un antiligando, y puede usarse un agonista conocido como el primer ligando. La interacción se caracteriza de acuerdo con una propiedad dieléctrica, u otra propiedad. Pueden ensayarse
45 compuestos que se exploran con respecto a candidatos farmacológicos por sus propiedades de unión con el receptor. Por ejemplo, un candidato que se une y produce un valor de la propiedad similar al agonista conocido tiene una mayor probabilidad de ser un agonista. Este método puede usarse para caracterizar cualquier tipo de acontecimiento de unión de diana-receptor de interés, u otras clases de acontecimientos de unión. En una realización, la sonda conjugada actúa como el sistema de reconocimiento para un ensayo inmunoabsorbente similar a un ensayo ELISA, o un ensayo de inmunotransferencia. Los conjugados de esta realización tienen un anticuerpo acoplado a este polímero, que es el anticuerpo primario del ensayo ELISA o ensayo de inmunotransferencia. Puede usarse un anticuerpo secundario acoplado a una enzima, que cataliza una reacción que forma un producto coloreado, para reconocer el anticuerpo primario o algún resto del conjugado. Puede usarse un sustrato de la enzima para producir color para detección. En realizaciones adicionales, puede prepararse un kit para
55 un sistema de ensayo, ensamblándose el kit usando, por ejemplo, un conjugado de polisacárido que se acopla al menos a una molécula de reconocimiento y al menos una molécula de señalización o especie marcadora. En estas realizaciones, la molécula de reconocimiento puede ser un anticuerpo, u otro producto químico o biomolécula.
En una realización, como se ilustra en la Figura 3, el sistema biosensor comprende un sensor de imágenes digitales 600 en una caja de luz baja 100, una estación de lectura de alto rendimiento de datos 400, y un ordenador de uso general 700. La estación de lectura 400 tiene al menos un conector para insertar una caja de luz baja 100 que contiene un sensor de imágenes digitales CMOS 600, conectando de este modo de forma eléctrica y mecánica la
65 caja sensora con la estación de lectura. La estación de lectura puede conectarse al ordenador mediante bus serial universal (USB) 454, por ejemplo, o por un dispositivo de interfaz de puestos paralelos diferente 452.
Opcionalmente, la estación de lectura puede conectarse al ordenador mediante una interfaz de Ethernet 456. Otras conexiones que pueden usarse en el sistema incluyen, pero sin limitación, Firewire, SCSI y PCMCIA. En realizaciones alternativas, el ordenador y la estación de lectura pueden reemplazarse por un ordenador portátil, o un asistente personal digital tal como una Palm Pilot.
5 En referencia a la realización de la Figura 3, un dispositivo lógico programable 460 en una placa madre en la estación de lectura 400 está en interfaz con un ordenador de uso general 700, tal como un ordenador personal. El dispositivo lógico programable 460 también está en interfaz con el sensor de imágenes digitales 600, y sincroniza la lectura de los datos de analito del sensor de imágenes digitales controlando las líneas de estado del sensor de imágenes digitales que señalizan el comienzo y el final de las imágenes, incluyendo las líneas de pulso de ciclo de datos de píxeles, fotograma y línea. El dispositivo lógico programable 460 controla el flujo de datos de imágenes del sensor de imágenes 600 y a la memoria FIFO local, donde la imagen se almacena hasta que el ordenador 700 pide una transferencia de los datos. Un ciclo típico para el dispositivo lógico programable 460 es recibir una orden del ordenador 700, lo que provoca que el sensor produzca una imagen, capturar esa imagen en la memoria FIFO local
15 en la placa madre en la estación de lectura 400, y transferir los datos de imágenes capturadas al ordenador 700. Una interfaz de usuario gráfica (GUI) proporciona un equipo para que el usuario del ordenador pida una captura de imágenes y ciclo de presentación, un modo de captura, o pida una secuencia continua, un modo de video en vivo. Se proporcionan filtros y herramientas de procesamiento de imágenes para permitir que el usuario maneje el sensor en condiciones de luz baja. Estas herramientas comprenden rutinas de procesamiento de imágenes para potenciar señales pequeñas del sensor, rutinas de software para coañadir imágenes, rutinas para restar imágenes de fondo o imágenes “oscuras” y rutinas para separar por filtrado el ruido. La GUI también proporciona al usuario control sobre los ajustes del sensor en placa. Esto permite que el usuario interaccione con el sensor, ajustando los parámetros en placa tales como tiempo de integración, aumento, e intervalo de conversor análogo a digital.
25 Como se ejemplifica por la realización de la Figura 3, la estación de lectura 400 incluye un conector 360 para unir la placa hija del sensor de imágenes y la caja de luz baja 100 con la estación de lectura 400. Una característica de la disposición de esta realización es que el lector de analitos del sensor de imágenes digitales óptico se separa fácilmente de forma mecánica de la estación de lectura, en otras palabras, es desmontable. Un sensor de imágenes digitales desmontable proporciona provechosamente portabilidad del sensor de imágenes digitales, y funcionamiento de alto rendimiento del sistema biosensor. En funcionamiento, la caja de luz baja y el sensor de imágenes digitales pueden conectarse a la estación de lectura desde una cola, bien manual o robóticamente, y después de detectar los analitos, la caja de luz baja y el sensor de imágenes digitales pueden desconectarse, bien manual o automáticamente. Esta característica de conexión y uso inmediato del sistema biosensor permite el funcionamiento del sistema biosensor con una caja de luz baja y sensor de imágenes digitales que es una unidad desechable, por
35 ejemplo. En realizaciones alternativas, la caja de luz baja y el sensor de imágenes digitales pueden regenerarse para su uso con una matriz diferente. En funcionamiento, se proporciona a la estación de lectura del sistema biosensor capacidad de inserción en caliente, en la que la caja de luz baja que contiene el sensor de imágenes ópticas puede conectarse con, y desconectarse de, la estación de lectura sin desactivar la fuente de alimentación ni de la estación de lectura ni del sensor de imágenes.
La estación de lectura incluye una interfaz microinformática de USB. Opcionalmente, puede incluirse una interfaz MICROSOFT EXTENDED CAPABILITIES PORT (ECP) con un interruptor controlado por el usuario para determinar la interfaz activa. El cable USB proporciona energía eléctrica que puede usarse por la placa madre de la estación de lectura. Para ECP, se proporciona un suministro de 9 VDC. Se proporciona un interruptor de reinicio manual para
45 reiniciar la placa madre del biosensor, y el dispositivo lógico programable también puede reiniciarse manualmente.
En una realización, la presente invención es un método para potenciar la detección de señales de analitos mediante integración de tiempo. El rendimiento de datos y la medición de los parámetros de analitos en la diana se limitan por la relación de señal y ruido inherente en la detección de luz de la matriz por el sensor de imágenes digitales. La relación de señal y ruido puede aumentarse integrando la señal del analito durante varios milisegundos o más tiempo, con frecuencia de aproximadamente 10 milisegundos a aproximadamente dos minutos, en ocasiones de aproximadamente 30 a aproximadamente mil milisegundos, y en ocasiones de aproximadamente 50 a aproximadamente 600 milisegundos. En otra realización, la dependencia del tiempo de la señal de analito se registra almacenando una secuencia de fotogramas de señal de matriz, en la que cada fotograma se obtiene integrando la
55 señal de analito durante un periodo de tiempo.
La interfaz microinformática de USB proporciona el reloj maestro para el sensor de imágenes y el dispositivo lógico programable. La producción del sensor de imágenes incluye datos de píxeles junto con línea de imagen y pulsos de fotogramas, que se pasan de vuelta a través del conector a la placa madre y se envían a una memoria FIFO. El pulso de fotogramas se usa para reiniciar el indicador de FIFO, y el pulso de líneas se usa como la autorización de escritura para la FIFO. Esta disposición almacena datos de píxeles en la FIFO comenzando con el píxel superior izquierdo como localización 0 (cero) de la FIFO.
Una vez que la imagen está en la FIFO, puede leerse por una de dos interfaces. En referencia a la realización de la
65 Figura 3, se proporciona ECP en el que los datos de imágenes de la matriz se leen en un puerto paralelo (PP) 452, un píxel por lectura. La lectura comienza cuando el PP 452 envía una petición inversa. Esto provoca que el
dispositivo lógico programable 460 habilite sus controladores de salida para el PP 452. Después el dispositivo lógico programable impone el por.ciclo. El PP 452 responde con por.ack. La secuencia de ciclo ack continúa hasta que el ordenador 700 ha leído un fotograma de píxeles. El dispositivo lógico programable 460 usa el bit de datos de PP 452 cero como SDA, y el bit de datos de PP 452 1 como SCL del bus I2C.
5 En otra realización, se leen los datos de imágenes en la FIFO por interfaz de USB. El funcionamiento del biosensor se potencia aumentando el ancho de banda de la transmisión de datos en serie en comparación con la transferencia de USB convencional. En la transferencia de USB convencional, se leería un paquete de datos de la FIFO, seguido de un intervalo de tiempo en el que la FIFO carga el siguiente paquete para leer. Por ejemplo, en una interfaz
10 microinformática de USB convencional se lee un paquete de 63 píxeles de la FIFO y se envía mediante una de las líneas de datos en el USB. En una realización, se designan dos criterios de valoración en la FIFO para establecer dos memorias temporales. En el funcionamiento, se lee una memoria temporal y se transmite en una de las líneas de datos en el USB mientras que la otra memoria temporal se está cargando, aumentando de este modo el ancho de banda de transferencia usando el bus serial universal hasta el 100 %. El final de la transmisión de datos de la
15 primera memoria temporal se produce inmediatamente antes, por ejemplo, uno o varios pulsos de ciclo antes, del inicio de la transmisión de datos en una línea de datos del bus serial universal de la segunda memoria temporal. Después se produce transmisión de datos en una línea de datos del bus serial universal de la segunda memoria temporal, cargando al mismo tiempo datos en el primer tampón. Estas etapas pueden repetirse hasta que se han enviado todos los datos que necesitan transferirse, aumentando de este modo la velocidad de transferencia de datos
20 frente al USB convencional.
Los siguientes ejemplos describen adicionalmente realizaciones de la presente invención. Los ejemplos se proporcionan solamente para el fin de ilustrar y no deben interpretarse como limitantes de la presente invención. Aunque se han descrito realizaciones ilustrativas de la presente invención, los expertos en la materia reconocerán
25 que pueden cambiarse o modificarse sin alejarse del espíritu y alcance de la presente invención, y se pretende que abarquen todos estos cambios, modificaciones y disposiciones equivalentes que quedan dentro del verdadero alcance de la invención como se expone en las reivindicaciones adjuntas.
30
Se disolvió polisacárido lineal dextrano (Sigma) en agua desionizada a una concentración final de 1 % y después se esterilizó por autoclave. Se oxidó una alícuota de 0,40 ml de solución de dextrano con 44 microlitros de peryodato
35 sódico 0,5 M durante una noche en oscuridad a temperatura ambiente en una plataforma de balanceo. El dextrano oxidado se limpió después por precipitación dos veces con NaOAc 0,3 M y 2xVol de EtOH. El sedimento se secó al aire y se volvió a disolver en 0,4 ml de tampón de NaPO4 5 mM, pH 7,2.
Se añadió un microlitro del dextrano oxidado a 7 microlitros de NaCO3 10 mM (pH 9,0) y 2 microlitros de
40 oligonucleótidos (solución 2 M en H2O) en un tubo Eppendorf. Los oligonucleótidos variaron en longitud de 25 a 45 unidades, con una amina primaria introducida en el extremo 3' o 5' durante la síntesis. La reacción se llevó a cabo durante una noche en un baño de agua a 37 °C. Se añadió NaBH4 al tubo y la mezcla se incubó adicionalmente durante 30 minutos a temperatura ambiente, después se precipitó con NaOAc 0,3 M y 2xVol de EtOH. El sedimento se disolvió en tampón TE y se resolvió una alícuota en un gel de agarosa al 1 % por electroforesis, y posteriormente
45 se tiñó con EtBr. En este sistema de detección, los oligonucleótidos libres migraron cerca del frente salino, mientras que el oligonucleótido acoplado a dextrano migró mucho más lentamente.
50 Se usaron polisacáridos ramificados de alto peso molecular, glucógeno (Sigma) y amilopectina (Sigma) para acoplar oligonucleótidos derivatizados con amina. Los grupos diol de estos polímeros se convirtieron a grupos aldehído por oxidación con NaIO4. Se añadió peryodato sódico a 0,4 ml de solución de polisacárido 1 % (en H2O) hasta una concentración final de 25 mM para glucógeno, y 20 mM para amilopectina, respectivamente. La oxidación se continuó en oscuridad durante una noche a temperatura ambiente en una plataforma de balanceo. El polisacárido
55 oxidado se precipitó después dos veces con NaOAc 0,3 M y 2xVol de EtOH para retirar el exceso de NaIO4. Después de secar al aire, los sedimentos se disolvieron en 0,4 ml de tampón de NaPO4 5 mM (pH 7,2). Se llevó a cabo acoplamiento de oligonucleótido derivatizado con amina y análisis en gel de los productos acoplados como se describe en el Ejemplo 1 para dextrano.
Se prepara la sonda conjugada del Ejemplo 2 que tiene, de media, aproximadamente 1000 moléculas oligonucleotídicas acopladas a cada molécula de glucógeno a una densidad de acoplamiento de un oligonucleótido por cada 10 monómeros de glucosa.
65
solución de bloqueo durante 10 minutos a temperatura ambiente. La superficie se aclaró después cuatro veces con dH2O esterilizada en autoclave.
Para hibridación en placa, la superficie de la microplaca se incubó con SSPE 3x/formamida al 50 %/BSA 1 mg/ml
5 durante 20 minutos a temperatura ambiente, después se hibridó con un producto de PCR (marcador de biotina en un extremo, como se describe posteriormente) en 20 ml de SSPE 3x/formamida al 50 %/BSA a 1 mg/ml (después de haberse calentado en un baño de agua hirviendo durante 2 minutos y enfriarse rápidamente a 4 ºC). La hibridación se llevó a cabo a 30 ºC durante una noche en una cámara húmeda. A continuación, la superficie de la microplaca se lavó con SSPE 0,1x a temperatura ambiente cuatro veces, 5 minutos cada vez. Para unir el conjugado de fosfatasa alcalina-estreptavidina con la biotina en el producto de PCR hibridado, la superficie de la microplaca se incubó en primer lugar con BSA 1 mg/ml en TBS a temperatura ambiente durante 20 minutos, después se incubó con Avidx-AP (Tropix) a una dilución 1:100 en TBS/BSA 1 mg/ml durante dos horas a temperatura ambiente. La superficie de la microplaca se lavó después con TBS cinco veces, 5 minutos cada vez a temperatura ambiente.
15 Para detectar la señal de hibridación en placa, la placa hija con TBS en la superficie de microplaca se insertó en el conector en la Estación de Lectura en una caja resistente a la luz. Se ejecutó un software patentando en un PC para recuperar una “imagen oscura” (es decir la imagen de fondo, Ioscura). Con la placa hija aún unida a la Estación de Lectura, se reemplazó el TBS con una solución de sustrato quimioluminiscente que incluía CDP-star y el potenciador Emerald II (ambos de Tropix) preparados de acuerdo con las especificaciones del proveedor. Se recuperó un fotograma (I) con un tiempo de integración de aproximadamente 0,1 s del sensor. Se trató I -I oscuro como una captura de señal real. El software tiene una subrutina incorporada que añade capturas procesadas sucesivas juntas y presentan el resultado como una imagen, extendiendo de este modo el tiempo de integración de señal.
Se descubrió que los siguientes ajustes de registro del sensor son óptimos en este punto:
25 Aumentos (Registros 53, y 43-46) al máximo; Tiempo de integración (Registros 9 y 10) a 0,1 segundos por fotograma; Compensación negativa análoga (Registros 32 y 57) al máximo; Etapa de ganancia (Registro 62) a
74. El resto de los Registros se dejaron en el ajuste por defecto.
Las sondas de captura y cebadores de PCR usados en el experimento descrito a continuación fueron los siguientes:
Neisseria meningitidis
Sonda de captura (1)
35 5’-amina-GGCAGAAGACGCGCTCAAACGT-TACGGTTTTTCAGAC-3’ Cebadores 5’-GACGACTACGCCTTGGAC-3’ 5’-biotina-AGACGGCGTAGTCTTCCAAA-3’ Listeria monocytogenes
Sonda de captura (2)
5’-amina-TGACCGCGTTGTAACAAAACAC-CCATTCTATGACCGTGATTC-3’
45 Cebadores 5’-GTCATCTGGACAACTACTCCTT-3’ 5’-biotina-TGTCCAGGAGCTGTATGAAC-3’ Hemophilus influenzae
Sonda de captura (3)
5’-amina-CTTCTCACTTAGGTCGTCCAACT-GAAGGAGAATTCAAACCAG-3’ Cebadores 5’-CCGTGCAGATCTTAATGTGCC-3’
55 5’-biotina-GCGCTGTACCAAAGGCATC-3’
Mycoplasma pneumoniae
Sonda de captura (4)
5’-amina-AAAGAGGAAACGCCAGCGGT-GATCTTCCGTGG-3’ Cebadores 5’-GTTAATGGTGTTGGCAAAACAAC-3’ 5’-biotina-AACCGTCCCGAGGTGTC-3’
65 Las sondas de captura se reticularon con glucógeno oxidado como se ha descrito anteriormente. Los sedimentos finales se disolvieron en NaCO3 50 mM (pH 10.5) a una concentración final de 100 pmoles/ml, y se aplicaron
5
10
15
20
25
30
- 24.
- Un método para aumentar la señal que surge de analitos en una matriz formada en un sensor de imágenes CMOS que comprende acoplar una pluralidad de sondas a una molécula seleccionada del grupo que consiste en un polisacárido, un hidrogel y un oligonucleótido ramificado.
- 25.
- Un método para detectar analitos en una matriz que comprende aumentar el tiempo de integración de marco de un sensor de imágenes CMOS, integrando de este modo la señal del analito.
- 26.
- El método del aspecto 25 que incluye además las etapas de almacenar la señal integrada y repetir la integración a intervalos temporales fijos.
- 27.
- Un dispositivo sensor que comprende, un sensor de imágenes digitales óptico; un recinto de luz baja; y una matriz de sonda conjugada.
- 28.
- El dispositivo sensor del aspecto 27 donde el sensor de imágenes digitales óptico es un sensor de imágenes CMOS.
- 29.
- El dispositivo sensor del aspecto 27 donde el recinto de luz baja comprende además una apertura de entrada fluida que tiene un septo.
- 30.
- Un sistema biosensor que comprende, una estación de lectura que tiene un primer conector; un recinto portátil que comprende un sensor de imágenes digital óptico; un recinto de luz baja; una matriz de sondas; un segundo conector para unir el recinto portátil con el primer conector, uniendo de este modo el recinto portátil con la estación de lectura.
- 31.
- El sistema biosensor del aspecto 30 donde el segundo conector es un conector de borde de circuito impreso.
- 32.
- El sistema biosensor del aspecto 30 donde la estación de lectura comprende un medio de circuito para cambio en caliente del recinto portátil.
- 33.
- El sistema biosensor del aspecto 30 que comprende además un medio para enfriar el sensor de imágenes digitales óptico.
- 34.
- Un kit que tiene partes componentes capaces de ensamblarse en un sistema de ensayo que comprende un conjugado de polisacárido acoplado a al menos una molécula de reconocimiento y al menos una molécula de señalización.
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-
imagen1
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