DE102007043834A1

DE102007043834A1 - Histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung für die Endoskopie

Info

Publication number: DE102007043834A1
Application number: DE102007043834A
Authority: DE
Inventors: Akira Yamamoto; Yusuke Iimori; Mizue Saze; Mariko Ishiguro; Yae Kurosawa; Hiroyuki Yokohama Sasaki
Original assignee: Pentax Corp
Current assignee: Hoya Corp
Priority date: 2006-09-14
Filing date: 2007-09-14
Publication date: 2008-03-27
Also published as: GB2441892B; FR2905869A1; US20080069776A1; GB0718083D0; JP2008069107A; GB2441892A

Abstract

Es wird ein histofluoreszierender Farbstoff für die Endoskopie bereitgestellt, der gegenüber innenliegenden Gewebeteilen ein gutes Fluoreszenzfärbungsvermögen aufweist. Eine histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung für die Endoskopie enthält eine Verbindung, die durch folgende Formel (1) dargestellt ist: $F1 worin R1 und R2, die identisch oder verschieden sein können, jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen und X- einen Anionrest darstellen.

Description

Die Erfindung betrifft eine histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung, die in Diagnosen unter Anwendung der Endoskopie verwendet wird.
Diagnostische Verfahren unter Anwendung der Endoskopie finden weitläufig Anwendung in der Diagnose von Krankheiten, z.B. Krebserkrankungen, Gastrointestinalgeschwüren und der Colitis ulcerosa, auf Grundlage endoskopischer Gastrointestinaluntersuchungen am oberen und unteren Gastrointestinaltrakt. Die Erfassung von Anomalien oder Schädigungen in Geweben anhand einer solchen endoskopischen Untersuchung beinhaltet üblicherweise die Betrachtung mittels eines mit sichtbarem Licht arbeitenden Endoskops mit etwa 10- bis 500-facher Vergrößerung ohne Verwendung eines Färbemittels. Mittlerweile kommt jedoch ein als Chromoendoskopie bezeichnetes Verfahren zur Anwendung, bei dem die endoskopische Beobachtung in einem Zustand durchgeführt wird, in dem eine Lösung, die einen Farbstoff enthält, zuvor über die Gewebeoberflächen gesprüht worden ist. Da es in der Chromoendoskopie möglich ist, die Morphologie der Oberfläche des Gastrointestinallumens klar und deutlich zu beobachten, können sogar mikroskopische Schädigungen anhand der Änderungen des Farbtons einfach entdeckt werden. Beispiele für Endoskope, die für die Chromoendoskopie verwendet werden können, sind ein mit sichtbarem Licht arbeitendes Endoskop und ein Fluoreszenzendoskop.
Beispiele für in der Chromoendoskopie hauptsächlich eingesetzte Farbstoffe sind Indigocarmin (Masahiro Tada, Akitada Iso, et al., (Clinical Gastroenterology, Bd. 7, Nr. 2, 1992)), das in der Beobachtung unter Anwendung des Kontrastverfahrens zum Färben des Gastrointestinallumens unter sichtbarem Licht verwendet wird; Acriflavin und Fluorescein (Gastroenterology 2004, Bd. 127, Nr. 3, Seiten 706-713) für Fluoreszenzfärbung; und dergleichen.
In der Diagnose von Krebs oder dergleichen ist es wichtig, sowohl die Oberfläche der biologischen Gewebe als auch die innenliegenden Gewebeteile zu betrachten. Um die innenliegenden Teile der biologischen Gewebe zu betrachten, wird im Allgemeinen ein Verfahren angewandt, bei dem ein mikroskopisch kleiner Teil eines durch Biopsie oder dergleichen entnommenen Gewebes im Labor in Scheiben geschnitten wird. Um den innenliegenden Teil des biologischen Gewebes in situ zu betrachten, kommen beispielsweise Verfahren wie MRI, PET, CT, ein mit weicher Röntgenstrahlung arbeitendes Verfahren und dergleichen zur Anwendung, bei denen der ganze Körper betrachtet wird. In der Gastrointestinalendoskopie sind Endoskope auf den Markt gebracht worden, die die Autofluoreszenzreaktion biologischer Gewebe nutzen. Wird Licht einer bestimmten Wellenlänge auf biologisches Gewebe gestrahlt, so geben endogene fluoreszierende Substanzen in dem Gewebe Autofluoreszenzstrahlung ab. Anhand von Intensitätsunterschieden und anhand der Spektren können so normale Gewebebereiche und geschädigte Gewebebereiche visuell betrachtet werden.
Um mit einem herkömmlichen Endoskop beispielsweise Gastrointestinalkrebs zu diagnostizieren, ist es erforderlich, den geschädigten Bereich durch Betrachtung auf empirischem Wege zu ermitteln, daraus eine Gewebsprobe herauszuschneiden und in einem separaten Labor eine Diagnose durch Färben des Gewebes durchzuführen. Nunmehr ist jedoch auch möglich, mittels eines kürzlich entwickelten konfokalen Endoskops die innenliegenden Teile eines Gewebes zu betrachten, ohne das Gewebe entfernen zu müssen.
Im Allgemeinen beruht ein konfokales Abbildungssystem auf einer Technik, bei der deutlich erkennbare Bilder innenliegender Gewebeteile ohne mechanische Schnitte erhalten werden können, indem eine Lochblende, auch als Pinhole bezeichnet, vor dem Detektor angeordnet und nur dasjenige Licht erfasst wird, das in der Schärfen- oder Bildebene innerhalb des Gewebes reflektiert wird. Bei einem solchen konfokalen Abbildungssystem wird typischerweise das mit einer fluoreszierenden Substanz gefärbte Gewebe mit Laserlicht abgetastet und ein Fluoreszenzbild des Gewebes betrachtet. Das konfokale Abbildungssystem benötigt demnach üblicherweise fluoreszierende Färbemittel.
Das konfokale Endoskop, das mit dem oben beschriebenen konfokalen Abbildungssystem arbeitet, hat sowohl eine der normalen Betrachtung dienende Optik als auch eine der konfokalen Betrachtung dienende Optik. Es ermöglicht so ein sogenanntes Screening, d.h. ein systematisches Durchtesten des geschädigten Gewebebereichs sowie eine Betrachtung von Zellen anhand von optischen Gewebeschnitten, ohne dass die Zellen herausgeschnitten werden müssen, was weniger invasiv und zudem in situ möglich ist.
Derzeit vermarktete konfokale Endoskope arbeiten mit blauem Laserlicht einer Wellenlänge von 488 nm als Lichtquelle zur Farbstoffanregung. Eine wichtige Eigenschaft, die ein in konfokalen Endoskopen zu medizinischen Zwecken eingesetzter fluoreszierender Farbstoff aufweisen muss, besteht darin, dass der fluoreszierende Farbstoff nicht toxisch ist und keine mutationsauslösende Wirkung gegenüber dem Körper aufweist. Derzeit sind deshalb fluoreszierende Farbstoffe, die zusammen mit konfokalen Endoskopen zu medizinischen Zwecken eingesetzt werden können, auf Fluorescein, das zur Augenfundusgefäßdarstellung intravenös injiziert wird, sowie auf Acriflavin beschränkt, das als antibiotische Substanz verwendet wird (Gastrointestinal Endoscopy Clin of N Am, 2005, Bd. 12, Seiten 715-731).
Was die für konfokale Endoskope verwendeten Lichtquellen betrifft, ist in Zukunft mit einer Wellenlängendiversifizierung zu rechnen. Da Licht in einem Wellenlängenbereich, der von rot bis infrarot reicht, ein größeres Durchdringungsvermögen gegenüber biologischen Geweben aufweist als blaues Licht, wird vermutet, dass mit solchem Licht konfokale Bilder an Stellen aufgenommen werden können, die tiefer als die Oberfläche des biologischen Gewebes liegen. Indocyaningrün (Icg) ist als infrarotfluoreszierende Verbindung zu Diagnosezwecken verfügbar und für die Verabreichung an den menschlichen Körper zugelassen worden. Es wird hauptsächlich für die Untersuchung der Leberfunktion und zur Augenfundusgefäßdarstellung verwendet. Wird Indocyaningrün als Färbemittel in der konfokalen Endoskopie eingesetzt, so ist es nicht möglich, damit einen Kontrast zu erzielen, wie er beispielsweise bei Verwendung von Fluorescein möglich ist, das in Gastroenterology 2004, vol. 127, Bd. 3, Seiten 706-713 beschrieben ist. Wird Indocyaningrün als fluoreszierender Farbstoff für die Endoskopie eingesetzt, so besteht weiterhin das Problem, dass es toxischer als Fluorescein ist.
Aufgabe der Erfindung ist es, eine histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung für die Endoskopie bereitzustellen, die

(1) geringe Biotoxizität aufweist,
(2) einen Kontrast liefert, um auch unter einer Weißlichtquelle Unregelmäßigkeiten auf einem Gewebe zu betonen,
(3) Fluoreszenzstrahlung aussendet, und
(4) ein gutes Fluoreszenzfärbevermögen gegenüber innenliegenden Gewebeteilen aufweist und zur Diagnose von Schädigungen in innenliegenden Gewebeteilen verwendbar ist.

Die Erfinder haben unter verschiedenartigen Aspekten Untersuchungen angestellt und sind dabei insbesondere auf die Sicherheit des Farbstoffs fokussiert gewesen. Im Ergebnis haben sie herausgefunden, dass eine Verbindung gemäß der nachfolgend angegebenen Formel (1), die durch Brillantgrün dargestellt ist, die oben genannten Anforderungen erfüllt. Sie haben auch herausgefunden, dass eine solche Verbindung als Fluoreszenzfarbstoff (fluoreszierendes Färbemittel) verwendbar ist, um innenliegende Gewebeteile selektiv zu färben, da diese Verbindung nur Fluoreszenzstrahlung aussendet, wenn sie auf ein Gewebe, insbesondere Albumin, aufgebracht wird, jedoch in wässriger Lösung keine Fluoreszenzstrahlung abgibt. Dadurch können deutlich erkennbare Fluoreszenzbilder der innenliegenden Gewebeteile erzeugt werden. Auf Grundlage dieser Erkenntnisse ist nun die Erfindung fertiggestellt worden.
Die Erfindung stellt eine histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung für die Endoskopie bereit, die eine Verbindung enthält, die durch die folgende Formel (1) dargestellt ist:
worin R¹ und R², die identisch oder verschieden sein können, jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellen und X^– einen Anionrest darstellt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, die Verwendung der durch die Formel (1) dargestellten Verbindung zur Herstellung eines histofluoreszierenden Farbstoffs für die Endoskopie anzugeben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist es, ein Verfahren anzugeben, bei dem mittels eines Endoskops durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die die durch die Formel (1) dargestellte Verbindung enthält, eine Diagnose durchgeführt und das mit der Zusammensetzung gefärbte Gewebe mit einem Endoskop betrachtet wird.

(1) Bei der Betrachtung des Gastrointestinaltrakts unter einem herkömmlichen Endoskop, das mit einer Weißlichtquelle arbeitet, erzeugt der histofluoreszierende Farbstoff nach der Erfindung, der ein blauer Farbstoff ist, im Vergleich zu roten Farbstoffen wie Fluorescein einen besonders starken Kontrast.
(2) Bei der Betrachtung mit einem Endoskop, bei dem ein Weißlichtendoskop und ein konfokales Endoskop miteinander kombiniert sind, sorgt der erfindungsgemäße Farbstoff gegenüber weißem Licht für einen blauen Kontrast, während er gegenüber rotem Licht eine gewebespezifische Fluoreszenz aufweist. Bei Verwendung des oben angegebenen Endoskops können so mittels eines einzigen Farbstoffs sowohl geschädigte Bereiche entdeckt als auch konfokale Bilder dieser Bereiche aufgenommen werden.
(3) Die Verbindung nach Formel (1) weist in einer wässrigen Lösung keine Fluoreszenz auf. Sie weist nur dann Fluoreszenz auf, wenn sie auf ein Gewebe, insbesondere Albumin, aufgebracht wird. Demzufolge färbt die Verbindung nicht den Interstitialraum zwischen den Zellen. Vielmehr ist sie in der Lage, gezielt den innenliegenden Teil des Gewebes zu färben.
(4) Bei Verwendung des erfindungsgemäßen histofluoreszierenden Farbstoffs ist ohne Entnahme des Gewebes die Visualisierung des innenliegenden Teils eines geschädigten Bereichs gleichzeitig unter endoskopischer Betrachtung unter sichtbarem Licht, Fluoreszenzstrahlung und konfokaler Betrachtung möglich. Dabei sind die Färbebilder scharf und deutlich erkennbar. Der Farbstoff ist deshalb in der Diagnose von Gastrointestinalkrankheiten und dergleichen verwendbar.

Die Erfindung wird im Folgenden anhand der Figuren näher erläutert. Darin zeigen:
1 ein Diagramm, welches das Anregungsspektrum (Abs.) und das Fluoreszenzspektrum (Emission) von Brillantgrün zeigt;
2 ein Diagramm, welches das Anregungsspektrum (Abs.) und das Fluoreszenzspektrum (Emission) von Rhodamin B zeigt;
3 ein Diagramm, welches das Fluoreszenzspektrum einer flüssigen Mischung aus Brillantgrün und Albumin zeigt;
4 ein Diagramm, welches das Fluoreszenzspektrum von Albumin zeigt;
5 einen Satz fotografischer Aufnahmen, die das Ergebnis einer Fluoreszenzfärbung eines Bereichs mit Brillantgrün bis zu einer Tiefe von 35 μm unter der luminalen Oberflächenschicht des Dickdarms zeigen;
6 eine fotografische Aufnahme, die die Ergebnisse einer Fluoreszenzfärbung eines Bereichs mit Brillantgrün in einer Tiefe von 10 μm unter der luminalen Oberflächenschicht des Dickdarms liegt; und
7 eine fotografische Aufnahme, die die Ergebnisse einer Fluoreszenzfärbung mit Brillantgrün eines Bereichs in einer Tiefe von 15 μm zeigt.
Beschreibung bevorzugter Ausführungsbeispiele
Beispiele für die Endoskopie, die in der vorliegenden Erfindung zur Anwendung kommt, sind medizinische Endoskopieverfahren wie die Gastrointestinalendoskopie, die respiratorische Endoskopie, die vaskuläre Endoskopie und die Peritoneoskopie. Unter diesen Verfahren wird die Gastrointestinalendoskopie besonders bevorzugt. Gemäß der vorliegenden Erfindung beinhalten mit sichtbarem Licht arbeitende Endoskope sämtliche Endoskope, die eine Betrachtung unter sichtbarem Licht ermöglichen, sowie konventionelle Endoskope, vergrößernde Endoskope und Chromoendoskope, bei denen eine Betrachtung unter sichtbarem Licht vorgenommen wird. Fluoreszenzendoskope beinhalten Endoskope, die die durch Bestrahlen mit Anregungslicht erzeugte Fluoreszenzstrahlung messen, und auch vergrößernde Fluoreszenzendoskope. Mit einem konfokalen Endoskop ist ein Endoskop gemeint, das mit einem konfokalen Abbildungssystem ausgestattet ist. Zudem hat ein solches konfokales Endoskop üblicherweise sowohl eine der normalen Betrachtung dienende Optik sowie eine der konfokalen Betrachtung dienende Optik.
Die histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung nach der Erfindung enthält eine Verbindung, die durch die oben angegebene Formel (1) dargestellt ist. In der Formel (1) bezeichnen R¹ und R², die identisch oder verschieden sein können, jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen. Beispiele für eine solche Alkylgruppe sind eine Methylgruppe, eine Ethylgruppe, eine n-Propylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine n-Butylgruppe und dergleichen. Unter diesen Substanzen sind eine Methylgruppe und eine Ethylgruppe bevorzugt. Außerdem stellen in einer besonders bevorzugten Ausgestaltung sowohl R¹ als auch R² eine Ethylgruppe dar.
X^– stellt einen Anionrest dar. Als Beispiel hierfür sind HOSO₃ ^– (Sulfat-Ion), ein Halogenion und dergleichen zu nennen. Unter diesen Verbindungen ist HOSO₃ ^– besonders bevorzugt.
Ein besonders bevorzugtes Beispiel der durch die Formel (1) dargestellten Verbindung ist Brillantgrün (R¹ = R² = C₂H₅, X^– = HOSO₃ ^–).
Brillantgrün wird weitläufig als farbgebender Stoff für kosmetische Produkte eingesetzt. Es ist also ein legales Färbemittel, das in kosmetischen Produkten verwendet werden darf. Die Sicherheit dieses Bestandteils ist anerkannt. Es ist jedoch nicht vollständig bekannt, dass diese Verbindung nur dann Fluoreszenzstrahlung aussendet, wenn sie an ein Protein wie Albumin gebunden ist. Außerdem ist es bisher überhaupt nicht bekannt, dass diese Verbindung die Erzeugung deutlich erkennbarer Fluoreszenzbilder innenliegender Gewebeteile nur dann ermöglicht, wenn es auf Gewebe aufgebracht wird.
Handelsübliche Produkte für Brillantgrün sind beispielsweise Brillantgrün (B4014-25G) von Sigma-Aldrich-Company. Brillantgrün ist auch unter anderen Namen erhältlich, z.B. unter Pigment Green 1 und Basic Green und mit einer Farbindexnummer C.I. 42040 angegeben.
Der Gehalt der Verbindung nach Formel (1) in dem erfindungsgemäßen Gewebefarbstoff beträgt im Hinblick auf das Färbevermögen und die Klarheit der Färbebilder vorzugsweise 0,01 bis 70 Gew.-%, noch besser 0,01 bis 50 Gew.-% und am besten 0,01 bis 20 Gew.-%.
Der Gewebefarbstoff nach der Erfindung kann in beliebiger Form eingesetzt werden, z.B. als Flüssigkeit, als Granulat oder als Tablette. Wird der Farbstoff im Gastrointestinaltrakt verteilt oder submukös verabreicht, so liegt er vorzugsweise als Flüssigkeit vor. Wird er oral verabreicht, so liegt er vorzugsweise als Flüssigkeit, Granulat, Tabletten oder dergleichen vor.
Der Gewebefarbstoff nach der Erfindung kann verschiedene Bestandteile aufweisen, die entsprechend der Formulierung miteinander vermischt sind. So können beispielsweise ein Konsistenzmittel, ein Eindickmittel, eine grenzflächenaktive Substanz, ein Süßungsmittel, ein Konservierungsmittel, ein Aromastoff, ein pH-Einstellmittel, Wasser und dergleichen eingemischt werden.
Das pH-Einstellmittel ist ein Wirkstoff, der den pH-Wert auf 5 bis 9 einstellt. Beispiele hierfür sind Salzsäure, Phosphorsäure, Zitronensäure, Malinsäure, Essigsäure und deren Salze, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumhydrogencarbonat, Tetranatriumpyrrolat und dergleichen. Außerdem können Ethanol, Wasser und dergleichen als Lösungsmittel hinzugegeben werden. Im Falle von Tabletten können Bestandteile, die üblicherweise bei Tabletten eingesetzt werden, verwendet werden, z.B. ein Bindemittel und ein Zersetzungsmittel.
Da der erfindungsgemäße Gewebefarbstoff Gewebe blau färben kann, ist er in der herkömmlichen endoskopischen Weißlichtbetrachtung verwendbar. Das vorliegend verwendete Endoskop ist ein herkömmliches Endoskop oder ein vergrößerndes Endoskop und dient der endoskopischen Betrachtung mit 10- bis 500-facher Vergrößerung.
Das Färbevermögen gegenüber Gewebe variiert ausgehend vom normalen Gewebezustand bis zu einem präkanzerösen Zustand oder einem Zustand, in dem ein Tumor vorhanden ist. Beim Färben normalen Gewebes werden die Zellmembran und das Cytoplasma der Epithelzellen im Dünndarm oder Dickdarm gefärbt. Dagegen weisen bei der Beobachtung von Tumoren individuelle Zellen Merkmale auf, wie z.B. einen Anstieg des Kernvolumens, einen Anstieg der Menge des Kernchromatins und des Hy perchromatismus, ein Anstieg der Zahl an Kernkörperchen, eine Anomalie in Zahl oder Form der Chromosome, eine basophile Zellfärbung und deren Zusammenhang mit den Proliferationseigenschaften der Zellen und dergleichen. Außerdem fügen sich in Tumorzellen eine große Zahl an Kernchromatinen nahe der Kernmembran aneinander, wodurch das endoplasmische Retikulum vereinfacht wird. Außerdem werden die Mitochondrien unregelmäßig und in ihrer Größe uneinheitlich, und es gibt eine erhöhte Menge an filamentösen Strukturen, die in den Zellen erzeugt werden.
Die Gewebefarbstoffzusammensetzung nach der Erfindung wurde durch Beobachtung gefunden, vornehmlich zu dem Zweck, eine gute Färbung der Epithelzellen und des Cytoplasmas zu gewährleisten und dabei den Interstitialraum praktisch nicht zu färben. Auf diese Weise können die Morphologie der Zellen in dem Gewebe oder die Eigenschaften der zellularen Anordnung erfasst werden. Die Farbstoffzusammensetzung ist sehr gut zusammen mit einem Endoskop verwendbar, das den auf die Farbstoffzusammensetzung ausgelegten Wellenlängenbereich nutzt, da Anomalien in Geweben und Zellen für die Betrachtung durch ein konfokales Abbildungssystem geeignet sind. Da der Zellkern nicht gefärbt wird, ist ein Nachweis, wie oben beschrieben, im Falle eines präkanzerösen Zustands oder dergleichen leichter möglich.
Die Farbstoffzusammensetzung nach der Erfindung hat außerdem die Eigenschaft, Fluoreszenzstrahlung nur für gebundene Gewebe auszusenden. Die benötigte Information kann so auch erhalten werden, ohne eine Spülung mit einer Lösung vornehmen zu müssen. Unter diesem Gesichtspunkt kann man auch sagen, dass die Signifikanz der mit dem erfindungsgemäßen Farbstoff erhaltenen Information hoch ist.
Wie die folgenden Beispiele zeigen, zeichnet sich die Verbindung nach Formel (1) gegenüber anderen Färbemitteln dadurch aus, dass sie in einem Lösungszustand keine Fluoreszenzstrahlung aussendet, jedoch bei Verteilung in dem Körperlumen Fluoreszenzstrahlung aussendet, und dass sie deutlich erkennbare, fluoreszenzgefärbte Bilder innenliegender Gewebeteile liefert. Deshalb ist der erfindungsgemäße Farbstoff sehr gut für die Endoskopie als histofluoreszierender Farbstoff verwendbar.
Hat das mit einer konfokalen Optik arbeitende Endoskop sowohl eine für die normale Betrachtung bestimmte Optik als auch eine für die konfokale Betrachtung bestimmte Optik, so kann sowohl die Oberfläche als auch der innenliegende Teil des Gewebes ohne Entfernen des Gewebes in dem geschädigten Bereich einer Diagnose unterzogen werden, indem dieser geschädigte Bereich zunächst unter normalem Licht visuell betrachtet wird und dann mit Erreichen der fraglichen Läsion mit einem konfokalen Endoskop fluoreszenzgefärbte Querschnittsbilder des innenliegenden Gewebeteils (beispielsweise bis zu 250 μm) betrachtet werden. Die Morphologie von Zellen oder Kernen eines biologischen Gewebes kann so in lebendem Zustand betrachtet werden. Im Ergebnis ist so eine Diagnose von Gastrointestinalerkrankungen wie einem präkanzerösen Stadium, Krebs, Geschwüren und der Colitis ulcerosa sicher, schnell und minimalinvasiv möglich. Auch kann die Genauigkeit, mit der die Diagnose durchgeführt wird, deutlich verbessert werden.
Bei einer solchen endoskopischen Beobachtung kann der erfindungsgemäße Gewebefarbstoff direkt in dem Gastrointestinallumen verteilt oder submukös verabreicht werden. Außerdem kann er auch oral oder intravenös verabreicht werden.
Beispiele
Die Erfindung wird im Folgenden genauer anhand von Beispielen beschrieben. Jedoch ist die Erfindung nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
Brillantgrün (hergestellt von Sigma-Aldrich Company, B4014-25G) wurde mit destilliertem Wasser auf eine Konzentration von 0,001 mg/ml eingestellt. Die Lichtabsorbanz wurde mittels eines Spektrofotometers (hergestellt von Shimadzu Corporation, BioSpec-1600) über einen Wellenlängenbereich von 200 bis 750 nm kontinuierlich gemessen, um die Wellenlänge zu bestimmen, bei der die Absorption maximal war. Dann wurde eine Bestrahlung mit der so erhaltenen Wellenlänge maximaler Absorption von 625 nm als Anregungslicht durchgeführt und die Wellenlänge des gestreuten Lichtes, das in der Richtung senkrecht zur Lichtachse des Anregungslichtes erfasst wurde, mittels eines Fluoreszenzspektrofotometers (hergestellt von Shimadzu Corporation, RF-1500) gemessen, um so eine Wellenlänge maximaler Fluoreszenz von 625 nm zu erhalten. Die maximale Anregungswellenlänge, die mit diesem Fluoreszenzspektrofotometer gemessen wurde, betrug 627 nm. 1 zeigt die Wellenlänge maximaler Anregung und die Wellenlänge maximaler Fluoreszenz, die mit dem Fluoreszenzfotometer gemessen wurden.
Im Ergebnis wurde von dem als Lösung zubereiteten Farbstoff keine Fluoreszenz erfasst. Der gleiche Test wurde an Brillantblau FCF durchgeführt, das als blauer Lebensmittelfarbstoff weitläufig Verwendung findet.
Im Ergebnis stellte sich heraus, dass Brillantblau FCF eine Wellenlänge maximaler Absorption von 629 nm, eine Wellenlänge maximaler Anregung von 619 nm und eine Wellenlänge maximaler Fluoreszenz von 650 nm aufwies. Im gleichen Wellenlängenbereich ergab sich ein deutlicher Unterschied in der Fluoreszenzintensität. Für Brillantgrün stellte sich heraus, dass es unter einer Lichtquelle, die im roten Wellenlängenbereich abstrahlt, keine Fluoreszenzstrahlung aussendet.
Bei Messung mit einem Fluoreszenzfotometer zeigte Brillantgrün keinen Unterschied zwischen der Wellenlänge maximaler Absorption und der Wellenlänge maximaler Fluoreszenz. Dies impliziert, dass die Verbindung nicht dem Prozess der Anregung durch eingestrahltes Licht und der Emission von Fluoreszenzstrahlung unterzogen wurde.
Wird jedoch biologisches Gewebe aus dem Dickdarm oder dergleichen mit Brillantgrün gefärbt und unter bestimmtem Laserlicht angeregt, so ist eine Betrachtung anhand intensiver Fluoreszenzstrahlung möglich.
Zum Vergleich mit Brillantgrün wurde das Wellenlängenmuster von Rhodamin B gemessen, das die innenliegenden Teile von Zellen im Lumen des Dickdarms oder dergleichen in gleicher Weise färbt wie Brillantgrün. Es konnte bestätigt werden, dass Rhodamin B auch im gelösten Zustand intensive Fluoreszenz zeigte, wie aus 2 hervorgeht.
Beispiel 2
Brillantgrün (hergestellt von Sigma-Aldrich Company, B4014-25G) wurde unter Verwendung von destilliertem Wasser als Lösung mit 0,1 mg/ml zubereitet. Albumin (aus Rinderserum, globulinfrei; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 013-15104) wurde unter Verwendung physiologischer Kochsalzlösung als Lösung mit 2,0 mg/ml zubereitet. Unter Verwendung einer 0,1 M-Pufferlösung (pH 5) und der oben angegebenen 2,0 mg/ml Albumin-Lösung wurde eine flüssige Mischung aus 0,01 mg/ml Brillantgrün und Albumin zubereitet. Dann wurde eine Bestrahlung mit der Wellenlänge maximaler Absorption durch Brillantgrün von 625 nm als Anregungswellenlänge vorgenommen und die Wellenlänge des gestreuten Lichtes, das in der Richtung senkrecht zur Lichtachse des Anregungslichtes erfasst wurde, unter Verwendung eines Spektrofotometers (hergestellt von Shimadzu Corporation, RF-1500) gemessen. Die Wellenlänge maximaler Fluoreszenz betrug 651 nm. 3 zeigt die mit einem Fluoreszenzfotometer gemessene Wellenlänge maximaler Fluoreszenz.
Zum Vergleich mit der flüssigen Mischung aus Brillantgrün und Albumin wurde die Wellenlänge maximaler Fluoreszenz einer Albuminlösung bezüglich einer Anregungswellenlänge von 625 nm gemessen, wie in 4 gezeigt ist. Da das Spektrum keinen Unterschied zwischen der Anregungswellenlänge und der Fluoreszenzwellenlänge zeigte, stellte sich heraus, dass Albumin selbst keine Fluoreszenzstrahlung bei einer Anregungswellenlänge von 625 nm aussendete.
Aus diesen Tatsachen konnte abgeleitet werden, dass Brillantgrün unter einer Lichtquelle, die im roten Wellenlängenbereich abstrahlt, im Zustand wässriger Lösung keine Fluoreszenz aussendet, jedoch bei Bindung an Albumin Fluoreszenz aussendet.
Beispiel 3
Brillantgrün (hergestellt von Sigma-Aldrich Company, B4014-25G) wurde unter Verwendung von destilliertem Wasser als Lösung zubereitet, wobei die Konzentration auf 1,0 mg/ml eingestellt wurde.
Eine Maus (ddY, 13 Wochen alt, männlich) wurde unter Anästhesie einer Laparotomie unterzogen. Ihr Dickdarm wurde entnommen. Unmittelbar nach der Entnahme wurde die zubereitete Lösung aus Brillantgrün auf den Dickdarm aufgebracht und eine Fluoreszenzbetrachtung der Probe mit einem konfokalen Abbildungssystem durchgeführt, das mit einem konfokalen Mikroskop arbeitet (hergestellt von Leica Corp., TCPSP2). Dabei wurden das Färbevermögen, das Durchdringungsvermögen sowie die Fluoreszenzeigenschaften von Brillantgrün untersucht.
Die Betrachtung wurde an Querschnitten in Abständen von 5 μm von der luminalen Oberflächenschicht der Fleischprobe in Tiefenrichtung vorgenommen (vergl. 5).
Wie 5 zeigt, war eine Betrachtung in ausreichender Qualität bis zu einer Tiefe von 35 μm möglich. Somit ist eine Betrachtung in Tiefenrichtung auch durch Einstellen von Verstärkungswerten und dergleichen möglich.
6 zeigt ein Querschnittsbild an einer Stelle, die 10 μm tief unter der Oberflächenschicht liegt. 7 zeigt ein Querschnittsbild an einer Stelle, die 15 μm tief unter der Oberflächenschicht liegt. Das Cytoplasma ist gut gefärbt, während der Interstitialraum kontrastdunkel ist. Somit ist eine sehr gute Beobachtung der Morphologie oder des Zustands der Zellen möglich.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die eine durch die Formel (1) dargestellte Verbindung enthält,
zur Herstellung eines histofluoreszierenden Farbstoffs für die Endoskopie, worin R¹ und R² jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellen und X^– einen Anionrest darstellt.
Verwendung nach Anspruch 1, bei der R¹ und R² jeweils eine Ethylgruppe sind.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, bei der X^– durch HOSO₃ ^– gegeben ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei der das Endoskop ein konfokales Endoskop ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei der der histofluoreszierende Farbstoff oral, direkt in den Gastrointestinaltrakt oder submukös verabreicht wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei der die Oberfläche des Gastrointestinallumens und/oder die innenliegenden Teile von Zellen des Gastrointestinallumens gefärbt werden.
Histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung für die Endoskopie, umfassend eine Verbindung, die durch folgende Formel (1) dargestellt ist:
worin R¹ und R² jeweils eine Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellen und X^– einen Anionrest darstellt.
Histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 7, bei der R¹ und R² jeweils eine Ethylgruppe sind.
Histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung nach Anspruch 7 oder 8, bei der X^– durch HOSO₃ ^– gegeben ist.
Histofluoreszierende Farbstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, bei der das Endoskop ein konfokales Endoskop ist.