WO2012173003A2 - 医療用組織マーカー及びその製造方法 - Google Patents

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Abstract

　臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能であって、かつ、マーキングした位置の臓器全体の中での位置の把握が容易となる医療用組織マーカー及びその製造方法を提供する。　そのため、本発明にかかる医療用組織マーカーは、リン脂質及び近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルと、前記リン脂質及びＸ線造影剤が複合して形成されたエマルションを含み、前記ベシクルと前記エマルションを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたクラスターを有する。

Description

医療用組織マーカー及びその製造方法
　本発明は、医療用組織マーカー及びその製造方法に関する。
　近年、内視鏡を用いた手術が発展し、診断・治療の手法として多く利用されるようになってきている。上記手術において、組織マーカーは極めて有用である。組織マーカーとは、診断・治療するために必要な部位にマーキングを施すものであり、マーキングを施すことで診断・治療するための部位を簡便に特定することができるようになる。
　公知の組織マーカーに関する技術としては、例えば、インドシアニングリーンに関する技術が、例えば下記非特許文献１乃至６、特許文献１及び２（以下これらを「文献」という。）に記載されている。下記文献には、インドシアニングリーンとゼラチンとを混合して作製した組織マーカーを用い、内視鏡カメラによって可視領域の吸収を観察したことが開示されている。
　Ｘ線造影剤を組織マーカーとして用いる技術としては、例えば、ヨード化ケシ油エチルエステルに関する技術が、下記非特許文献７に記載されている。下記文献には、ヨード化ケシ油エチルエステルとリン脂質とを混合して作製した組織マーカーの安定性が、リン脂質を用いない場合に比べて向上したことが開示されている。
　また、下記特許文献３には、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたベシクルクラスターを有する医療用組織マーカーが開示されている。
草野満夫編著，ＩＣＧ 蛍光Ｎａｖｉｇａｔｉｏｎ Ｓｕｒｇｅｒｙのすべて，インターメディカ，２００８． Ｓ．Ｙｏｎｅｙａｅｔ ａｌ，Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ Ｏｐｈｔａｌｍｏｌｇｙａｎｄ Ｖｉｓｕａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ１９９８；３９：１２８６－１２９０． Ｓ．Ｉｔｏｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ２００１；３３：８４９－８５３ Ｒ．Ａｓｈｉｄａｅｔ ａｌ，Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ ２００６；３８：１９０－１９２． Ｓ．Ｔａｏｋａｅｔ ａｌ，Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｅｎｄｏｓｃｏｐｙ１９９９；１１：３２１－３２６． Ｊ．Ｖ．Ｆｒａｎｇｉｏｎｉ，ＣｕｒｒｅｎｔＯｐｉｎｉｏｎ ｉｎＣｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２００３；７：６２６－６３４． 安康晴博、Ｌｅｃｉｔｈｉｎ配合ｌｉｐｉｏｄｏｌ　ｅｍｕｌｓｉｏｎを用いた肝動脈化学塞栓療法の基礎的研究、東京女子医大誌、１９９０；６０：９９９－１０１０． 特開２００７－２６２０６２号公報 特開２００８－６９１０７号公報 特開２０１０－２６６２９５号公報
　しかしながら、上記非特許文献１乃至６、特許文献１及び２に記載の技術は、マーキングした組織部位の大雑把な把握には有用であるものの、切除すべき最低限の組織範囲を正確に決める指標として用いることは容易でない。具体的に説明すると、上記文献に記載の技術では、内視鏡により臓器内側の組織及び当該組織にマーキングされたマーカーを直接観察することができるものの、可視領域の光を殆ど通さない臓器の外側からの観察で臓器内側のマーキング位置を確認し、必要な部分のみを切除しようとする場合等に困難性がある。また、ＩＣＧを単にゼラチンと混合して使用しただけでは、体内組織内における血管を通じて早期に拡散してしまい、マーキングした位置の特定が困難になってしまう。
　これら課題は、マーカーとしての機能において改善の余地があることを意味する。すなわち、生体透過率が高い近赤外領域の蛍光が弱く可視光の吸収に大きく依存したマーカーでは、臓器内側からマーキングしたとしても外側から発見することが困難であり、また、マーカーがすぐに拡散してしまうと、マーキング箇所が拡散して広くなる結果、体内組織を必要以上切除しなければならず、患者に対する負担が大きくなってしまう。
　一方で、上記特許文献３に記載の技術によると上記課題を解決することができる。しかしながら、上記特許文献３に記載の技術ではマーキングした位置の臓器全体の中での位置の把握が容易ではなく、例えばＸ線ＣＴを用いた画像診断による臓器全体の中でのマーキング位置の把握が容易となれば、手術前の術前シミュレーションや術中のナビゲーションにもつなげることができると期待される。
　また上記非特許文献７に記載の技術は、難水溶性のヨード化ケシ油エチルエステルをリン脂質で保護することで、ヨード化ケシ油エチルエステルの水中での分散性をよくすると同時に、生体滞留性を向上させるといった利点がある。しかしながら、この分散液は流動性が高いために、臓器へマーキングすると定着性が低く、マーキング箇所から染み出すといった課題が残る。
　そこで、本発明は、上記課題を鑑み、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能であって、かつ、マーキングした位置の臓器全体の中での位置の把握が容易となる医療用組織マーカー及びその製造方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決する本発明の一観点に係る医療用組織マーカーは、リン脂質及び近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルと、リン脂質及びＸ線造影剤が複合して形成されたエマルションとを含み、ベシクルとエマルションを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたクラスターを有する。
　また、本発明の他の一の手段に係る医療用組織マーカーの製造方法は、第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素、Ｘ線造影剤及びリン脂質を加えて攪拌し、疎水性溶媒に、第一の親水性溶媒、乳化剤を加えて懸濁液を形成し、懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する。
　以上、本発明により、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能であって、かつ、マーキングした位置の臓器全体の中での位置の把握が容易となる医療用組織マーカー及びその製造方法を提供することができる。
実施形態に係るクラスターのイメージ図である。 実施形態に係るベシクルのイメージ図である。 実施形態に係るエマルションのイメージ図である。 実施形態に係るクラスターの製造方法の工程の概略を示す図である。 実施形態に係るクラスターの製造方法の工程を示す図である。 実施形態に係るクラスターのイメージ図である。 実施例に係るクラスターの明視野顕微鏡像を示す図である。 実施例に係るクラスターの蛍光顕微鏡像を示す図である。 実施例に係るクラスターの明視野顕微鏡像（２７時間後）を示す図である。 実施例に係るクラスターの蛍光顕微鏡像（２７時間後）を示す図である。 実施例に係るクラスターのＸ線造影の結果を示す図である。 実施例に係るクラスターを注入した場合のブタの胃内壁側の写真図である。 実施例に係るクラスターを注入した場合のブタの胃外側の写真図である。 実施例に係るクラスターを注入した場合のブタの胃外側の蛍光像である。 比較としてＩＣＧ水溶液を注入した場合のブタの胃外側の蛍光像である。 実施例に係るクラスターを注入した場合（２４時間後）のブタの胃外側の蛍光観察の結果を示す図である。 実施例に係るクラスターの注入量を５０μＬとした場合における蛍光像である。 実施例に係るクラスターの注入量を１００μＬとした場合における蛍光像である。 実施例に係るクラスターの注入量を２００μＬとした場合における蛍光像である。 実施例に係るクラスターの注入量を３００μＬとした場合における蛍光像である。 実施例に係るクラスターを注入した後（３２時間後）、ブタの胃を取り出して蛍光観察を行った結果を示す図である。 実施例に係るクラスターを注入した後（３２時間後）、ブタの胃を取り出してＣＴ撮像を行った結果を示す図である。 ＩＣＧ濃度及び卵黄レシチンの濃度を変化させた場合の蛍光強度の変化を示す図である。 実施例２において作製したベシクルを分散液の状態でＣＴ撮影を行った場合のＸ線像を示す図である。 実施例３において作製したクラスターをブタの胃粘膜下層に局注した結果を示す図である。
　以下、本発明を実施するための形態について図面を用いて詳細に説明する。ただし、本発明は多くの異なる形態による実施が可能であり、以下に示す実施形態、実施例の例示にのみ限定されるものでない。
（実施形態１）
（医療用組織マーカー）
　本実施形態に係る医療用組織マーカーは、リン脂質と近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルと、リン脂質とＸ線造影剤とが複合して形成されたエマルションを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたクラスター（以下「クラスター」という。）を有する。図１は、本実施形態に係る医療用組織マーカーにおけるクラスター１のイメージ図であり、図２は、クラスター１に含まれるベシクル２のイメージ図であり、図３は、クラスター１に含まれるエマルション３のイメージ図である。
　まず図２で示すように、本実施形態に係るベシクル２は、リン脂質２１と、近赤外蛍光色素２２と、を有して形成されている。ここでベシクルとは、リン脂質が分子間力により自己集合することで形成される袋状の二分子膜をいう。そして近赤外蛍光色素２２は、リン脂質２１と複合化され、ベシクルの構成要素となっている。ここで「複合」とは、主に疎水性相互作用の分子間相互作用によってベシクルと複合体を形成する状態もしくは、ベシクルの内部に溶解している状態を意味する。近赤外蛍光色素２２をリン脂質２１に複合させることで、本実施形態に係るベシクルは近赤外蛍光色素２２を安定化させ、近赤外領域において蛍光を安定的に発することができるようになる。
　なお本実施形態においてリン脂質２１は、ベシクルを形成することができるものである限りにおいて限定されるわけではないが、例えばレシチン、フォスファチジルコリン及びこれらのうちの二以上の混合物を用いることができる。なおレシチンとしては、限定されるわけではないが、卵黄レシチン、大豆レシチン又はこれらの混合物を例示することができるが、体内における蛍光強度の関係から、リン脂質は卵黄レシチンが好適である。
　またフォスファチジルコリンの場合、上記の要求を満たす限りにおいて限定されるわけではないが、例えば１－パルミトイル－２－オレオイル－３－ｓｎ－グリセロフォスファチジルコリン、１－ステアリル－２－オレオイル－３－ｓｎ－グリセロフォスファチジルコリン、１－パルミトイル－２－リノレイル－３－ｓｎ－グリセロフォスファチジルコリン、１－ステアリル－２－リノレイル－３－ｓｎ－グリセロフォスファチジルコリン、１，２－ジオレオイル－３－ｓｎ－フォスファチジルコリン、１，２－ジパルミトイル－３－ｓｎ－グリセロフォスファチジルコリン、１，２－ジステアリル－３－ｓｎ－グリセロフォスファチジルコリン、１，２－ジリノレイル－３－ｓｎ－グリセロフォスファチジルコリン及びこれらのうちの二以上の混合物を用いることができる。
　また本実施形態において、近赤外蛍光色素２２は、インドシアニングリーンやブリリアントグリーンやインジゴカルミンそのものを含み、その誘導体を含む。近赤外蛍光色素とは、インドシアニングリーンやブリリアントグリーンやインジゴカルミンの主要な骨格及び機能を維持しつつその一部を他の官能基等で置換した化合物をいう。なお、インドシアニングリーンは下記式（１）で示され、ブリリアントグリーンは下記式（２）で示され、インジゴカルミンは下記式（３）で示される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本実施形態におけるベシクル２の大きさとしては、特に限定されないが、一般に１０ｎｍ以上１００μｍ以下となっていることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍ以上１０μｍ以下である。
　本実施形態のベシクル２において、含まれるリン脂質２１及び近赤外蛍光色素２２の量は、適宜調整可能であり限定されるわけではないが、例えば、リン脂質であるレシチンの重量を１とすると、近赤外蛍光色素であるインドシアニングリーンは、１×１０－４以上１×１０－３以下であることが好ましく、４×１０－３以上６×１０－３以下であることがより好ましい。１×１０－４以上１×１０－３以下とすることで、臓器内部のマーキングされた組織部分を臓器外部からより容易に認識することができるといった利点があり、４×１０－３以上６×１０－３以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　また図３で示すように、本実施形態に係るエマルション３は、リン脂質３１と、Ｘ線造影剤３２と、を有して形成されている。ここでエマルション３とは、リン脂質３１が分子間力により自己集合することで形成される分子膜をいう。そしてＸ線造影剤３２は、リン脂質３１と複合化され、エマルションの構成要素となっている。なおここで「複合」とは、主に疎水性相互作用の分子間相互作用によってリン脂質と複合体を形成する状態もしくは、エマルションの内部に溶解している状態を意味する。Ｘ線造影剤３２をリン脂質３１に複合させることで、本実施形態に係るエマルションはＸ線造影剤３２を安定化させ、Ｘ線ＣＴ造影を好適に行うことができるようになる。
　なお本実施形態においてリン脂質３１は、上記ベシクルにおけるリン脂質２１と同様である。
　また本実施形態において、Ｘ線造影剤３２は、限定されるわけではないが、ヨード化ケシ油エチルエステル及びその誘導体、ヨードベンゼン及びその誘導体、またはバリウム塩であることが好ましい。ヨード化ケシ油エチルエステルは、ケシ油脂肪酸をヨード化及びエステル化することで得られる化合物であり、例えば下記式（４）で表すことができる。なお、限定されるわけではないが、ヨード化ケシ油エチルエステル及びその誘導体、ヨードベンゼン及びその誘導体、またはバリウム塩又はこれらの混合物を例示することができるが、臓器におけるＸ線吸収率の関係から、Ｘ線造影剤はヨード化ケシ油エチルエステルが好適である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
　本実施形態におけるエマルション３の大きさとしては、特に限定されないが、一般に１０ｎｍ以上１００μｍ以下となっていることが好ましく、より好ましくは１００ｎｍ以上１０μｍ以下である。
　本実施形態のエマルション３において、含まれるリン脂質３１及びＸ線造影剤３２の量は、適宜調整可能であり限定されるわけではないが、例えば、リン脂質であるレシチンの重量を１とすると、Ｘ線造影剤であるヨード化ケシ油エチルエステルは、１×１０－１以上１×１０３以下であることが好ましく、２×１０－１以上２×１０１以下であることがより好ましい。１×１０－１以上１×１０３以下とすることで、ヨード化ケシ油エチルエステルのエマルションの表面をリン脂質の膜で十分に保護できるといった利点があり、２×１０－１以上２×１０１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　また図１で示すように、本実施形態に係るクラスター１は、親水性溶媒４が内包されたカプセル５を、乳化剤により複数形成、凝集させものとなっている。なお親水性溶媒４には、上記ベシクル２及びエマルション３の少なくともいずれかが内包されている。
　親水性溶媒４は、ベシクル３、エマルション３を安定的に内包するために用いるものであり、この限りにおいて限定されるわけではないが、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらのうち二以上の混合物であることが好ましい。なお、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液の場合、ｐＨ６．５以上８以下であることが好ましい。
　また親水性溶媒４には、体内組織のマーキングされた位置で長時間安定して留まることが可能となるよう、食用増粘剤を加えておくことが好ましい。食用増粘剤の種類としては、限定されるわけではないが、例えばゼラチン、寒天、フィブリノーゲン、糖類及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
　ゼラチンの場合、限定されるわけではないが、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、コラーゲンＶ型及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
　寒天の場合、限定されるわけではないが、分子量が数千～数万のアガロース、アガロペクチン及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
　フィブリノーゲンの場合、限定されるわけではないが、濃度５ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬのフィブリノーゲンを主成分とし、塩化カルシウム、プロトロンビン及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
　糖類の場合、限定されるわけではないが、例えばグルコース、スクロース、マントース、ガラクトース、アラビノース、リブロース、フルクトース、ルトース、マンノース、スクロース、マルトース、ラクトース、セロビオース及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
　また、食用増粘剤を添加する量としては、限定されるわけではないが、カプセルに含まれる親水性溶媒の重量を１とすると、１×１０－３以上１０以下であることが好ましく、１×１０－１以上１以下とすることがより好ましい。１×１０－３以上とすることで親水性溶媒３の粘度を向上することができるといった効果があり、１×１０－１以上とすることでこの効果がより顕著となる。また１０以下とすることで親水性溶媒３の流動性低下を抑制できるといった効果があり、１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　また、本実施形態において、親水性溶媒に加える近赤外蛍光色素、Ｘ線造影剤及びリン脂質の重量の比（ベシクル、エマルションの重量の比）は、医療用組織マーカーとして十分な蛍光強度を確保することができ、十分にＸ線造影を行うことができる限りにおいて限定されるわけではないが、１００：１以上１：１００以下、より好ましくは１０：１以上１：１以下の範囲である。１００：１以上とすることで蛍光強度とＸ線吸収率がバックグラウンドである臓器のそれより高めることができるといった効果があり、１０：１以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１：１００以下とすることで蛍光に対するＸ線吸収による干渉抑制する効果があり、１：１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　また、本実施形態において、親水性溶媒に加える近赤外蛍光色素、Ｘ線造影剤及びリン脂質の合計の重量（ベシクル、エマルションの重量）は、医療用組織マーカーとして十分な蛍光強度を確保することができ、十分にＸ線造影を行うことができる限りにおいて限定されるわけではないが、親水性溶媒の重量（食用増粘剤等を含む場合はそれを含む重量）を１とした場合に、１×１０－４以上１×１０－１以下、より好ましくは１×１０－３以上１×１０－２以下の範囲である。１×１０－４以上とすることでマーカーの蛍光強度やＸ線吸収率を向上することができるといった効果があり、１×１０－３以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１×１０－１以下とすることで親水性溶媒中でベシクルやエマルションではなくラメラ相に変化することを抑制する効果があり、１×１０－２以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　また、本実施形態において、乳化剤は、親水性溶媒を内包するカプセルの壁部を形成すると共に、これらをクラスターとして凝集させるために用いられるものである。そして本実施形態における乳化剤は、カプセルの壁部を形成するだけでなくクラスター全体を覆う表皮をも形成することができ、複数のカプセルを凝集、結合させることができる。本実施形態に係る乳化剤としては、限定されるわけではないが、例えばポリグリセリルポリリシノレート、ポリグリセリルポリリシノレート誘導体、グリセリン脂肪酸エステル誘導体およびこれらのうち二以上の混合物を用いることができる。
　また、本実施形態において、カプセル形成のために加えられる乳化剤の重量は、限定されるわけではないが、例えば親水性溶媒（近赤外蛍光色素、Ｘ線造影剤及びリン脂質の合計の重量を含み、食用増粘剤等を含む場合はそれを含む）の量を１とした場合、１×１０－３以上１以下であることが好ましく、より好ましくは１×１０－２以上１×１０－１以下である。１×１０－３以上とすることで親水性溶媒のカプセルを安定に乳化剤がつくることができるといった効果があり、１×１０－２以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１以下とすることで乳化剤と疎水性溶媒と第一親水性溶媒とがゲル層を形成する反応を抑制するといった効果があり、１×１０－１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　なお本実施形態において、クラスターの粒径としては、医療用組織マーカーとしての機能を保持することができる限りにおいて限定されないが例えば５０μｍ以上５００μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ以上２５０μｍ以下である。５０μｍ以上とすることでマーカーが生体内で分解されにくくマーカーからの蛍光強度を向上することができ、１００μｍ以上とすることでこの効果がより顕著となる。また５００μｍ以下とすることで内視鏡を通じて注射する針が詰まることを抑制することができ、２５０μｍ以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　また本実施形態において、１つのクラスター内におけるカプセルの数は、組織マーカーとしての機能を維持することができる限りにおいて限定されないが例えば１個以上１０３個以下であることが好ましく、より好ましくは１０個以上１０２個以下である。１個以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上するといった効果があり、１０個以上とすることでこの効果がより顕著となる。また１０３個以下とすることでカプセルの強度の向上とマーカーが安定化するといった効果があり、１０２個以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　また、本実施形態における医療用組織マーカーは、クラスターを保持するために、例えば疎水性溶媒を用い、この疎水性溶媒にクラスターを保持させることが好ましい。このようにすることで、カプセルを複数形成して凝集させることができるようになるといった効果がある。またもちろん、上記溶媒のほか、医療用組織マーカーの機能を安定又は増強させるために他の要素、例えば疎水性高分子等を加え架橋することができる。
　以上、本実施形態に係る医療用組織マーカーにより、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能であって、かつ、マーキングした位置の臓器全体の中での位置の把握が容易となる。
　より具体的に説明すると、本実施形態に係る医療用組織マーカーは、近赤外蛍光色素がベシクルに結合しているため近赤外の蛍光を強く安定に発することが可能となるとともに、Ｘ線造影剤がエマルションを形成しているため、Ｘ線造影が可能となる。しかも、ベシクル、エマルション双方を親水性溶媒に内包しそのカプセルを含んでクラスターとして形成するため、臓器へ打ち込んで生体内の組織液に接してもカプセルどうしが解離しにくく、長期にわたって局所的に留まるといった利点があり、更にクラスターのカプセルに食用増粘剤を用いるため、局所的に長期に留まるだけの強度をもちつつ、内視鏡の流路を経て臓器へ注射される柔軟性を有するといった利点がある。
（クラスターの製造方法）
　ここで、上記医療用組織マーカーの製造方法（以下「本製造方法」という。）の一例について、詳細に説明する。図４は、本製造方法の概略を示す図である。
　本図で示すように、本製造方法は、（１）第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素、Ｘ線造影剤及びリン脂質を加えて攪拌し、（２）疎水性溶媒に、上記第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成し、（３）懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離することを特徴とする。
（１）第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素、Ｘ線造影剤及びリン脂質を加えて攪拌する工程によると、近赤外蛍光色素が複合したリン脂質を含むベシクル、Ｘ線造影剤が複合したリン脂質を含むエマルションを形成することができるようになる。本実施形態ではこの作業を一度に行うことができ、撹拌するための大型装置は不要であるといった利点がある。もちろん、ベシクルを形成する工程、エマルションを形成する工程を別々に行い、その溶液を混合させて一つの溶液としてもよい。その場合、ベシクルを形成する工程、エマルションを形成する工程は、リン脂質を加えて撹拌する工程に限定されるものではなく、有機溶媒や超臨界流体を用いてリン脂質と混合した後に減圧処理によって溶媒を除去する工程、リン脂質を加えて超音波処理やフィルター処理を施す工程としてもよい。しかし、無有機溶媒による生体親和性の向上と、リン脂質の安定性の観点から、リン脂質を加えて撹拌する工程が好ましい。
　この工程において、第一の親水性溶媒は、上記カプセルの内部に存在する親水性溶媒と同一のものを採用することがカプセル４を容易に形成する観点から好ましい。すなわち水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらのうち二以上の混合物であることが好ましい。
　また、第一の親水性溶媒には、食用増粘剤を含ませることも好ましい。含ませる食用増粘剤は、上記の通り、ゼラチン、寒天、フィブリノーゲン、糖類及びこれらのうちの二以上の混合物を挙げることができる。
　また、第一の親水性溶媒の量に対する近赤外蛍光色素、Ｘ線造影剤及びリン脂質の量は、限定されるわけではないが、カプセル内に存在する親水性溶媒における近赤外蛍光色素、Ｘ線造影剤及びリン脂質との重量関係と同様の範囲とすることが好ましい。すなわち、例えば、第一の親水性溶媒の重量（食用増粘剤等を含む場合はそれを含む重量）を１とした場合に、１×１０－４以上１×１０－１以下、より好ましくは１×１０－３以上１×１０－２以下の範囲である。１×１０－４以上とすることでマーカーからの蛍光強度を向上することができ、かつ、十分にＸ線造影を行うことができるといった効果があり、１×１０－３以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１×１０－１以下とすることで親水性溶媒中でベシクルやエマルションではなくラメラ相に変化することと抑制する効果があり、１×１０－２以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　また、この工程を行なう温度は、ベシクル及びエマルションを形成することができる限りにおいて限定されるわけではないが、４℃以上８０℃以下であることが好ましく、室温程度で行なうことが簡便でありより好ましい。またこの工程において、第一の親水性溶媒を攪拌する時間も、ベシクル、エマルションを形成することができる限りにおいて限定されるわけではないが、５分以上１時間以内であることが好ましく、より好ましくは１０分以上３０分以下である。
　（２）疎水性溶媒に、第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成する工程によると、ベシクル、エマルションを内包させた第一の親水性溶媒の周囲に乳化剤を取り囲ませ、疎水性溶媒中にカプセル状のエマルションを多数形成させることができる。
　本工程おいて、疎水性溶媒は、４℃以上８０℃以下でカプセル状のエマルションができる限りにおいて限定されるわけではないが、例えばケロシン、ヘキサン、デカン、ドデカン、ヘプタン、スクアレン、スクアラン、流動パラフィン、ミネラルオイル及びこれらのうち二以上の混合物を用いることができる。
　また、本実施形態において疎水性溶媒の重量は、限定されるわけではないが、第一の親水性溶媒の重量を１とした場合、１以上１００以下であることが好ましく、より好ましくは５以上１０以下である。１以上とすることでカプセル状のエマルションがゲル相へ転移してしまうことを抑制することができ、５以上とすることでこの効果がより顕著となる。一方、１００以下とすることでカプセル状のエマルションの粒径を安定に保持してクラスターとすることができるといった効果があり、１０以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　なお本工程において乳化剤は、上記記載したものを採用することができる。
　またこの工程において、加える第一の親水性溶媒の量としては、限定されることなく適宜調整可能であるが、例えば疎水性溶媒の重量を１とした場合、１×１０－３以上１以下であることが好ましく、より好ましくは１×１０－２以上１×１０－１以下である。１×１０－３以上とすることでクラスターあたりのカプセルの数を増加させマーカーの蛍光強度を向上できるといった効果があり、１×１０－２以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１以下とすることで親水性溶媒と疎水性溶媒との相分離を抑制するといった効果があり、１０－１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　またこの工程において、加える乳化剤の量としては、限定されることなく適宜調整可能であるが、例えば加える第一の親水性溶媒の量を１とした場合、１×１０－３以上１以下であることが好ましく、より好ましくは１×１０－２以上１×１０－１以下である。１×１０－３以上とすることで親水性溶媒のカプセルを安定に乳化剤がつくることができるといった効果があり、１×１０－２以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１以下とすることで乳化剤と疎水性溶媒と第一親水性溶媒とがゲル層を形成する反応を抑制するといった効果があり、１×１０－１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　本実施形態において、（３）懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する工程は、疎水性溶媒層と親水性溶媒層を相分離させて配置し、疎水性溶媒中に存在するカプセル状のエマルションを遠心分離を用いて親水性溶媒側に沈降させていく方法であり、このイメージを図５に示しておく。この結果、疎水性溶媒層と親水性溶媒層との間の界面の乳化剤がカプセルからクラスターを形成させることができる。
　第二の親水性溶媒は、遠心分離するために用いられるものであり、この限りにおいて限定されるわけではないが、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝液、ＴＲＩＳ塩酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液及びこれらのうち二以上の混合物を好適に用いることができる。
　なお、第二の溶媒の量としては、限定されるわけではないが、例えば懸濁液の重量を１とした場合、１以上１０００以下であることが好ましく、より好ましくは１０以上１００以下である。１以上とすることで疎水性溶媒層と親水性溶媒層との相分離を安定化させることができるといった効果があり、１０以上とすることでこの効果がより顕著となる。また、１０００以下とすることでマーカーの粘度が減少することを抑制することができるといった効果があり、１００以下とすることでこの効果がより顕著となる。
そしてこの結果、上記した医療用組織マーカーを構成することができる。
（実施形態２）
（医療用組織マーカー）
　本実施形態に係る医療用組織マーカーは、上記実施形態１とほぼ同じであるが、疎水性溶媒に、第一の親水性溶媒、乳化剤を加えて懸濁液を形成する際、疎水性溶媒にＸ線造影剤を加えている点が実施形態１と異なる。異なる点について以下説明する。
　図６は、本実施形態に係る医療用組織マーカーにおけるクラスター１のイメージ図である。本図で示すとおり、本実施形態に係る医療用組織マーカーは、カプセル５の外側にもＸ線造影剤を含んでいることを特徴とする。このようにすることでより多くのＸ線造影剤を含ませることができ、しかもクラスター１のより外側に近い位置にＸ線造影剤を含ませることが可能となり、感度の向上を図ることができる。
（クラスターの製造方法）
　ここで本実施形態に係る医療用組織マーカーの製造方法について説明する。本実施形態におけるクラスターの製造方法も、ほぼ実施形態１と同様であるが、上記実施形態の（２）疎水性溶媒に、上記第一の親水性溶媒と乳化剤を加えて懸濁液を形成する工程が少し異なる。具体的には、疎水性溶媒に第一の親水性溶媒、乳化剤を加えて懸濁液を形成する際、Ｘ線造影剤も加えておく点が実施形態１と異なる。
　この段階で加えるＸ線造影剤については、上記実施形態１と同様である。Ｘ線造影剤の濃度については、特に限定されるわけではないが、例えば加える第一の親水性溶媒の量を１とした場合、０．０１以上１０以下であることが好ましく、より好ましくは０．１以上１以下である。０．０１以上とすることでＸ線造影の感度が高くなるといった効果があり、０．１以上とすることでその効果がより顕著となる。また、１０以下とすることでクラスター作製時の自重による沈降を抑制する効果があり、１以下とすることでこの効果がより顕著となる。
　以上、本実施形態に係る医療用組織マーカーにより、臓器内側にマーキングしたものでも臓器外側から位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能であって、かつ、マーキングした位置の臓器全体の中での位置の把握が容易となる。特に、本実施形態に係るマーカーによると、カプセル外部にもＸ線造影剤を含ませることができ、より感度が向上する。
　ここで上記医療用組織マーカーについて具体的に作成し、本発明の効果を確認した。以下具体的に説明する。
（実施例１）
　本実施例では、第一の親水性溶媒としてＴＲＩＳ塩酸緩衝液を、近赤外蛍光色素としてインドシアニングリーン（以下「ＩＣＧ」という。）を、Ｘ線造影剤として、ヨード化ケシ油エチルエステル（以下「ＬＰＧ」という。）を、リン脂質として卵黄レシチンを、採用した。なお、この場合における増粘剤として、スクロースを採用した。
　まず、室温下において、ガラス管に、５０ｍＭ、ｐＨ７．８となるようＴＲＩＳ緩衝液を１ｍＬ準備し、そこにＩＣＧ３．２×１０－２ｍＭ、ＬＰＤ２０ｍＭ、卵黄レシチン３０ｍＭとなるよう加え、攪拌し、ベシクル及びエマルションを形成した。
　次に、疎水性溶媒であるスクアレン１５ｍＬに、乳化剤であるポリグリセリルポリリシノレート（ＰＧＰＲ）を１５ｗ／ｗ％溶解させ、そこへ上記作成したベシクル及びエマルションを含む溶液１ｍＬを加え、ＰＧＰＲによるエマルション（ＰＧＰＲエマルション）を含む懸濁液を作成した。なお本実施例では、疎水性溶媒にもＬＰＧ４ｍＭを加え、ＰＧＰＲエマルション中又はその周辺にＬＰＧを多く存在させた。
　そして、更に、第二の親水性溶液として、５０ｍＭ、ｐＨ７．７のＴＲＩＳ緩衝溶液５ｍＬを準備し、増粘剤としてグルコースを用い、この第二の親水性溶液に、上記ＰＧＰＲエマルションを含む懸濁液１０ｍＬを上部から加え、油相（スクアレン相）と水相（ＴＲＩＳ緩衝溶液相）とを接触させた状態、室温下で、３５００ｒｐｍを３０分間回転させ、ＰＧＰＲのクラスターを形成させた。
　図７は、この結果得られたＰＧＰＲクラスターの明視野顕微鏡像であり、図８は、蛍光顕微鏡像である。この結果、クラスターであることが確認できるとともに、蛍光をも発することができていることを確認した。また図９は、この結果得られたＰＧＰＲクラスターの作成後２７時間後における明視野顕微鏡像であり、図１０は、同時間経過後の蛍光顕微鏡像である。この結果、１日以上の長時間経過した後であっても、形状及び性能が安定して存在していることが確認できた。
　作成したこのクラスターに対し、分散液の状態でＣＴ撮影を行いＸ線造影を行なった結果を図１１に示しておく。この結果、本クラスターのＸ線吸収度（ＣＴ値）は、胃壁のそれよりも十分に大きな値であることが確認でき、胃壁に打ち込まれてもコントラストが強く表れることが確認できた。
　次に、作成したこのクラスターを、生体組織に注入し、その効果を確認した。具体的には、ブタの胃の内壁粘膜下層を投与対象組織とし、ここに上記作製したクラスターを含む分散液を３００μＬ、腫瘍に見立てたクリップの周囲に４箇所局部注射で投与した。図１２はこの場合における胃内壁側の写真図を、図１３は、胃の外側の写真図である。
　また、図１４は、胃外側から観察した際の蛍光像を示す。図中左側は局注直後の蛍光像を、図中右側は、約６時間後の蛍光像を示す。本図によると、６時間経過後でも、４箇所を明確に区別することができ、十分注射位置近傍にクラスターをとどまらせることができていることを確認した。なお、比較として、ＩＣＧ水溶液を同様の位置に局部注射した際の同様の図を図１５に示しておく。この場合では、注射後６時間後はもちろん、直後においても、位置が不明瞭となっていることが確認できる。
　またここで、局注後２４時間経過後の安定性についても、改めて確認した。ここでは上記と同様、胃の内壁粘膜下層を投与対象組織とし、ここに上記作製したクラスターを含む分散液を３００μＬ、腫瘍に見立てたクリップの周囲に２箇所局注した。局注後、２４時間経過させ、麻酔から覚醒した後のブタに対して、腹腔鏡により外側から蛍光観察を行なった。この結果を図１６に示す。生体組織内においても十分蛍光を観察することができた。
　またここで、注射量についても確認した。本実施例に係るクラスターの濃度の場合、１００μＬ以上あれば、位置を確認することができ、好ましくは２００μＬ以上、より好ましくは３００μＬ以上であると考えられる。図１７乃至図２０に、局注量を変えた場合における蛍光像を示しておく。図１７は５０μＬの場合を、図１８は１００μＬの場合を、図１９は２００μＬの場合を、図２０は３００μＬの場合をそれぞれ示す。
　次に、ブタの胃を取り出し、上記と同様の量（３００μＬ）で同様に４箇所局注した後、３２時間経過した後、ＬＥＤによる蛍光観察を行なった。この結果を図２１に示す。なお図中右側は、本実施例に係るクラスターを含む分散液を局注した場合の蛍光画像であり、図中左側は、ＩＣＧ水溶液を同様に４箇所局注した場合の蛍光画像である。この結果、本実施例の場合は、３２時間経過しても４箇所の局注の位置を確認することができる一方で、ＩＣＧ水溶液の場合は胃全体に広がり、局注位置を確認することは困難であった。
　また、この場合において胃のＣＴ撮影を行い、３次元画像を作成した。図２２に、ＣＴ撮影による３次元を示しておく。この結果、上記蛍光観察を行なったと同じ位置に、造影部位があることを確認することができた。
　以上、本実施例により、蛍光だけでなく、ＣＴ撮像を行なうことが可能であることが確認でき、臓器外側からでも位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能であって、かつ、マーキングした位置の臓器全体の中での位置の把握が容易となる医療用組織マーカー及びその製造方法を提供できることを確認した。
　なお、本実施例ではＩＣＧの濃度を３．２×１０－２ｍＭの例を示しているが、ＩＣＧの濃度を適宜調整することは当然に可能である。図２３（ａ）は、ベシクルに配合させたＩＣＧ濃度を変化させた場合（卵黄レシチン３０ｍＭ）におけるその蛍光強度の変化を、図２３（ｂ）は、ベシクルに配合させた卵黄レシチンの濃度を変化させた場合（ＩＣＧ水溶液の濃度３．２×１０－２ｍＭ）における蛍光強度の変化をそれぞれ示しておく。この結果、ＩＣＧ濃度は３．２×１０－１ｍＭ以上１．６×１０－１ｍＭの範囲であることが好ましいことが確認でき、卵黄レシチンの濃度としては、５ｍＭ以上４０ｍＭ以下であることが好ましいことが確認できた。
（実施例２）
　本実施例では、第一の親水性溶媒にだけＬＰＧをいれた以外は上記実施例１と同様の材料、方法を用いて医療用組織マーカーを作製した。以下異なる点を中心に説明する。
　まず、室温下において、ガラス管に、５０ｍＭ、ｐＨ７．８となるようＴＲＩＳ緩衝液を１ｍＬ準備し、そこにＩＣＧ３．２×１０－２ｍＭ、ＬＰＤ２０ｍＭ、卵黄レシチン３０ｍＭとなるよう加え、攪拌し、ベシクル及びエマルションを形成した。
　次に、疎水性溶媒であるスクアレン１５ｍＬに、乳化剤であるポリグリセリルポリリシノレート（ＰＧＰＲ）を１５　ｗ／ｗ％溶解させ、そこへ上記作成したベシクル及びエマルションを含む溶液１ｍＬを加え、ＰＧＰＲによるエマルション（ＰＧＰＲエマルション）を含む懸濁液を作成した。なお本実施例では、疎水性溶媒にはＬＰＧを加えていない。
　そして、更に、第二の親水性溶液として、５０ｍＭ、ｐＨ７．７のＴＲＩＳ緩衝溶液５ｍＬを準備し、増粘剤としてグルコースを用い、この第二の親水性溶液に、上記ＰＧＰＲエマルションを含む懸濁液１０ｍＬを上部から加え、油相（スクアレン相）と水相（ＴＲＩＳ緩衝溶液相）とを接触させた状態、室温下で、３５００ｒｐｍを３０分間回転させ、ＰＧＰＲクラスターを形成させた。
　次に、作成したこのクラスターに対し、分散液の状態でＣＴ撮影を行いＸ線像影を行なったこの結果を図２４に示しておく。この結果、本クラスターにおいても、Ｘ線吸収度（ＣＴ値）は、胃壁のそれよりも十分に大きな値であることが確認でき、十分に効果を奏することが確認できた。
（実施例３）
　本実施例では、ＩＣＧの誘導体である下記式（５）で示されるＩＣＧ－８を用いた医療用組織マーカーを以下の手順で作製した。まず、室温下において、ガラス管に、５０ｍＭ、ｐＨ７．８となるようＴＲＩＳ緩衝液を１ｍＬ準備し、そこにＩＣＧ－８　３．２×１０－２ｍＭ、ＬＰＤ４０ｍｇ／ｍＬ、卵黄レシチン３０ｍＭとなるよう加え、攪拌し、ベシクル及びエマルションを形成した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　次に、疎水性溶媒であるスクアレン１５ｍＬに、乳化剤であるポリグリセリルポリリシノレート（ＰＧＰＲ）を１５ｗ／ｗ％とＬＰＤを１６０ｍｇ／ｍＬ溶解させ、そこへ上記作成したベシクル及びエマルションを含む溶液１ｍＬを加え、ＰＧＰＲによるエマルション（ＰＧＰＲエマルション）を含む懸濁液を作成した。
　そして、更に、第二の親水性溶液として、５０ｍＭ、ｐＨ７．７のＴＲＩＳ緩衝溶液５ｍＬを準備し、増粘剤としてグルコースを用い、この第二の親水性溶液に、上記ＰＧＰＲエマルションとＬＰＤを含む懸濁液１０ｍＬを上部から加え、油相（スクアレン相）と水相（ＴＲＩＳ緩衝溶液相）とを接触させた状態、室温下で、３５００ｒｐｍで３０分間回転させ、ＰＧＰＲクラスターを形成させた。
　次に、作成したこのクラスターに対し、消化管内視鏡を用いて、全身麻酔下の家畜ブタの胃粘膜下層に、半径１ｃｍとなる円周上の４カ所を設定して本医療用マーカーを各３００μＬずつ局注（Ａ）した結果を図２５に示しておく。投与直後に撮影したＸ線ＣＴの３次元再構成画像では、局注点４箇所を明瞭に識別可能であった（Ｂ）。投与１８時間後の蛍光腹腔鏡でも、同様に４カ所の局注点が認識可能であった（Ｃ）。参照実験として投与したＩＣＧ水溶液では、広く滲みが見られ、局注点を個別に認識することは不可能であった（Ｄ）。
　以上、本実施例により、蛍光だけでなく、ＣＴ撮像を行なうことが可能であることが確認でき、臓器内側に投与したものでも臓器外側から位置の認識が可能であり、長時間局所的に留まることが可能であって、かつ、マーキングした位置の臓器全体の中での位置の把握が容易となる医療用組織マーカー及びその製造方法を提供できることを確認した。
　本発明は、医療用組織マーカー及びその製造方法として産業上の利用可能性がある。

Claims (7)

  1. 　リン脂質及び近赤外蛍光色素が複合して形成されたベシクルと、前記リン脂質及びＸ線造影剤が複合して形成されたエマルションを含み、前記ベシクルと前記エマルションを親水性溶媒に内包させ、乳化剤により複数のカプセルを形成、凝集させたクラスターを有する医療用組織マーカー。
  2. 　前記Ｘ線造影剤は、ヨード化ケシ油エチルエステルを含む請求項１記載の医療用組織マーカー。
  3. 　前記リン脂質は、レシチン及びフォスファチジルコリンの少なくともいずれかである請求項１記載の医療用組織マーカー。
  4. 　前記親水性溶媒は、水と食用増粘剤を含む、請求項１記載の医療用組織マーカー。
  5. 　第一の親水性溶媒に近赤外蛍光色素、Ｘ線造影剤及びリン脂質を加えて攪拌し、
    　疎水性溶媒に、前記第一の親水性溶媒、乳化剤を加えて懸濁液を形成し、
    　前記懸濁液と第二の親水性溶媒とを用いて遠心分離する、医療用組織マーカーの製造方法。
  6. 　前記疎水性溶媒に、前記第一の親水性溶媒、乳化剤を加えて懸濁液を形成する際、Ｘ線造影剤も加える請求項５記載の医療用組織マーカーの製造方法。
  7. 　前記Ｘ線造影剤は、ヨード化ケシ油エチルエステルを含む請求項５記載の医療用組織マーカーの製造方法。
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