CN115252825A - 一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针及其制备方法与应用 - Google Patents

一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针及其制备方法与应用，属于半导体聚合物纳米材料技术领域。利用共轭聚合物PTZTPA‑BBT和功能聚合物PS‑PEG‑COOH通过纳米沉淀法制备获得聚合物点(Pdots)。使用细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒，从收获的C6胶质瘤细胞中提取细胞膜成分。将聚合物点和细胞膜成分混合，使用脂质体挤出器反复10次挤压，从而使得纯化的C6膜蛋白连接到聚合物点的表面，从而获得Pdots‑C6。本发明将胶质瘤细胞膜融合到聚合物点的表面，使得包覆后的聚合物点探针穿越血脑屏障的能力大大增强，根据同源靶向机制，胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点能够实现活体脑胶质瘤的近红外二区荧光成像。

Description

一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及半导体聚合物纳米材料技术领域，具体涉及一种胶质 瘤细胞膜包覆的聚合物点探针及其制备方法与应用。
背景技术
脑胶质瘤是颅内常见的原发性恶性肿瘤，恶性度最高可达4级， 其平均生存期仅为12-15个月。磁共振成像(MRI)是最常见的胶质 瘤的检测手段。然而磁共振成像诊断方法价格昂贵且耗时久。相比之 下，近红外二区(NIR-II,1000-1700nm)荧光成像技术用于癌症诊断 的发展受到越来越多的关注。生物组织在近红外二区窗口中的自发荧 光比可见光区(400-700nm)和近红外一区窗口(NIR-I,700-900)中 少，近红外二区荧光探针能够实现对生物组织更高的时空分辨率和更 深的穿透性成像。构建能够穿过血脑屏障(BBB)并能对肿瘤部位靶 向性聚集的纳米探针，用于脑胶质瘤的检测和治疗是非常具有挑战性 的。
纳米探针可以通过多种不同的策略进行设计修饰来增强穿过血 脑屏障的可能性，包括直接破坏血脑屏障、吸附介导的胞吞作用、细 胞介导的转运、受体介导的胞吞作用、载体介导的胞吞作用和反向神 经元转运等。最近，细胞膜包覆的纳米颗粒已被应用于多种形式的成 像和治疗，包括药物输送、疫苗开发和中和毒素等。仿生纳米系统是 一种很有临床转化前景的研发方向。细胞可在复杂的环境中执行各种 各样的功能。因此，利用细胞膜包覆技术，将天然的细胞膜包裹在纳 米颗粒表面，可以赋予其天然的细胞功能。通过从母细胞中提取细胞 膜，然后将细胞膜连接到纳米探针的表面，因此所有与生物相关的表面部分都被转移到纳米颗粒表面，形成一种仿生纳米平台。与传统的 纳米探针不同，细胞膜包覆的纳米探针展现出更好的生物相容性和特 定的生物学功能，如细胞特性的滞留特性和适应性等。涂有红细胞膜 的纳米颗粒可以延长其体内循环时间，降低其在血液中的快速清除性 质。此外，研究发现涂有细胞膜活性成分的纳米探针可以打开血脑屏 障的通道，并且提高胶质瘤的靶向性。因此，由于细胞膜表面保留了 细胞的抗原和细胞膜结构，仿生纳米探针可以获得许多新奇的功能， 例如：配体识别和靶向性特性、长血液循环时间和免疫逃逸等特殊功 能为脑肿瘤诊断提供了一种有潜力的方法。
多功能纳米探针可作为高灵敏度脑肿瘤检测的造影剂。共轭聚合 物点(Pdots)具有许多优异的生物功能和光学特性，例如生物相容 性好、光稳定性强、光物理性质可调和表面官能团丰富等，因此在生 物医学领域受到广泛关注。近来，近红外发光共轭聚合物荧光特性的 研究受到广泛关注，为实时成像和脑胶质瘤检测提供了新的方法。例 如，Wu课题组开发了具有聚集诱导发光(AIE)活性的聚合物点， 用于小鼠的脑血管成像。然而，聚合物点作为外源性物质，很容易被 免疫系统识别，因此，在被输送到大脑之前容易被肝脏和肾脏清除。 此外，聚合物点难以穿过血脑屏障。相比之下，表面修饰靶向适配体 或细胞穿透肽的纳米颗粒已证实具有脑肿瘤诊断特性。利用天然细胞 膜作为外衣的新型仿生纳米平台也有望作为一种新的方法，实现荧光 聚合物点的脑胶质瘤检测。因此，将细胞膜有效成分与共轭聚合物点 连接，有可能为改善脑胶质瘤诊断提供一种有效方案。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提供了一种胶质瘤细胞膜包覆的 聚合物点探针及其制备方法与应用。C6胶质瘤细胞膜包覆的聚合物 点(Pdots-C6)作为仿生生物材料荧光探针，用于脑胶质瘤靶向的近红 外二区荧光成像。通过体内和体外实验，系统性的证明了Pdots-C6 的与脑胶质瘤细胞的同源靶向性、生物分布特性和近红外二区荧光成 像特性。
本发明提供的一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针，所述探针 包括聚合物点和包覆在聚合物点上的胶质瘤细胞膜，胶质瘤细胞膜的 膜蛋白与聚合物点连接；所述聚合物点至少包括结构如式Ⅰ的共轭聚 合物和结构如式II所示的功能聚合物；
需要说明的是，所述探针还可以由聚合物点和包覆在聚合物点上 的胶质瘤细胞膜组成；所述聚合物点由结构如式Ⅰ的共轭聚合物和结 构如式II所示的功能聚合物组成。
式Ⅰ中，n的取值范围为20-40；式II中n的范围为20-40，m的 范围为180-400。
Figure BDA0003759240880000041
细胞膜与传统的聚合物点表面均带负电荷。为了克服这种电荷阻 力，这里在制备过程中加入PS-PEG-COOH(羧基封端的聚苯乙烯-聚 乙二醇)，使得聚合物点表面包覆一层PEG(聚乙二醇)，降低聚合物 点表面的电荷，使其能更顺利的与细胞膜结合。
在较优的技术方案中，所述共轭聚合物由PTZTPA-DOB(二硼 酸频那醇酯-(二甲基三苯胺-吩噻嗪))和BBT-DBr(二溴-苯并双噻二 唑)通过Suzuki聚合反应制得。
在较优的技术方案中，所述PTZTPA-DOB和BBT-DBr的摩尔比 为1∶1。
在较优的技术方案中，所述聚合物点中共轭聚合物和功能聚合物 的质量比为10:3。
在较优的技术方案中，所述胶质瘤细胞膜的膜蛋白与聚合物点的 质量比为3:2。
本发明还提供了上述的胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针的制 备方法，包括以下步骤：
S1、共轭聚合物PTZTPA-BBT的合成
取50mL圆底烧瓶，分别加入0.5mmol的PTZTPA-DOB和 BBT-DBr、2M碳酸钾水溶液4mL、0.03mmol的四(三苯基膦)钯和 甲苯20mL，密封；进行3次冻干-抽泵-解冻的循环对烧瓶进行脱气； 将混合物加热至80℃保持48小时并在冷却至室温后用水洗涤；将有 机层浓缩并在搅拌下滴入200mL甲醇中；将溶液过滤，沉淀物以已 丙酮为溶剂，通过索氏萃取进一步纯化，最终得到深绿色固体产物 PTZTPA-BBT；
S2、C6胶质瘤细胞膜的提取
采用试剂盒提取胶质瘤细胞膜；首先，使用175T细胞培养瓶培 养C6胶质瘤细胞约2000-5000万个，用磷酸盐缓冲液冲洗一遍，用 细胞刮子刮下细胞，离心收集细胞，吸除上清液，留下细胞沉淀备用； 用适量冰浴预冷的磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞沉淀，4℃，600g离心 5min沉淀细胞，弃上清液；取2mL膜蛋白抽提试剂A加入苯甲基 磺酰氟，使苯甲基磺酰氟的最终浓度为1mM，把2mL临用前添加 了甲基磺酰氟的膜蛋白抽提试剂A加入至2000-5000万细胞中，轻轻 并充分悬浮细胞，冰浴放置15分钟；把细胞悬液转移到玻璃匀浆器中，匀浆约50下；4℃，700g离心10分钟，去除细胞核和未破碎的 细胞，收集上清液至一新的离心管中；4℃，14000g离心30分钟， 沉淀即为细胞膜碎片；
S3、Pdots-C6的制备
Pdots是通过纳米沉淀法和简单的超声处理合成的。将共轭聚合 物PTZTPA-BBT和功能聚合物PS-PEG-COOH溶解在3mL四氢呋喃 中得到混合溶液，混合溶液中PTZTPA-BBT浓度为100μg·mL-1， PS-PEG-COOH的浓度为30μg·mL-1；然后将混合溶液快速倒入 10mL超纯水中，并在剧烈超声作用(40KHz，300w)下持续震荡3 分钟；然后将所得悬浮液在氮气保护下加热除去四氢呋喃；浓缩后使 用220nm过滤膜过滤除去尺寸较大的聚集体；从而获得Pdots溶液， 然后将S2提取的胶质瘤膜蛋白与Pdots溶液混合，其中膜蛋白与Pdots 的质量比为3∶2，使用脂质体挤出器挤压通过200nm的滤膜，挤压重 复10次，使得纯化的C6膜蛋白连接到聚合物点的表面，从而获得 Pdots-C6纳米探针。
在较优的技术方案中，步骤S3中，所述混合溶液中还包括其他 共轭聚合物，如：0-100μg·mL-1的PFBT，即混合溶液中PFBT与 PTZTPA-BBT的质量比为0-1∶1。
传统的聚合物点难以穿过血脑屏障、主动靶向性较弱，且体内循 环时间较短。脑胶质瘤细胞膜包覆后具有与脑胶质瘤细胞的同源靶向 性、低毒性和体内长循环特性。
基于此，本发明还提供了一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针 在荧光成像和/或荧光传感中的应用。
本发明进一步提供了一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针在 制备治疗颅内胶质瘤药物中的应用。
本发明技术方案具有如下优点：
本发明提供的探针Pdots-C6不仅在细胞水平上表现出同源靶向 作用，而且在组织水平上表现出高空间分辨率和深层组织穿透性。作 为一种新的近红外二区荧光成像探针，与纯的聚合物点探针相比， Pdots-C6具有高特异性、低毒性和长循环特性，在临床胶质瘤检测方 面具有很大的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方 案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简 单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式， 对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可 以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明制备的用于脑肿瘤靶向的近红外二区荧光成像的 C6胶质瘤细胞膜包覆的探针Pdots-C6。
其中，(a)Pdots-C6的制备过程；(b)Pdots-C6穿越血脑屏障和 同源靶向脑瘤成像的示意图。
图2是胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点(Pdots-C6)的表征；
其中，(a)共轭聚合物PTZTPA-BBT的结构式及其合成路线；(b) Pdots-C6的水合粒径分布和透射电子显微镜图像；(c)聚合物点(Pdots) 的水合粒径分布和透射电子显微镜图像；(d)Pdots-C6的水合粒径与 室温下储存时间的关系变化曲线；(e)Pdots、Pdots-C6和C6细胞膜 (C6CMs)的Zeta电位；(f)Pdots和Pdots-C6的吸收光谱；(g)Pdots 和Pdots-C6的发射光谱；(h)C6CMs、Pdots-C6、Pdots和蛋白质标 记物的凝胶电泳蛋白质分析结果。
图3是Pdots-C6的抗吞噬特性。
其中，(a)Pdots和Pdots-C6之间细胞摄取差异的示意图；(b) Pdots和Pdots-C6孵育后的C6细胞通过流式细胞术分析细胞内荧光 强度对比；(c)C6细胞的平均荧光强度值对比；(d)C6细胞的荧光 成像图，比例尺＝20μm；(e)用荧光成像图分析的C6细胞内荧光强 度分布。
图4：(a)PTZTPA-BBT:PFBT Pdots、PTZTPA-BBT:PFBT Pdots-C6 以及C6细胞膜(C6CMs)的吸收光谱；(b)PTZTPA-BBT:PFBT Pdots 和PTZTPA-BBT:PFBT Pdots-C6的发射光谱(激发波长为460nm)； (c)PTZTPA-BBT:PFBT Pdots和PTZTPA-BBT:PFBT Pdots-C6的发射光谱(激发波长为808nm)。
图5是不同浓度Pdots和Pdots-C6孵育后的C6细胞的细胞活力 测定。
图6：(a)脑胶质瘤小鼠的核磁共振成像图；(b)脑胶质瘤小鼠 的脑部光学相干断层扫描成像图像；(c)脑胶质瘤小鼠的荧光成像图； (d)分别注射Pdots和Pdots-C6后，在不同时间点对小鼠的脑胶质 瘤进行活体近红外二区荧光成像；(e)注射24小时后小鼠脑组织切 片；比例尺＝1mm。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合 实施例，对本发明进行进一步详细说明。
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不 用于限定本发明。
实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。
本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆 盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制 品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素 或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征 只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
如没有特殊说明，本发明所用的原料均为市售常规产品。
一.实验部分
制备过程如图1(a)所示。
1.1共轭聚合物PTZTPA-BBT的合成
取50mL或100mL圆底烧瓶，加入PTZTPA-DOB(二硼酸频那 醇酯-(二甲基三苯胺-吩噻嗪)，361-722mg，0.5-1.0mmol)、BBT-DBr (二溴-苯并双噻二唑)，175-350mg，0.5-1.0mmol)、碳酸钾水溶 液(K2CO3，2.0M，2-4mL)、四(三苯基膦)钯(Pd(PPh3)4，34-68 mg，0.03-0.06mmol)和甲苯(20-40mL)，然后用封口膜密封。进 行3次冻干-抽泵-解冻的循环对烧瓶进行脱气。将混合物加热至85 ℃保持48小时并在冷却至室温后用水洗涤。将有机层浓缩并在搅拌 下滴入甲醇(100-200mL)中。将溶液过滤，沉淀物已丙酮为溶剂， 通过索氏萃取进一步纯化，最终得到深绿色固体产物。聚合物的分子 量通过凝胶渗透色谱表征，测得数均分子量为4.9kDa。
1.2 C6胶质瘤细胞膜的提取
采用碧云天细胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒提取胶质瘤细 胞膜。首先，使用175T细胞培养瓶培养C6胶质瘤细胞约2000-5000 万个，用磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，离 心收集细胞，吸除上清液，留下细胞沉淀备用。用适量冰浴预冷的磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞沉淀，离心沉淀细胞(4℃，600g，5分钟)。 弃上清液。取2mL膜蛋白抽提试剂A加入苯甲基磺酰氟(PMSF)，使 苯甲基磺酰氟的最终浓度为1mM，把2mL临用前添加了甲基磺酰氟 的膜蛋白抽提试剂A加入至2000-5000万细胞中，轻轻并充分悬浮细 胞，冰浴放置15分钟。把细胞悬液转移到玻璃匀浆器中，匀浆约50 下。4℃，700g离心10分钟，去除细胞核和未破碎的细胞：收集上 清液至一新的离心管中。4℃，14000g离心30分钟，沉淀即为细胞 膜碎片。通过BCA(Bicinchoninicacid)蛋白测定法测定提取细胞 膜碎片的蛋白质含量。
1.3Pdots-C6的制备
Pdots是通过纳米沉淀法和简单的超声处理合成的。将共轭聚合 物PTZTPA-BBT(100μg·mL-1)、PFBT(0-100μg·mL-1)和功能聚 合物PS-PEG-COOH(30μg·mL-1)溶解在3mL四氢呋喃溶液中。然 后将混合溶液快速倒入10mL超纯水中，并在剧烈超声作用下持续震荡3分钟。然后将所得悬浮液在氮气保护下加热除去四氢呋喃。浓缩 后使用220nm过滤膜过滤除去尺寸较大的聚集体。从而获得Pdots 溶液，然后将提取的胶质瘤膜蛋白(1.5mg/mL)与Pdots溶液(1mg/mL) 混合，使用脂质体挤出器挤压通过200nm的滤膜，挤压重复10次， 从而获得Pdots-C6纳米探针。
2.结果与讨论
2.1.Pdot-C6的制备和表征。
Pdots-C6的制备包括以下步骤。首先，利用共轭聚合物 PTZTPA-BBT(化学结构式见图2a)和PS-PEG-COOH(羧基封端的聚苯 乙烯-聚乙二醇)过纳米沉淀法制备获得聚合物点(Pdots)。共轭聚 合物PTZTPA-BBT通过铃木(Suzuki)聚合反应合成。此外，使用细 胞膜蛋白与细胞浆蛋白提取试剂盒，从收获的C6胶质瘤细胞中提取 细胞膜成分。然后，将聚合物点和细胞膜成分混合，使用脂质体挤出 器反复10次挤压，从而使得纯化的C6膜蛋白连接到聚合物点的表面， 从而获得Pdots-C6。透射电子显微镜(TEM)图像和动态光散射(DLS)结果表明，Pdots-C6具有球形形貌和典型的核壳结构，平均粒径为 40.8nm(图2b)，尺寸略大于纯Pdots(35.2nm)(图2c)。我们还 发现获得的Pdots和Pdots-C6可以保持10天以上的胶体稳定性(图2d)，从而为后续实验的开展提供了可行性。研究发现Pdots被C6细 胞膜包被后，Zeta电位也从原来的-16.3mV增加到-23.5mV(图2e)。 因此，透射电镜、动态光散射以及表面电位分析结果一致表明聚合物 点成功地被C6胶质瘤细胞膜包覆。
此外，利用吸收光谱和近红外发射光谱分别测量了Pdots和 Pdots-C6的光学性质。Pdots和Pdots-C6显示几乎相同的吸收光谱， 其最高吸收峰在745nm处(图2f)。同时，我们用808nm为激发光， 测得Pdots和Pdots-C6的荧光光谱，其最高发射峰在1055nm处(图2g)。使用IR-26染料(近红外荧光染料IR 26，CAS:76871-75-5) 作为参考，在808nm激发下，测得Pdots的近红外荧光量子效率为 0.6％。此外，通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 蛋白质分析，同样证明了C6膜蛋白已转移到Pdots的表面(图2h)。 C6细胞膜、Pdots-C6和蛋白标记的相同蛋白条带表明Pdots-C6成功 地保留了原始C6细胞的膜蛋白。
2.2.Pdots-C6的生物相容性和抗吞噬特性
外源性纳米探针进入细胞后会被免疫系统识别并被巨噬细胞清 除，导致纳米探针在生物医学诊断和治疗中的效率受到限制。对比了 Pdots和Pdots-C6的体外生物相容性和细胞内吞特性。同源胶质瘤 细胞膜(C6CMs)表面的膜蛋白可以主动向巨噬细胞发出“不要吃我” 的信号，防止它们被清除(图3a)。
本研究中，我们采用混合共轭聚合物PFBT(聚(9,9-二辛基芴- 共-苯并噻二唑))制备两种纳米探针分别是为PTZTPA-BBT:PFBT Pdots和PTZTPA-BBT:PFBT Pdots-C6。因此，它们能够发出PFBT所 具有的绿色荧光信号(图4)。首先，我们使用CCK-8测定法评估了Pdots和Pdots-C6的体外细胞毒性，验证了不同浓度(0、3、6、12、 25、50和100μg/mL)Pdots-C6的细胞毒性(图5)。接下来，我们 将PTZTPA-BBT:PFBT Pdots和PTZTPA-BBT:PFBT Pdots-C6分别与C6 细胞共孵育6小时。采用流式细胞术分别量化C6细胞对Pdots和 Pdots-C6的摄取效率(图3b)。实验结果表明Pdots-C6实验组的荧 光强度比纯Pdots组高约3.3倍(图3c)。这种细胞摄取差异主要是 源于Pdots-C6所具有的同源靶向能力。另外，我们还对细胞的定性 摄取进行了可视化分析，细胞核采用具有蓝色荧光信号的DAPI(4′,6- 二脒基-2-苯基吲哚)标记。由于PFBT发射绿色荧光，该实验中混合 了PFBT的Pdots和Pdots-C6都能够发射绿色荧光。通过将两个发光 通道的合并视图比较Pdots和Pdots-C6的荧光亮度差异(图3d)。 结果表明，Pdots-C6组检测到更强的绿色荧光信号。(图3e)。与传 统的Pdots相比，细胞膜包覆的Pdots-C6更容易被同源的胶质瘤细 胞摄取，证明了Pdots-C6具有更好的同源靶向能力。
2.3.近红外二区活体脑肿瘤成像
根据体外实验结果中Pdots-C6优异的生物相容性和主动靶向能 力结果，进一步使用携带脑肿瘤的BALB/c裸鼠模型进行体内成像实验。 将荧光素酶标记的C6胶质瘤细胞(C6-Luc)注射到小鼠纹状体中，构 建胶质瘤原位植入肿瘤模型。雌性BALB/c裸鼠(5-6周)购自北京维 通利华实验动物技术有限公司。将小鼠麻醉后固定在脑立体定位仪上， 使用酒精对小鼠头皮层消毒，把小鼠注射位点的头皮剪开，对颅顶钻 孔后，5分钟时间内缓慢进针至-4毫米，等待小鼠适应5分钟后调整Z 轴至-3.5毫米，使用微量进样器吸取5uL细胞(5×105个细胞/小鼠)， 在5分钟内缓慢注射胶质瘤细胞，缓慢将注射器抽出后，用骨蜡将颅顶的孔封好，最后用缝合液将脑皮黏合。通过使用C6-Luc构建肿瘤模 型，使我们能够通过生物发光成像评估胶质瘤细胞的活性。此外，还 进行了核磁共振成像(MRI)和光学相干断层扫描(OCT)以监测颅内 胶质瘤细胞的生长情况。核磁共振成像结果显示，肿瘤细胞接种8天 后，胶质瘤的深度约为3.55mm(图6a)，而OCT能够观察到胶质瘤肿 瘤微环境中的血管结构(图6b)。核磁共振成像和光学相干断层扫描 成像结果表明脑肿瘤模型构建成功。
此外，我们还进行了体内近红外二区荧光成像，分别获取Pdots 和Pdots-C6在活体脑肿瘤中的靶向能力。由于胶质瘤细胞含有荧光素 酶标记的报告基因，能够在原位胶质瘤小鼠的肿瘤部位检测到荧光信 号强度(图6c)。取两组小鼠，每组3只，分别通过尾静脉注射Pdots 和Pdots-C6，在注射后1、6、12、24和48小时监测两组小鼠的荧 光信号(图6d)。在Pdots-C6组的小鼠大脑中清楚地检测到大量荧光。 而Pdots组中没有发现出明显的荧光信号。此外，对Pdots-C6组的小 鼠大脑组织切片进行荧光成像，同样表现出明显的荧光信号(图6e)。 该结果表明，与Pdots组相比，Pdots-C6组纳米探针在胶质瘤细胞中 表现出明显的富集量增加，这是由于Pdots-C6具有更好的血脑屏障穿 越能力和脑瘤靶向性。
显然，上述具体实施方式仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并 非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说 明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法 对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变 动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针，其特征在于，所述探针包括聚合物点和包覆在聚合物点上的胶质瘤细胞膜，胶质瘤细胞膜的膜蛋白与聚合物点连接；所述聚合物点至少包括结构如式Ⅰ的共轭聚合物和结构如式II所示的功能聚合物；
Figure FDA0003759240870000011
2.根据权利要求1所述的一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针，其特征在于，所述共轭聚合物由PTZTPA-DOB和BBT-DBr通过Suzuki聚合反应制得。
3.根据权利要求2所述的一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针，其特征在于，所述PTZTPA-DOB和BBT-DBr的摩尔比为1∶1。
4.根据权利要求1所述的一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针，其特征在于，所述聚合物点中共轭聚合物和功能聚合物的质量比为10:3。
5.根据权利要求1所述的一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针，其特征在于，所述胶质瘤细胞膜的膜蛋白与聚合物点的质量比为3:2。
6.权利要求1-5任一项所述的一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、共轭聚合物PTZTPA-BBT的合成
取50mL圆底烧瓶，分别加入0.5mmol的PTZTPA-DOB和BBT-DBr、2M碳酸钾水溶液4mL、0.03mmol的四(三苯基膦)钯和甲苯20mL，密封；进行3次冻干-抽泵-解冻的循环对烧瓶进行脱气；将混合物加热至80℃保持48小时并在冷却至室温后用水洗涤；将有机层浓缩并在搅拌下滴入200mL甲醇中；将溶液过滤，沉淀物以已丙酮为溶剂，通过索氏萃取进一步纯化，最终得到深绿色固体产物PTZTPA-BBT；
S2、C6胶质瘤细胞膜的提取
采用试剂盒提取胶质瘤细胞膜；首先，使用175T细胞培养瓶培养C6胶质瘤细胞约2000-5000万个，用磷酸盐缓冲液冲洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，离心收集细胞，吸除上清液，留下细胞沉淀备用；用适量冰浴预冷的磷酸盐缓冲液轻轻重悬细胞沉淀，4℃，600g离心5min沉淀细胞，弃上清液；取2mL膜蛋白抽提试剂A加入苯甲基磺酰氟，使苯甲基磺酰氟的最终浓度为1mM，把2mL临用前添加了甲基磺酰氟的膜蛋白抽提试剂A加入至2000-5000万细胞中，轻轻并充分悬浮细胞，冰浴放置15分钟；把细胞悬液转移到玻璃匀浆器中，匀浆约50下；4℃，700g离心10分钟，去除细胞核和未破碎的细胞，收集上清液至一新的离心管中；4℃，14000g离心30分钟，沉淀即为细胞膜碎片；
S3、Pdots-C6的制备
将共轭聚合物PTZTPA-BBT和功能聚合物PS-PEG-COOH溶解在3mL四氢呋喃中得到混合溶液，混合溶液中PTZTPA-BBT浓度为100μg·mL-1，PS-PEG-COOH的浓度为30μg·mL-1；然后将混合溶液快速倒入10mL超纯水中，并在剧烈超声作用下持续震荡3分钟；然后将所得悬浮液在氮气保护下加热除去四氢呋喃；浓缩后使用220nm过滤膜过滤除去尺寸较大的聚集体；从而获得Pdots溶液，然后将S2提取的胶质瘤膜蛋白与Pdots溶液混合，其中膜蛋白与Pdots的质量比为3:2，使用脂质体挤出器挤压通过200nm的滤膜，挤压重复10次，使得纯化的C6膜蛋白连接到聚合物点的表面，从而获得Pdots-C6纳米探针。
7.根据权利要求6所述的胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述混合溶液中还包括0-100μg·mL-1的PFBT。
8.权利要求1-5任一项所述的一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针在荧光成像和/或荧光传感中的应用。
9.权利要求1-5任一项所述的一种胶质瘤细胞膜包覆的聚合物点探针在制备治疗颅内胶质瘤药物中的应用。
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