CN113521311A - 一种具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡及其制备方法和应用，该制备方法包括将PCL‑b‑PEG‑b‑PCL、疏水性荧光染料和聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸溶于有机溶剂，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；将薄膜干燥后进行水化，在冰浴以及匀浆条件下滴加全氟碳化合物，形成乳液；将乳液在冰浴条件下进行超声处理，除杂，得到所述具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡；上述制备方法以聚合物纳米囊泡作为载体，共载PFH和ICG用于荧光成像和超声成像指导的光热‑光动力治疗肿瘤，其中，光敏剂荧光化合物的包封率高达93.20％；此外，该制备方法工艺简单、操作方便，无需昂贵仪器或高端技术人员即可实现，成本较低，适合推广应用。

Description

一种具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及肿瘤成像和抗肿瘤光热-光动力疗法药物技术领域，具体涉及一种具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
光疗法，包括光热疗法(Photothermal therapy，PTT)和光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)，是新兴且高效的光激发癌症治疗方法。与大多数传统的癌症治疗方法相比，具有时空可控性，无创性，低毒性，可忽略的耐药性，低成本等优点。PTT是利用光敏剂在特定波长的激光照射下将吸收的光子能量转化为热量，在一定时间内导致肿瘤局部温度升高杀死肿瘤细胞的治疗方法。研究证明肿瘤组织比正常组织对热更敏感，更容易发生不可逆损伤。当PTT将肿瘤局部温度提升至48～60℃时，只需4～6min就会导致蛋白质严重变性和DNA严重损伤，对细胞造成不可逆的损伤。PDT是指光敏剂在适当波长的激发光照射下，能够在肿瘤局部产生细胞毒性活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，诱导肿瘤细胞死亡，已成功应用于食管癌、皮肤癌和非小细胞肺癌的治疗中。有机近红外染料吲哚菁绿(Indocyanine green，ICG)是一种被食品药品监督管理局(Food and drugadministration，FDA)批准的应用于临床的近红外成像剂，也是激光介导的光疗法中有效的近红外光(Near infrared，NIR)吸收剂。ICG具有突出的生物相容性，潜在的生物降解性，易加工性和较高的光热转换效率等特点，并取得了令人鼓舞的抑瘤效果。但是，游离的ICG存在在水溶液中容易聚集和降解且光稳定性差，缺乏靶标特异性，非特异性地结合蛋白和在人体内被快速清除的不足。为了提高游离ICG的光稳定性，并增强其在肿瘤部位的蓄积，提高光疗效果，借助纳米技术平台具有重要意义。
超声成像由于固有的组织穿透能力，高安全性、无创性、实时性，无电离辐射，成本低等优点，在临床上受到广泛应用。然而，超声成像的低成像分辨率和诊断精度严重限制了其进一步的诊断能力。超声造影剂的引入和改良有望解决这一问题。虽然传统的微泡可以显著增强超声的回波信号，但是微泡的大颗粒尺寸使得它们容易被网状内皮系统捕获，导致血液循环时间短和肿瘤内的蓄积量低而限制了它们的临床应用。只有尺寸小于700nm的颗粒才能渗透到肿瘤渗漏的脉管系统中，但是由于非线性后向散射随着颗粒直径的减小而显著减小，因此具有纳米尺寸的气泡对改善对比度增强超声成像的贡献非常有限。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡及其制备方法和应用，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(a)将PCL-b-PEG-b-PCL、疏水性荧光染料和聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸溶于有机溶剂，然后，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；
(b)将薄膜干燥后进行水化，随后，在冰浴以及匀浆条件下滴加全氟碳化合物，形成乳液；
(c)将乳液在冰浴条件下进行超声处理，除杂，得到所述具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡。
优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷。
优选地，所述疏水性荧光染料中的荧光染料选自吲哚菁绿、IR780和IR820中的任意一种。
优选地，所述疏水性荧光染料通过如下方法制得：
将荧光染料和碘化四丁胺溶于有机溶剂于避光室温条件下搅拌反应，得到疏水性荧光染料，其中，所述碘化四丁胺和荧光染料的质量比为(5～6)：1，有机溶剂可以为二氯甲烷。
优选地，所述PCL-b-PEG-b-PCL、疏水性荧光染料以及聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸的质量比为(40～60)∶(4～6)∶1；
优选地，所述步骤(a)还包括：预先将聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸溶于无水甲醇中。
优选地，所述水化采用的溶剂为去离子水或pH为7.4的PBS溶液；水化温度为60～70℃，时间为4～6h；
所述溶剂的添加体积与PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为(1～5)mL∶20mg。
优选地，所述PCL-b-PEG-b-PCL与全氟碳化合物的质量体积比为(80～120)mg：1mL。
优选地，所述匀浆转速为(20～24)×103rpm，时间为8～12min。
优选地，所述全氟碳化合物选自全氟己烷、全氟戊烷、全氟庚烷、全氟辛溴烷中的至少一种。
优选地，所述超声处理采用3mm探头，功率为25％～35％，超声处理时间为18～25min，并且每间隔5s超声5s。
优选地，所述除杂方式为高速离心或者透析。
本发明第二方面提供一种上述制备方法制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡。
本发明第三方面提供一种上述具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡在制备肿瘤成像产品或抗肿瘤光热-光动力疗法药物中的应用；
所述肿瘤成像产品包括荧光成像产品和超声成像产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
(1)本发明上述制备方法，以聚合物纳米囊泡作为载体，共载PFH和ICG用于荧光成像和超声成像指导的光热-光动力治疗肿瘤，并在囊泡表面修饰叶酸靶向，得到具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡；同时，该制备方法工艺简单、操作方便，无需昂贵仪器或高端技术人员即可实现，成本较低，适合推广应用。
(2)本发明制备方法可有效包载光敏剂，具有较高包封率(93.20％)和良好的生物相容性，可保护游离光敏剂，克服其不稳定和易被光漂白的缺点。
(3)本发明制备方法制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡具有温度响应性“由小到大”相变的能力，温度高于PFH沸点时，能够产生较强的超声信号，可以实现荧光成像和激光激活的超声成像；另外，该聚合物囊泡可以靶向肿瘤，高效蓄积在肿瘤局部；此外，该聚合物囊泡粒径较小，分布均一，具有较好的稳定性。
(4)本发明提供的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡在808nm激光照射下，可以发挥光热-光动力治疗肿瘤的功能，消除大部分的肿瘤。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)的表征图；
图2为本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)在不同温度时观察到的“由小到大”的过程和特定温度下的明场照片和超声图像；
图3为本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)在有无激光照射下对肿瘤细胞的杀伤效果图；
图4为本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)的肿瘤细胞摄取结果图；
图5为本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)的肿瘤细胞产生ROS结果图；
图6为本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)尾静脉注射小鼠后在体内的分布和荧光成像图；
图7为小鼠经本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)治疗后的温度升高和体内超声成像图；
图8为小鼠经本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)治疗后肿瘤产生ROS和凋亡损伤结果图；
图9小鼠经本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)治疗后肿瘤体积和体重变化的结果图；
图10为小鼠经本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)治疗后的主要脏器H&E染色图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
实施例1
本实施例为一种具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(a)将亲水性ICG2.0mg和碘化四丁胺11.44g溶于2mL二氯甲烷中于避光室温条件下磁力搅拌过夜，得到疏水性光敏剂ICG；
预先将0.4mg聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸加入100μL无水甲醇，于40℃水浴下溶解；
再将20.0mg PCL-b-PEG-b-PCL溶于3mL二氯甲烷中，并加入溶解完全聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸和疏水性吲哚菁绿，然后，35℃水浴下旋转蒸发去除有机溶剂，在瓶壁形成一层均匀薄膜，干燥过夜；
(b)将薄膜干燥后加入1.8mL去离子水震荡混匀，于65℃烘箱静置5h，随后，在冰浴以及匀浆条件下滴加200μL全氟己烷，匀浆转速为24×103rpm，时间为10min，形成乳液；
(c)将乳液在冰浴条件下进行超声处理，其中，超声处理采用3mm探头，功率为30％，超声处理时间为20min，并且每间隔5s中超声5s；然后透析法除杂，得到上述具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)。
对比例1
本对比例提供了一种空白聚合物囊泡，制备方法包括步骤：
S1：称取20.0mg两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL溶于5mL二氯甲烷中，35℃水浴下旋转蒸发除去二氯甲烷，在瓶壁形成一层均匀薄膜，干燥过夜；
S2：将薄膜干燥后加入1.8mL去离子水震荡混匀，于65℃烘箱静置5h，然后将水化液转移到10mL EP管中，冰浴条件下，用3mm探头超声(功率为30％，时间为20min，超声5s停5s)，得到空白聚合物囊泡(Blank NPs)。
对比例2
本对比例提供了一种双模态成像指导的聚合物囊泡，制备方法包括步骤：
S1：称取2.0mg亲水性吲哚菁绿与11.44mg碘化四丁胺溶于2mL二氯甲烷中，避光室温条件下磁力搅拌过夜，得到疏水性吲哚菁绿；
S2：称取20.0mg两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL溶于3mL二氯甲烷中，并加入S1中制备的疏水性吲哚菁绿，35℃水浴下旋转蒸发除去二氯甲烷，在瓶壁形成一层均匀薄膜，干燥过夜；
S3将薄膜干燥后加入1.8mL去离子水进行震荡混匀，于65℃烘箱静置5h，然后将水化液转移到10mL EP管中，冰浴条件下高速匀浆，并同时逐滴加入200μL全氟己烷，转速为24×103rpm，时间为10min，形成乳液；
S4：乳液用3mm探头冰浴条件下超声形成聚合物纳米囊泡(功率为30％，时间为20min，超声5s停5s)，透析法除杂，得到双模态成像指导的聚合物囊泡(IP-NPs)。
对比例3
本对比例提供了一种包载光敏剂的聚合物纳米囊泡，制备方法包括步骤：
S1：称取2.0mg亲水性吲哚菁绿与11.44mg碘化四丁胺溶于2mL二氯甲烷中，避光室温条件下磁力搅拌过夜，得到疏水性吲哚菁绿；
S2：称取20.0mg两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL溶于3mL二氯甲烷中，并加入S1中制备的疏水性吲哚菁绿，35℃水浴下旋转蒸发除去二氯甲烷，在瓶壁形成一层均匀薄膜，干燥过夜；
S3：将薄膜干燥后加入1.8mL去离子水进行震荡混匀，于65℃烘箱静置5h，然后将水化液转移到10mL EP管中，冰浴条件下用3mm探头超声形成聚合物纳米囊泡(功率为30％，时间为20min，超声5s停5s)，透析法除杂，得到包载光敏剂的聚合物纳米囊泡(I-NPs)。
对比例4
本对比例提供了一种具有肿瘤靶向功能的包载光敏剂的聚合物纳米囊泡，制备方法包括步骤：
S1：称取2.0mg亲水性吲哚菁绿与11.44mg碘化四丁胺溶于2mL二氯甲烷中，避光室温条件下磁力搅拌过夜，得到疏水性吲哚菁绿；
S2：预先称取0.4mg聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸，加入100μL无水甲醇，于40℃水浴下溶解；称取20.0mg两亲性三嵌段共聚物PCL-b-PEG-b-PCL溶于3mL二氯甲烷中，并加入溶解完全的聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸和S1中制备的疏水性吲哚菁绿，35℃水浴下旋转蒸发除去二氯甲烷，在瓶壁形成一层均匀薄膜，干燥过夜；
S3：薄膜干燥后加入1.8mL去离子水进行震荡混匀，于65℃烘箱静置5h，然后将水化液转移到10mL EP管中，冰浴条件下，用3mm探头超声(功率为30％，时间为20min，超声5s停5s)，离心或者透析法除杂，得到具有肿瘤靶向功能的包载光敏剂的聚合物纳米囊泡(FI-NPs)。
为了更好的表征具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡的效果，进行如下实验：
实验例1
1、本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)中光敏剂ICG的载药量和包封率：
将样品混悬液冷冻干燥，取适量冷冻干燥后的样品用乙腈：甲醇＝1：1的混合溶液溶解，通过紫外分光光度计在775nm波长处检测ICG的吸光度，根据标准曲线计算I-NPs、IP-NPs和FIP-NPs中ICG载药量和包封率。
ICG载药量(％)＝聚合物囊泡中ICG的质量/聚合物囊泡的质量×100％
ICG包封率(％)＝聚合物囊泡中ICG的质量/加入ICG的质量×100％
ICG的投药量是2.0mg，I-NPs、IP-NPs和FIP-NPs中ICG的载药量分别为8.74％，8.69％，8.55％；而I-NPs、IP-NPs和FIP-NPs中ICG的包封率分别为97.02％，95.30％，93.20％，表明聚合物囊泡具有较高的ICG包载能力。
2、本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)稳定性考察：
取FIP-NPs混悬液适量，加去离子水稀释后分别于0，1，2，3，4，5，6，7d置于MalvernNano ZS粒度分析仪中测定所制得聚合物囊泡的粒径大小。
粒径的具体结果见图1A，结果表明所制备的FIP-NPs的平均粒径在300nm以下，具有良好的粒径稳定性，没有出现聚集和沉淀，说明载药聚合物囊泡稳定性良好，可能是由于PEG层的保护作用。
3、本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)体外ROS产生情况考察
将DPBF/DMF溶液加入0.5mL游离ICG和FIP-NPs样品中(ICG等效浓度为15μg/mL)，在808nm 1.5W/cm2激光照射5min内，检测各样品在410nm处吸光度值随时间的变化；另外设置激光照射的DPBF对照组。
如图1B所示，在激光照射下，DPBF在游离ICG和FIP-NPs分散液中的吸光度随着照射时间的延长逐渐下降，趋势类似，说明FIP-NPs具有较好的ROS产生能力。
4、本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)体外光热评估实验
研究ICG浓度为15μg/mL时，用808nm激光(1.5W/cm2，5min)分别照射0.5mL PBS，游离ICG和FIP-NPs的升温情况和激光停止照射后的降温情况；并拍摄最高温度时的红外热成像图。
图1C是不同样品经激光照射5min内的温度升高和激光停止照射后的降温曲线，图1D是最高温度时的各样品的红外热成像图。其中，PBS的温度基本保持不变，聚合物囊泡包载ICG改善了游离ICG不稳定、容易被光漂白的不足，在激光照射下，FIP-NPs能够达到51.7℃，这一温度可造成肿瘤细胞的不可逆损伤。
实验例2
本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)体外温度响应性“由小到大”相变观察
1、应用共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscopy，CLSM)观察FIP-NPs的体外温度诱导蒸发和融合。将一滴稀释的FIP-NPs悬液滴在共焦皿上，温度从25℃增加到80℃，并在63×/1.40油镜下观察。
图2A为加热过程中获得的代表性图像，随着温度的升高，纳米粒的尺寸越来越大，也可以看见纳米粒的融合，当温度过高时，纳米粒破裂消失。
2、将一滴稀释的FIP-NPs悬液滴于细胞培养皿上。然后，将细胞培养皿置于金属浴上，将温度分别调节至37℃、60℃、70℃和80℃。加热至各温度后，立即在光学显微镜下快速观察拍照。
图2B为不同温度下获得的代表性图像，在37℃时没有明显变化，当温度上升到60℃时，PFH经历了相变，并开始形成微泡。当温度达到70℃时，几乎所有颗粒都变大并产生大量微泡，一些形成的微泡开始破裂。在更高的温度下(80℃)，可以观察到更大但更少的气泡。
3、将FIP-NPs放入乳胶指套中，并在温度分别设置为37℃、60℃、70℃和80℃的水浴中温育。乳胶指套中装入等量的脱气水用作对照。达到设定温度后，立即使用飞利浦CX50超声系统观察。
图2C为不同温度下获得的代表性体外超声图像，与上述显微镜观察结果一致。当温度升高到60℃和70℃时，在对比模式下，回波信号的对比度显著增强。相比之下，由于缺乏足够的微泡，在37℃和80℃的温度下很难观察到超声造影。
实验例3
1、本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)对BEL-7404肿瘤细胞的光毒性检测
将BEL-7404细胞用含10％胎牛血清的无叶酸RPMI1640培养基配成单个细胞悬液后接种到96孔板中(每孔103个细胞)，培养过夜，然后吸弃培养基，分别加入100μL含不同ICG等效浓度的各样品的培养基继续培养。孵育2h后，激光照射组细胞接受808nm 1.5W/cm2激光照射5min，继续孵育22h后，用PBS洗涤细胞，并加入含20μL MTS的100μL RPMI1640培养液中孵育30min。用酶标仪测定490nm处的吸光度，按照以下公式计算细胞存活率：
细胞存活率＝(实验组OD值-空白组OD值)/(阴性组OD值-空白组OD值)×100％
细胞毒性结果见图3A、B，没有激光照射时，各聚合物囊泡对肿瘤细胞基本没有毒性；当激光照射后，随着ICG浓度的增加，聚合物囊泡对细胞的杀伤作用增强。说明聚合物囊泡具有良好的生物相容性，在激光照射下才会产生较强的光毒性杀伤肿瘤细胞。
2、本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)对BEL-7404肿瘤细胞凋亡研究
消化下来的BEL-7404细胞以5×105/孔的细胞密度接种于6孔培养板。过夜后，加入用无叶酸培养基稀释的IP-NPs和FIP-NPs(使ICG浓度为15μg/mL)，孵育4h后收集细胞染色。为了考察给药组激光照射后的细胞凋亡情况，在孵育纳米粒2h后在1.5W/cm2 808nm激光下照射5min，再继续孵育2h；另设PBS组作为阴性对照。染色步骤按照索莱宝Calcein-AM/PI活细胞/死细胞双染试剂盒说明书操作。
图3C为PBS，IP-NPs和FIP-NPs与肿瘤细胞共孵育并在激光照射下的死/活细胞双染图，绿色荧光为活细胞激发出的荧光信号，红色荧光为死细胞激发的荧光信号。IP-NPs和FIP-NPs给药组在激光照射后肿瘤细胞出现大量死亡，而PBS处理组在视野中几乎无细胞死亡，且细胞存活率并未受到激光照射的影响，说明该递药系统在激光照射下能够有效杀伤肿瘤细胞。
实验例4
本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)的肿瘤细胞摄取评价
1、激光共聚焦显微镜检测细胞摄取：以每孔104个BEL-7404细胞接种于激光共聚焦皿，培养过夜后，培养皿中分别加入用无叶酸培养基稀释的游离ICG、IP-NPs和FIP-NPs(ICG浓度为15μg/mL)。叶酸预处理组在加FIP-NPs之前，与2μg/mL叶酸共培养2h。激光考察组在细胞与FIP-NPs共孵育2h后，用808nm近红外激光器在1.5W/cm2功率下照射5min后继续孵育2h，然后进行染色。具体染色步骤为：吸弃含药培养基，用PBS洗涤细胞2次，加入4％组织固定液固定细胞10min，再与Hoechst 33342孵育5min，最后加入500μL PBS去激光共聚焦观察。
2、流式细胞仪检测细胞摄取：以每孔106个BEL-7404细胞接种于6孔板，培养过夜后，培养皿中分别加入用无叶酸培养基稀释的游离ICG、IP-NPs和FIP-NPs(ICG浓度为15μg/mL)。叶酸预处理组在加FIP-NPs之前，与2μg/mL叶酸共培养2h。激光考察组在细胞与FIP-NPs共孵育2h后，用808nm近红外激光器在1.5W/cm2功率下照射5min后继续孵育2h，然后收集细胞并用PBS洗涤2次，通过流式细胞仪定量测定BEL-7404细胞摄取ICG的比例。
图4A和B分别为CLSM图和流式处理图，游离ICG组孵育细胞中几乎看不到ICG的荧光(流式荧光定量数值为15.7％)，IP-NPs处理组细胞质内ICG荧光要弱于FIP-NPs(流式荧光定量数值分别为24.5％和42.0％)，说明叶酸修饰的聚合物囊泡能够与BEL-7404细胞表面高表达的叶酸受体特异性结合，增强细胞对药物的摄取。当FIP-NPs样品组给予激光照射，细胞质内ICG荧光强度明显増强，流式细胞荧光定量显示能够达到58.4％，显著高于其他样品组，可能是由于激光照射增强了细胞膜的渗透性和流动性。
实验例5
本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)的肿瘤细胞产生ROS情况评价
1、激光共聚焦半定量细胞内活性氧含量：以每孔105个BEL-7404细胞接种于激光共聚焦皿，细胞培养过夜贴壁后，培养皿中加入用无叶酸培养基稀释的FIP-NPs(ICG浓度为15μg/mL)共孵育4h。具体染色步骤为：吸弃含药培养基，用PBS洗涤细胞2次，加入500μL 10μM carboxy-H2DCFDA，于培养箱中孵育10min，激光考察组此时用808nm近红外激光器在1.5W/cm2功率下照射5min，PBS洗一次后，4％组织固定液固定细胞10min，再与Hoechst33342孵育5min，最后加入500μL PBS用激光共聚焦观察。
2、流式细胞仪定量细胞内活性氧含量：以每孔106个BEL-7404细胞接种于6孔板，培养过夜后，培养皿中加入用无叶酸培养基稀释的FIP-NPs(ICG浓度为15μg/mL)共孵育4h。吸弃含药培养基，用PBS洗涤细胞2次，加入500μL 10μM carboxy-H2DCFDA，于培养箱中孵育10min，激光考察组此时用808nm近红外激光器在1.5W/cm2功率下照射5min，PBS洗一次后，收集细胞，并重悬于PBS中，用流式细胞仪检测荧光探针的荧光强度。
图5A和B分别为不同放大倍数下的CLSM图、图5C为流式处理图，与其他处理组相比，FIP-NPs+Laser组细胞内的活性氧荧光探针的强度要明显增高，为42.9％。这是因为叶酸靶向的作用能够促进肿瘤细胞对聚合物囊泡的摄取而使肿瘤内有较多ICG蓄积，同时加入激光照射能够显著促进活性氧的产生。
实验例6
本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)在体内的分布和荧光成像考察
肿瘤模型的建立：在6～8周龄的BALB/c雌性裸鼠的右侧靠近下肢部位皮下注射BEL-7404细胞(每只小鼠106个细胞)接种肿瘤。
当肿瘤在生长到～200mm3时，将所有小鼠随机分成三组。接下来，对小鼠进行尾静脉注射游离ICG、IP-NPs和FIP-NPs(每只小鼠7.5mg/kg ICG)。使用CRI Maestro成像系统在不同的时间点(1、8、24、48、72和96h)观察肿瘤部位的荧光强度。激发/发射波长设置为704/735nm。注射24h后，每组处死一只小鼠采集主要脏器和肿瘤的荧光图像。
图6A为尾静脉注射各样品后不同时间点小鼠体内ICG荧光成像图；图6B为肿瘤局部ICG的半定量荧光强度分析；图6C为尾静脉注射24h后离体主要脏器和肿瘤的荧光成像。游离ICG组显示快速的荧光清除和低肿瘤蓄积；而IP-NPs和FIP-NPs组均在尾静脉注射24h达到最大的肿瘤局部蓄积，其中FIP-NPs组的荧光强度要强于IP-NPs组，因为叶酸的主动靶向作用促进聚合物囊泡在肿瘤局部的积累。另外，FIP-NPs组的荧光在肿瘤部位滞留时间延长。
实验例7
1、本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)在体内的光热效果研究
荷BEL-7404肿瘤的小鼠随机分为四组，各组分别尾静脉注射PBS，游离ICG，IP-NPs和FIP-NPs(每只小鼠7.5mg/kg ICG)，24h后，小鼠肿瘤部位经1.5W/cm2 808nm近红外激光照射5min。通过近红外热成像仪监测肿瘤局部的升温情况和红外热成像图。
图7A和B分别为肿瘤局部的红外热成像图和温度-时间曲线。与对照组PBS相比，IP-NPs和FIP-NPs组均表现出优良的光热性能，最高温度都能超过50℃，足以抑制肿瘤的增殖并消融细胞。
2、本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)在体内的超声成像研究
荷BEL-7404肿瘤的小鼠随机分为三组，分别尾静脉注射FI-NPs和FIP-NPs(每只小鼠7.5mg/kg ICG)，另设无处理的小鼠作为对照。24h后，使用飞利浦CX50超声系统观察小鼠肿瘤部位；然后小鼠经1.5W/cm2 808nm近红外激光照射5min，立即进行超声成像观察。
图7C为肿瘤局部在激光照射前后的超声成像图片，对照组无论有无激光照射，均无明显的超声信号；而FI-NPs和FIP-NPs组在激光照射前有较弱的超声信号，后者在激光照射后超声信号明显增强，可能是由于温度达到PFH的沸点，利于PFH发生相变。
实验例8
本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)体内ROS产生情况和光热-光动力治疗后肿瘤细胞凋亡情况评价
1、荷BEL-7404肿瘤的小鼠随机分为四组，分别尾静脉PBS，游离ICG，IP-NPs和FIP-NPs(每只小鼠7.5mg/kg ICG)，24h后，瘤内注射50μL 1mg/mL DCFH-DA，2h后小鼠肿瘤经1.5W/cm2 808nm近红外激光照射5min，处死小鼠取出肿瘤，经冰冻切片染DAPI后用CLSM观察ROS荧光探针强度。
图8A为肿瘤组织内ROS荧光图，FIP-NPs治疗组经808nm激光诱导产生的ROS含量要高于IP-NPs治疗组，这是由于FIP-NPs治疗组小鼠有更多的ICG在瘤内蓄积。相比之下，游离ICG给药组由于自身不稳定性，体内清除率高和缺乏靶向性使其在肿瘤组织内几乎不产生ROS。
2、荷BEL-7404肿瘤的小鼠随机分为四组，分别尾静脉PBS，游离ICG，IP-NPs和FIP-NPs(每只小鼠7.5mg/kg ICG)，24h后，小鼠肿瘤经1.5W/cm2808nm近红外激光照射5min，24h后处死小鼠取出肿瘤，经TUNEL和H&E染色后观察肿瘤细胞凋亡情况。
图8B和C分别为肿瘤组织经TUNEL免疫荧光染色图和H&E染色图。FIP-NPs+Laser治疗组在近红外激光诱导下产生更多的ROS和更高的温度，从而有效促进肿瘤细胞凋亡。
实验例9
本发明实施例1制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡(FIP-NPs)体内抗肿瘤效果实验
荷BEL-7404肿瘤的小鼠在第0天肿瘤生长到～100mm3时，随机分为四组，在第0、5、10、15天各组分别尾静脉注射PBS，游离ICG，IP-NPs和FIP-NPs(每只小鼠7.5mg/kg ICG)，在24h后，激光照射组小鼠肿瘤部位经1.5W/cm2808nm近红外激光照射5min。从第0天开始，每两天测量所有小鼠的肿瘤大小和体重。肿瘤体积是根据公式计算的：肿瘤体积＝(长×宽2)/2。在第20天治疗结束后，处死小鼠，收集主要脏器，固定、脱水、切片、H&E染色，观察各脏器有无明显的病理异常。
图9A为不同治疗组的小鼠在第20天的图片，图9B和C分别为小鼠的肿瘤体积-时间和体重-时间变化曲线。仅使用FIP-NPs治疗的小鼠的肿瘤体积与PBS+Laser小鼠的肿瘤体积增长趋势相似，而其他组小鼠的肿瘤体积增长趋势要缓慢得多。在FIP-NPs+Laser治疗组中，有3只小鼠的肿瘤被消除。另外对所有组小鼠的重量进行了测量，不同组之间没有显著差异(图9C)。
图10为不同治疗组小鼠各主要器官的H&E染色图，各治疗组的小鼠主要器官均未出现明显的病理异常，表明该药物递送系统对正常组织没有明显的毒副作用，具有较高的生物安全性。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (10)

1.一种具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(a)将PCL-b-PEG-b-PCL、疏水性荧光染料和聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸溶于有机溶剂，然后，去除有机溶剂并形成一层均匀薄膜；
(b)将薄膜干燥后进行水化，随后，在冰浴以及匀浆条件下滴加全氟碳化合物，形成乳液；
(c)将乳液在冰浴条件下进行超声处理，除杂，得到所述具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述疏水性荧光染料中的荧光染料选自吲哚菁绿、IR780和IR820中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PCL-b-PEG-b-PCL、疏水性荧光染料以及聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸的质量比为(40～60)∶(4～6)∶1；
优选地，所述步骤(a)还包括：预先将聚乙二醇化磷脂修饰的叶酸溶于无水甲醇中。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述水化采用的溶剂为去离子水或pH为7.4的PBS溶液；水化温度为60～70℃，时间为4～6h；
所述溶剂的添加体积与PCL-b-PEG-b-PCL的质量比为(1～5)mL∶20mg。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PCL-b-PEG-b-PCL与全氟碳化合物的质量体积比为(80～120)mg：1mL。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述匀浆转速为(20～24)×103rpm，时间为8～12min。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述全氟碳化合物选自全氟己烷、全氟戊烷、全氟庚烷、全氟辛溴烷中的至少一种。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述超声处理采用3mm探头，功率为25％～35％，超声处理时间为18～25min，并且每间隔5s超声5s。
9.权利要求1～8任一所述的制备方法制备得到的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡。
10.权利要求9所述的具有肿瘤靶向功能的双模态成像指导的聚合物囊泡在制备肿瘤成像产品或抗肿瘤光热-光动力疗法药物中的应用；
所述肿瘤成像产品包括荧光成像产品和超声成像产品。
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