CN115068444A - 一种巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒及其制备方法，属于生物医药技术领域。所述巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒以包载有三溴丙酮酸和二甲双胍的脂质体作为内核，在脂质体表面包覆有巨噬细胞膜作为外壳。本发明的脂质体纳米粒不仅可以实现肿瘤部位的主动靶向，降低药物的毒副作用，且以其为平台装载抗肿瘤代谢药物的方法简单易行，有优异的生物相容性，为抗代谢药物的有效靶向递送提供了一种理想的仿生载体，具有良好的应用前景。

Description

一种巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒及其制备方法。
背景技术
糖代谢的异常被认为是肿瘤细胞的一个重要特征。与正常细胞不同，肿瘤细胞无论氧气是否存在都主要依赖糖酵解方式进行代谢，消耗大量葡萄糖并伴有乳酸的产生，这一过程被称为有氧糖酵解或Warburg效应，这是癌症的一个标志。基于Warburg效应，多种抗肿瘤糖酵解的药物应运而生，如3-溴丙酮酸(3BP)、2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)等。但最新的研究表明，肿瘤细胞可以在糖酵解和氧化磷酸化(OXPHOS)表型之间转换，交替应对代谢挑战，具有一定的代谢可塑性。针对混合状态消除代谢可塑性可能是一种新的治疗策略，以对抗癌症进展。
三溴丙酮酸(3-Bromopyruvic acid，3BP)是一种丙酮酸的结构类似物，可在MCT1受体的介导下被肿瘤细胞摄取。通过抑制糖酵解通路中己糖激酶II的活性，阻断ATP的产生进而杀死肿瘤细胞。研究发现3BP具有较高的安全性，对周围正常组织几乎没有损伤，具有优异的临床应用价值。二甲双胍(metformin，Met)是不仅是治疗2型糖尿病的一线药物，也是一种潜在的抗癌药物。研究发现Met在多种不同类型的肿瘤中有抗癌作用，主要通过抑制线粒体复合物Ⅰ，减少ATP的合成，以抑制肿瘤的生长。Met具有低成本、高安全性和能够逆转肿瘤多药耐药性(MDR)等优点。
研究发现，未经配制的抗癌药物，往往缺乏一定的靶向性和无法达到靶部位或靶细胞的有效剂量浓度，容易产生毒副作用。例如：3BP静脉输液产生灼热静脉注射的感觉，高GSH水平和血清蛋白可能使3BP灭活，EPR效应阻碍分子较小的3BP在肿瘤部位的滞留以及无法通过血脑屏障等；Met单药治疗的高剂量需求所带来的胃肠道副作用、高水溶性和较低肿瘤部位浓度等。这些均限制药物在临床中的广泛应用，因此迫切需要发现或开发新的具有较高靶向性，既安全又有效的载药平台。
脂质体(Liposome)是由两亲性磷脂分子通过自组装而形成的囊泡状微粒。具有生物相容性和可降解性的双分子层膜状结构，可包载亲水性及亲脂性的药物以改善药物的性质，因此常作为药物载体，用于构建药物递送系统。基于肿瘤的增强渗透与滞留效应(EPR效应)，脂质体可以被动在肿瘤部位富集。但被动靶向缺乏高效性，通常需要进一步的修饰来增加其靶向肿瘤细胞的能力，然而修饰过程都涉及多个合成步骤，过程复杂且较为困难。
通过提取细胞膜来包被纳米粒，达到伪装成自体成分被免疫系统识别和清除的生物仿生技术受到广泛关注。这种自上而下的方法绕过了费力的修饰工程，并且保留了抗原和细胞膜结构。研究表明巨噬细胞能够通过α4整合素与乳腺癌细胞上的血管细胞粘附分子1(VCAM-1)相互作用，从而与肿瘤细胞积极结合。因此本发明设计基于生物仿生技术构建一种巨噬细胞膜包裹载药脂质体的载药系统，用于递送3BP和Met，达到主动靶向肿瘤细胞，协同阻断肿瘤能量供应，抑制肿瘤的生长和转移的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于生物仿生技术的巨噬细胞膜包裹三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体纳米粒，以巨噬细胞膜作为外壳制备的脂质体纳米粒具有合成步骤简单、载药范围广、以及优异主动靶向性、生物相容性。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒，以包载有三溴丙酮酸和二甲双胍的脂质体作为内核，在脂质体表面包覆有巨噬细胞膜作为外壳。
进一步地，所述包载有三溴丙酮酸和二甲双胍的脂质体由大豆磷脂和胆固醇通过自组装作用形成。
上述巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，巨噬细胞膜的提取：将巨噬细胞通过挤出进行破膜，得到的细胞匀浆与蔗糖溶液混合，离心收集上清液，上清液经离心，得到纯化的巨噬细胞膜沉淀；
步骤2，采用薄膜分散法制备包裹三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体纳米粒；
步骤3，将步骤1得到的巨噬细胞膜和步骤2得到的脂质体纳米粒混合，挤出，得到所述巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒。
上述巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明基于生物仿生技术制备了巨噬细胞膜包裹三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体纳米颗粒，所使用的大豆磷脂和胆固醇通过自组装作用构成囊状的脂质双分子层，可包载亲水性及亲脂性的药物，3BP和Met被包封于脂质体的亲水空腔中。通过物理挤压作用，将巨噬细胞膜同三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体(MBL)共挤出，得巨噬细胞膜包裹的三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体纳米颗粒(RMBL)。所述的以巨噬细胞膜作为外壳制备的脂质体纳米粒可有效的保护MBL，增强其在生理条件下的稳定性，还可以通过α4整合素与癌细胞上的血管细胞粘附分子1(VCAM-1)相互作用，从而靶向肿瘤细胞，阻碍肿瘤能量供应，抑制肿瘤的生长和转移的作用。所述的巨噬细胞膜包裹的载药脂质体的递送系统，不仅可以实现肿瘤部位的主动靶向，降低药物的毒副作用，且以其为平台装载抗肿瘤代谢药物的方法简单易行，有优异的生物相容性，为抗代谢药物的有效靶向递送提供了一种理想的仿生载体，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为巨噬细胞膜包裹三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体纳米粒的制备流程。
图2为实施例1中所制备的RMBL粒径分布图。
图3为实施例1中空白脂质体(Lipos)和巨噬细胞膜包裹脂质体(R-Lipos)的透射电子显微镜图。
图4为实施例1中Lipos和R-Lipos纳米颗粒细胞摄取情况共聚焦显微镜观察图。
图5为实施例1中Lipos和R-Lipos纳米颗粒细胞摄取情况流式细胞仪检测结果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。
实施例1
巨噬细胞膜包裹三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体纳米粒制备方法，包括以下步骤：
1.巨噬细胞膜的提取
(1)巨噬细胞的培养：将巨噬细胞RAW 264.7接种于含10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养液中，并将其置于37℃含5％CO2的细胞培养箱中孵育。
(2)巨噬细胞的收集：当细胞生长密度达到80％时，用细胞刮刀收获细胞并悬浮在含有1mM PMSF的冰冷的1×Tris-Mg缓冲液(TM缓冲液)中。
(3)巨噬细胞膜的纯化：将1×108个的巨噬细胞通过400nm的无聚碳酸酯膜的脂质体挤出机，来回挤出20次进行破膜，得到细胞匀浆。然后将细胞匀浆与1M的蔗糖混匀，使蔗糖的终浓度为0.25M。离心机4℃、2000rpm离心15min，收集上清液。将上清液重复离心1次以去除剩余的细胞器。取上清液于4℃、10,000rpm离心15min，即获得纯化的细胞膜沉淀，最后，将纯化的细胞膜重悬于4℃、1mL PBS(pH＝7.4)中，待用。
2.巨噬细胞膜包裹脂质体纳米颗粒的制备：
(1)称取100mg磷脂和5mg胆固醇，加入5mL氯仿中，并充分溶解。
(2)将步骤(1)中的液体置于纳米乳置于真空旋转蒸发仪下，37℃缓慢旋蒸，并于37℃真空烘箱干燥过夜，完全除去有机溶剂，即形成脂质体薄膜。
(3)取10mL PBS其作为水相添加到步骤(2)中干燥后的脂质体薄膜，37℃充分混匀并搅拌2h进行水化，得到液体1。
(4)称取12mg的三溴丙酮酸和12mg二甲双胍并溶解于10mL PBS(pH＝7.4)中，其作为水相添加到步骤(2)中干燥后的脂质体薄膜，37℃充分混匀并搅拌2h进行水化，得到液体2。
(5)将步骤(3)中的液体1和步骤(4)中的液体2分别用超声波仪超声处理(功率0.2KW，工作3s，停止7秒，时长10min)，即可得到空白脂质体(Lipos)以及包载三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体(MBL)。
(6)将纯化的巨噬细胞膜分别和步骤(5)中的Lipos和MBL按体积比1:3混合，分别通过装有200nm聚碳酸酯膜的脂质体挤出仪，来回挤出20次，即可获得巨噬细胞膜包裹的空白脂质体纳米颗粒(R-Lipos)和巨噬细胞膜包裹的三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体纳米颗粒(RMBL)。
一、RMBL纳米粒的形态表征
采用马尔文粒径测定仪测定所制备的RMBL纳米颗粒的粒径，如图2所示，所制备的纳米颗粒的粒径大约为180nm，且粒度分布均匀。
乙酸铀溶液(1％，w/v)对Lipos和R-Lipos进行负染色，并通过透射电子显微镜进行形态学表征，如图3所示，对比Lipos的透射电镜图可知，RMBL具有明显的壳核结构，表明膜包脂质体的成功制备。
二、RMBL纳米粒的细胞摄取情况考察
巨噬细胞膜的修饰能够通过α4整合素与乳腺癌细胞上的血管细胞粘附分子1(VCAM-1)相互作用，从而靶向肿瘤细胞，增强细胞对RMBL的摄取能力。
将4T1细胞以2×105个细胞/皿的密度接种于35mm玻底培养皿中，在37℃细胞培养箱中孵育24h。当细胞密度达到约60％汇合度时，加入Cyanine5(Cy5)荧光标记的空纳米粒(Lipos/R-Lipos)，分别孵育2h。弃去培养基上清液，用PBS(pH 7.4)洗涤细胞3次。然后加入4％多聚甲醛在室温下固定15min，并用PBS洗涤2次。接下来加入2μg/mL DAPI染色10min以标记细胞核，并用PBS洗涤3次以去除多余的染料，最后滴加50μL抗荧光淬灭封固液，并用共聚焦激光扫描显微镜进行定性观察。如图4所示，红色为Cy5荧光标记的纳米粒，蓝色为细胞核染料颜色。结果显示R-Lipos组的细胞内荧光强度高于Lipos组，R-Lipos组的摄取量明显增多。
为了进一步量化细胞摄取，将4T1细胞以2×105个细胞/皿的密度接种于六孔板中，在37℃细胞培养箱中孵育24h。当细胞密度达到约80％汇合度时，加入Cy5荧光标记的NPs(Lipos/R-Lipos)，分别孵育2h。然后胰酶消化收集细胞，并用4％多聚甲醛固定10min，PBS洗涤3次。最后使用流式细胞仪测量细胞内荧光强度，并用FlowJo V10软件进行分析。如图5所示，结果与共聚焦观察一致，即表明巨噬细胞膜修饰的R-Lipos能显著增强4T1细胞的摄取量(P<0.5)。

Claims (4)

1.一种巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒，以包载有三溴丙酮酸和二甲双胍的脂质体作为内核，在脂质体表面包覆有巨噬细胞膜作为外壳。
2.根据权利要求1所述的巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒，其特征在于：所述包载有三溴丙酮酸和二甲双胍的脂质体由大豆磷脂和胆固醇通过自组装作用形成。
3.权利要求1所述的巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，巨噬细胞膜的提取：将巨噬细胞通过挤出进行破膜，得到的细胞匀浆与蔗糖溶液混合，离心收集上清液，上清液经离心，得到纯化的巨噬细胞膜沉淀；
步骤2，采用薄膜分散法制备包裹三溴丙酮酸和二甲双胍脂质体纳米粒；
步骤3，将步骤1得到的巨噬细胞膜和步骤2得到的脂质体纳米粒混合，挤出，得到所述巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒。
4.权利要求1所述的巨噬细胞膜包裹的脂质体纳米粒在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106075444A (zh) * 2016-07-18 2016-11-09 苏州大学 一种脂质体制剂及其制备方法与应用
WO2021098686A1 (zh) * 2019-11-18 2021-05-27 深圳先进技术研究院 一种跨越血脑屏障和特异性靶向脑胶质瘤治疗药物的投递系统的制备方法
CN114246843A (zh) * 2021-12-09 2022-03-29 同济大学 一种同时包埋有竹红菌素和顺铂的载药纳米粒子的制备方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106075444A (zh) * 2016-07-18 2016-11-09 苏州大学 一种脂质体制剂及其制备方法与应用
WO2021098686A1 (zh) * 2019-11-18 2021-05-27 深圳先进技术研究院 一种跨越血脑屏障和特异性靶向脑胶质瘤治疗药物的投递系统的制备方法
CN114246843A (zh) * 2021-12-09 2022-03-29 同济大学 一种同时包埋有竹红菌素和顺铂的载药纳米粒子的制备方法

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