CN101361714B

CN101361714B - 长春新碱-逆转剂复合纳米粒

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Publication number: CN101361714B
Application number: CN2008103048435A
Authority: CN
Inventors: 宋相容; 魏于全; 侯世祥
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2008-10-10
Filing date: 2008-10-10
Publication date: 2010-08-25
Anticipated expiration: 2028-10-10
Also published as: CN101361714A

Abstract

本发明涉及长春新碱逆转剂复合纳米粒及其制备方法和用途，属医药领域。本发明所解决的第一个技术问题是：克服多种肿瘤细胞对长春新碱存在的多药耐药现象。即将长春新碱及逆转剂复合包载于PLGA中制备纳米粒。为了获得较小粒径的纳米粒，同时减少表面活性剂的残留，采用F68和TPGS作为表面活性剂，TPGS和F68与PVA相比，可显著增加耐药乳腺癌细胞的死亡率(p＜0.05)；而TPGS的肿瘤抑制率又显著高于F68。

Description

长春新碱-逆转剂复合纳米粒

技术领域

本发明涉及长春新碱-逆转剂复合纳米粒及其制备方法和用途，属医药领域。

背景技术

肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指一种药物作用于肿瘤使之产生耐药性后，该肿瘤对未接触过的、结构无关、机制各异的多种抗肿瘤药物也具有交叉耐药性。它涉及临床常用的多种抗肿瘤药物，是肿瘤成功化疗最严重的障碍之一。过去二十余年，致力于通过恢复耐药肿瘤对化疗药物敏感性以克服多药耐药的研究，虽在体外实验中取得了一定逆转效果，但体内、特别是临床试验的结果则不甚理想。主要原因有：(1)多数高效逆转剂如维拉帕米除逆转活性外，还有其他药理作用，如抗高血压作用，普通制剂给药，对肿瘤组织缺乏选择性，因而其抗高血压作用就成为伴随逆转作用的副作用，导致较为严重的心血管系统毒性；(2)抗癌药物与逆转剂联用，多数需同时到达肿瘤部位，才能发挥较好疗效，普通制剂给药，不能保证两药同时到达肿瘤部位，因而不如体外实验结果理想。因此，采用靶向给药系统递呈抗癌药物与MDR逆转剂，成为抗癌药物与MDR逆转剂联合治疗耐药肿瘤研究的新趋势。

硫酸长春新碱(vincristine sulfate，VCR)的母体长春新碱是1962年由长春花中提取的二聚吲哚类化合物，其游离形式极不稳定，因此常用其硫酸盐形式。VCR为细胞周期特异性抗癌药物，作用于M期，对G1期也有作用。VCR抗肿瘤作用靶点是微管，主要抑制微管蛋白的聚合而影响纺锤体微管的形成，从而使有丝分裂停止于中期；还可干扰蛋白质代谢及抑制RNA多聚酶的活力；并抑制细胞膜类脂质的合成和氨基酸在细胞膜上的转运。临床上主要用于治疗急性淋巴细胞白血病、恶性淋巴瘤，绒毛膜上皮癌，对乳腺癌、小细胞肺癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤文氏瘤、脑瘤、平滑肌瘤及宫颈癌等也有一定疗效。近年来，发现胃癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、白血病、神经胶质瘤、卵巢癌、膀胱癌、结肠癌、人口腔鳞癌等多种肿瘤细胞对VCR存在多药耐药现象，严重影响其在临床上的抗癌效果。VCR的MDR主要由Pgp、MRP1、MRP2、MRP3、人核糖体蛋白S13、蛋白激酶C等介导。针对VCR的MDR，目前主要的策略有：一、采用联合用药的方法来提高其疗效，临床应用效果并不理想；二、提高用药剂量或给药次数，但VCR对神经系统毒副作用较大、对注射局部正常组织有较强刺激性且还有骨髓抑制作用，因此这种方法临床应用受限；三、将VCR与MDR逆转剂联合应用，研究报道最多的逆转剂是维拉帕米，其次是槲皮素，红霉素和牛精子PKC抑制剂及其他天然产物或中药逆转剂也有研究报道。

乳酸-羟基乙酸共聚物((poly(D，L-lactide-co-gly-colide)，PLGA)又名乳酸-羟乙醇酸共聚物、丙交酯乙交酯共聚物、聚乙丙交酯等，它是由羟乙酸(或称乙醇酸)和乳酸聚合而成。近年来，聚乳酸及其共聚物已成为一类重要的可生物降解的高分子材料，由于其水解作用后能完全分解为二氧化碳和水，通过新陈代谢途径排出体外，具有无毒安全可靠、良好的生物相容性及降解性能可控等优点，因而广泛用作生物医用材料，如手术缝合线、药物控制释放体系、骨科固定及组织修复材料。PLGA降解速率一般会随着分子量的增大而减小，但分子量不是共聚物降解速率唯一的决定因素。PLGA可以通过调节共聚物的组成来控制降解速度，随着GA含量的增加，共聚物PLGA的降解速率逐渐加快，GA含量为30％～40％的PLGA一个月内降解可达60％～80％。加上其易于合成、质量稳定、生物惰性、生物可降解性、降解速度可调节性和良好的可塑性等优点，它成为了近些年来常采用的控释给药系统的载体材料之一，已被美国FDA认可。

尚未见将长春新碱与逆转剂共同包载于同一个纳米粒的复方纳米粒，应用于抗耐药肿瘤活性。

发明内容

本发明所解决的第一个技术问题是：克服多种肿瘤细胞对长春新碱存在的多药耐药现象。

为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：将长春新碱及逆转剂复合包载于PLGA中制备纳米粒。

其中，长春新碱采用其硫酸盐——硫酸长春新碱(VCR)，逆转剂采用维拉帕米(verapamil，VRP)或槲皮素(quercetin，QC)。

PLGA、长春新碱、逆转剂三者的配比如下：

PLGA：20-80mg、长春新碱：50～1000μg、逆转剂：1mg～20mg；其中，PLGA采用有机溶剂溶解使其浓度为20-80mg/ml。PLGA的浓度在制剂时是一个很重要的参数，因为若其浓度大于80mg/ml制得纳米粒的粒径过大，若其浓度小于20mg/ml，则载药量和包封率过低，均无法应用，因此需控制其浓度在合理范围。

制备PLGA复合纳米粒可采用乳化溶剂挥发法、喷雾干燥法、自乳化/溶剂分散法、沉淀法、界面沉积法、溶剂-非溶剂法等，常用的表面活性剂为聚乙烯醇(PVA)。

为了获得较小粒径的纳米粒，制备工艺中PVA用量通常较大，尽管后期处理中会反复洗涤离心除PVA，但是由于大量PVA分子与纳米粒表面的PLGA相互连接形成了网络，不易除去，故而会有大量PVA残留。细胞试验结果显示，如果PVA残留较多，即使纳米粒粒径较小，细胞对纳米粒的摄取仍会显著降低。

因此本发明所解决的第二个技术问题即是为了获得较小粒径的纳米粒，同时减少表面活性剂的残留。为解决该技术问题所采用的技术方案为：以F68和TPGS作为表面活性剂。经过实验比较TPGS、F68、PVA三者作为表面活性剂的效果，TPGS和F68与PVA相比，可显著增加耐药乳腺癌细胞的死亡率(p＜0.05)；而TPGS的肿瘤抑制率又显著高于F68。

附图说明

图1复方纳米粒VCR-VRPNP、抗癌药物单药纳米粒和耐药逆转剂单药纳米粒联用制剂VCRNP+VRPNP、抗癌药物和耐药逆转剂游离药物联用制剂(VCR+VRP)治疗荷人耐药乳腺癌裸鼠，HE染色进行肿瘤组织学观察组织切片图。

其中，A为Saline组，B为VCR组，C为VCR+VRP组，D为VCR-PLGANPs+VRP-PLGANPs组，E为VCR-VRP-PLGANPs组。

具体实施方式

本发明长春新碱-逆转剂复合纳米粒，是将长春新碱及逆转剂复合包载于PLGA中制备而得。

PLGA、长春新碱、逆转剂三者的配比如下：

PLGA：20-80mg、长春新碱：50～1000μg、逆转剂：1mg～20mg；其中，PLGA采用有机溶剂溶解使其浓度为20-80mg/ml。

制备本发明长春新碱-逆转剂复合纳米粒可采用乳化溶剂挥发法、喷雾干燥法、自乳化/溶剂分散法、沉淀法、界面沉积法、溶剂-非溶剂法等，常用的表面活性剂为聚乙烯醇(PVA)。

如：

1.乳化溶剂挥发法采用单乳法

取PLGA适量，溶于CH₂Cl₂和丙酮组成的混合溶剂中，加入药物，超声混匀。加入表面活性剂溶液，探头超声，37℃旋转蒸发挥去有机溶剂，即得。其中，丙酮/CH₂Cl₂体积比为0.2～1，O/W体积比为1/2～1/8。

2.乳化溶剂挥发法采用复乳法

取PLGA适量，溶于CH₂Cl₂溶液中，加入药物，超声混匀。加入表面活性剂溶液，探头超声，形成油包水初乳(W/O)，再加入大量的表面活性剂溶液中，探头超声，形成复乳(W/O/W)，37℃旋转蒸发挥去有机溶剂，即得。其中，水相/CH₂Cl₂体积比为1/3～1/10，外水相体积为5～30ml。

3.沉淀法

取PLGA适量，溶于丙酮溶液中，加入药物，混匀。在搅拌条件下，缓慢滴入一定浓度表面活性剂溶液中，37℃旋转蒸发或室温搅拌挥去有机溶剂，即得。其中，丙酮/水相体积比为1/3～1/10。

在上述方法中，所采用的PLGA载体材料可以购买商品化的PLGA载体材料，也可以自行合成。其分子量：5000～30000，L∶G比例：25/75～75/25。

由于表面活性剂的选择对药效有显著差别，故发明人对比了如下三种表面活性剂的药效：PVA(分子量：20,000～70,000，浓度：0.5％～6％)，F68(浓度：0.5％～6％)，TPGS(浓度：0.5％～6％)。

对比PVA、F68和TPGS为表面活性剂指标的纳米粒粒径和包封率，试验结果见下表1。

表1

可见，F68与PVA比较，制备的纳米粒在粒径、粒径分布、VCR/VRP/QC三种药物的包封率方面没有显著差异，而TPGS作为表面活性剂制备的纳米粒粒径较PVA制备的粒径小，分布均匀。

另通过体外细胞毒实验考察三种表面活性剂的性能。

于-150℃冰箱取出MCF-7/Adr细胞，37℃水浴迅速解冻，转入离心管中，加RPMI-1640培养液10ml，1500rpm离心洗涤两次。然后转入培养瓶中，加入含青链霉素和10％胎牛血清的RPMI-1640培养液，在37℃，5％CO₂的孵箱中培养，待细胞贴壁后，更换成含1μg/ml Adr、青链霉素和10％胎牛血清的RPMI-1640培养液培养，细胞密度达70～80％时，用0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液消化，传代，同前述操作，先用无Adr的培养液培养，待细胞贴壁后，再更换为含1μg/ml Adr培养液培养。传代3次以后，再用无的培养液脱药培养2周以后，收集对数生长期的细胞，制成6×10³的细胞悬液，取100μL接种于96孔培养板中，培养24h，细胞贴壁后，分成多个试验组。加入用不同表面活性剂制备的载药纳米粒溶液，每个试验点设置三个复孔。37℃、5％CO₂培育一定时间后，每孔加入MTT(5mg/ml)20μL继续培养4h，吸弃培养液，加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，置振荡器振荡10min后，于酶标仪测定570nm波长处的吸光值(A)。每株细胞重复试验三次。按下式计算细胞抑制率。

细胞毒试验结果见表2。试验数据采用SPSS 13.0统计学处理软件进行方差分析，结果发现，TPGS和F68组与PVA比较，可显著增加耐药乳腺癌细胞的死亡率(p＜0.05)，而TPGS的肿瘤抑制率又显著高于F68组。

表2不同表面活性剂制备的复方纳米粒制剂体外细胞毒实验结果

^AP＜0.05，采用t检验与PVA比较进行统计学分析。

可见，TPGS和F68与PVA相比，培养不同的时间(24h，48h，72h)，都可显著增加耐药乳腺癌细胞的死亡率(p＜0.05)；说明TPGS和F68这两种表面活性剂制备的纳米粒的抗癌效果都较PVA好，而TPGS的肿瘤抑制效果又较F68略高。

通过上述方法制备而得的长春新碱-逆转剂复合纳米粒可用于制备为冻干制剂等制剂应用。发明人对长春新碱-逆转剂复合纳米粒胶束溶液的稳定性进行了初步研究，实验结果显示，纳米粒胶束溶液在室温和4℃放置6个月以后，纳米粒都有不同程度的聚集，为了提高纳米粒的稳定性，使其能够长期贮存，将纳米粒制成冻干制剂后可以长期贮存，采用冻干制剂复溶以后，纳米粒的粒径、包封率和载药量与冻干前没有显著性差异。

具体地，制备冻干制剂，支架剂可采用葡萄糖、乳糖、蔗糖或甘露醇，用量为1％～6％。冻干工艺为：将支架剂加入制备的纳米粒胶体溶液中，振摇使溶解完全，分装于5ml西林瓶中，置冻干机中冻干，即得。

一、体外抗耐药肿瘤活性试验结果。

复方纳米粒、抗癌药物单药纳米粒和耐药逆转剂单药纳米粒联用制剂、抗癌药物和耐药逆转剂游离药物联用制剂体外抗人耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR活性的比较研究。从表3和表4中可以看出，复方纳米粒和单药纳米粒联用制剂的细胞毒作用较游离药物联用制剂强。

表3为复方纳米粒VCR-VRPNP(CVn)、抗癌药物单药纳米粒和耐药逆转剂单药纳米粒联用制剂VCRNP+VRPNP(Cn+Vn)、抗癌药物和耐药逆转剂游离药物联用制剂(C-V)体外抗人耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR活性的比较研究。

表3

^AP＜0.05，采用t检验与游离VCR比较进行统计学分析。

可见，将VCR与VRP联用，比较两药游离药物联用、纳米粒联用及复方纳米粒这三种制剂对MCF-7/ADR的生长抑制作用。VCR与VRP联用，不管以哪种制剂形式给药，都比游离药物的细胞抑制活性高。用方差分析进行统计学处理，发现两药游离药物联用、纳米粒联用及复方纳米粒这三种制剂在作用三个不同的时间(24h，48h，72h)里，对耐药细胞的生长抑制作用没有显著差异，可能原因是三种药物都是同时与细胞接触，细胞通过内吞或胞饮作用摄取药物，不管VCR和VRP是以游离药物形式存在还是纳米粒形式存在，被细胞摄取的速度和程度是相似的。这也说明将VCR和VRP用PLGANPs包封后，仍然能够保持游离药物联用的MDR逆转活性。

表4为复方纳米粒VCR-QCNP、抗癌药物单药纳米粒和耐药逆转剂单药纳米粒联用制剂VCRNP+QCNP、抗癌药物和耐药逆转剂游离药物联用制剂(VCR+QC)体外抗人耐药乳腺癌细胞MCF-7/ADR活性的比较研究。

表4

^AP＜0.05，采用t检验与游离VCR比较进行统计学分析。

可见，PLGANPs对BEL-7402和MCR-7/Adr的生长抑制作用，在考察的三个时间里都明显高于VCR和QC游离药物联用组(P＜0.05)，与VCR-PLGANPs+QC-PLGANPs组无显著差异，说明用PLGANPs包封后，VCR和QC在PLGANPs载带下，通过内吞作用，摄取入胞内量增加，逆转效率增加，从而达到了较强的细胞生长抑制作用。

二、体内抗耐药肿瘤活性试验结果

表5复方纳米粒VCR-VRPNP、抗癌药物单药纳米粒和耐药逆转剂单药纳米粒联用制剂VCRNP+VRPNP、抗癌药物和耐药逆转剂游离药物联用制剂(VCR+VRP)治疗荷人耐药乳腺癌裸鼠，肿瘤体积生长曲线。

表5

^AP＜0.05，与生理盐水组进行比较，采用t检验进行统计学分析

可见，VCR-PLGANPs+VRP-PLGANPs组和VCR-VRP-PLGANPs组的肿瘤质量明显小于生理盐水组。这可能是由肿瘤的EPR效应引起的^[3]。肿瘤组织血管丰富，毛细血管壁通透性亢进，纳米粒比较容易进入，而肿瘤组织又缺乏有效的淋巴排泄，纳米粒消除减慢，从而增加了VCR和VRP在肿瘤内的滞留，延长了药物对肿瘤的生长抑制作用。

三、选用常用的HE染色进行肿瘤组织学观察。

苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。HE染色可以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。HE染色后显微照片见图1(A-E)。可见，VCR-VRPNP对肿瘤的治疗效果明显优于VCRNP+VRPNP和VCR+VRP。病理切片观察发现，生理盐水组肿瘤生长迅速，增生层很厚；VCR组肿瘤生长性状与生理盐水组极为相似，仅有极少量坏死，除可能是药物的杀伤作用外，也可能是瘤体内部供血不足所致；VCR与VRP联用的三组制剂均可致肿瘤不同程度的坏死，说明VRP可以逆转MCF-7/Adr裸鼠异位移植瘤对VCR的耐药性，增加该耐药肿瘤对VCR的敏感性，从而使VCR对MCF-7/Adr肿瘤细胞的杀伤力大大增加。其中VCR-VRP-PLGANPs组肿瘤细胞坏死率最高，可能原因是VCR和VRP用PLGANPs包封后，因EPR效应在肿瘤中的滞留增加，且PLGANPs的缓释作用，使VCR能够持续杀伤MCF-7/Adr肿瘤细胞，此外，VCR-VRP-PLGANPs可将VCR和VRP同时递送到MCF-7/Adr肿瘤细胞，使VRP能够最大程度发挥多药耐药逆转作用，增加VCR对MCF-7/Adr肿瘤细胞的杀伤作用，因此，VCR-VRP-PLGANPs对MCF-7/Adr肿瘤细胞的杀伤作用强于VCR-PLGANPs和VRP-PLGANPs的机械复合物。

四、体内药动学结果

表6和表7为复方纳米粒VCR-VRPNP、抗癌药物单药纳米粒和耐药逆转剂单药纳米粒联用制剂VCRNP+VRPNP、抗癌药物和耐药逆转剂游离药物联用制剂(VCR+VRP)在正常大鼠体内的药-时曲线图。

表6 VCR的药-时数据(n＝6)

^AP＜0.05，与VCR组进行比较，采用t检验进行统计学分析

^AAP＜0.01，与VCR组进行比较，采用t检验进行统计学分析

可见，VCR与VRP游离药物联用后与VCR单药比较，血药浓度在各个时间点都有所增加，提示VRP可改变VCR的药动学参数，减慢VCR在体内的清除速度。VCR-VRP-PLGANPs静脉给药后，VCR的血药浓度在各个时间点都显著高于游离VCR给药组，也高于VCR+VRP组，可能原因是PLGANPs可进一步减慢VCR在体内的清除速度，从而改变了VCR的药动学参数。但VCR-PLGANPs+VRP-PLGANPs组与VCR+VRP组比较，VCR的血药浓度却没有显著差异，说明单药纳米粒联用制剂与复方纳米粒的体内动力学过程存在差异。

表7 VRP的药-时数据(n＝6)

^AP＜0.05，与VRP组进行比较，采用t检验进行统计学分析

^AAP＜0.01，与VRP组进行比较，采用t检验进行统计学分析

可见，VRP与VCR游离药物联用与VRP单药比较，血药浓度没有显著差异；而制成纳米粒制剂后，纳米粒联用制剂和复方纳米粒都使其Cmax显著增加，且在不同时间点，都较VRP游离药物血药浓度高。VRP作为VCR的逆转剂，有效血药浓度最好维持在5μg/mL左右^[8]。VCR-VRP-PLGANPs静脉给药后，维持VRP 5μg/mL的浓度水平可长达6h，而游离VRP 1.5h以后血药浓度就低于5μg/mL，这说明PLGANPs可改变VRP的药动学参数，可能作用机制是延缓了VRP在体内的消除。VCR-PLGANPs+VRP-PLGANPs组VRP的血药浓度高于VCR+VRP，低于VCR-VRP-PLGANPs组，与其对VCR的药-时数据规律不同，提示单药纳米粒联用制剂与复方纳米粒的体内动力学过程不仅存在差异，且对不同的药物作用各异。

综上说明VCR和VRP制成纳米粒制剂后，纳米粒联用制剂和复方纳米粒都使VCR和VRP两种药物的Cmax显著增加，且在不同时间点，都较VRP游离药物血药浓度高。

五、急性毒性试验结果。

LD50试验数据见下表8，可见复方纳米粒和纳米粒联用制剂的毒性明显低于游离药物。

表8

Claims

1.长春新碱-逆转剂复合纳米粒，其特征在于：将长春新碱及逆转剂复合包载于PLGA中，PLGA、长春新碱、逆转剂三者的配比如下：PLGA：20-80mg、长春新碱：50～1000μg、逆转剂：1mg～20mg；

其中，PLGA采用有机溶剂溶解使其浓度为20-80mg/ml，所述的长春新碱为硫酸长春新碱，所述的逆转剂为维拉帕米或槲皮素；

复合纳米粒是采用乳化溶剂挥发法、喷雾干燥法、沉淀法、界面沉积法、溶剂-非溶剂法制备而得；制备方法中使用的表面活性剂为F68或TPGS。

2.根据权利要求1所述的长春新碱-逆转剂复合纳米粒，其特征在于：所述乳化溶剂挥发法采用单乳法，即取PLGA，溶于CH₂Cl₂和丙酮组成的混合溶剂中，加入长春新碱和逆转剂，混匀；加入表面活性剂溶液，超声，挥去有机溶剂，即得；其中，丙酮/CH₂Cl₂体积比为0.2～1，O/W体积比为1/2～1/8。

3.根据权利要求1所述的长春新碱-逆转剂复合纳米粒，其特征在于：所述乳化溶剂挥发法采用复乳法，即取PLGA，溶于CH₂Cl₂溶液中，加入长春新碱和逆转剂，混匀；加入表面活性剂溶液，探头超声，形成油包水初乳，再加入表面活性剂溶液中，探头超声，形成W/O/W型复乳，挥去有机溶剂，即得；其中，水相/CH₂Cl₂体积比为1/3～1/10，外水相体积为5～30ml。

4.根据权利要求1所述的长春新碱-逆转剂复合纳米粒，其特征在于：所述沉淀法为，取PLGA，溶于丙酮溶液中，加入长春新碱和逆转剂，混匀；在搅拌条件下，缓慢滴入表面活性剂溶液中，挥去有机溶剂，即得；其中，丙酮/水相体积比为1/3～1/10。