CN104415029A - 一种穿心莲内酯聚合物胶束及其制备方法与医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的两亲性嵌段共聚物与穿心莲内酯形成的胶束载药系统。该两亲性嵌段共聚物包括亲水性链段和疏水性链段，其疏水性链段端基用疏水性基团封端。所述疏水性基团为乙酰基、叔丁酰基、叔丁乙酰基、苯甲酰基、氨基酸残基、或氨基酸衍生物残基中的一种，不仅改善药物分子和嵌段共聚物中疏水性链段的相容性，增加其相互间的作用力，同时为容纳药物分子提供更大的空间，所制备的胶束能够更有效的将药物分子限制在胶束的核中使其不易溶出，从而获得具有高度稳定性的载药胶束。

Description

一种穿心莲内酯聚合物胶束及其制备方法与医药用途

技术领域

本发明涉及穿心莲内酯与两亲性嵌段共聚物形成的稳定聚合物胶束载药系统及其制备方法与医药用途，属纳米药物制剂领域。

背景技术

穿心莲内酯（Andrographolide）为爵床科植物穿心莲（Andrographis Paniculata(bunn.f.)Nees）中提取得到的一种具有半日花烷骨架的二萜内酯类化合物，化学名3,19-dihydroxy-8(17),13-laboiadien-16,15-olide，化学结构如下所示：

研究表明，穿心莲内酯具有抗炎、抗菌、抗病毒等广泛的生理活性，能够抑制TNF-α、IL-1β和LPS等诱导的腹膜炎模型中白细胞向腹腔的浸润，抑制LPS引起的内毒素休克，以及嗜酸性粒细胞介导的过敏性呼吸道炎症，对细菌性与病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊疗效，被誉为天然抗生素【Basak A,et al.Inhibition of proprotein convertases-1,-7andfurin by diterpines of Andrographis paniculata and their succinoyl esters.Biochem J1999,338(Pt1):107-113；Chiou W F,et al.Andrographolide suppresses the expression of induciblenitric oxide synthase in macrophage and restores the vasoconstriction in rat aorta treated withlipopolysaccharide.Br J Pharmacol1998,125(2):327-334；Calabmse C,et al.A phase I trial ofandrographolide in HIV positive patients and normal volunteers.Phytother Res2000,14(5):333-338；Chiou W F,et al.Mechanisms of suppression of inducible nitric oxide synthase(iNOS)expression in RAW264.7cells by andrographolide.Br J Pharmacol2000,129(8):1553-1560；Batkhuu J,et al.Shen Y C,et al.Andrographolide prevents oxygen radicalproduction by human neutrophils:possible mechanism(s)involved in its anti-inflammatoryeffect.Br J Pharmacol2002,135(2):399-406；Xia Y F,et al.Andrographolide attenuatesinflammation by inhibition of NF-κB activation through covalent modification of reducedcysteine62of p50.J Immunol2004,173(6):4207-4217；Hidalgo M A,et al.Andrographolideinterferes with binding of nuclear factor-kappaB to DNA in HL-60-derived neutrophilic cells.Br J Pharmacol2005,144(5):680-686.】。近年来的研究还发现，穿心莲内酯可通过细胞毒活性、诱导细胞凋亡、诱导细胞周期阻滞以及抗肿瘤新生血管的生成等多种途径对肿瘤细胞的体内外增殖发挥直接或间接的抑制作用，显示广谱抗肿瘤活性，是一种备受关注的天然抗肿瘤候选药物【Zhou J,et al.Critical role of pro-apoptotic Bcl-2family members inandrographolide-induced apoptosis in human cancer cells.Biochem Pharmacol2006,72(2):132-144.Cheung H Y,et al.Andrographolide isolated from andrographis paniculata inducescell cycle arrest and mitochondrial-mediated apoptosis in human leukemic HL-60cells.PlantaMed2005,71(12):1106-1111；Li W,et al.Secondary metabolites from Andrographis paniculata.Chem Pharm Bull(Tokyo)2007,55(3):455-458.】。

穿心莲内酯为无色结晶性粉末，无臭，味苦，溶解性极差，仅在沸乙醇中溶解，在甲醇或乙醇中略溶，在三氯甲烷中极微溶解，在水中则几乎不溶，其临床应用的给药途径均为口服，且普遍存在生物利用度低的问题（＜3%），因而限制了临床疗效的发挥。以改善溶解性为目标，从而实现注射途径给药的化学结构修饰受到关注。目前已应用于临床的品种有：穿琥宁（14-脱羟-11,12-二脱氢穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯单钾盐）、炎琥宁（14-脱羟-11,12-二脱氢穿心莲内酯-3,19-二琥珀酸半酯钾钠盐）、莲必治（亚硫酸氢钠穿心莲内酯）、喜炎平（穿心莲内酯总磺化物）等。然而，这些品种普遍存在肾毒性，以及过敏反应、致血小板和白细胞减少等不良反应，用药安全性和顺应性较低，且在有效性上均不及母体化合物穿心莲内酯【邓文龙,等.十三种穿心莲注射液的药理作用比较研究：解热、抗炎作用及毒性.中药通报1985,10(7):38-42;贺敬敏,程国印.穿心莲内酯不同盐类注射剂不良反应分析.中国药业2011,20(19):60-61.】。因此，针对穿心莲内酯的给药系统研究引起广泛关注，其中包括滴丸、固体分散体、环糊精包合物、脂质体、微囊、微乳、微球和纳米粒等众多剂型【毛声俊,等.一种穿心莲内酯脂微球制剂及其制备方法.ZL200510020527.1,2005-10-26；童玉新,等.一种穿心莲内酯滴丸及其制备方法.CN1626076A,2005-06-15；王康,等.穿心莲内酯固体分散体的制备及体外溶出实验.中国现代应用药学杂志2009,26(8):638-641；Ren K,et al.Physicochemical characteristicsand oral bioavailability of andrographolide complexed with hydroxypropyl-β-cyclodextrin.Pharmazie,2009,64(8):515-520；Du H,et al.Preparation and evaluation of andrographolide-loaded microemulsion.Journal of Microencapsulation2012,29(7):657-665】。目前，这些给药系统多处于学术研究阶段，具有临床应用和开发价值的穿心莲内酯给药系统研究仍是一项挑战。

聚合物胶束是近年来发展起来的一种新型给药系统。胶束通常由大量两亲性嵌段共聚物分子链定向排列组成，其疏水链段通过和药物分子之间弱的相互作用将药物包裹于核中，亲水链向外稳定胶束，呈现典型的核-壳结构。聚合物材料具有生物可降解性和良好的生物相容性。聚合物胶束不仅能增加药物的溶解度，提高治疗剂量，而且药物包裹其中，可避免降解失活，减少毒副反应。胶束粒径通常在100nm以下，且外围为亲水性PEG链段，因此可以躲避网状内皮系统（RES）的吞噬，延长体循环时间，并通过EPR效应（高通透性和滞留效应，enhanced permeability and retention effect）达到对肿瘤等组织被动靶向的效果。另外，由于聚合物胶束分子量大，因此也能防止肾清除。与小分子表面活性剂相比，聚合物胶束的CMC值（临界胶束浓度）非常低，在载药胶束稀释时，也能保持胶束结构的稳定。胶束给药系统载药量可达25%，完全可以满足临床用量的需要。

发明内容

本发明的目的在于提供穿心莲内酯聚合物胶束，以解决现有技术中存在的上述问题。本发明的两亲性嵌段共聚物以具有公认安全性的聚乙二醇单甲醚-聚酯嵌段共聚物为基础材料，并将聚酯链段的端羟基用疏水性基团进行改性，引入具有叔丁氧羰基或者苯环结构的具有较大空间结构的疏水性基团，不仅改善药物分子和嵌段共聚物中疏水性链段的相容性，增加其相互间的作用力，而且引入的疏水性基团具有较大的空间结构，为药物分子进入胶束的核提供了更大的空间，从而使其更加不易溶出。从而获得具有高度稳定性的载药胶束。该发明的最大意义在于提高胶束的在溶液状态的稳定性，尤其是体内的稳定性，从而发挥胶束的EPR效应，达到更高的生物利用度和更好的治疗效果。

本发明提供的技术方案如下：

一种穿心莲内酯聚合物胶束，其特征在于该胶束载药系统包含两亲性嵌段共聚物、治疗有效量的穿心莲内酯以及药学上可接受的药用辅料，所述的两亲性嵌段共聚物包括亲水性链段和疏水性链段，其亲水性链段为数均分子量在400～20000之间的聚乙二醇（PEG）或聚乙二醇单甲醚（mPEG），其疏水性链段选自采用疏水性基团封端的数均分子量在500～100000之间的聚丙交酯（PLA）、聚乙交酯（PGA）、聚乙丙交酯（PLGA）、聚己内酯（PCL）、聚碳酸酯（PTMC）或其衍生物、或者聚二氧环己酮（PPDO）或其衍生物中的一种，所述的疏水性基团选自乙酰基、叔丁酰基、叔丁乙酰基、苯甲酰基、氨基酸残基、或氨基酸衍生物残基中的一种。

本发明所提供的制备载药聚合物胶束制剂的穿心莲内酯可以为天然提取物或人工合成物，在形态上可以是全部结晶、部分结晶、全部无定形或晶体相与无定形相的混合物。

在推荐的实施例中，所述亲水性链段的数均分子量在750～5000之间；所述的疏水性链段的数均分子量在1000～50000之间。

本发明中两亲性嵌段共聚物和穿心莲内酯的重量比在99.5:0.5～50:50之间，优选99:1～70:30之间。

本发明制备得到的胶束的平均粒径在5～500nm之间，优选10～100nm之间。

本发明所述的药用辅料为冻干赋形剂，选自乳糖、甘露醇、右旋糖酐、蔗糖、海藻糖、果糖、葡萄糖、海藻酸钠、甘氨酸或明胶中的至少一种，冻干赋形剂占整个体系的重量比为0～99.9%之间，优选10～80%之间。

本发明另一目的在于提供一种胶束载药系统的制备方法，包括透析法、直接溶解法、薄膜水化法、固体分散法、高能均质乳化法，优选薄膜水化法和固体分散法。

薄膜水化法的具体步骤为：将聚合物辅料和药物溶解于有机溶剂，经旋转蒸发去除溶剂后，加入注射用水、生理盐水、5%葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液为分散介质，溶解药膜得载药胶束溶液，经过滤除菌冻干后得胶束冻干粉。

固体分散法的具体步骤为：将药物溶解于加热后处于熔融状态的聚合物辅料（这一过程可适当添加少量有机溶剂帮助溶解）得到澄清的混合物，再加入注射用水、生理盐水、5%葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液为分散介质，溶解得胶束溶液，经过滤除菌后冻干得胶束冻干粉。

在推荐的实施例中，所用有机溶剂为乙醇、甲醇、叔丁醇、三氟乙醇、六氟异丙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、氯仿、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的混合溶剂，优选为乙醇。

在推荐的实施例中，所述的冻干步骤前有无菌处理步骤。

本发明所制备得到的穿心莲内酯聚合物胶束，不含任何有机溶剂，临床使用时可以用注射用水、葡萄糖注射液或生理盐水重新溶解进行注射途径给药，也可以适量温开水冲开口服。本发明的冻干制剂再溶解时溶解迅速，所得溶液澄清透明。

本发明的另一目的是提供穿心莲内酯聚合物胶束在制备治疗感染性疾病药物中的用途，所述的感染性疾病包括全身炎症反应综合症、急性病毒性上呼吸道感染、病毒性细菌性肺炎、流行性感冒、急慢性支气管炎、急性肠胃炎、急性细菌性痢疾、急性黄疸型肝炎、腹泻、慢性前列腺炎、精囊炎、泌尿系统感染、结膜炎、单纯疱疹性角膜、急慢性鼻炎、鼻窦炎、咽炎、化脓性扁桃体炎、单纯性中耳炎、盆腔炎、附件炎、子宫内膜炎、盆腔炎和术后感染。

本发明的另一目的是提供穿心莲内酯聚合物胶束在制备治疗肿瘤药物中的用途，所述的肿瘤包括癌症、恶性肿瘤、卡波西肉瘤、继发于组织损伤的失调的组织或细胞增生，优选治疗肝细胞癌、肝转移瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、前列腺癌和头颈癌。

本发明中提及的治疗有效量指的是上述胶束载药系统含有的药物的量能有效地治疗所述适应症。

与现有技术相比，本发明具有以下的特点：

1）本发明有效解决了穿心莲内酯因水溶性差而无法直接注射给药的问题，可用于皮下、肌肉和静脉等多种方式的注射给药。与此同时，通过形成胶束，可实现对穿心莲内酯的高度分散，极大地提高了其口服给药的生物利用度，并可有效掩盖普通穿心莲内酯口服制剂的严重苦感。

将穿心莲内酯制成高分子载药胶束，供临床注射或口服使用，目前尚未有相关文献报道。本发明所提供的穿心莲内酯聚合物制剂处方简单，所用辅料安全性好，可充分保证临床使用的安全性和顺应性。本发明所提供的穿心莲内酯聚合物胶束制剂制备工艺简单，适于GMP生产，产品质量稳定、可控。

2）本发明将聚酯链段的端羟基用疏水性基团进行改性，通过改善药物分子和嵌段共聚物中疏水性链段的相容性，增加其相互间的作用力，同时增加胶束核中可容纳药物分子的空间，将药物分子限制在胶束的核中使其不易溶出，从而获得了一系列在体内外均具有高度稳定性的载药胶束，该载药胶束可制成冻干制剂；

试验结果证明：本发明的两亲性嵌段共聚物制备得到的抗肿瘤药物载药胶束的制成的冻干制剂复溶后可迅速分散形成无色的澄清溶液，该溶液在室温环境下依然至少可稳定72小时以上无明显药物沉淀析出，经注射后在体内可有效发挥EPR效应。

附图说明

附图1为穿心莲内酯聚合物胶束粒径分布图；

附图2为穿心莲内酯聚合物胶束电镜图；

附图3为穿心莲内酯聚合物胶束大鼠尾静脉注射的药时曲线；

附图4为穿心莲内酯聚合物胶束大鼠灌胃的药时曲线；

附图5为穿心莲内酯聚合物胶束对LPS诱导的巨噬细胞体外释放一氧化氮的抑制作用；

附图6为穿心莲内酯聚合物胶束对蛋清致大鼠足趾肿胀的影响。

具体实施方式

以下实施例和试验例，不以任何方式限制本发明，本发明的宗旨和范围不限于这些实施例中所描述的具体条件或细节，而是由权利要求保护范围限定。

实施例1两亲性嵌段共聚物的制备

（1）甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯嵌段共聚物（mPEG₃₄₀₀-PLA₁₈₀₀）：取50g mPEG（数均分子量为3400）加到聚合瓶中，加热至100℃，真空脱水2h后加入36mg辛酸亚锡和36gD,L-丙交酯（D,L-LA），真空密闭反应瓶，在125℃反应15h。用二氯甲烷溶解反应物，加入大量乙醚充分沉淀聚合物，经过滤、真空干燥即得。

（2）苯甲酰基封端的甲氧基聚乙二醇-聚丙交酯嵌段共聚物（mPEG₃₄₀₀-PLA₁₈₀₀-Bz）：取38g mPEG₃₄₀₀-PLA₁₈₀₀加190ml乙酸乙酯溶解，加入2.8ml三乙胺，在搅拌下滴加2.3ml苯甲酰氯，滴加完毕后将上述溶液加热至沸腾，继续回流反应6h，过滤去除不溶物后加入大量乙醚沉淀聚合物，经过滤、真空干燥即得。

（3）甲氧基聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物（mPEG₅₀₀₀-PCL₄₀₀₀）：取50g mPEG（数均分子量为5000）加入到聚合瓶中，加热至130℃，真空脱水4h后加入57mg辛酸亚锡和57g己内酯（CL），真空密闭反应瓶，在135℃反应24h。用二氯甲烷溶解反应物，加入大量乙醚充分沉淀聚合物，经过滤，真空干燥即得。

（4）乙酰基封端的甲氧基聚乙二醇-聚己内酯嵌段共聚物（mPEG₅₀₀₀-PCL₄₀₀₀-Ac）：取9gmPEG₅₀₀₀-PCL₄₀₀₀加入45ml四氢呋喃溶解，加入0.28ml三乙胺，将上述溶液冷却至-10℃，在搅拌下加入0.16g乙酰氯，滴加完后在0℃反应1h，室温继续反应1h，过滤去除不溶物后加入大量乙醚沉淀聚合物，经过滤，真空干燥即得。

（5）甲氧基聚乙二醇-聚（乙丙交酯）嵌段共聚物（mPEG₂₀₀₀-PLGA₂₀₀₀）：取18.2g mPEG（数均分子量为2000）加入到聚合瓶中，加热至100℃，真空脱水3h后加入26mg辛酸亚锡，11.6g乙交酯（GA）和14.4g D,L-丙交酯（D,L-LA），真空密闭反应瓶，在130℃反应15h。用二氯甲烷溶解反应物，加入大量乙醚充分沉淀聚合物，经过滤、真空干燥即得。

（6）叔丁酰基封端的甲氧基聚乙二醇-聚（乙丙交酯）嵌段共聚物（mPEG₂₀₀₀-PLGA₂₀₀₀-TB）：取4g mPEG₂₀₀₀-PLGA₂₀₀₀加20ml二氯甲烷溶解，加入0.5g碳酸钾，搅拌下加入0.25g特戊酰氯，室温反应24h，过滤去除不溶物后加入大量乙醚沉淀聚合物，经过滤、真空干燥即得。

实施例2穿心莲内酯聚合物胶束冻干制剂制备

（1）mPEG₅₀₀₀-PCL₄₀₀₀-Ac/穿心莲内酯聚合物胶束及其冻干制剂的制备

取150mg实施例1（4）中制得的mPEG₅₀₀₀-PCL₄₀₀₀-Ac和30mg穿心莲内酯溶解于2ml四氢呋喃，搅拌下缓慢滴加5ml超纯水，滴加完毕后该溶液在室温下搅拌过夜去除有机溶剂后得带有明显蓝色乳光的澄清紫杉醇胶束溶液，加入120mg甘露醇，所得溶液经0.22μm除菌膜过滤后冻干得穿心莲内酯聚合物胶束冻干粉。经HPLC分析，药物包封率为96.5%，载药量大于15.4%，平均粒径18.7nm，分散系数PDI0.1。粒径分布与形态分别见附图1、2。该胶束冻干粉用生理盐水复溶成5mg/mL浓度的溶液后，在室温下稳定时间大于72h。

（2）mPEG₃₄₀₀-PLA₁₈₀₀-Bz穿心莲内酯聚合物胶束及其冻干制剂的制备

取100mg穿心莲内酯和1.9g实施例1(2)中制得的mPEG₃₄₀₀-PLA₁₈₀₀-Bz溶解于25ml无水乙醇，45℃下通过旋转蒸发去除有机溶剂，加入25ml生理盐水溶解药膜，加入400mg乳糖后溶液经0.22μm除菌膜过滤后冻干后得穿心莲内酯聚合物胶束冻干粉。经HPLC分析，药物包封率为95.8%，载药量4.76%，平均粒径为23.3nm，分散系数PDI0.02。该胶束冻干粉用生理盐水复溶成5mg/mL浓度的溶液后，在室温下稳定时间大于72h。

（3）mPEG₂₀₀₀-PLGA₂₀₀₀-TB/穿心莲内酯聚合物胶束及其冻干制剂的制备

取1.9g实施例1（6）中制得的mPEG₂₀₀₀-PLGA₂₀₀₀-TB加热至50℃使之熔融，然后加入100mg卡巴他赛，在搅拌下使其溶解于聚合物中得到澄清透明的混合物，加入25ml预热至50℃的生理盐水溶解聚合物/药物的混合物得胶束溶液，再加入400mg蔗糖后溶液经0.22除菌膜过滤后冻干得穿心莲内酯聚合物胶束冻干粉。经HPLC分析，药物包封率为96.2%，载药量大于4.82%，平均粒径为24.2nm，分散系数小于PDI0.02。该胶束冻干粉用生理盐水复溶成5mg/mL浓度的溶液后，在室温下稳定时间大于72h。

实施例3穿心莲内酯聚合物胶束在大鼠体内的药代动力学

（1）穿心莲内酯聚合物胶束大鼠尾静脉注射的血浆药时曲线

试验药物：穿心莲内酯聚合物胶束冻干制剂按照实施例2(1)制得，临用前以生理盐水溶解，制成每1ml含穿心莲内酯10mg的溶液。另以DMSO为溶剂溶解穿心莲内酯，制成每1ml含穿心莲内酯10mg的穿心莲内酯注射液，作为参比制剂。

给药与取血方案：SD大鼠12只，体重200～220g，随机分为两组，每组6只，雌雄各半，分别经尾静脉注射给予穿心莲内酯聚合物胶束溶液和DMSO溶液，给药剂量以穿心莲内酯计均为20mg/kg。于给药后不同时间点经由大鼠眼内眦取血0.5ml，置经肝素处理的离心管中，离心分离血浆，HPLC-MS/MS法测定穿心莲内酯的血药浓度。

结果：两种制剂经尾静脉注射给药后大鼠血浆的穿心莲内酯药物浓度经时变化曲线见附图3。血药浓度数据经DAS2.0软件处理得主要药动参数。其中，胶束制剂的AUC_0-∞为8.68mg/L*h、t_1/2为3.07h、CL为2.305L/h/kg、C_max为16.7mg/L；普通注射液（DMSO）的AUC_0-∞为1.54mg/L*h、t_1/2为1.40h、CL为12.983L/h/kg、C_max为2.74mg/L。实验结果显示，在相同给药剂量下，本发明制备的穿心莲内酯聚合物胶束经静脉注射途径给药，可使治疗药物穿心莲内酯在体内的消除减缓，半衰期延长1倍以上，峰值血浆药物浓度和药时曲线下面积均显著增大，分别是普通注射液的6.09倍和5.64倍，显示良好的缓释特性。

（2）穿心莲内酯聚合物胶束大鼠灌胃给药的血浆药时曲线

试验药物：穿心莲内酯聚合物胶束冻干制剂按照实施例2(1)制得，临用前以生理盐水溶解，制成每1ml含穿心莲内酯10mg的溶液；穿心莲内酯原料药加适量CMC溶液研磨分散，制成每1ml含穿心莲内酯10mg的混悬液，作为参比制剂。

给药与取血方案：SD大鼠12只，雌雄各半，体重200～220g，随机分为两组，每组6只，分别经口灌胃给予穿心莲内酯聚合物胶束溶液和穿心莲内酯滴丸混悬液，给药剂量以穿心莲内酯计均为20mg/kg。于给药后不同时刻经由大鼠眼内眦取血0.5ml，置经肝素处理的离心管中，离心分离血浆，HPLC-MS/MS法测定穿心莲内酯的血药浓度。

结果：穿心莲内酯聚合物胶束和穿心莲内酯原料药经CMC混悬灌胃给药后大鼠血浆的穿心莲内酯药物浓度经时变化曲线见附图4。血药浓度数据经DAS2.0软件处理得药动参数。其中，胶束制剂的AUC_0-∞为5.48mg/L*h、t_1/2为8.344h、CL为2.02L/h/kg、C_max为1.03mg/L；普通CMC混悬剂的AUC_0-∞为0.216mg/L*h、t_1/2为3.13h、CL为19.395L/h/kg、C_max为0.205mg/L。实验结果显示，在相同给药剂量下，本发明制备的穿心莲内酯聚合物胶束通过使原料纳米化，可显著提高血浆药物浓度以及穿心莲内酯的口服生物利用度，提高倍数可达25倍。

实施例4穿心莲内酯聚合物胶束对巨噬细胞体外分泌炎性因子的影响

实验材料：穿心莲内酯聚合物胶束冻干制剂按照实施例2(1)制得，参比制剂为炎琥宁注射液（广东先强药业有限公司，20mg/ml）。所有药物在临用前以生理盐水溶解稀释至相同浓度，于-4℃冷藏备用。小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7（中科院上海细胞库，ATCC）用含10%胎牛血清、100μg/ml链霉素、100单位/ml青霉素的RPMI1640培养液于37℃CO₂培养箱中常规培养，隔天传代，细胞于对数生长期呈半贴壁状态生长。

实验方法：

（1）MTT检测：取对数生长期的RAW264.7细胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成每毫升含5×10⁵个细胞的单细胞悬液，接种于96孔细胞培养板（每孔200μl），每组设3个平行孔。培养1h后分别加入不同浓度的喜炎平或穿琥宁注射液及LPS（终浓度1μg/ml），同时设LPS组和空白对照组，置37℃培养箱中培养24h后，于每孔加入8μl MTT（终浓度200μg/ml）继续培养4h后弃去上清，吸干残留液，每孔加入DMSO100μl，振摇至生成的蓝紫色甲瓒结晶完全溶解后，以630nm为参比波长，用酶标仪测定570nm处的吸光值，计算细胞生长抑制率。

（2）一氧化氮浓度测定：将每毫升含5×10⁵个细胞的单细胞悬液接种于96孔细胞培养板（每孔200μl），每组设3个平行孔。培养1h后分别加入不同浓度的喜炎平或穿琥宁注射液及LPS（终浓度1μg/ml），同时设LPS组和空白对照组，置37℃培养箱中培养24h后，吸取培养液上清100μl至酶标板中，加入等体积的Griess试剂，室温反应5min后测定540nm的吸光值，根据NaNO₂标准曲线计算细胞培养上清液中NO₂ ^-的浓度以及对NO释放的抑制率。

（3）ELISA法测定上清中IL-6浓度：将每毫升含5×10⁵个细胞的单细胞悬液接种于96孔细胞培养板（每孔200μl），每组设3个平行孔。培养1h后分别加入不同浓度的喜炎平或穿琥宁注射液及LPS（终浓度1μg/ml），同时设LPS组和空白对照组，置37℃培养箱中培养6h后收集细胞上清液，测定各组培养上清中IL-6的浓度。

（4）ELISA法测定上清中TNF-α浓度：接种细胞、加药处理同上。收集培养6h后的细胞上清液，按照TNF-αELISA试剂盒说明书操作进行测定，根据标准曲线计算样品中TNF-α浓度。

实验结果：

（1）对巨噬细胞增殖的影响：穿心莲内酯聚合物胶束及炎琥宁注射液在30～150μg/ml的浓度范围内，对RAW264.7细胞的正常增殖抑制作用不显著，巨噬细胞的存活率均大于85%。但高浓度下（200μg/ml）作用24h后，穿心莲内酯聚合物胶束组细胞的存活率为84.5%，喜炎平组细胞的存活率为73.8%，表明高浓度的穿心莲内酯聚合物胶束及穿琥宁注射液可轻微抑制RAW264.7细胞的正常增殖，且穿心莲内酯聚合物胶束的细胞毒性小于炎琥宁。

（2）对巨噬细胞生成NO的影响：在1μg/ml的LPS刺激下，巨噬细胞大量释放NO。与LPS组相比，经穿心莲内酯聚合物胶束或炎琥宁注射液作用的RAW264.7细胞上清液中，NO的含量明显减少，且随着用药浓度的增高NO的浓度逐渐降低，呈现出良好的剂量依赖关系。但穿心莲内酯聚合物胶束（样品）对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的抑制作用明显强于炎琥宁注射液（对照），结果见图5。

（3）对巨噬细胞分泌IL-6的影响：在实验浓度范围内，穿心莲内酯聚合物胶束及炎琥宁注射液均可剂量依赖地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放IL-6，且前者的抑制作用稍强。结果见表1。

（4）对巨噬细胞分泌TNF-α的影响：经1μg/ml的LPS刺激6h后，RAW264.7细胞释放大量的TNF-α。在实验浓度范围内，穿心莲内酯聚合物胶束及炎琥宁注射液均可剂量依赖地抑制LPS诱导的RAW264.7细胞释放，且前者显示更强的抑制作用。结果见表1。

表1穿心莲内酯聚合物胶束对LPS诱导的巨噬细胞体外释放IL-6和TNF-α的抑制作用

实施例5穿心莲内酯聚合物胶束的体内抗炎作用

实验药物：穿心莲内酯聚合物胶束冻干制剂按照实施例2(1)制得；炎琥宁注射液（广东先强药业有限公司，20mg/ml）和喜炎平注射液（江西青峰药业有限公司，25mg/ml）为实验的参比制剂。所有试验药物在临用前以生理盐水溶解、稀释至所需药物浓度。

实验方法：

（1）对小鼠皮肤毛细血管通透性增高的影响：雄性小鼠背部皮下注射相同体积的药物或生理盐水后1h，尾静脉注射0.5%伊文思兰生理盐水溶液（0.1ml/10g体重），随即于腹部皮肤滴二甲苯0.03ml/只或皮内注射0.1%磷酸组织胺0.03ml/只，20分钟后将动物处死，剪下腹部皮肤，翻转，比较各组动物腹部皮肤致炎部位染色斑块深浅的级别。在二甲苯致炎的实验中，还按Harada法将每个皮块剪碎，投入丙酮硫酸钠混合液中浸泡提取染料，于波长590nm比色测定各皮块中伊文思兰的含量，并计算给药各组染料渗出的抑制百分率。

（2）对小鼠腹腔毛细血管通透性增高的影响：雄性小鼠于背部皮下给药后1h，尾静脉注射0.05%伊文思兰的生理盐水溶液（0.1ml/10g体重），然后于腹腔内注入0.6%的醋酸生理盐水溶液0.2ml/只，20min后将动物拉颈处死，剪开腹壁，用6ml生理盐水分数次冲洗腹腔，合并洗液,再加入生理盐水使总量为20ml，3000rpm离心10min，取上清，于波长590nm测定吸光度值，并计算每只小鼠腹腔内渗入的伊文思兰的微克数和各给药组动物腹腔内渗入染料的抑制百分率。

（3）对炎性渗出的影响：按Selye氏巴豆油性肉芽囊法进行实验。大鼠于背部皮下注入空气20ml形成气囊，用同一针头向气囊内注入10%巴豆油0.5ml,左右上下摇晃动物，以使巴豆油粘遍气囊内表面。当日开始腹腔注射相同体积的药物或生理盐水，每日一次，连续六日，于末次给药后1h用乙醚将大鼠迅速麻醉致死，仔细剖取肉芽囊，吸尽囊内液体，观察渗液性质，精密测定渗出液体积，并计算给药各组渗出液的抑制百分率。

（4）对大鼠蛋清性脚肿的影响：大鼠于腹腔注射药物或相同体积生理盐水后1h，于左后脚肠皮下注入新鲜鸡蛋清0.05ml/只，用排水法测定致炎前及致炎后0.5、1、2、4及6h鼠爪体积，按下式计算肿胀百分率：

实验结果：分别见表2和图6。结果表明，在相同给药剂量下，穿心莲内酯聚合物胶束的体内抗炎作用明显优于阳性对照药物炎琥宁注射液和喜炎平注射液。

表2穿心莲内酯聚合物胶束的体内抗炎作用

实施例6穿心莲内酯聚合物胶束对人肝癌SMMC-7721裸鼠肿瘤抑制作用

实验材料：穿心莲内酯聚合物胶束和空白胶束制剂冻干粉按实施例2（1）制备；5-氟尿嘧啶（5-Fu）注射液由上海旭东海普药业公司生产，规格250mg/10mL；BALB/c nu小鼠，4～6周龄，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2009-0004；人肝癌SMMC-7721细胞引自ATCC，由本实验室进行体外培养，接种于裸鼠成瘤，传代保存。

实验方法：

（1）选择H460肿瘤生长良好，全身状况较好荷瘤动物，颈椎脱臼处死。无菌条件下取出瘤块，用手术刀切割成直径2～3mm的瘤块，套管针接种于裸小鼠腋部皮下。接种后第7～8天，荷瘤鼠平均瘤体积达110～120mm³，将动物按瘤体积大小分层分为7组，即阴性对照组（空白溶媒对照组）、空白胶束组、阳性对照组（5-Fu组）、穿心莲内酯聚合物胶束低、中、高剂量组，以及5-Fu-穿心莲内酯胶束联合组，每组8只，雌雄各半。

（2）各给药组同时静脉注射相同体积药物，阴性对照组给予相同体积的空白溶媒。其中，阳性对照组给药剂量为5mg/kg/d；穿心莲内酯聚合物胶束低、中、高剂量组给药剂量分别为10、20、40mg/kg/d；联合组给药剂量为5-Fu2.5mg/kg/d+穿心莲内酯聚合物胶束20mg/kg/d空白溶媒对照组给予相同体积溶剂（生理盐水）。自分组当日开始，每隔2天对各组动物按计划静脉注射给药1次，连续给药2周。

（3）给药期间每天观察各组动物的精神、饮食、活动、大小便等一般情况。每3天用标卡尺测量一次瘤体大小。给药2周后，处死动物，剥取瘤组织，称重，并计算抑瘤率。

实验结果：

裸鼠一般情况：实验用药后，联合组、各剂量穿心莲内酯胶束组及生理盐水组裸鼠精神状态均良好，活动正常，反应敏捷，进食、饮水正常，皮肤颜色如常，大小便正常；5-FU组裸鼠用药后精神逐渐萎靡不振，活动减少，反应迟钝，不同程度进食下降，并于用药后7天后陆续出现血性腹泻，消瘦。实验过程中，阴性对照组、空白胶束组、5-FU阳性对照组、穿心莲内酯胶束低剂量组各有1只死亡，穿心莲内酯胶束中、高剂量组和联合组无死亡。

瘤重与抑瘤率：阴性对照与空白胶束对照组的瘤重基本一致（P>0.05），穿心莲内酯胶束低、中、高剂量组、5-FU组、穿心莲+5-FU联合组的瘤重依次降低，与阴性对照组相比，差异均有统计学意义（P<0.05）；联合组与阳性组相比差异有显著性（P<0.05）；而高剂量组和阳性对照组比较未见显著差异（P>0.05）。抑瘤率结果显示，阳性对照组及穿心莲内酯胶束高、中、低剂量组裸鼠肿瘤的生长均明显受到抑制，穿心莲内酯胶束的抑瘤率随剂量增加逐渐增高（P<0.05）；高剂量组和阳性对照组间未见显著差异（P>0.05）；穿心莲内酯胶束与5-Fu与联合作用时抑瘤率显著高于胶束高剂量组和阳性组（P<0.05）。结果见表3。

表3穿心莲内酯聚合物胶束对SMMC-7721细胞裸鼠移植瘤的抑制作用

结论：瘤裸鼠体内实验证明，穿心莲内酯聚合物胶束注射给药能有效抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长，且呈明显的时间和剂量依赖性。穿心莲内酯胶束与5-FU联合使用的抑瘤效果显著增强，表明两者在一定浓度范围内可发挥协同或相加效应，既有助于增加疗效，也减轻了化疗药物的毒副反应，延缓了耐药性的发生，显示穿心莲内酯聚合物胶束在肿瘤临床联合化疗中具有良好的应用前景。

实施例7穿心莲内酯聚合物胶束的急性毒性试验

实验药物：穿心莲内酯聚合物胶束冻干制剂按照实施例2(1)制得；炎琥宁注射液（广东先强药业有限公司，20mg/ml）和喜炎平注射液（江西青峰药业有限公司，25mg/ml）为实验的参比制剂。所有试验药物在临用前以生理盐水溶解、稀释至所需药物浓度。

实验方法：按常法进行，每组用小鼠10只，所有制剂均静注一次,记录3日内死亡情况，计算各药之LD₅₀值。

结果与结论：穿心莲内酯聚合物胶束和参比制剂炎琥宁和喜炎平注射液对小鼠的LD₅₀分别为1.914±0.205g/kg、1.635±0.142g/kg和1.826±0.133g/kg，没有显著性差异（P>0.05），显示目标制剂具有较低的毒性和良好的安全性。

Claims (10)

1.一种穿心莲内酯聚合物胶束，其特征在于该胶束载药系统包含两亲性嵌段共聚物、治疗有效量的穿心莲内酯以及药学上可接受的药用辅料，所述的两亲性嵌段共聚物包括亲水性链段和疏水性链段，其亲水性链段为数均分子量在400～20000之间的聚乙二醇或聚乙二醇单甲醚，其疏水性链段选自采用疏水性基团封端的数均分子量在500～100000之间的聚丙交酯、聚乙交酯、聚乙丙交酯、聚己内酯、聚碳酸酯或其衍生物、或者聚二氧环己酮或其衍生物中的一种，所述的疏水性基团选自乙酰基、叔丁酰基、叔丁乙酰基、苯甲酰基、氨基酸残基、或氨基酸衍生物残基中的一种。

2.根据权利要求1所述的穿心莲内酯聚合物胶束，其特征在于所述穿心莲内酯为天然提取物或人工合成物，在形态上是全部结晶、部分结晶、全部无定形或晶体相与无定形相的混合物。

3.根据权利要求1或2所述的穿心莲内酯聚合物胶束，其特征在于所述疏水性链段的数均分子量在1000～50000之间；所述亲水性链段的数均分子量在750～5000之间。

4.根据权利要求1或2所述的穿心莲内酯聚合物胶束，其特征在于所述两亲性嵌段共聚物和穿心莲内酯的重量比在99.5:0.5～50:50之间，优选重量比在99:1～70:30之间。

5.根据权利要求1或2所述的穿心莲内酯聚合物胶束，其特征在于所述药用辅料为冻干赋形剂，选自乳糖、甘露醇、右旋糖酐、蔗糖、海藻糖、果糖、葡萄糖、海藻酸钠、甘氨酸或明胶中的至少一种，冻干赋形剂占整个体系的重量比为0～99.9%之间，优选占整个体系的重量比为10～80%之间。

6.权利要求1至5任一所述的穿心莲内酯聚合物胶束的制备方法，包括透析法、直接溶解法、薄膜水化法、固体分散法、高能均质乳化法。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其步骤为：将聚合物辅料和药物溶解于有机溶剂，经旋转蒸发去除溶剂后，加入注射用水、生理盐水、5%葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液为分散介质，溶解药膜得载药胶束溶液，经过滤除菌冻干后得胶束冻干粉。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为乙醇、甲醇、叔丁醇、三氟乙醇、六氟异丙醇、乙腈、丙酮、二氯甲烷、氯仿、二甲亚砜、N,N-二甲基甲酰胺中的一种或几种的混合溶剂。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其步骤为：将药物溶解于加热后处于熔融状态的聚合物辅料得到澄清的混合物，再加入注射用水、生理盐水、5%葡萄糖溶液或磷酸盐缓冲液为分散介质，溶解得胶束溶液，经过滤除菌后冻干得胶束冻干粉。

10.权利要求1至5任一所述的穿心莲内酯聚合物胶束在制备治疗感染性疾病药物和肿瘤药物中的用途，所述的感染性疾病为全身炎症反应综合症、急性病毒性上呼吸道感染、病毒性细菌性肺炎、流行性感冒、急慢性支气管炎、急性肠胃炎、急性细菌性痢疾、急性黄疸型肝炎、腹泻、慢性前列腺炎、精囊炎、泌尿系统感染、结膜炎、单纯疱疹性角膜、急慢性鼻炎、鼻窦炎、咽炎、化脓性扁桃体炎、单纯性中耳炎、盆腔炎、附件炎、子宫内膜炎、盆腔炎和术后感染；所述的肿瘤为癌症、恶性肿瘤、卡波西肉瘤、继发于组织损伤的失调的组织或细胞增生。