CN104856949A - 一种多西他赛胶束载药系统及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种新型的两亲性嵌段共聚物与多西他赛形成的胶束载药系统。该两亲性嵌段共聚物包括亲水性链段和疏水性链段，所述亲水性链段为聚乙二醇单甲醚，所述疏水性链段为聚己内酯，其疏水性链段端基用疏水性基团封端。所述疏水性基团为叔丁氧羰基苯丙氨酸，不仅改善药物分子和嵌段共聚物中疏水性链段的相容性，增加其相互间的作用力，同时为容纳药物分子提供更大的空间，所制备的胶束能够更有效的将药物分子限制在胶束的核中使其不易溶出，从而获得具有高度稳定性的载药胶束。

Description

一种多西他赛胶束载药系统及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种两亲性嵌段共聚物和多西他赛形成的载药系统及其制备方法、属纳米药物制剂领域。

背景技术

肿瘤是一类严重威胁人类生命安全的疾病，研究安全、有效的抗肿瘤药物对于提高人类的生存质量具有重要意义。

多西他赛(Docetaxel、DTX)是一种非常有效且广谱的抗肿瘤药物，其作用机理主要是聚合和稳定微管，可致使快速分裂的肿瘤细胞固定于有丝分裂阶段，使癌细胞复制受阻断而死亡。

体外实验证明：多西他赛具有显著的放射增敏作用，可使细胞中止于对放疗敏感的G2和M期。然而，由于其高度疏水性，所以口服吸收差，目前只有注射途径给药。由于难以配制成水溶液，其市售制剂是通过添加增溶剂吐温80的方法来增加药物溶解性。但是该类增溶方法存在诸多缺点：(1)易引发过敏反应，因此患者用药前需进行抗过敏治疗；(2)药物稳定性差、注射利用度不高：上述制剂经稀释后药物易沉淀析出，在给药时需经过特殊的过滤装置，且注射液稀释过程需缓慢进行，往往因操作人员的不同而造成药物析出的程度不一致，从而导致进入体内的药量不准确，继而产生疗效差异；(3)血液学毒性较高：吐温80可引起血液学毒性，成为限制治疗剂量提高的主要因素。因此，寻找研发新释药系统以避免辅料带来的毒副反应为紫杉烷类细胞毒药物的发展趋势【Charity D,William DF,Alex S.Therapeuticsand Clinical Risk Management 2005,1(2):107-114.】。

目前多西他赛新制剂研究未取得突破性进展，正在研究开发的新制剂包括胶束、乳剂和微乳、前体药物、环糊精包合物、脂质体等，大都处在临床前研究。分析其原因，可能是多西他赛相对于紫杉醇具有更小的空间结构和更好的亲水性，在选择辅料方面存在一定的差异，同时，吐温80的毒性相对于聚氧乙烯蓖麻油(EL)要低，在降低毒性方面，多西他赛的新制剂难度更大。

聚合物胶束是近年来发展起来的一种新型给药系统。胶束通常由大量两亲性嵌段共聚物分子链定向排列组成，其疏水链段通过和药物分子之间弱的相互作用将药物包裹于核中，亲水链向外稳定胶束，呈现典型的核-壳结构。聚合物胶束不仅能增加药物的溶解度，提高治疗剂量，而且药物包裹其中，可避免降解失活，减少毒副反应。胶束粒径通常在l00nm以下，且外围为亲水性PEG链段，因此可以躲避网状内皮系统(RES)的吞噬，延长体循环时间，通过EPR效应(高通透性和滞留效应，enhanced permeability and retention effect)达到对肿瘤被动靶向的效果。另外，由于聚合物胶束分子量大，因此也能防止肾清除。同小分子表面活性剂相比，聚合物胶束的CMC值(临界胶束浓度)非常低，在载药胶束稀释时，也能保持胶束结构的稳定，同时聚合物材料具有生物可降解性和良好的生物相容性。

虽然聚合物胶束被认为是一种极具潜力的新型给药系统，特别是针对一些难溶性的抗肿瘤药物，但是其在溶液状态下较低的稳定性一直是影响这种新型给药系统向临床研究转化的最关键问题，多西他赛胶束之所以不能向临床转化，其胶束溶液的稳定性差是一个关键原因【Gaucher G,et al.Polyester-based micelles and nanoparticles for the parenteral delivery oftaxanes.Journal of Controlled Release 2010,143:2-12.】。如以mPEG-PLA/多西他赛胶束为例，当胶束的载药量为5％，药物浓度在0.1-2mg/ml之间，胶束在室温下只能稳定6h左右【Lee SW,et al.Development of docetaxel-loaded intravenous formulation,Nanoxel-PM^TM usingcolymer-based delivery system.Journal of Controlled Release 2011,155:262-271.】。这种胶束在进入体内以后迅速解体，药物随即和血液中的蛋白(如白蛋白)结合，因此无法发挥胶束的EPR效应，动物实验的结果显示药效和多西他赛注射液没有区别，耐受剂量也未见提高，因此优势并不明显。

选择适宜的高分子辅料，通过制备工艺筛选，得到全新的多西他赛胶束制剂，提高其在溶液中的稳定性，成为多西他赛制剂研究的新方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种两亲性嵌段共聚物，以解决现有技术中存在的上述问题。本发明的两亲性嵌段共聚物以具有公认安全性的聚乙二醇单甲醚-聚酯嵌段共聚物为基础材料，并将聚酯链段的端羟基用疏水性基团进行改性，引入叔丁氧羰基苯丙氨酸，不仅改善药物分子和嵌段共聚物中疏水性链段的相容性，增加其相互间的作用力，而且引入的疏水性基团具有较大的空间结构，为药物分子进入胶束的核提供了更大的空间，从而使其更加不易溶出。从而获得具有高度稳定性的载药胶束。该发明的最大意义在于提高胶束的在溶液状态的稳定性，尤其是体内的稳定性，从而发挥胶束的EPR效应，达到更高的生物利用度和更好的治疗效果。

本发明提供的技术方案如下：

一种胶束载药系统，其特征在于该胶束载药系统包含两亲性嵌段共聚物、治疗有效量的多西他赛以及药学上可接受的药用辅料，所述的两亲性嵌段共聚物包括亲水性链段和疏水性链段，其亲水性链段为数均分子量在400～20000之间的聚乙二醇或聚乙二醇单甲醚，其疏水性链段选自采用疏水性基团封端的数均分子量在500～100000之间的聚己内酯，所述的疏水性叔丁氧羰基苯丙氨酸。

在推荐的实施例中，所述的疏水性链段的数均分子量在1000～50000之间；所述亲水性链段的数均分子量在750～5000之间。

本发明另一目的在于提供一种胶束载药系统的制备方法，包括以下步骤：

1)取数均分子量在400～20000之间的亲水性链段加入到聚合瓶中，加热至100℃～130℃真空脱水2h～4h。金属钾溶解于萘的四氢呋喃溶液形成萘钾，然后将萘钾溶液加入到脱水的甲氧基聚乙二醇中反应，然后加入内酯单体室温聚合聚合物经乙醇重结晶后得到甲氧基聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物；

2)取亲水性链段和疏水性链段组成的嵌段共聚物，用乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯或双蒸水溶解，而后加入叔丁氧羰基苯丙氨酸-新戊酸酐进行反应，使端羟基反应形成疏水性叔丁氧羰基苯丙氨酸，过滤去除不溶物后加入足量乙醚沉淀或者用乙醇重结晶聚合物，过滤真空干燥后得目标共聚物。

3)将共聚物、多西他赛和合适的药用辅料制成胶束溶液后进行冻干。

在推荐的实施例中，所述的药用辅料为冻干赋型剂。

在本发明中，所述的冻干赋型剂选自乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、果糖、葡萄糖、海藻酸钠或明胶中的至少一种。

在推荐的实施例中，所述的冻干步骤前有无菌处理步骤。

本发明的另一目的是公开胶束载药系统在制备治疗肿瘤药物中的用途。

本发明的另一目的是公开胶束载药系统在制备用于与化学治疗药物联合治疗肿瘤药物中的用途，所述的化学治疗药物是7-乙基-10-羟基喜树碱、10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、长春瑞宾、吉西他宾、阿糖胞苷、替加氟、甲氨蝶呤、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、埃坡霉素及其衍生物、米托蒽醌、异环磷酰胺、达卡巴嗪、顺铂、奥沙利铂等。

本发明的胶束载药系统可通过注射途径给药，并一般制成冻干粉制剂，另外，本领域技术人员可参照现有抗肿瘤药物的给药剂量确定给药剂量，并根据个体情况的不同上下调整。

与现有技术相比，本发明具有以下的特点：

1)本发明根据大多数抗肿瘤药物结构上的疏水性以及较大的空间结构，将聚酯链段的端羟基用疏水性基团进行改性，通过改善药物分子和嵌段共聚物中疏水性链段的相容性，增加其相互间的作用力，同时增加胶束核中可容纳药物分子的空间，将药物分子限制在胶束的核中使其不易溶出，从而获得了一系列在体内外均具有高度稳定性的载药胶束，该载药胶束可制成冻干制剂；

2)与现有技术中使用的乙醚沉淀法纯化高分子聚合物，本发明采用乙醇重结晶法纯化高分子聚合物，所得到的高分子纯度更高，所得高分子的分子量分布系数可达到1.1以下；

3)试验结果证明：本发明的两亲性嵌段共聚物制备得到的抗肿瘤药物载药胶束的制成的冻干制剂复溶后可迅速分散形成略带乳光的澄清溶液，该溶液在室温环境下依然至少可稳定24小时以上无明显药物沉淀析出，经注射后在体内可有效发挥EPR效应，具有良好的产业化应用前景。

附图说明

附图1高分子辅料凝胶渗透色谱图；

附图2多西他赛胶束冻干粉及复溶后溶液外观；

附图3冻干前溶液粒径分布图(A)和冻干后复溶溶液粒径分布图(B)；

附图4五种不同高分子辅料制备的注射用多西他赛胶束制剂大鼠血浆多西他赛药物浓度经时变化曲线比较；

附图5注射用多西他赛胶束对前列腺癌PC-3A阿霉素耐药细胞裸鼠异种移植性肿瘤的生长抑制作用图；

附图6注射用多西他赛胶束对多发性骨髓瘤RPMI8226阿霉素耐药细胞裸鼠异种移植瘤的生长抑制作用图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，特列举实施例，以进一步诠释本发明，而不是对本发明的任何方式的限制。

实施例1高分子辅料mPEG₂₀₀₀-PLA₁₈₀₀-Phe(Boc)的合成

20g(10mmol)mPEG(数均分子量为2000)加入到聚合瓶中，加热至130℃真空脱水3h后备用。1.28g(10mmol)萘溶解于20ml四氢呋喃，加入390mg(10mmol)金属钾于室温下搅拌直至金属钾完全溶解得到墨绿色萘钾溶液，将上述溶液加入到干燥的mPEG中，室温搅拌5min后加入25g D,L丙交酯/四氢呋喃溶液(1g/mL)，氮气保护下室温搅拌反应30min后真空出去溶剂，然后用乙醇溶解反应物，所得溶液冷却至-20℃后将沉淀的聚合物过滤，真空干燥得mPEG₂₀₀₀-PLA₁₈₀₀嵌段共聚物。

6.65g Boc-L-苯丙氨酸溶解于50ml无水乙酸乙酯，加入4.2ml三乙胺，将上述溶液冷却至-10℃，加入3.66ml特戊酰氯，上述反应物在0℃搅拌反应2h后在室温下继续反应1h，过滤去除不溶物，真空去除溶剂得白色固体。

加入25ml二氯甲烷溶解后将此溶液加入到含有15g mPEG₂₀₀₀-PLA₁₈₀₀的75ml二氯甲烷溶液中，充分混合溶解后加入14ml吡啶和160mg四甲氨基吡啶，此混合物在0℃反应2h后在室温下继续反应36h，过滤去除溶剂后所得聚合物加入100ml乙醇溶解，溶液在-20℃冷冻1h后过滤聚合物，真空干燥后得目标共聚物mPEG₂₀₀₀-PLA₁₈₀₀-Phe(Boc)。

试验证明：制备所得到的目标产物具有很窄的分子量分布系数，纯度很高，其凝胶渗透色谱图见附图1。

实施例2多西他赛胶束的制备

取100mg多西他赛和1.9g mPEG₂₀₀₀-PLA₁₈₀₀-Phe(Boc)溶解于25ml无水乙醇，45℃下通过旋转蒸发去除有机溶剂，加入25ml生理盐水溶解药膜，加入400mg甘露醇后溶液经0.22μm除菌膜过滤后冻干后得多西他赛胶束冻干粉。经LC-MS/MS分析，药物包封率为100％，载药量5％，粒径16nm，分散系数PDI＝0.02。其复溶性好，复溶前后粒径分布变化较小，详细结果见附图2和附图3。

试验例3药代动力学试验

A、实验动物：

雄性SD大鼠，体重240±20g，随机分为五组，每组均为6只，备用。

B、实验制剂：

制剂Ⅰ：为供试多西他赛胶束冻干粉制剂，按实施例1和2制备，每瓶含多西他赛20mg；

制剂Ⅱ：为参比多西他赛胶束制剂，以中国专利CN201110231519.7公开的MPEG-PLA作为高分子辅料，每瓶含多西他赛20mg；

制剂III：为参比多西他赛胶束冻干粉制剂，参考专利CN1429120A合成苯甲酰基封端甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物mPEG-PLA-Bz及该共聚物/多西他赛胶束，每瓶含多西他赛20mg；

制剂IV：为参比多西他赛胶束制剂，参考专利US7311901B2方法合成胆固醇封端的甲氧基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物mPEG-PLA-CH及共聚物/多西他赛胶束，每瓶含多西他赛20mg；

制剂V：参考专利US7311901B2方法合成维生素E封端的mPEG-PLA嵌段共聚物并制备该共聚物/多西他赛胶束，每瓶含多西他赛20mg。

C、给药与样本采集：

实验制剂及各参比制剂分别于临用前溶解稀释至合适浓度，以5mg/kg剂量(均以多西他赛计)经尾静脉注射给予五组大鼠。分别于给药后不同时刻经大鼠眼眶静脉丛采集血样于肝素抗凝离心试管中，离心分离血浆，置-80℃超低温冰箱冻存，待测。

D、血浆处理与测定：

血浆样品以乙酸乙酯萃取后进行LC-MS/MS分析，测定其中多西他赛药物浓度。

E、实验结果：

分别绘制5种制剂的血浆多西他赛药物浓度经时变化曲线(附图4)，并计算主要的血浆药动学参数。结果显示，本发明所制备的多西他赛聚合物胶束和已公开专利(CN201110231519.7，US7311901B2)胶束在相同剂量下经静脉途径给予大鼠，前者有显著高的血浆药物浓度和AUC，相同时间的血药浓度基本高一个数量级以上，多西他赛在血液的清除率显著降低，结果反映了本发明所制备的多西他赛胶束具有优越的体内稳定性和独特的释药特性。

实施例4药效学试验

4.1注射用多西他赛胶束对前列腺癌PC-3A阿霉素耐药细胞裸鼠异种移植性肿瘤的生长抑制作用

雄性BALB/c裸小鼠腹侧皮下接种5×10⁶个PC-3A细胞。约一周以后，荷瘤鼠肿瘤平均体积达100mm³以上时，30只荷瘤小鼠按肿瘤体积随机分层分组，分别为：溶媒组、注射用多西他赛胶束(10mg/kg，来源于实施例2)、多西他赛注射液(泰素帝，10mg/kg)，静脉给药，每隔3天给一次药，共计3次。实验期间，每周测定动物肿瘤体积(计算公式ab²/2,a、b分别为肿瘤的长和宽)和体重。结果如图5所示，等剂量注射用多西他赛胶束抑瘤率明显高于多西他赛注射液，二者比较有统计学差异(P<0.05)。

4.2注射用多西他赛胶束对多发性骨髓瘤RPMI8226阿霉素耐药细胞裸鼠异种移植瘤的生长抑制作用

雄性BALB/c裸小鼠腹侧皮下接种5×10⁶个PC-3A细胞。约一周以后，荷瘤鼠肿瘤平均体积达100mm³以上时，30只荷瘤小鼠按肿瘤体积随机分层分组，分别为：溶媒组、多西他赛注射液(泰素帝，10mg/kg)、注射用多西他赛胶束(10mg/kg，来源于实施例2)、静脉给药，每隔3天给一次药，共计3次。实验期间，每周测定动物肿瘤体积(计算公式ab²/2,a、b分别为肿瘤的长和宽)和体重。结果如图6所示，多西他赛胶束单独给药抑瘤率明显高于多西他赛注射液，二者比较有统计学差异(P<0.05)。

Claims (8)

1.一种多西他赛胶束载药系统，其特征在于该胶束载药系统包含两亲性嵌段共聚物、治疗有效量的多西他赛以及药学上可接受的药用辅料，所述的两亲性嵌段共聚物包括亲水性链段和疏水性链段，其亲水性链段为数均分子量在400～20000之间的聚乙二醇或聚乙二醇单甲醚，其疏水性链段选自采用疏水性基团封端的数均分子量在500～100000之间的聚酯，所述的疏水性基团是含有叔丁氧羰基苯丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的多西他赛胶束载药系统，其特征在于所述疏水性链段的数均分子量在1000～50000之间；所述亲水性链段的数均分子量在750～5000之间。

3.权利要求1或2所述多西他赛胶束载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)取数均分子量在400～20000之间的亲水性链段加入到聚合瓶中，加热至100℃～130℃真空脱水2h～4h，金属钾溶解于萘的四氢呋喃溶液形成萘钾，然后将萘钾溶液加入到脱水的甲氧基聚乙二醇中反应，最后加入内酯单体室温聚合，聚合物经乙醇重结晶后得到甲氧基聚乙二醇-聚酯嵌段共聚物

2)取亲水性链段和疏水性链段组成的嵌段共聚物，用乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙酸乙酯或双蒸水溶解，而后加入疏水性的封端剂进行反应，使端羟基反应形成疏水性基团，过滤去除不溶物后加入足量乙醚沉淀或用乙醇重结晶聚合物，过滤真空干燥后得目标共聚物；

3)将共聚物、多西他赛和合适的药用辅料制成胶束溶液后进行冻干。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的药用辅料为冻干赋型剂。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述的冻干赋型剂选自乳糖、甘露醇、蔗糖、海藻糖、果糖、葡萄糖、海藻酸钠或明胶中的至少一种。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述冻干步骤前有无菌处理步骤。

7.权利要求1或2所述多西他赛胶束载药系统在制备治疗肿瘤药物中的用途。

8.权利要求1或2所述多西他赛胶束载药系统在制备用于与化学治疗药物联合治疗肿瘤药物中的用途，所述的化学治疗药物是7-乙基-10-羟基喜树碱、10-羟基喜树碱、伊立替康、拓扑替康、长春瑞宾、吉西他宾、阿糖胞苷、替加氟、甲氨蝶呤、多柔比星、表柔比星、吡柔比星、伊达比星、丝裂霉素、埃坡霉素及其衍生物、米托蒽醌、异环磷酰胺、达卡巴嗪、顺铂或奥沙利铂。