BR112021011609A2 - Nanopartículas filamentosas que têm efeito adjuvante de vacina - Google Patents

Abstract

nanopartículas filamentosas que têm efeito adjuvante de vacina. a presente invenção se refere a nanopartículas filamentosas, isto é, similares a fio que compreendem esterol e um componente derivado de quillaja saponaria molina selecionada a partir de ácido de quillaja e saponina de quillaja. mais particularmente, a invenção se refere ao uso das ditas nanopartículas similares a fio em sistemas de absorção ou entrega de fármaco e vacina, métodos para sua produção e usos das mesmas, como para uso como um adjuvante de vacina e na terapia de câncer.

Description

“NANOPARTÍCULAS FILAMENTOSAS QUE TÊM EFEITO ADJUVANTE DE VACINA” CAMPO TÉCNICO

[0001] A presente invenção se refere a nanopartículas filamentosas ou similares a fios que compreendem esterol e uma saponina triterpenoide, como um componente derivado de Quillaja saponaria Molina selecionada a partir de saponinas de quillaja. Mais particularmente, a invenção se refere ao uso das ditas nanopartículas filamentosas em vacinas, terapia de câncer e entrega de fármaco, métodos para sua produção e usos das mesmas, como tanto para uso humano quanto uso veterinário como um adjuvante de vacina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] As vacinas requerem adjuvantes ideais, incluindo imunopotenciador e sistemas de entrega para oferecer proteção de longo prazo contra doenças infecciosas em animais e no homem. Emulsões de óleo, lipopolissacarídeos, polímeros, saponinas, lipossomas, citocinas, complexos imunoestimulantes (ISCOMs), adjuvante completo de Freund, adjuvante incompleto de Freund, alúmen, toxinas bacterianas, etc., são adjuvantes comuns sob investigação ou já implementados em vacinas licenciadas. Os adjuvantes à base de saponina têm a capacidade de estimular o sistema imunológico mediado por células, bem como de aumentar a produção de anticorpos e têm a vantagem de que apenas uma dose baixa é necessária para a atividade de adjuvante.

[0003] As matrizes ISCOM são uma série de nanopartículas automontadas em forma de gaiola, ocas, esferoidais estruturalmente definidas (40-60 nm, como observado com

Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)) resultantes da interação entre saponinas de Quillaja e colesterol, em um sistema também contendo fosfolipídios. As mesmas exibem uma carga eletrostática negativa com um potencial medido de cerca de -30 mV. A combinação de uma matriz ISCOM com um antígeno é chamada ISCOM. Acredita-se que as saponinas de Quillaja (e possivelmente todas as saponinas com um núcleo triterpenoide) possuem uma alta afinidade para o colesterol que induz a estruturação e estabilização da matriz ISCOM.

[0004] Os ISCOMs têm sido amplamente explorados para a entrega de antígenos, visto que imitam uma partícula de vírus em termos de tamanho e forma (Barr, 1998). A alta resposta imune de ISCOM está principalmente associada à presença de saponinas de QS (Quillaja saponaria), em particular, os componentes acilados, como QS-21, que exibem forte atividade imunoestimulante (Boyaka et al., 2001). Isso, em combinação com a natureza particular de ISCOMs, dá o efeito adjuvante geral e foi relatado como indutor de respostas imunes tanto humorais quanto celulares (Sun et al., 2009).

[0005] O maior desafio com a fabricação de ISCOM está relacionado à “solubilização” de colesterol na fase aquosa, visto que essa molécula é essencialmente insolúvel em água. A ideia básica por trás da formação de ISCOM consiste em fornecer colesterol ao solvente em volume na forma de micelas mistas ou integrado em vesículas formadas por codetergentes ou fosfolipídios. A adição de uma solução micelar de saponinas Quillaja resulta em uma redistribuição de moléculas de colesterol nas micelas de saponinas e na reorganização das moléculas nas partículas de ISCOM características. No entanto, esse processo produz na prática resultados variáveis em termos de homogeneidade de população e número de partículas. Portanto, várias etapas a jusante de purificação são necessárias para eliminar o colesterol agregado ou residual e os fosfolipídios (por exemplo, fosfatidil colina), através de centrifugação, ultrafiltração, fluxo tangencial ou diálise. Tais técnicas necessariamente causam perda de material durante o processo de produção. Mais prejudicial para a produção em grande escala de ISCOM é o uso de fosfolipídios de grau farmacêutico (e às vezes codetergentes), o que aumenta ainda mais os custos de fabricação. As perdas de colesterol semissintético dispendioso (de origem não animal) também resultam no aumento dos custos de produção. Tomadas em conjunto, essas variações nos rendimentos e nas perdas se tornam obstáculos sérios para a produção em grande escala de nanopartículas adjuvantes à base de saponina a preços acessíveis.

[0006] Alguns dos problemas de formulação associados à produção de ISCOM foram abordados por Morein et al. pela revelação de um novo método de preparação livre de fosfolipídios, resultando nas chamadas nanopartículas à base de saponina “G3”, que são descritas, entre outros, nos pedidos de patentes internacional WO2013051994 e WO2014163558. No entanto, o dito método de preparação infelizmente também se mostrou difícil de implementar em escala comercial, visto que o produto obtido mostra distribuição heterogênea e de tamanho de partícula variável, e foi agora demonstrado pelos inventores da presente invenção que realmente produz partículas de uma morfologia diferente daquela descrita nos dois pedidos de patente.

[0007] Os presentes inventores trabalharam intensamente com a tentativa de aumento de escala dos procedimentos descritos nos documentos WO2013051994 e WO2014163558, mas perceberam que as nanopartículas "G3" descritas nos pedidos de patente e que aparecem como pontos circulares de ~20 nm em micrográficos de elétrons não podiam ser reproduzidas seguindo as instruções nos aplicativos. Isso foi percebido pela primeira vez quando os produtos obtidos foram analisados não apenas por microscopia eletrônica de transmissão (TEM), como empregado nos dois pedidos de patente, mas também por Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) e Microscópio de Força Atômica (AFM). O problema era simplesmente que as partículas reivindicadas de 20 nm eram visíveis apenas pela análise de TEM, mas não com DLS nem AFM.

[0008] As técnicas analíticas diferem significativamente em sua metodologia e em sua preparação de amostra de pré- análise. Em TEM, alguns microlitros da solução coloidal (em tampão de solução salina de fosfato, PBS) são depositados em uma grade metálica e secos sob vácuo antes de serem pulverizados com um agente de contraste e visualizados com o feixe de elétrons. As regiões de alta densidade eletrônica (alta densidade molecular) são observadas como projeções em um plano 2D. Em AFM, alguns microlitros de amostra são depositados em um substrato atomicamente plano (folha de mica recém-clivada), secos e varridos com uma ponta ressonante de AFM com apenas alguns nanômetros de espessura. A imagem resultante fornece uma topologia da superfície do substrato e onde as partículas na superfície aparecem em 3D.

Em particular, a espessura das partículas pode ser medida.

Em DLS, a amostra é analisada como tal (isto é, sem secagem), dissolvida em um tampão de fosfato e é fornecida uma descrição estatística da distribuição de tamanho de partícula.

No imageamento de AFM, as partículas “G3” apareceram como uma população heterogênea de diferentes tamanhos e formas, às vezes esferoidais, às vezes alongados ao longo de um eixo geométrico (similar a uma minhoca) com tamanhos de até vários 100 s de nm de comprimento, e apenas 4 nm a 10 nm de espessura, nunca uniformemente esféricos com um diâmetro regular entre 20 nm e 30 nm.

Em DLS, a distribuição de tamanho médio estava consistentemente na faixa de 50 nm a 60 nm, não 20 nm como reivindicado nos documentos WO2013051994 e WO2014163558. Os presentes inventores, portanto, especularam se o que foi observado em TEM como partículas "G3" de ~20 nm nos documentos WO2013051994 e WO2014163558 poderia ser atribuído a um artefato na preparação de amostra.

Isso foi corroborado pela análise de uma amostra por TEM sem colesterol ou saponina, mas apenas o tampão de fosfato, que produziu uma imagem de TEM praticamente idêntica à figura 1A das partículas "G3" reveladas no documento WO2013051994, consulte a Figura 1. Isso provou que as nanopartículas "G3" com um diâmetro de aprox. 20 nm, como descrito nos dois pedidos de patente (consulte, por exemplo, fig. 1A do documento WO2013051994), eram na verdade cristais de sal de fosfato ou agregados que precipitam do sistema de tampão após a evaporação da amostra, ou formados pela interação com a grade de substrato metálico (íons de fosfato têm afinidade por superfícies metálicas). As observações de controle do mesmo sistema de tampão sozinho ou de partículas de colesterol de saponina (partículas “G3” reais) no sistema de tampão depositado em grades de substrato de carbono em vez de grades metálicas nunca produziram as estruturas em forma de disco de ~20 nm de diâmetro relatadas nos pedidos de patente, comprovando sua natureza de artefato. Por DLS, tais partículas não eram visíveis, visto que os sais de fosfato são dissolvidos nas condições de análise.

[0009] Os inventores da presente invenção decidiram investigar a natureza e/ou morfologia das “partículas G3” descritas nos documentos WO2013051994 e WO2014163558 mais de perto, visto que as preparações tinham, afinal, demonstrado efeitos biológicos, entre outros, em diferentes experimentos de inoculação. Para essa finalidade, o procedimento original como revelado no documento WO2013051994 foi realizado 5 vezes e as partículas resultantes analisadas por DLS. O resultado foi que o procedimento original proporcionou partículas com uma distribuição de tamanho de partícula heterogênea para o experimento individual (consulte a figura 2) e, além disso, uma grande variabilidade entre os experimentos. Concluiu-se que essa falta de homogeneidade era inaceitável para um adjuvante comercial.

[0010] Assim, permanece a necessidade de desenvolver um procedimento confiável e escalonável para nanopartículas à base de saponina, que podem ser usadas como partículas carreadoras/de entrega para produtos farmacêuticos e como adjuvantes de vacinas.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0011] Os inventores da presente invenção constataram agora que tanto a morfologia quanto a distribuição de tamanho das partículas obtidas pelo procedimento de fabricação original, como revelado no documento WO2013051994, podem ser drasticamente modificadas alterando-se alguns parâmetros de reação críticos; em particular, incubando-se as partículas a uma temperatura elevada e ajustando-se a proporção entre a saponina e o colesterol na preparação inicial. Em contraste com as partículas descritas no gráfico de DLS da figura 2, que mostra dois ou mais tipos de partículas de diferentes tamanhos aparentes, as partículas produzidas de acordo com o método da presente invenção têm um tamanho uniforme quando medidas por DLS (monodispersas, consulte a figura 4).

[0012] Consequentemente, em um primeiro aspecto da presente invenção, se fornece, então, nanopartículas que compreendem colesterol e uma saponina triterpenoide, como um componente de Quillaja saponaria Molina, como Quil A® ou componentes isolados dos mesmos, como frações QS-7, QS-8, QS-17, QS-18 e QS-21, ou um componente de Quillaja brasiliensis, como fração QB-90, caracterizadas pelo fato de que as ditas nanopartículas são similares a fio (filamentosas). Essas nanopartículas são doravante referidas por todo o presente pedido como partículas “NanoQuil F70”.

[0013] Em um segundo aspecto, a presente invenção fornece um método para produzir as nanopartículas NanoQuil F70 do primeiro aspecto, compreendendo as seguintes etapas:

a) Preparar uma camada de colesterol na superfície interna de um vaso de reação e/ou na superfície de um artigo poroso insolúvel em água localizado no dito vaso de reação, removendo-se o solvente de uma solução não aquosa de colesterol em um solvente orgânico selecionado a partir de um ou mais C1-C6 álcoois, C2-C6 cetonas, ésteres C1-C6 alquílicos de ácidos C1-C3 carboxílicos, e C4-C8 éteres lineares ou cíclicos, b) Adicionar um meio de reação aquosa, que pode ser uma solução de um ou mais sais, uma solução de tampão ou água destilada sem sal, preferencialmente pré-aquecido a 70 oC ±5 oC, c) Adicionar uma solução de saponinas triterpenoides, como uma saponina de Quillaja a uma concentração final de 1 mg/ml a 10 mg/ml para produzir uma razão final de 10:1 a 20:1, preferencialmente 16:1 (p/p) de saponina: Colesterol, d) Aquecer a mistura de reação a 70 oC ±5 oC por cerca de uma hora, e) Resfriar a mistura de reação a 4 oC ±2 oC durante a noite, isolar as partículas formadas e remover a saponina em excesso, por exemplo, por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC).

[0014] As nanopartículas “NanoQuil F70” preparadas pelo método de acordo com o segundo aspecto da presente invenção diferem substancialmente da técnica anterior, incluindo as chamadas nanopartículas “G3” descritas nos documentos WO2013051994 e WO2014163558, não menos por sua combinação única de morfologia (formato similar a fio (filamentosas) vs. redondo/esférico) e dispersão de partícula (uniforme vs. não uniforme) quando medidas por análise de DLS.

[0015] Comparando as etapas de método do procedimento como revelado no documento WO2013051994 com aquelas da presente invenção, fica claro que as características estruturais que definem as nanopartículas NanoQuil F70 do segundo aspecto são devido às modificações do procedimento de fabricação vis-à-vis do procedimento descrito nos documentos WO2013051994 e WO2014163558.

[0016] As nanopartículas de acordo com a invenção podem ser usadas como sistemas de entrega para um ou vários compostos, por exemplo, para produtos farmacêuticos incluindo aqueles usados para o tratamento de câncer e compostos relacionados à nutrição em que a substância (ou substâncias) adicional fornece funções adicionais e modos complementares de ação.

[0017] Em um terceiro aspecto, as nanopartículas NanoQuil F70 e composições que compreendem as mesmas podem ser usadas, como um produto farmacêutico, opcionalmente em uma composição farmacêutica que compreende adicionalmente tampões farmaceuticamente aceitáveis, excipientes de diluentes, aditivos, adjuvantes e/ou carreadores.

[0018] Moléculas anfipáticas e hidrofóbicas, que podem ser selecionadas a partir de um antígeno, um adjuvante, uma molécula de direcionamento, um composto de produto farmacêutico e um nutriente, podem ser integradas nas nanopartículas de acordo com a presente invenção ou misturadas com as mesmas em uma composição. Os compostos alternativamente diferentes são incorporados nas nanopartículas separadas.

[0019] A composição farmacêutica pode ser usada como um adjuvante, por exemplo, para uso em combinação com uma vacina, para uso em combinação com uma vacina de vírus influenza sazonal, para uso em combinação com uma vacina de influenza pandêmica ou para uso em combinação com uma vacina de emergência, como uma vacina contra uma arma biológica.

[0020] Assim, a invenção também se refere a uma formulação de vacina de produto farmacêutico que compreende as partículas NanoQuil F70 de acordo com a presente invenção, especialmente como um adjuvante, como mencionado acima.

[0021] A invenção também se refere a um método para tratar ou prevenir uma doença causada ou complicada por um organismo, que compreende administrar a um indivíduo uma formulação de vacina de produto farmacêutico de acordo com a invenção para uma pessoa em necessidade da mesma.

[0022] Além disso, a invenção se refere a um método para o tratamento de cânceres, incluindo tumores sólidos, que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de nanopartículas NanoQuil F70 ou uma composição contendo as mesmas, de acordo com a presente invenção.

[0023] Além disso, a invenção também se refere a nanopartículas NanoQuil F70, ou uma composição contendo as mesmas, para uso no tratamento de cânceres, que compreendem administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de nanopartículas NanoQuil F70 ou uma composição contendo as mesmas.

[0024] Acredita-se que o efeito terapêutico de ambas as partículas G3 mencionadas doravante no presente documento e das nanopartículas NanoQuil F70 da presente invenção em vários tipos de células cancerosas seja causado pela capacidade de as nanopartículas transformarem as células cancerosas em células apoptóticas ao encerrar o ciclo mitótico.

[0025] As nanopartículas NanoQuil F70, ou composições contendo as mesmas podem ser administradas por via parenteral. O termo parenteral como usado no presente documento inclui injeções subcutâneas, intravenosas, intramuscular, intramusculares, injeção intradérmica de técnicas de infusão, eletroporação (EP), para injeção sem agulha - injeção a jato, arma de gene, bijetor, bem como administrações orais de aerossol.

[0026] A invenção também se refere a um método para avaliar a aplicabilidade do método para o tratamento de câncer de acordo com a invenção para um paciente individual, que compreende • colocar as células cancerosas do dito paciente em contato in vitro com nanopartículas NanoQuil F70 de acordo com a presente invenção ou uma composição farmacêutica contendo tais nanopartículas, • medir pelo menos um efeito indicativo de efeito terapêutico das ditas nanopartículas ou composição farmacêutica, nas ditas células cancerosas; em que o método é avaliado como sendo aplicável ao dito paciente individual se as nanopartículas ou composição farmacêutica mostrar um efeito significativo indicativo do efeito terapêutico nas ditas células cancerosas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0027] Figura 1A. Uma cópia da Fig. 1A do documento WO2013051994 que é descrito como “The electron microscopy (EM) shows a nanoparticle comprising cholesterol, QHC and diterpenoid in a molar ratio of 1:1:0.5. The particles have a mean diameter of about 17 - 20 nm according to the invention”.

[0028] Figura 1B. Uma microscopia de elétrons de uma amostra não contendo colesterol ou saponina, mas apenas o tampão de fosfato. As “nanopartículas” de 20 nm capturadas nessa foto de TEM após uma preparação de amostra similar como para a Fig. 1A, são apenas sais de fosfato que precipitam durante a evaporação necessária do tampão de fosfato.

[0029] Figura 2. Análise de tamanho de partícula de DLS de 3 bateladas produzida de acordo com o procedimento descrito no documento WO201305199. Como pode ser visto, as partículas contêm pelo menos duas frações principais.

[0030] Figuras 3 A e B. Microscopia Eletrônica de Transmissão de partículas NanoQuil F70 de acordo com a invenção usando PBS (figura 3A) ou água destilada (figura 3B) como o meio de reação aquosa, e um período de incubação de cerca de uma hora a 70 °C. As fotos de TEM revelam que independente do meio de reação, as partículas de F70 resultantes têm um formato filamentoso (similar a fio), isto é, uma morfologia completamente diferente daquela das ditas nanopartículas similares a disco do documento WO2013051994.

[0031] Figura 3C. Gráfico de barras que mostra nanopartículas NanoQuil F70 produzidas usando 4 diferentes meios de reação aquosa: Água destilada (D.W.), Solução salina (0,85 % de NaCl em D.W.), Tampão de acetato (pH 4,6) e PBS (pH 7,4) de acordo com o protocolo de produção de NanoQuil F70 acima. Diferenças no tamanho de partícula (diâmetro hidrodinâmico) foram observadas por DLS nessas formulações: NanoQuil F70 formulada em PBS gera o maior tamanho (cerca de 42 nm), seguido de NanoQuil F70 formulada em Solução salina (cerca de 35 nm). Partículas de NanoQuil F70 formuladas em Tampão de acetato (pH 4,6) e água destilada geram tamanhos de partícula de cerca de 25 e 24 nm respectivamente.

[0032] Figura 4. As mesmas partículas que aquelas analisadas por TEM na Fig. 3A, agora analisaram a distribuição de tamanho de partícula por DLS. Isso revela que as partículas de acordo com a presente invenção são monodispersadas com um diâmetro hidrodinâmico médio de 42,2 nm ±1,0 nm quando preparadas em PBS. Para as partículas produzidas em outros meios diferentes de PBS, consulte a figura 3C.

[0033] Figura 5. A análise de Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS) de três bateladas de NanoQuil F70 preparada em PBS, antes da purificação por SEC.

[0034] Figura 6: Cromatograma de RP-HPLC de NanoQuil F70 purificada por SEC em Sephacryl S300-HR. A fração que elui em 6 ml do cartucho de Sephacryl S300-HR de 13 ml e que contém NanoQuil F70 purificada foi analisada por HPLC. Integração do sinal entre 20 ml e 32 ml (barra cinza) é usada para quantificar as saponinas na fração. Integração do sinal em 39 ml é usada para quantificar o colesterol.

[0035] Figura 7: Quantidades relativas de QuilA (cinza claro) e colesterol (cinza escuro) coletadas nas frações de SEC. Um volume de 1 ml de NanoQuil F70 em 4,2 mg/ml de QuilA foi carregado na coluna de Sephacryl S300-HR e frações de 1 ml foram coletadas para análises quantitativas de HPLC. As frações de SEC que contêm quantidades detectáveis de QuilA, de 4 ml a 13 ml, são mostradas. NanoQuil F70 e QuilA são mostradas como referências.

[0036] Figura 8: Efeito hemolítico de frações de SEC de sephacryl S300-HR de NanoQuil F70.

[0037] Figura 9 Ensaio hemolítico com QuilA sozinho. O gráfico mostra a hemoglobina liberada das células de glóbulos vermelhos (RBC) como uma função de diluição de RBC. Em 0,4 mg/ml, QuilA mostra potencial hemolítico completo nesse ensaio. Redução no efeito hemolítico é observada de 0,3 mg/ml para baixo. Método: 20 µl de QuilA foram adicionados a 180 µl de sangue de ovelha fresco diluídos de 0,9x a 0,1x em PBS. As misturas foram incubadas a 37 oC por 45 min, e células são peletizadas em 500 xg por 5 min. A hemoglobina no sobrenadante é medida medindo-se a absorbância em 580 nm.

[0038] Figuras 10 A e B Ensaio hemolítico com partículas de nanoQuil F70. O gráfico mostra a hemoglobina liberada das células de glóbulos vermelhos (RBC) como uma função de diluição de RBC. O método de teste como para a fig. 9.

[0039] Figura 10A: Em comparação com QuilA sozinha (figura 9), nanoQuil F70 (bruta) não purificada mostra efeito hemolítico em uma concentração de QuilA equivalente de 1 mg/ml. Em 2 mg/ml de nanoQuil F70 bruta, o efeito hemolítico é similar àquele induzido por 0,2 mg/ml de QuilA livre.

[0040] Figura 10B: NanoQuil F70 purificada por S300-HR não mostra efeito hemolítico até uma concentração de QuilA equivalente de 2 mg/ml. Em 4 mg/ml de NanoQuil F70 purificada, o efeito hemolítico é menor ou similar àquele induzido por 0,1 mg/ml de QuilA livre ou por 1 mg/ml de nanoQuil F70 bruta.

[0041] Figura 11: Uma comparação do efeito de adjuvante de partículas de nanoQuil F70 com partículas G3. Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre partículas G3- VAX e Nanoquil. No entanto, nanoQuil F70 parecia gerar respostas ab um pouco mais potentes e uma variação menor que G3.

DEFINIÇÕES

[0042] Todos os termos e palavras no presente relatório descritivo devem ser interpretados como tendo o significado normalmente dado aos mesmos na técnica relevante, salvo se especificamente indicado o contrário. Para fins de clareza, alguns termos são definidos abaixo.

[0043] Uma formulação de vacina é uma formulação farmacêutica que é usada profilaticamente e melhora/aumenta a imunidade protetora para/contra uma ou mais doenças específicas.

[0044] Uma vacina terapêutica de acordo com a invenção pode ser usada para curar ou tratar a doença quando um antígeno específico para um componente conectado à doença está incluído na formulação com a invenção ou, como é particular para tratamento de câncer, o antígeno está presente no câncer/tumor. Uma vacina inclui um “antígeno”

que obtém uma resposta imune no indivíduo tratado e, opcionalmente, uma substância adicionada a uma vacina para melhorar a resposta imune chamada de um “adjuvante” ou “imunoestimulador”.

[0045] Um “antígeno” é, assim, a parte específica ativa em uma vacina e pode ser todo o microrganismo, como vírus ou bactéria, causando a doença que a vacina visa melhorar a imunidade. Pode-se também ser uma parte do dito microrganismo uma subunidade, como uma proteína (uma subunidade) uma parte de uma proteína, uma proteína isolada do microrganismo patogênico ou produzida por técnica de rDNA ou sinteticamente produzida, então, frequentemente chamada de peptídeo. Um peptídeo tem menos aminoácidos que uma proteína e geralmente nenhuma dobra estrutural 3D ordenada.

[0046] Um "adjuvante" é um constituinte da vacina que aumenta o nível e/ou a qualidade da resposta imune à parte de antígeno da vacina profilática ou terapêutica.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0047] Os inventores revelaram que a heterogeneidade observada (quando analisada por Espalhamento Dinâmico de Luz, DLS) das partículas preparadas de acordo com o procedimento do documento WO2013051994 surpreendentemente pode ser superada incubando-se as partículas a uma temperatura elevada e ajustando-se a razão entre a saponina e o colesterol na preparação inicial. Outros parâmetros de processo, como a área de superfície e espessura do filme de colesterol e a polaridade de solvente também podem desempenhar um papel. A morfologia das partículas "NanoQuil F70" produzidas pelo procedimento de acordo com a presente revelação difere da morfologia das partículas "G-3" em formato de disco aparente produzidas pelo procedimento revelado no documento WO2013051994, em que as partículas NanoQuil F70 de acordo com a presente revelação são filamentosas, "similares a fio" e podem aparecer em formato aberto, isto é, similar a uma minhoca ou macarrão, ou em formato fechada/circular (em contraste com o formato em forma de disco aparente no documento WO2013051994), consulte a figura 3A e B. As nanopartículas NanoQuil F70 de acordo com a presente invenção não são formuladas com e não contêm, fosfolipídios ou codetergentes (como MEGA-10), em contraste com, por exemplo, formulações de adjuvante de matriz de ISCOM e ISCOM.

[0048] Em um primeiro aspecto da presente invenção, se fornece, então, nanopartículas (“NanoQuil F70”) que compreende colesterol e uma saponina triterpenoide, como um componente da Quillaja saponaria Molina como Quil A®, ou componentes isolados dos mesmos, como frações QS-7, QS-8, QS-17, QS-18 e QS-21 ou um componente de Quillaja brasiliensis, como fração QB-90, caracterizadas pelo fato de que as ditas nanopartículas são similares a fio (filamentosas).

[0049] Como mencionado acima, as nanopartículas de acordo com o primeiro aspecto foram encontradas por análise de TEM para existir em duas formas separadas, ambas tendo um formato característico similar a fio (filamentoso). Uma forma é com extremidade aberta, isto é, similar à minhoca ou macarrão, a outra forma é fechada e substancialmente circular. A nanopartículas produzidas de acordo com os métodos descritos abaixo no presente documento contêm tipicamente ambas as formas.

[0050] Em uma modalidade, as nanopartículas NanoQuil F70 podem, então, compreender duas formas: • Forma A, composta de nanopartículas fechadas substancialmente circulares, e • Forma B, composta de nanopartículas similares a minhoca com extremidade aberta.

[0051] A razão entre a Forma A: Forma B é influenciada pela natureza do solvente de reação empregado e/ou pelo pH do solvente de reação empregado, entre outros parâmetros.

[0052] Em uma modalidade adicional, a dita mistura de Forma A e Forma B tem uma razão entre 20:80 a 45:55, como 30:70 a 40:60, como cerca de 35:65.

[0053] Em outra modalidade, a dita mistura de Forma A e B tem uma razão entre 5:95 a 10:90.

[0054] Em uma modalidade, as nanopartículas de acordo com o primeiro aspecto são substancialmente compostas de apenas uma forma, isto é, as nanopartículas contêm pelo menos cerca de 95 % de Forma A ou Forma B.

[0055] Em outra modalidade, as nanopartículas substancialmente circulares de Forma A têm um raio entre 10-15 nm e as nanopartículas com extremidade aberta de Forma B têm um comprimento de 35-45 nm, ambos os valores como medido por TEM.

[0056] Em uma modalidade, a espessura ou diâmetro de filamento está entre 4–8 nm, preferencialmente 5-7 nm, como 5,8 ± 0,8 nm.

[0057] Em outra modalidade, as nanopartículas substancialmente circulares de Forma A têm um perímetro entre 65 – 120 nm, como 70 – 80 nm, como 80 – 90 nm ou como

85-120 nm.

[0058] Em outra modalidade, as nanopartículas substancialmente circulares de Forma A têm um perímetro 75 ± 7 nm.

[0059] Em outra modalidade, as nanopartículas substancialmente circulares de Forma A têm um perímetro 103,5 ± 17 nm.

[0060] Em outra modalidade, a razão entre saponina de quillaja e colesterol é de 12:1 a 18:1, como 14:1 a 17:1, preferencialmente, 16:1.

[0061] As nanopartículas NanoQuil F70 de acordo com o primeiro aspecto da presente invenção diferem substancialmente da técnica anterior, incluindo as chamadas nanopartículas “G3” descritas nos documentos WO2013051994 e WO2014163558, não menos por sua combinação única de morfologia (filamentosa/similar a fio vs. Similar a disco) e dispersão de partícula (uniforme vs. não uniforme).

[0062] As nanopartículas similares a fio têm atraído considerável interesse no campo de sistemas de distribuição de fármaco. Em um estudo documentado por B. Karagoz et al. “Polymerization-Induced Self-Assembly (PISA) – control over the morphology of nanoparticles for drug delivery applications.", Polym. Chem., 2014 mostrou-se que nanopartículas similares à minhoca e cilíndricas são sete vezes mais mortais que aquelas esféricas tradicionais ao entregar os fármacos às células de câncer de mama, mas não mais tóxicas para as células saudáveis.

[0063] Esses resultados foram corroborados em outro estudo documentado por Elizabeth Hinde et al. em “Pair correlation microscopy reveals the role of nanoparticle shape in intracellular transport and site of drug release”, Nature Nanotechnology Volume 12, páginas 81–89 (2017). Hinde et al. demonstrou que nanopartículas poliméricas com diferentes formatos, nas químicas de superfície idêntica movidas através de várias barreiras celulares em diferentes taxas, definindo, por fim, o sítio de liberação de fármaco. O grupo mediu quantas micelas, vesículas, hastes e minhocas entraram na célula e se escaparam do sistema endossomal e tiveram acesso ao núcleo através do complexo de poro nuclear. As hastes e minhocas, mas não micelas e vesículas, entraram no núcleo por difusão passiva. O aprimoramento do acesso nuclear, por exemplo, com um sinal de localização nuclear, resultou em mais liberação de doxorrubicina dentro do núcleo e correlacionou-se com maior citotoxicidade. Os resultados do grupo, portanto, demonstram que a entrega de fármaco através da barreira celular principal, o envelope nuclear, é importante para a eficiência da doxorrubicina e pode ser alcançada com nanopartículas de formato adequado.

[0064] Em um segundo aspecto da presente invenção, é fornecido um método de produção para as partículas NanoQuil F70 filamentosas (similares a fio) do primeiro aspecto, compreendendo as seguintes etapas: a) Preparar uma camada de colesterol na superfície interna de um vaso de reação e/ou na superfície de um artigo poroso insolúvel em água localizado no dito vaso de reação, removendo-se o solvente de uma solução não aquosa de colesterol em um solvente orgânico selecionado a partir de um ou mais C1-C6 álcoois, C2-C6 cetonas, ésteres C1-C6 alquílicos de ácidos C1-C3 carboxílicos, e C4-C8 éteres lineares ou cíclicos, b) Adicionar um meio de reação aquosa, que pode ser uma solução de um ou mais sais, uma solução de tampão ou água destilada sem sal, preferencialmente pré-aquecido a 70 oC ±5 oC, c) Adicionar uma solução de saponinas triterpenoides, como uma saponina de Quillaja, a uma concentração final de 1 mg/ml a 10 mg/ml para produzir uma razão final de 10:1 a 20:1, preferencialmente 16:1 (p/p) de saponina: Colesterol, d) Aquecer a mistura de reação a 70 oC ±5 oC por cerca de uma hora, e) Resfriar a mistura de reação a 4 oC ±2 oC durante a noite, isolar as partículas formadas e remover a saponina em excesso, por exemplo, por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC).

[0065] Em relação ao ponto a) do segundo aspecto, o técnico no assunto entenderá a importância de alcançar um contato íntimo entre colesterol insolúvel em água e saponinas insolúveis em água a fim de produzir as partículas NanoQuil F70 da invenção. Isso exige a criação de uma superfície acessível por solvente grande de colesterol. Em uma modalidade da invenção, isso é executado ao preparar e/ou depositar uma camada de colesterol tão fina quanto possível na superfície interna de um vaso de reação no qual a solução de saponina pode ser subsequentemente adicionada.

[0066] Alternativamente, em outra modalidade, a camada de colesterol pode ser preparada e/ou depositada na superfície de um artigo poroso insolúvel em água que pode ser colocado em contato com a solução de saponina. Em ambas as modalidades mencionadas acima, a camada de colesterol pode ser praticamente preparada ou depositada por evaporação de uma solução de colesterol em um solvente orgânico adequado.

[0067] Por fim, em uma modalidade diferente da invenção, o contato íntimo entre colesterol insolúvel em água e saponinas insolúveis em água também pode ser alcançado em microrreatores de fluxo contínuo em que as soluções separadas de colesterol e saponinas são misturadas em alta velocidade e alta turbulência.

[0068] O técnico no assunto apreciará que o termo “vaso de reação” se refere a qualquer tipo e tamanho de recipiente, tubo de teste, barril, frasco, jarro, caixa ou receptáculo que é adequado para e compatível com as operações de unidade delimitadas no processo de acordo com o primeiro aspecto. Um vaso de reação pode ser convenientemente selecionado a partir de equipamento laboratorial normal, como tubos de teste, tubos de centrifugação, frascos de fundo redondo ou em formato de pêra com um ou múltiplos gargalos, etc., que são tipicamente produzidos a partir de vidro ou polímeros resistentes a solventes adequados. Um vaso de reação para fins de aumento de escala e produção pode ser selecionado a partir de reatores de escala piloto e escala de produção, que podem ser revestidos de vidro ou produzidos a partir de aço inoxidável ou outras ligas.

[0069] O técnico no assunto apreciará adicionalmente que pelo termo "um artigo poroso insolúvel em água" significa qualquer artigo de tamanho adequado tendo uma estrutura de célula aberta e um formato adequada, como uma fibra oca, e feito de um material adequado, material poroso insolúvel, como vidro poroso, aerogéis e outros géis inorgânicos, alumina porosa, partículas de zircônia ou sílica, espumas de metal e polímeros porosos.

[0070] O técnico no assunto apreciará ainda que a remoção de solvente da solução de colesterol convenientemente pode ser realizada por evaporação da solução. Isso compreende aplicar um vácuo moderado, opcionalmente com aquecimento, enquanto agita os conteúdos do vaso de reação. A dita agitação pode ser realizada girando-se o vaso de reação ou aplicando-se um agitador interno dentro do vaso de reação, como uma barra de agitação ou um agitador de pá.

[0071] Alternativamente, a remoção do solvente da solução de colesterol pode ser executada passando uma corrente de ar, árgon ou nitrogênio para o interior do vaso de reação, opcionalmente enquanto se agita os conteúdos no mesmo.

[0072] Independentemente do método pelo qual o solvente é removido, a referida remoção efetua a deposição de uma camada de colesterol com espessura e rugosidade variáveis no interior do vaso de reação e/ou na superfície do artigo poroso.

[0073] Em relação ao ponto b) do segundo aspecto, as nanopartículas NanoQuil F70 foram produzidas usando 4 meios de reação aquosa diferentes: Água destilada (D.W.), Solução salina (0,85 % de NaCl em D.W.), Tampão de acetato (pH 4,6) e PBS (pH 7,4) de acordo com o protocolo de produção de

NanoQuil F70 acima.

[0074] Diferenças no tamanho de partícula (diâmetro hidrodinâmico) foram observadas por DLS nessas formulações: NanoQuil F70 formulada em PBS gera o maior tamanho (cerca de 42 nm), seguido de NanoQuil F70 formulada em Solução salina (cerca de 35 nm). As partículas NanoQuil F70 formuladas em Tampão de acetato (pH 4,6) e água destilada geram tamanhos de partícula de cerca de 25 e 24 nm respectivamente (consulte a figura 3C).

[0075] Através da análise de DLS, o diâmetro das partículas que é dado é o diâmetro hidrodinâmico. O diâmetro hidrodinâmico, ou diâmetro de Stokes, é o diâmetro de uma esfera dura equivalente que se difunde na mesma taxa do analito, isto é, que de uma esfera que tem o mesmo coeficiente de difusão translacional da partícula que é medida, assumindo uma camada de hidratação em torno da partícula. Portanto, o que é medido é o raio de rotação das partículas em solução. Isso não fornece informações sobre a morfologia da partícula em condições “estáticas”; no entanto, isso pode ser avaliado por TEM.

[0076] Usando a análise TEM, verificou-se que o uso de diferentes meios de reação aquosa sob o ponto b) acima também leva a outras diferenças na morfologia das partículas. Como pode ser visto na tabela abaixo, a razão de nanopartículas abertas vs. fechadas (Forma A: Forma B) produzidas nos diferentes meios é diferente. Para tampão de PBS, a razão é de cerca de 8:92 A:B, mas para a água destilada e tampão de acetato, a razão é de cerca de 40:60. Todos os valores medidos por análise de imagem de TEM.

Forma B de Forma A Perímetro Comprimento Amostra de NanoQuil F70 Extremidade Circular (nm) (nm) Aberta H2O pH ~5,2 39,7 % 75,7±7,4 60,3 % 43,9 (R = 12 nm) 150 mM de NaCl pH ~5,2 A ser realizado 10 mM de acetato de Na 35,4 % 74,7±7,3 64,6 % 44,1 pH 4,6 (R = 11,9 nm) PBS pH 7,4 8,3 % 103,5±17,8 91,7 % 61,1 (R = 16,5 nm)

[0077] A morfologia de partícula NanoQuil F70 pode, então, ser ajustada alterando-se os parâmetros de processo, o que é uma grande vantagem sobre os procedimentos da técnica anterior. Os requerentes preveem que os vários tipos de partículas e razões de composição encontrarão usos individuais.

[0078] Assim, em uma modalidade, o meio de reação aquosa adicionado sob o ponto b) é um tampão, como um acetato ou tampão de PBS. Em outra modalidade, o meio de reação aquosa adicionado sob o ponto b) é uma solução de um ou mais sais como solução salina (0,85 % de NaCl em água destilada). Ainda em outra modalidade, o meio de reação aquosa adicionado sob o ponto b) é água destilada sem sal. Em uma modalidade preferencial, o meio de reação aquosa adicionado sob o ponto b) é um tampão de acetato que tem um pH de ~4,6.

[0079] Em outra modalidade, o processo de fabricação para partículas NanoQuil F70 é conduzido em um pH entre 4-

5. Em outra modalidade, o processo de fabricação para partículas NanoQuil F70 é conduzido em um pH entre 5-6. Em outra modalidade, o processo de fabricação para partículas NanoQuil F70 é conduzido em um pH entre 6-7. Em outra modalidade, o processo de fabricação para partículas NanoQuil F70 é conduzido em um pH entre 7-8.

[0080] Em relação ao ponto c) do segundo aspecto, a adição de Quil A (ou outra fração de quilaja) é preferencialmente realizada usando uma solução aquosa de uma concentração cerca de 1 mg/ml. Quantidades suficientes de tal solução é adicionada para produzir uma razão final de 10:1 a 20:1, preferencialmente uma razão final de 16:1 (p/p) saponinas: Colesterol.

[0081] O aquecimento da mistura de reação resultante no ponto d) do processo de acordo com o segundo aspecto é um recurso essencial da presente invenção, que altera drasticamente a morfologia e distribuição de tamanho de partícula das partículas produzidas vis-à-vis as partículas do documento WO2013051994, como descrito acima.

[0082] Assim, em uma modalidade preferencial, a mistura de reação resultante no ponto d) do processo de acordo com o primeiro aspecto é aquecida a 70 ˚C ±5 ˚C por cerca de uma hora. O técnico no assunto apreciará que embora o aquecimento seja um recurso essencial da presente invenção, a temperatura de reação exata, período de aquecimento, taxa de aquecimento e perfil de temperatura durante o aquecimento e resfriamento subsequente, especialmente ao dimensionar o método de produção para uma nova escala, são parâmetros que todos precisam ser analisados e otimizados. A análise e otimização dos parâmetros do processo são tarefas bem compreendidas pelo técnico no assunto e consideradas tarefas de rotina a serem executadas, que não requerem habilidades inventivas.

[0083] Em relação ao ponto e) do segundo aspecto, o isolamento final das partículas NanoQuil F70 da invenção inclui uma etapa de purificação. Essa etapa é incluída devido ao fato de que as partículas "brutas" NanoQuil F70, que resultam do processo de formulação de saponinas com colesterol de acordo com o segundo aspecto da presente invenção, nunca estão totalmente livres de micelas de saponina livre residual e, portanto, o produto bruto de NanoQuil F70 pode conter micelas de saponina livre em quantidades variáveis de batelada por batelada. A etapa de purificação final reduz a variabilidade de batelada a batelada a um nível aceitável, que será discutido a seguir.

[0084] As saponinas das espécies de Quillaja, como QuilA - uma mistura comercial de saponinas parcialmente purificadas da Quillaja saponaria Molina - têm uma atividade lítica inerente em membranas biológicas quando entregues como micelas em tampões aquosos, como muitas outras saponinas (Kensil, C. R. et al. (1991). Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex. The Journal of Immunology, 146(2), 431-437; Oda, K., et al. (2000). Adjuvant and haemolytic activities of 47 saponins derived from medicinal and food plants. Biological Chemistry, 381(1), 67-74). Nessa forma, as saponinas de Quillaja induzem uma síndrome de inflamação aguda adversa quando injetada como adjuvantes de vacina, devido a seu efeito lítico de membrana celular potente (uma reação que leva à interrupção ou lise de uma célula).

[0085] A estrutura das moléculas de saponina, que possuem metades hidrofílicas e lipofílicas, fornece a essas moléculas um efeito detergente pronunciado.

[0086] Mediante a injeção, as moléculas de saponina tal como interagem com colesterol e fosfolipídios em membranas celulares, agindo, através disso, como um detergente. Esse efeito é quantificado no ensaio de hemólise executado em células de glóbulos vermelhos de ovelha, como descrito na Seção experimental abaixo no presente documento.

[0087] O efeito de solvente da saponina leva a uma reação lítica com o tecido que circunda o inóculo. As recomendações de dosagem para o uso de saponinas como adjuvantes de vacinas, portanto, devem refletir um equilíbrio entre a obtenção de um bom efeito imunoestimulante sem também induzir reações adversas clinicamente significativas no sítio de injeção (na forma de úlceras, necrose, etc.). Isso, no entanto, confere algumas limitações para a dosagem ao aplicar esses adjuvantes.

[0088] Ao preparar NanoQuil F-70, bem como outros adjuvantes de particulado contendo saponina, pode haver um certo excesso de saponina livre que não é imobilizada por incorporação, nesse caso, no complexo de NanoQuil F70 com colesterol.

[0089] Esta saponina livre ainda possuirá a capacidade de induzir reações líticas no tecido circundante, como discutido acima. Para que um adjuvante à base de saponina seja aceito na vacinação, seu potencial lítico de membrana precisa ser o mais baixo possível, sem afetar o efeito de imunopotenciadores das saponinas. Para essa finalidade, uma etapa de purificação das nanopartículas NanoQuil F70 é necessária para garantir um produto aceitável.

[0090] Os requerentes constataram que a filtração em gel (a seguir referida como cromatografia de exclusão por tamanho, SEC) remove de forma satisfatória o excesso de saponinas do produto bruto. Ademais, a metodologia de SEC é facilmente escalonável para a escala de produção industrial.

[0091] A filtração em gel (também referida como cromatografia por exclusão de tamanho, SEC) separa as moléculas de acordo com as diferenças de tamanho visto que atravessam um meio de filtração em gel embalado em uma coluna. Ao contrário da cromatografia de troca iônica ou de afinidade, as moléculas não se ligam ao meio de cromatografia, assim, a composição de tampão não afeta diretamente a resolução (o grau de separação entre os picos). Consequentemente, uma vantagem significativa da filtração em gel consiste no fato de que as condições podem ser variadas para se adequar ao tipo de amostra ou às exigências para purificação adicional, análise ou armazenamento sem alterar a separação.

[0092] Em uma modalidade, a remoção de saponina residual é executada usando, por exemplo, Sephacryl 300 ou outro meio de filtração em gel que o técnico no assunto será capaz de escolher sem esforços inventivos. A metodologia de SEC é capaz de separar as partículas NanoQuil F70 com um tamanho médio de 20-50 nm (diâmetro hidrodinâmico dependente do meio de reação) das micelas de saponina residual com um tamanho médio de ~5 nm e, assim, obter um produto com um efeito lítico altamente reduzido.

[0093] O efeito da remoção do excesso de saponina na atividade hemolítica das nanopartículas NanoQuil F70 é completamente documentado na Seção Experimental abaixo no presente documento e pode ser facilmente demonstrado comparando-se o efeito hemolítico das nanopartículas "brutas" com as partículas purificadas de SEC, consulte as Figuras 9 e 10.

[0094] O efeito hemolítico das nanopartículas de nanoQuil F70 analisadas (que contêm QuilA complexada) é apresentado de forma mais eficaz como “equivalentes de QuilA”. Comparada com a própria QuilA, a nanoQuil F70 não purificada (bruta) induz um efeito hemolítico a uma concentração de QuilA equivalente de 1 mg/ml. Em 2 mg/ml de nanoQuil F70 não purificada, o efeito hemolítico é similar ao de 0,2 mg/ml de QuilA livre. O efeito hemolítico dessa preparação pode ser, portanto, considerado cerca de 10x reduzido em relação à própria QuilA.

[0095] NanoQuil F70 purificada de Sephacryl 300-HR não mostra qualquer efeito hemolítico até uma concentração de QuilA equivalente de 2 mg/ml. Em 4 mg/ml, NanoQuil F70 purificada exibe um efeito hemolítico que é menor ou similar àquele induzido por 0,1 mg/ml de QuilA livre ou 1 mg/ml de nanoQuil F70 não purificada. O efeito hemolítico das nanopartículas NanoQuil F70 purificada pode, então, ser considerado pelo menos 40x reduzido em relação à própria QuilA ou cerca de 4x reduzido em relação à nanoQuil F70 bruta.

[0096] Esse efeito (redução do efeito lítico) da purificação de SEC das partículas de nanoQuil F70 é surpreendentemente alto e, além disso, muito significativo a partir do ponto de vista do tratamento, visto que aumenta o limite superior de quanto adjuvante contendo saponina pode ser injetado com segurança sem aumentar concomitantemente a reatogenicidade local. Como resultado, o uso de partículas de nanoQuil F70 como adjuvante pode possibilitar a indução de uma resposta imunológica mais elevada para uma determinada injeção.

[0097] Em uma modalidade preferencial da invenção, o efeito hemolítico induzido pelas nanopartículas de nanoQuil F70 contendo saponina é reduzido pelo menos 20x, como 20x, 30x ou 40x em comparação ao efeito hemolítico induzido pela mesma saponina, como QuilA, na forma não complexada pura por meio de técnicas de filtração em gel, como cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) realizada nas nanopartículas de nanoQuil F70 brutas ou cruas.

[0098] Comparando as etapas de método do procedimento como revelado no documento WO2013051994 com aquelas da presente invenção, fica claro que as características estruturais que definem as nanopartículas de nanoQuil F70 do segundo aspecto são um resultado direto das modificações do procedimento de fabricação.

[0099] Consequentemente, em uma modalidade específica, as nanopartículas de acordo com o primeiro aspecto da invenção são obteníveis pelo método de acordo com o segundo aspecto.

[0100] Apesar de seu uso como adjuvantes da vacina, as nanopartículas de nanoQuil F70 de acordo com a invenção também podem ser usadas como sistemas de entrega para um ou vários compostos, por exemplo, para produtos farmacêuticos incluindo aqueles usados para o tratamento de câncer e compostos relacionados à nutrição em que a substância (ou substâncias) adicional fornece funções adicionais e modos complementares de ação.

[0101] Em um terceiro aspecto, as nanopartículas NanoQuil F70 e composições que compreendem as mesmas podem ser usadas, como um produto farmacêutico, opcionalmente em uma composição farmacêutica que compreende adicionalmente tampões farmaceuticamente aceitáveis, excipientes de diluentes, aditivos, adjuvantes e/ou carreadores.

[0102] Carreadores e/ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis adequados incluem qualquer um ou todos os solventes convencionais, meios de dispersão, cargas, carreadores sólidos, soluções aquosas, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardadores de absorção e similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica e é descrito, a título de exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18ª Edição, Mack Publishing Company, Pensilvânia, EUA. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional seja incompatível com o ingrediente ativo, seu uso nas composições farmacêuticas da presente invenção é contemplado. Ingredientes ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

[0103] A invenção compreende também uma composição farmacêutica que compreende adicionalmente pelo menos um composto farmaceuticamente ativo, como fármacos anticâncer, compostos de coordenação de platina, compostos de taxano, compostos de camptotecina, alcaloides antitumorais de vinca, derivados de nucleosídeos antitumorais, agentes alquilantes de nitrosoureia ou mostarda nitrogenada,

derivados de antraciclina antitumoral, trastzumabe e derivados de podofilotoxina antitumoral, Quillaja saponaria Molina e subfragmentos dos mesmos, receptores para anticorpos ou anticorpos monoclonais, como receptores de Fc ou DD de Proteína A de Staphylococcus aureus, agentes para tratar câncer, como agentes selecionados a partir do grupo que consiste em Citarabina, Daunorubicina, Paclitaxel, Docetaxel, Cabazitaxel, Toricsel e Trabectidina, cujo composto ativo pode ser integrado na nanopartícula ou misturado com a composição.

[0104] Os agentes anticâncer adicionais são preferencialmente selecionados a partir de compostos de coordenação de platina, compostos de taxano, compostos de camptotecina, alcaloides antitumorais de vinca, derivados de nucleosídeos antitumorais, agentes alquilantes de nitrosoureia ou mostarda nitrogenada, derivados de antraciclina antitumoral, trastzumabe e derivados de podofilotoxina antitumoral.

[0105] O termo "composto de coordenação de platina” é usado no presente documento para denotar qualquer crescimento de célula tumoral que inibe o composto de coordenação de platina que fornece platina na forma de um ferro. Os compostos de coordenação de platina incluem cisplatina, carboplatina, cloreto de (dietilenotriamina)- platina (II) de cloro; dicloro (etilenodiamina)-platina (II); diamina (1,1-ciclobutanodicarboxilato)-platina (II) (carboplatina); espiroplatina; iproplatina; diamina (2- etilmalonato)-platina (II); (1,2-diaminociclo- hexano)malonatoplatina (II); (4-carboxiftalo-1,2- diaminociclo-hexano)platina (II); (1,2-diaminociclo-

hexano)-(isocitrato)platina (II); (1,2-diaminociclo- hexano)-cis-(piruvato)platina (II); (1,2-diaminociclo- hexano)-oxalato-platina (II); ormaplatina e tetraplatina.

[0106] Cisplatina está comercialmente disponível, por exemplo, sob o nome comercial Platinol junto a Bristol Myers Squibb Corporation como um pó para constituição com água, solução salina estéril ou outro veículo adequado. Outros compostos de coordenação de platina e suas composições farmacêuticas são comercialmente disponíveis e/ou podem ser preparados por técnicas convencionais.

[0107] Os compostos de taxano incluem, por exemplo, Taxol junto a Bristol Myers Squibb, docetaxel (Taxotere) junto a Rhone-Poulenc Rorer e Carbazitaxel junto a Sanofi Pasteur. Outros compostos de taxano podem ser preparados de modo convencional, por exemplo como descrito nos documentos EP 253738, EP 253739 e WO 92/09589 ou por processos análogos aos mesmos.

[0108] Os compostos de camptotecina incluem irinotecano e topotecano. Irinotecano está comercialmente disponível, por exemplo, junto a Rhone-Poulenc Rorer sob o nome comercial Campto e pode ser preparado, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente europeia n° 137145 ou por processos análogos aos mesmos. Topotecano está comercialmente disponível, por exemplo, junto a SmithKline Beecham sob o nome comercial Hicamtina e pode ser preparado, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente europeia n° 321122 ou por processos análogos aos mesmos. Outros compostos de camptotecina podem ser preparados de modo convencional, por exemplo, por processos análogos àqueles descritos acima para irinotecano e topotecano.

[0109] Os alcaloides antitumorais de vinca incluem vinblastina, vincristina e vinorelbina referidas acima. Vinblastina está comercialmente disponível, por exemplo, como o sal de sulfato para injeção junto a Eli Lilly e Co sob o nome comercial Velban, e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente alemã n° 2124023 ou por processos análogos aos mesmos. Vincristina está comercialmente disponível, por exemplo, como o sal de sulfato para injeção junto a Eli Lilly e Co sob o nome comercial Oncovin e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente alemã acima n° 2124023 ou por processos análogos aos mesmos. Vinorelbina está comercialmente disponível, por exemplo, como o sal de tartrato para injeção junto a Glaxo Wellcome sob o nome comercial Navelbine e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente nº US 4307100 ou por processos análogos aos mesmos. Outros alcaloides antitumorais de vinca podem ser preparados de modo convencional, por exemplo, por processos análogos àqueles descritos acima para vinoblastina, vincristina e vinorelbina.

[0110] Os derivados de nucleosídeo antitumorais incluem 5-fluorouracila, gemcitabina e capecitabina referidas acima. 5-Fluorouracila está ampla e comercialmente disponível e pode ser preparada, por exemplo, como descrito na Patente nº US 2802005. Gemcitabina está comercialmente disponível, por exemplo, junto a Eli Lilly sob o nome comercial Gemzar e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente europeia n° 122707 ou por processos análogos aos mesmos.

[0111] Capecitabina está comercialmente disponível, por exemplo, junto a Hoffman-La Roche sob o nome comercial Xeloda e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente europeia n° 698611 ou por processos análogos aos mesmos. Outros derivados de nucleosídeo antitumorais podem ser preparados de modo convencional, por exemplo, por processos análogos àqueles descritos acima para capecitabina e gemcitabina.

[0112] Os compostos de mostarda nitrogenada incluem ciclofosfamida e clorambucila. Ciclofosfamida está comercialmente disponível, por exemplo, junto a Bristol- Myers Squibb sob o nome comercial Cytoxan e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente do Reino Unido n° 1235022 ou por processos análogos aos mesmos. ClorambucilA está comercialmente disponível, por exemplo, junto a Glaxo Welcome sob o nome comercial Leukeran e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente nº US 3046301, ou por processos análogos aos mesmos. Os compostos de nitrosoureia preferenciais para uso de acordo com a invenção incluem carmustina e lomustina referidas acima. Carmustina está comercialmente disponível, por exemplo, junto a Bristol-Myers Squibb sob o nome comercial BiCNU e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente europeia n° 902015 ou por processos análogos aos mesmos. Lomustina está comercialmente disponível, por exemplo, junto a Bristol-Myers Squibb sob o nome comercial CeeNU e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente nº US 4377687 ou por processos análogos aos mesmos.

[0113] Os derivados de antraciclina antitumorais incluem daunorubicina, doxorubicina e idarubicina referidas acima. Daunorubicina está comercialmente disponível por exemplo como o sal de cloridrato junto a Bedford Laboratories sob o nome comercial Cerubidine, e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente nº US 4020270 ou por processos análogos aos mesmos.

[0114] Doxorubicina está comercialmente disponível, por exemplo, como o sal de cloridrato junto a Astra, e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente nº US 3803124 ou por processos análogos aos mesmos. Idarubicina está comercialmente disponível, por exemplo, como o sal de cloridrato junto a Pharmacia & Upjohn sob o nome comercial Idamycin, e pode ser preparada, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente n° US 4046878 ou por processos análogos aos mesmos. Outros derivados de antraciclina antitumorais podem ser preparados de modo convencional, por exemplo, por processos análogos àqueles descritos acima para daunorubicina, doxorubicina e idarubicina.

[0115] Trastzumabe está comercialmente disponível junto a Genentech sob o nome comercial Herceptin e pode ser obtido como descrito no relatório descrito de Patente n° US 5821337 ou relatórios descritivos de patente PCT WO 94/04679 e WO 92/22653.

[0116] Derivados de podofilotoxina antitumoral incluem etoposídeo e teniposídeo. Etoposídeo está comercialmente disponível, por exemplo, junto a Bristol-Myers Squibb sob o nome comercial VePesid, e pode ser preparado, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente europeia n° 111058 ou por processos análogos aos mesmos. Teniposídeo está comercialmente disponível, por exemplo, junto a Bristol-Myers Squibb sob o nome comercial Vumon e pode ser preparado, por exemplo, como descrito no relatório descritivo de patente PCT n° WO 93/02094 ou por processos análogos aos mesmos. Outros derivados de podofilotoxina antitumorais podem ser preparados de modo convencional, por exemplo, por processos análogos àqueles descritos acima para etoposídeo e teniposídeo.

[0117] Assim, os fármacos anticâncer podem, por exemplo, ser escolhidos a partir de:

1.Agentes de alquilação polifuncionais: Nitrosoureias, Mostardas (mostardas nitrogenadas), metanossulfonatos (bussulfano), etileniminas

2.Outros Fármacos de Alquilação: Procarbazina (Matulane), Dacarbazina (DTIC), Altretamina (Hexalen), Cisplatina (Platinol)

3.Antimetabólitos: Compostos de ácido antifólico (Metotrexato), Antagonistas de Aminoácido (Azaserina)

4.Antagonistas de purina: Mercaptopurina (6-MP), Tioguanina (6-TG), Fosfato de Fludarabina, Cladribina (Leustatin), Pentostatina (Nipent)

5. Antagonistas de Pirimidina: Fluorouracila (5-FU), Citarabina (ARA-C), Azacitidina

6.Alcaloides de planta: Vinblastina (Velban), Vincristina (Oncovin), Etoposídeo (VP-16,VePe-sid), Teniposídeo (Vumon), Topotecano

(Hycamtin), Irinotecano (Camptosar), Paclitaxel (Taxol), Docetaxel (Taxotere)

7.Antibióticos: Antraciclinas, Doxorubicina (Adriamicina, Rubex, Doxil), Daunorubicina (DaunoXome), Dactinomicina (Cosmegen), Idarubincina (Idamycin), Plicamicina (Mithramycin), Mitomicina (Mutamycin), Bleomicina (Blenoxane)

8.Anticorpos Monoclonais,

9.Agentes hormonais: Tamoxifeno (Nolvadex), Flutamida (Eulexin), Agonistas de Hormônio de Liberação de Gonadotrofina, (Leuprolida e Goserelina (Zoladex)), Inibidores de Aromatase, Aminoglutetimida, Anastrozol (Arimidex),

10.Fármacos anticâncer diversos: Amsacrina, Hidroxiureia (Hydrea), Asparaginase (El-spar), Mitoxantrona (Novantrone), Mitotano, Derivados de Ácido Retinoico, Fatores de Crescimento de Medula Óssea, Amifostina.

[0118] Moléculas anfipáticas e hidrofóbicas, que podem ser selecionadas a partir de um antígeno, um adjuvante, uma molécula de direcionamento, um composto de produto farmacêutico e um nutriente, podem ser integradas nas nanopartículas de nanoQuil F70 de acordo com a presente invenção ou misturadas com as mesmas em uma composição. Uma composição de acordo com a presente invenção também pode conter diferentes moléculas anfipáticas e hidrofóbicas incorporadas nas nanopartículas separadas.

[0119] A composição farmacêutica que compreende as nanopartículas NanoQuil F70 da presente invenção pode, como mencionado acima, ser usada como um adjuvante de vacina,

por exemplo, para uso em combinação com uma vacina sob desenvolvimento ou já implementada em vacinas licenciadas, para uso em combinação com uma vacina de vírus influenza sazonal, para uso em combinação com uma vacina de influenza pandêmica ou para uso em combinação com uma vacina de emergência, como uma vacina contra uma arma biológica, ou para uso como um componente em um sistema de entrega de fármaco. As nanopartículas NanoQuil F70 da presente invenção são, assim, úteis como adjuvantes em vacinas tanto para uso em ser humano quanto para uso veterinário.

[0120] Assim, a invenção também se refere a uma formulação de vacina de produto farmacêutico, como uma vacina para ser humano ou veterinária, que compreende as partículas NanoQuil F70 de acordo com a presente invenção, e especialmente como um adjuvante como mencionado acima.

[0121] Em uma modalidade preferencial, as partículas NanoQuil F70 que compreendem saponina de QS-21 são particularmente adequadas para serem usadas como adjuvantes em vacinas para seres humanos. Em outra modalidade, as partículas NanoQuil F70 que compreendem saponina de QuilA são particularmente adequadas para serem usadas como adjuvantes em vacinas veterinárias.

[0122] Em outra modalidade, a composição farmacêutica compreende adicionalmente diterpenos, como um ou mais glicosídeos de esteviol.

[0123] A invenção também se refere a um método para tratar ou prevenir uma doença causada ou complicada por um organismo, que compreende administrar a um indivíduo uma formulação de vacina de produto farmacêutico de acordo com a invenção para uma pessoa em necessidade da mesma.

[0124] Além disso, a invenção se refere a um método para o tratamento de câncer, que compreende administrar a um paciente em necessidade do mesmo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de nanopartículas ou uma composição de acordo com a invenção.

De acordo com uma modalidade, o dito câncer é leucemia, linfoma, mielom, câncer de mama, câncer de próstata, câncer renal, câncer de pâncreas, câncer de ovário, câncer de cérebro, câncer de colo do útero, câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer dos rins, câncer oral, câncer sanguíneo.

O câncer pode estar localizado na Glândula adrenal (Câncer da Glândula Adrenal, Adenocarcinoma da Glândula Adrenal, Carcinoma Adrenocorticol; Ânus, Câncer Anal (Carcinoma de Células Escamosas do Ânus); Câncer de Bexiga (Carcinoma de Células Escamosas da Bexiga), Câncer de Bexiga (Carcinoma de Células de Transição da Bexiga); Sangue, Coagulação Intravascular Disseminada, Hiponatremia, Sepses Neutropênicas, Síndrome de Lise Tumoral; Osso, Endocondroma (condroma, doença de Ollier), Sarcoma de Ewings, Osteosarcoma, (Sarcoma Osteogênico), Metástases para o Osso, Câncer Ósseo (Condrossarcoma da Cartilagem); Medula óssea, Leucemia Mieloide Crônica, Mieloma Múltiplo, Leucemia Promielocítica (PML), Síndrome Mielodisplásica (MDS), Leucemia Linfocítica Crônica, Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), Leucemia Mieloide Aguda (LMA); Cérebro, Câncer Cerebral (Glioblastoma Multiforme do Cérebro), Tumor Cerebral (Glioma do Cérebro), Linfoma do Cérebro, Meduloblastoma/Tumor Neuroectodérmico Primitivo (PNET) [Meduloblastoma/Tumor Neuroectodérmico Primitivo (PNET)], Meningioma do Cérebro, Neuroblastoma, Tumor

Neuroectodérmico Primitivo do Cérebro (PNET), Metástase Cerebral, Neuroma Acústico, Tumor Cerebral (Astrocitoma do Cérebro); Mama, Câncer de Mama (Carcinoma da Mama), Câncer de Mama (Carcinoma Inflamatório da Mama), Câncer de Mama Masculino (Carcinoma de Mama Masculino), Câncer de Mama (Carcinoma de Mama Invasivo) [Carcinoma de Mama Invasivo (Câncer de Mama)], Câncer de Mama (Carcinoma Lobular Pré- Invasivo; Carcinoma Lobular In Situ; LCIS) [Carcinoma Lobular Pré-Invasivo (Carcinoma Lobular In Situ; LCIS; Câncer de Mama)], Câncer de Mama (Carcinoma Ductal Pré- invasivo; Carcinoma Ductal In Situ; DCIS) [Carcinoma Ductal Pré-invasivo (Carcinoma Ductal In Situ; DCIS; Câncer de Mama)]; Ceco, Câncer de Intestino (Adenocarcinoma do Ceco); Colo do Útero, Câncer Cervical (Carcinoma de Células Escamosas do Colo do Útero); Colorretal, Câncer de Cólon (Adenocarcinoma do Cólon), Câncer Retal (Adenocarcinoma de Reto) 1, Cabeça e Pescoço, Câncer de Amígdala (Linfoma de amígdala), Câncer de Laringe (Câncer de Laringe, Carcinoma de Células Escamosas de Laringe), Câncer de Faringe (Carcinoma de Células Escamosas da Faringe), Câncer de Língua (Carcinoma de Células Escamosas da Língua), Câncer de Garganta (Carcinoma de Células Escamosas da Amígdala), Câncer Oral (Carcinoma de Células Escamosas do Assoalho da Boca); Rim, Câncer de Rim (Carcinoma de Célula Renal; RCC); Fígado, Câncer de Fígado (Carcinoma Hepatocelular), Metástases para o Fígado; Pulmão, Câncer de Pulmão (Carcinoma de Células Grandes do Pulmão), Derrame Pleural, Câncer de Pulmão (Adenocarcinoma do Pulmão), Câncer de Pulmão de Células Pequenas (Carcinoma do Pulmão), Câncer de Pulmão de Células Não Pequenas (NSCLC), Mesotelioma Maligno do Pleura, Câncer de Pulmão (Carcinoma de Células Escamosas do Pulmão); Sistema Linfático; Linfoma de Hodgkin, Linfoma de Hodgkin; linfoma não Hodgkin, linfoma de Burkitt, Linfoma Cerebral, Linfoma Cutâneo de Células T, Linfoma Folicular, Linfoma Linfoblástico (Linfoma não Hodgkin), Linfoma MALT, Linfoma de Células Mantle, Linfoma de Células B Grandes do Mediastino (Tímico) Linfoma de Células B Grandes, Linfoma não Hodgkin, Linfoma de Células T Periférico, Linfoma Linfocítico Pequeno, Linfoma Difuso de Grandes Células B (DLBCL), Linfoma Anaplásico de Grandes Células (ALCL); Músculo, Câncer do Ducto Biliar (Colangiocarcinoma, Câncer Biliar), Leiomiossarcoma de Músculo, Rabdomiossarcoma de Músculo, Sarcomas de Tecidos Moles; Esôfago, Câncer Esofágico (Carcinoma de Células Escamosas do Esôfago), Câncer Esofágico (Adenocarcinoma do Esôfago); Ovário, Câncer do Ovário (Adenocarcinoma do Ovário); Pâncreas, Câncer do Pâncreas (Adenocarcinoma do Pâncreas), Tumor Neuroendócrino do Pâncreas (PNET); Pênis, Câncer do Pênis (Carcinoma de Células Escamosas do Pênis), Doença de Peyronie; Glândula Pituitária, Câncer da Glândula Pituitária (Carcinoma da Glândula Pituitária), Síndrome de Secreção Inadequada de Hormônio Antidiurético (SIADH) [Síndrome de Secreção Inadequada de Hormônio Antidiurético (SIADH)]; Próstata, Câncer da Próstata (Carcinoma Neuroendócrino da Próstata), Câncer da Próstata (Adenocarcinoma da Próstata); Pele, Câncer de Pele (Carcinoma Basocelular da Pele), Câncer de Pele (Carcinoma de Células Escamosas da Pele), Carcinoma de Células de Merkel (MCC), Câncer de Pele (Melanoma Maligno da Pele), Manchas (Lesões Pigmentadas Benignas, Lesões Melanocíticas

Benignas, Nevo Melanocítico, Nevo melanocítico); Intestino Delgado, Câncer do Intestino Delgado (Linfoma do Intestino Delgado), Câncer do Intestino Delgado (Adenocarcinoma do Intestino Delgado); Medula Espinhal, Glioma da Medula Espinhal, Meningioma da Medula Espinhal, Metástases da Medula Espinhal, Astrocitoma da Medula Espinhal (Tumor), Câncer da Medula Espinhal (Linfoma da Medula Espinhal); Estômago, Síndrome de Zollinger-Ellison (Gastrinoma), Linfoma do Estômago (Linfoma Gástrico), Câncer do Estômago (Adenocarcinoma do Estômago); Testículo, Câncer Testicular (Seminoma do Testículo), Câncer Testicular (Teratoma do Testículo); Tireoide, Câncer de Tireoide (Célula Folicular da Tireoide), Célula Medular da Tireoide, Célula Papilar da Tireoide, Câncer de Tireoide (Anaplásico da Tireoide); Útero, Doença Trofoblástica Gestacional (Gravidez Molar) [Gravidez Molar (Doença Trofoblástica Gestacional, GTD)], Câncer Uterino (Adenocarcinoma do Endométrio); Vulva, Câncer da Vulva (Carcinoma de Células Escamosas da Vulva); Outros cânceres, Tumor de Primário Desconhecido (TUP), Síndrome da Dor Crônica, Tumor Carcinoide e Síndrome Carcinoide, Tumor Neuroendócrino; Outras Doenças cancerosas, Anemia de Doença Crônica, Dor do Câncer, Síndrome da Falha da Cirurgia na Coluna (FBSS), HIV AIDS (Vírus da Imunodeficiência Humana e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida), Doença Renal - Insuficiência Renal Crônica, Desnutrição, Ototoxicidade, Púrpura Cutânea de Petéquias, Neoplasia Intraepitelial Prostática (PIN).

[0125] Exemplos do efeito de nanopartículas de nanoQuil F70 em células cancerosas são dados na seção de Exemplos abaixo.

[0126] As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril. Essa suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando aqueles agentes dispersantes ou molhantes e agentes de suspensão adequados, que foram mencionados acima. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, os óleos fixos estéreis são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para essa finalidade, qualquer óleo fixo suave pode ser empregado, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, ácidos graxos como ácido oleico têm utilidade na preparação de produtos injetáveis.

[0127] As soluções ou suspensões também podem compreender pelo menos um dos seguintes adjuvantes: diluentes estéreis, como água para injeção, solução salina, óleos fixos, polietilenoglicóis, glicerol, propilenoglicol ou outros solventes sintéticos, agentes antibacterianos, como álcool benzílico ou metil parabeno, antioxidantes, como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio, agentes quelantes, como ácido etilenodiaminotetra-acético, tampões, como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajuste da tonicidade, como cloreto de sódio ou dextrose. A preparação parenteral pode ser confinada em ampolas, seringas descartáveis ou vasos de dosagem múltipla feitos de vidro ou plástico.

[0128] Geralmente, as partículas NanoQuil F70 da invenção são administradas em uma quantidade farmaceuticamente eficaz. A quantidade das partículas realmente administradas será tipicamente determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto real administrado, a idade, peso e resposta do paciente individual, a gravidade dos sintomas do paciente e similares.

[0129] A nanopartícula de acordo com a invenção pode ser usada como um adjuvante em qualquer vacina contra quaisquer microrganismos. A mesma pode ser usada em qualquer animal, como pássaros, mamíferos, como seres humanos, animais domésticos, como gatos, cães, ovelha, cabra, porcos, gado e cavalos. De acordo com uma modalidade, a invenção é usada como adjuvante em uma vacina contra streptococci em animais e influenza em cavalos.

[0130] Exemplos do efeito de nanopartículas de nanoQuil F70 como um adjuvante de vacina são dados na seção de Exemplos abaixo.

[0131] As doses tanto para uso em seres humanos quanto para uso veterinário podem variar de acordo com outros compostos incluídos. Tendo em vista a duração do tratamento, a dose pode variar de < 50 µg a 1 mg ou mais por dia.

EXEMPLOS Exemplo 1 – produção de nanopartículas NanoQuil F70 brutas usando PBS ou Tampão de acetato como meio de reação Materiais

[0132]

• Colesterol vegetal. Lot. SCOL 129-2. Código de material: C1231, Sigma-Aldrich. • Estoque de Quil A de 100 mg/ml, Brenntag Biosector A/S. • Tampão de PBS pH 7,4, ou Tampão de acetato de 2- 10 mM pH 4,6. • Água destilada. • Solução salina (0,85 % de NaCl em água destilada). • Acetona, Ph. Eur. ≥ 99,5 %. • 50 ml de tubos de Cellstar • Bomba de ar. Eheim 200, tipo 3702010. • Termoagitador e termostatos de bloqueio com controle inteligente. MKR13 junto a Hettich Lab Technology, Países Baixos. • Centrífuga Sorvall ST16R, Thermo Scientific. • Cabine de fluxo LaminAir, Holten. Thermo Fisher Scientific. • Filtração a vácuo, 1000 ml, SFCA, 0,22 µM esterilizado, artigo europeu VWR n° 514-1058. • Pipetas e pontas (esterilizadas). Procedimento

[0133]

1. Pesar 3,125 mg/tubo x 5 tubos = 15,625 mg de colesterol derivado de planta.

2. Adicionar 5 ml de acetona ao colesterol, dissolver bem usando Vortex

3. Dispensar a solução de colesterol em 1 ml/tubo.

4. Evaporar a acetona através do bombeamento de ar no tubo enquanto gira o tubo a fim de depositar o colesterol uniformemente no fundo em V do tubo de teste.

5. Adicionar 70 °C de meio de reação aquosa quente (50 ml por tubo): água destilada, Solução salina (0,85 % de NaCl), Tampão de acetato (pH 4,6) ou tampão de PBS (pH 7,4).

6. Adicionar 500 µl/tubo de 100 mg/ml de Estoque de Quil A para gerar 1 mg/ml de solução de Quil A.

7. Incubar a 70 °C por 60 min em MKR13 (consulte Materiais).

8. Resfriar até 4 °C diretamente.

9. Armazenar a 4 °C durante a noite.

10. Centrifugar a 4696 x G por 45 min.

11. Filtração do sobrenadante agrupado através de uma carga de 0,22 µM. Exemplo 2 – teste de reprodutibilidade

[0134] A fim de avaliar a reprodutibilidade do procedimento indicado no Exemplo 1 doravante no presente documento, as nanopartículas NanoQuil F70 foram produzidas três vezes em três dias sucessivos em 18, 19 e 20 de julho de 2018. Essas três bateladas (Teste 1, 2 e 3) de NanoQuil F70 foram formuladas em tubos Falcon de 5-50 ml por batelada (250 ml) e incubadas por 1 hora a 70 °C como implicado pelo nome NanoQuil F70 (formulação a 70 °C). Como um exemplo não limitativo, o protocolo de formulação pode ser simplificado da seguinte forma: • Pesar 15,625 mg de colesterol vegetal. • Adicionar 5 ml de acetona ao colesterol, dissolver bem. • Dispensar 1 ml/tubo de solução de colesterol em tubos Falcon de 5-50 ml. • Evaporar acetona através do bombeamento de ar no tubo enquanto gira o tubo a fim de depositar o colesterol uniformemente no fundo em V de cada tubo. • Adicionar PBS a 70 °C, 50 ml/tubo. • Adicionar 500 µl/tubo de 100 mg/ml de estoque de Quil A para gerar 1 mg/ml de solução de Quil A. • Incubar a 70 °C por 60 min. • Resfriar até 4 °C diretamente. • Armazenar a 4 °C durante a noite. • Centrifugar a 4696xg por 45 min. • Filtração do sobrenadante agrupado através de 0,22 µM de carga. • Armazenar a 4 °C Resultados e discussões

[0135]

1. Recuperação de Quil A nos produtos Teor de Quil A das nanopartículas NanoQuil F70 produzidas foi medido usando o teste Orcinol (também conhecido como teste de Bial). Os resultados são mostrados graficamente na Figura 12. Para as três bateladas de teste, as taxas de recuperação de Quil A eram altas, 91,5 %, 93,8 % e 98,3 % respectivamente, isto é, todas acima de 90 %.

2. Tamanho de partícula Os tamanhos de partícula médios das três formulações eram 46,32±1,48 nm, 40,07±0,98 nm e 42,20±0,74 nm, respectivamente, medidos por análise de Espalhamento

Dinâmico de Luz (DLS), consulte a figura 5. A Figura 13 mostra um sumário gráfico das medições de DLS.

3. Redução de efeito de hemólise As taxas de redução de hemólise para as três bateladas são preferencialmente similares: 31 % para Teste 1, 29 % para Teste 2 e 31 % para Teste 3 (consulte o gráfico de barras na Figura 14). Isso pode ser visto como níveis similares de redução de efeitos colaterais pela formulação de Quil A em F70 que foram alcançados, isto é, alto grau de reprodutibilidade na redução de efeitos colaterais. Observa-se, no entanto, que todas as bateladas de teste induzem hemólise a um grau que é inaceitavelmente alto para um adjuvante de vacina.

4. Nanopartículas NanoQuil F70 produzidas em outros meios de reação As nanopartículas NanoQuil F70 foram produzidas usando 4 solventes diferentes: água destilada (D.W.), Solução salina (0,85 % de NaCl em D.W.), Tampão de acetato (pH 4,6) e PBS (pH 7,4) de acordo com o protocolo de NanoQuil F70. Diferenças no tamanho de partícula (diâmetro hidrodinâmico) foram observadas por DLS nessas formulações: NanoQuil F70 formulada em PBS gera o maior tamanho (cerca de 42 nm), seguido de NanoQuil F70 formulada em Solução salina (cerca de 35 nm). As partículas NanoQuil F70 formuladas em Tampão de acetato (pH 4,6) e água destilada geraram tamanhos de partícula de cerca de 25 e 24 nm respectivamente (consulte o gráfico de barras na Figura 15). Exemplo 3 - Separação de tamanho de partículas NanoQuil F70 brutas com cromatografia de Sephacryl S300-HR

[0136] A fim de remover saponinas livres (não incorporadas) suscetíveis a aumentar a lise celular das partículas NanoQuil F70, o produto de NanoQuil F70 bruto é purificado por Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC).

[0137] Um volume de 13 ml de Sephacryl S300-HR (GE Healthcare Life Sciences) foi colocado em um cartucho PD-10 e equilibrado com tampão de PBS ou tampão de acetato. Um volume de 1 ml de partículas NanoQuil F70 brutas como produzido de acordo com o Exemplo 1 doravante no presente documento, foi carregado no topo da coluna e permitiu-se percolar por gravidade através do material de Sephacryl. As frações de 1 ml foram coletadas para serem analisadas para saponinas e teores de colesterol usando RP-HPLC, bem como para serem testadas para atividade hemolítica. RP-HPLC de frações de SEC de nanoQuil F70

[0138] HPLC foi usado como um meio para detectar e quantificar saponinas e colesterol nas frações de S300-HR. Os teores totais de saponina e colesterol são expressos como sinais integrais do Detector de Aerossol Carregado por HPLC (CAD) e representados graficamente como uma função do volume de eluição S300-HR. Como com o método de detecção de fluorescência do vermelho do Nilo (consulte abaixo), o cromatograma de S300-HR mostra dois picos de saponinas centrados em 6-7 ml e 9-10 ml, e o colesterol está principalmente associado ao pico em 6-7 ml, como esperado com partículas NanoQuil. Método:

[0139] 100 µl de cada fração S300HR a partir do fracionamento de SEC de NanoQuil F70 foram analisados em coluna de Kromasil C4 usando cromatograma curto. O gráfico de barras na Figura 16 mostra o sinal de CAD integrado para frações de S300HR correspondentes à soma dos picos de saponinas e do pico de colesterol. Análise de Fluorescência de Vermelho do Nilo

[0140] A análise das frações de S300-HR SEC (45 µl da fração + 5 µl de NileRed aproximadamente 10 µM para Leituras de fluorescência) com o fluoróforo do Vermelho do Nilo mostra a distribuição de saponinas, consulte o gráfico de barras na Figura 17. A fluorescência do vermelho do Nilo (NR) é extinta por moléculas polares, como a água e, portanto, mostra apenas fluorescência fraca em ambiente aquoso. No entanto, quando o vermelho do Nilo interage com moléculas apolares, como o núcleo triterpenoide das saponinas, ou é incorporado às estruturas micelares, sua fluorescência é aumentada em ordens de magnitude. Vermelho do Nilo é usado como traçador para monitorar a presença de saponinas QuilA livres ou partículas de NanoQuil nas frações de S300-HR.

[0141] O cromatograma de S300-HR mostra dois picos centrados na fração de 6 ml, correspondendo às partículas de NanoQuil (confirmadas com TEM), e em 9 ml, correspondendo às micelas de QuilA.

[0142] Os espectros de fluorescência de NR para as frações de 6 e 7 ml (não mostradas) exibiram o desvio típico para o azul para nanoQuil (que indica interação com o colesterol) com emissão máxima em 570 nm, enquanto as frações de 9 e 10 ml exibiram o espectro típico para micelas de QuilA com uma emissão máxima a 620 nm. Ensaio hemolítico das frações de SEC de NanoQuil F70

[0143] Um volume de 120 µl de cada fração do fracionamento de SEC de NanoQuil F70 é adicionado a 480 µl de sangue de ovelha fresco diluído tratado com anticoagulante. O fator de diluição de frações de SEC de NanoQuil F70 é 5 vezes, enquanto o sangue de ovelha é diluído 12,5 vezes em tampão de PBS com 2 mM de EDTA. Após a incubação por 45 min a 37 oC, as células são sedimentadas por centrifugação e a quantidade de hemoglobina liberada no sobrenadante é medida por Absorbância a 415 e 540 nm. A atividade hemolítica é expressa como uma função do Valor de absorbância em 540 nm e contra uma faixa de calibração com saponina de QuilA de 0,4 mg/ml a 1,0 mg/ml. Os resultados são mostrados na Figura 18.

[0144] As frações de S300-HR mais hemolíticas, isto é, 9 ml e 10 ml, são aquelas contendo QuilA livre. As frações de 6 ml e 7 ml contendo nanoQuil F70 não mostram efeito hemolítico nas condições do ensaio.

[0145] Isso também pode ser expresso em “equivalentes de QuilA”, consulte o gráfico de barras na Figura 19.

[0146] O produto de nanoQuil F70, por outro lado, não mostra o efeito hemolítico de 1 mg/ml de equivalente de QuilA e mais. Os resultados são mostrados na Figura 20. Resultados

[0147] Um cromatograma de RP-HPLC típico usado para a análise quantitativa das nanopartículas NanoQuil F70 é mostrado na figura 6. Para uma quantidade fixa de saponina de QuilA a 1 mg/ml, o aumento do colesterol de 0,1 mg/ml a 0,8 mg/ml produziu uma resposta linear ao longo dessa faixa de concentração, que poderia ser usado para calibração e estimativas de teores de colesterol em frações desconhecidas (Frações de SEC de NanoQuil F70).

[0148] A fração que elui em 6 ml do cartucho de

Sephacryl S300-HR de 13 ml e que contém NanoQuil F70 purificada foi analisada por HPLC. A integração do sinal entre 20 ml e 32 ml (indicada por uma barra cinza horizontal na figura 6) foi usada para quantificar as saponinas na fração. A integração do sinal em 39 ml foi usada para quantificar o colesterol.

[0149] Após o fracionamento de SEC de NanoQuil F70 e análise quantitativa por RP-HPLC, a Figura 7 mostra claramente que as partículas NanoQuil F70 são eluídas primeiro, em frações de 5 ml a 8 ml em que tanto saponina de QuilA quanto colesterol são encontrados, enquanto que a saponina de QuilA residual sem colesterol é eluída em frações posteriores de 9 ml a 12 ml. Esse resultado é consistente com a forma como o fracionamento de SEC deve funcionar, em que quanto maiores as partículas, menos permeiam na malha polimérica das microesferas de Sephacryl; portanto, quanto mais cedo eluem da coluna. As partículas Nanoquil F70 têm um diâmetro hidrodinâmico de 20-50 nm (dependendo do meio de reação) enquanto as micelas de saponina de QuilA têm um diâmetro de cerca de 5 nm. A separação de partículas NanoQuil e micelas de saponina de QuilA também é consistente com a faixa de fracionamento para Sephacryl S300-HR. Um experimento de controle em que apenas a saponina de QuilA foi carregada na coluna de SEC mostrou que a saponina de QuilA elui em frações de 8-11 ml sob as mesmas condições. Isso confirma que a saponina de QuilA encontrada nas frações de 5-8 ml, quando NanoQuil F70 é injetada (Figura 7), está, de fato, associada ao colesterol. As figurações de TEM do material nas frações de 5-8 ml confirmaram a identidade de partículas NanoQuil F70.

O fracionamento de SEC também mostra que a quantidade de micelas de saponina de QuilA livre (sem colesterol detectável), nessa batelada, representa cerca de 50 % da quantidade total de saponina de QuilA no produto de NanoQuil F70 bruto. Por fim, a razão inicial de colesterol/saponina de QuilA medida no produto de NanoQuil F70 bruto era 3 %, enquanto verificou-se ser 13 % nas frações de SEC combinadas de 5 ml a 8 ml.

[0150] Um volume de 1 ml de NanoQuil F70 em 4,2 mg/ml de QuilA foi carregado na coluna de Sephacryl S300-HR e frações de 1 ml foram coletadas para análises quantitativas de HPLC. As frações de SEC que contêm quantidades detectáveis de QuilA, de 4 ml a 13 ml, são mostradas. NanoQuil F70 e QuilA são mostradas como referências.

[0151] A atividade hemolítica de cada fração de SEC foi medida e comparada com uma referência de saponina de QuilA a 1 mg/ml, bem como o produto bruto de NanoQuil F70 a 1 mg/ml de QuilA. A atividade hemolítica das diferentes amostras é apresentada como um Valor de Absorbância a 540 nm que está diretamente correlacionado à quantidade de hemoglobina liberada no meio extracelular. A Figura 8 mostra claramente que a atividade hemolítica foi observada apenas para as frações de SEC 9-11 ml, onde as micelas de QuilA livres são essencialmente encontradas. Nenhuma atividade hemolítica foi registrada nas frações de 5-8 ml, onde a NanoQuil purificada foi eluída (consulte a Figura 7 para referência). Isso confirma a identidade do material eluído nas frações de SEC, visto que é conhecido que micelas de saponina de QuilA livre têm uma atividade hemolítica marcada, como exemplificado pela referência de

QuilA a 1 mg/ml na Figura 8. Os resultados também mostram que NanoQuil F70 purificada na fração de 6 ml, contendo cerca de 12 % de colesterol/QuilA (p/p), não apresenta atividade hemolítica significativa (Figura 8), provando, portanto, que a incorporação direta de colesterol em micelas de saponina de QuilA, usando o protocolo de acordo com a presente revelação, e que leva a NanoQuil F70, também leva a uma forte inibição do efeito hemolítico de saponinas de QuilA. Conclusão

[0152] A cromatografia de exclusão por tamanho usando esferas de Sephacryl S300-HR foi comprovada com sucesso na separação de partículas NanoQuil F70 das micelas de saponina de QuilA livres residuais. A análise quantitativa das frações de SEC por RP-HPLC e detecção de absorção de UV permitiu a determinação das razões entre colesterol/saponina de QuilA e para confirmar a identidade do material em cada fração (NanoQuil F70 ou saponina de QuilA livre). As frações contendo saponina de QuilA livre mostraram um efeito hemolítico acentuado, enquanto aquelas contendo NanoQuil F70 purificada não mostraram nenhum efeito hemolítico. Por último, foi demonstrado que mesmo a amostra de NanoQuil F70 bruta contendo cerca de 50 % de saponina de QuilA como micelas de saponina residual livre apresentou apenas uma atividade hemolítica limitada, em comparação com QuilA livre em quantidades similares. Isso confirma a validade da formulação da saponina de QuilA com colesterol, diretamente, usando o protocolo na presente invenção, a fim de reduzir significativamente a atividade lítica da membrana celular inerente das saponinas de QuilA.

Exemplo 4 - Efeito Adjuvante de NanoQuil F70

[0153] O objetivo do estudo consistiu em comparar o efeito de adjuvante de vacina das partículas Nanoquil F-70 com as partículas G3 descritas nos documentos WO2013051994 e WO2014163558. Resumos do estudo:

[0154] ▪ Antígeno: Antígeno x, 10 ug/imunização ▪ Adjuvantes: G3-VAX (Adjuvaq-V100, n° 150609) ou Nanoquil (n° 70, 180326), 5 ug/imunização ▪ Animais: camundongos BALB/c fêmeas, 8/grupo ▪ Imunizações: Um total de 3 imunizações s.c., uma vez a cada 4ª semana ▪ Amostras: Soro coletado 2 semanas após a última imunização ▪ Análise: ELISA (IgG de Cabra-Anti- Camundongo/soro/antígeno de TWIN/ST-HRP/TM) Resultados são mostrados graficamente na figura 11. Conclusão

[0155] ▪ Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre G3-VAX e Nanoquil ▪ No entanto, Nanoquil F-70 parece gerar respostas ab um pouco mais potentes e uma variação maior que G3 Exemplo 5 - Efeito apoptótico de NanoQuil F70 em células cancerosas U937-1 Objetivo do experimento

[0156] O objetivo desse experimento consiste em explorar o efeito apoptótico de NanoQuil F70 sobre a linhagem de célula cancerosa U937-1. As células U937 são uma linhagem de células modelo originalmente isoladas do linfoma histiocítico de um paciente macho e são caracterizadas como uma linhagem de célula de leucemia mieloide humana (AML).

EQUIPAMENTO

[0157] • Capela de fluxo laminar estéril, Biowizard Golden Line Ergosilence, Kojair • Vortex, IKA MS3 básico • Incubador, Incubadores de Ciclo de CO2 de Forma Steri, TermoFisher Scientific • Refrigerador • Centrífuga; Allergra X-22R, Beckman Coulter • Microscópio • Câmara de Bürker • Espectrofotômetro (Labsystems Multiskan RC, tipo 351)

MATERIAL

[0158] • Partículas NanoQuil F70 como obtido pelos métodos descritos doravante no presente documento • células U937-1 foram gentilmente fornecidas pelo Prof. Kenneth Nilsson (Rudbeck laboratory, Uppsala University, Uppsala, Suécia) • RPMI 1640 (código de produto: 992605; batelada 16- 8082; SVA, Uppsala) contendo soro bovino fetal (Sigma Aldrich) em uma concentração final de 10 %, PeSt (60 µg/ml de Penicilina; 50 µg/ml de Estreptomicina (nº de cat. 992450, SVA, Uppsala) e 2 mM de L-Glutamina (nº de cat. 992005, SVA,

Uppsala) • Placas de cultura de célula, 96 poços. Código de produto: 83.3924.500, Lote: 4025001, SARSTEDT • Solução salina de tampão de fosfato (PBS) pH 5,9- 6,0 do departamento de substrato, Uppsala University Hospital. • reagente de viabilidade celular 10X de AlamarBlue®, solução pronta para uso • H2O Destilada • Frasco de cultura celular, frascos de cultura celular Corning®, área de superfície de 75 cm2, nº de cat.: CLS430641-100EA, Sigma Aldrich • FINNTIP de 300 µl (VWR, 613-2614) • Pontas de pipeta de 1000 µl de FINNTIP, nº de Cat.: 613-4485, VWR • placa de fundo em V de 96 poços (Nunc, Dinamarca) • Azul de Tripano, n° de Cat.: T8154, nº de batelada RNBD3142, Sigma • Reservatórios de reagente de 100 ml, nº de Cat.: 89094-656, Lote: 96817, VWR

INSTRUÇÕES DE SEGURANÇA

[0159] Saponina pode causar irritação respiratória e aos olhos e inflamação do contato com a pele em algumas pessoas. • Use luvas para evitar o contato com a pele com saponina etc. • Trabalhe com capuz para evitar a inalação de clorofórmio Definição experimental

[0160] Preparar a diluição em série de partículas NanoQuil F70 em concentrações de 1000 µg/ml até 0,32 µg/ml (1:5 diluições) em PBS pH 7,4. A concentração final em células será de 100 µg/ml a 0,032 µg/ml em células. Use PBS para controle de células brancas.

MÉTODOS Teste de viabilidade

[0161] • Verter as células U937-1 em meio de cultura em um tubo falcon • Girar para baixo as células a 200 g por 5-10 minutos • Verter para fora o meio de cultura de células • Ressuspender as células em novo meio pré-aquecido • Contar as células e determinar a viabilidade por coloração com azul de tripano (viabilidade deve ser ≥90 %) • Ajustar a concentração celular para 0,11x106 células/ml • Semear as células em placas de microtitulação de 96 poços em uma densidade de célula de ≈20 000 células/poço (180 µl) • Adicionar formulações de NanoQuil F70 aos poços (20 µl) (usar PBS em células não tratadas de controle) • Colocar a placa a 37 oC em atmosfera umidificada contendo CO2 a 5 % durante o tempo de incubação • Após 66 hora, adicionar 20 µl de azul de Alamar e medir o sinal de fluorescência (ou absorbância) a cada hora por 6 horas (no total de 72 horas) a 570 e 620 nm por espectrofotometria. Resultados

[0162] A fração de QS-21 de saponina de quillaja formulada em nanopartículas foi anteriormente mostrada para induzir apoptose em várias linhagens de célula cancerosa, como descrito nos documentos WO2013051994 e WO2014163558. O efeito apoptótico de partículas NanoQuil F70 testado no presente documento na linhagem de célula monocítica U937-1 medido por ensaio de azul de Alamar mostra um EC50 entre 0,15 e 0,25 mg/ml após 3 dias de incubação.

Claims (15)

REIVINDICAÇÕES

1. Nanopartículas caracterizadas por compreenderem colesterol e uma saponina triterpenoide, como um componente de Quillaja saponaria Molina, como Quil A® ou componentes isolados dos mesmos selecionados a partir de frações QS-7, QS-8, QS-17, QS-18 e QS-21, em que a razão entre saponina de quillaja e colesterol é de 10:1 a 20:1 e em que as ditas nanopartículas são similares a fio (filamentosas).

2. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas pelo fato de que as ditas nanopartículas similares a fio têm um diâmetro ou espessura de filamento entre 4 – 8 nm.

3. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizadas por compreenderem duas formas: • Forma A, composta de nanopartículas fechadas substancialmente circulares com um raio entre 10- 15 nm, e • Forma B, composta de nanopartículas similares a minhoca com extremidade aberta com um comprimento de 35-45 nm.

4. Nanopartículas, de acordo com a reivindicação 3, caracterizadas pelo fato de que a razão entre Forma A e Forma B na dita mistura é entre 20:80 a 45:55, como de 30:70 a 40:60, como cerca de 35:65.

5. Nanopartículas, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizadas pelo fato de que a razão entre saponina de quillaja e colesterol é de 12:1 a 18:1, como 14:1 a 17:1, preferencialmente 16:1.

6. Nanopartículas, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizadas por compreenderem adicionalmente pelo menos uma molécula anfipática ou hidrofóbica selecionada a partir de um antígeno, um adjuvante, uma molécula de direcionamento, um composto de produto farmacêutico e um composto relacionado ao alimento.

7. Composição farmacêutica caracterizada por compreender uma ou mais nanopartículas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1-6, que compreendem ainda opcionalmente tampões farmaceuticamente aceitáveis, diluentes, excipientes, adjuvantes e/ou carreadores.

8. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender ainda pelo menos um composto farmaceuticamente ativo, como fármacos anticâncer, compostos de coordenação de platina, compostos de taxano, compostos de camptotecina, alcaloides antitumorais de vinca, derivados de nucleosídeo antitumorais, agentes alquilantes de nitrosoureia ou mostarda nitrogenada, derivados de antraciclina antitumorais, trastzumabe e derivados de podofilotoxina antitumoral, antimetabólitos, esteroides, inibidor de alvo mamífero de rapamicina (mTOR), agentes para tratar câncer, como agentes selecionados a partir do grupo que consiste em Citarabina, Daunorubicina, Paclitaxel, Docetaxel, Cabazitaxel, Toricsel e Trabectidina, cujo composto ativo pode ser integrado na nanopartícula ou misturado com a composição.

9. Nanopartícula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 e 8, caracterizadas por serem opcionalmente formuladas como uma composição farmacêutica que compreende adicionalmente tampões farmaceuticamente aceitáveis, excipientes de diluentes, adjuvantes e/ou carreadores para uso no tratamento de câncer, como leucemia.

10. Método para produzir nanopartículas conforme definidas em qualquer uma das reivindicações 1-6 caracterizado por compreender as etapas: a. Preparar uma camada de colesterol na superfície interna de um vaso de reação e/ou na superfície de um artigo poroso insolúvel em água localizado no dito vaso de reação, removendo-se o solvente de uma solução não aquosa de colesterol em um solvente orgânico selecionado a partir de um ou mais C1-C6 álcoois, C2-C6 cetonas, C1-C6 alquil ésteres de C1-C3 ácidos carboxílicos, e C4-C8 éteres lineares ou cíclicos, b. Adicionar um meio de reação aquosa, que pode ser uma solução de um ou mais sais, uma solução de tampão ou água destilada sem sal, preferencialmente pré-aquecido a 70 oC ± 5 oC, c. Adicionar uma solução de saponinas triterpenoides, como um componente de Quillaja saponaria Molina, como Quil A® ou componentes isolados dos mesmos selecionados a partir de frações QS-7, QS-8, QS-17, QS-18 e QS-21, a uma concentração final de 1 mg/ml to 10 mg/ml para produzir uma razão final de 10:1 a 20:1, preferencialmente 16:1 (p/p) de saponina: Colesterol, d. Aquecer a mistura de reação a 70 oC ±5 oC por cerca de uma hora, e. Resfriar a mistura de reação a 4 oC ±2 oC durante a noite, isolar as partículas formadas e remover saponina em excesso, por exemplo, por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC).

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é etanol e/ou acetona.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico é removido por evaporação.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 - 12, caracterizado pelo fato de que o meio de reação aquosa é um tampão de acetato.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 - 12, caracterizado pelo fato de que o meio de reação aquosa é tampão de PBS.

15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 - 14, caracterizado pelo fato de que a remoção de saponina em excesso é realizada por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) em um meio de filtração em gel adequado, como, por exemplo, Sephacryl S300-HR.