CN113365657A

CN113365657A - 具有疫苗佐剂效应的丝状纳米颗粒

Info

Publication number: CN113365657A
Application number: CN201980083532.7A
Authority: CN
Inventors: 胡克非; L·杜鲁克斯; E·林德布拉德
Original assignee: Croda International PLC
Current assignee: Croda International PLC
Priority date: 2018-12-18
Filing date: 2019-12-16
Publication date: 2021-09-07
Also published as: KR20210105389A; TW202038905A; EP3897713A1; ZA202103649B; BR112021011609A2; WO2020127115A1; AU2019409474A1; EP3669890A1; JP2022514276A; CA3123475A1; US20230321227A1; AR117712A1

Abstract

本发明涉及丝状(即线状)纳米颗粒，其包含固醇和衍生自莫利纳皂树的选自皂树酸和皂树皂苷的组分。更具体的，本发明涉及所述线状纳米颗粒在疫苗和药物递送或吸附系统中的用途、其生产方法及其用途例如用作疫苗佐剂和用于癌症疗法中的用途。

Description

具有疫苗佐剂效应的丝状纳米颗粒

技术领域

本发明涉及丝状或线状纳米颗粒，其包含固醇和三萜皂苷(例如衍生自莫利纳皂树(Quillaja saponaria Molina)的选自皂树(quillaja)皂苷的组分)。更具体的，本发明涉及该丝状纳米颗粒在疫苗、癌症疗法和药物递送中的用途、其生产方法及其用途(例如作为疫苗佐剂用于人类和兽医用途)。

发明背景

疫苗需要最佳佐剂包括免疫增强剂和递送系统以在动物和人类中提供长期保护免受传染性疾病折磨。油乳液、脂多糖、聚合物、皂苷、脂质体、细胞因子、免疫刺激复合物(ISCOM)、弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、明矾、细菌毒素等是正在研究中或已经在许可的疫苗中实施的常见佐剂。皂苷基佐剂具有刺激细胞介导的免疫系统以及增强抗体产生的能力并且具有佐剂活性仅需要低剂量的优势。

ISCOM基质是还包含磷脂的系统中由于皂树皂苷与胆固醇之间的相互作用所产生的一系列结构上确定的球形、空心、笼状的自组装纳米颗粒(40至60nm，如利用动态光散射(DLS)所观察到的)。它们展现具有测量的约-30mV的ζ-电位的负静电荷。ISCOM基质与抗原的组合被称为ISCOM。据信皂树皂苷(和可能地具有三萜核心的所有皂苷)对胆固醇具有高亲和力，这诱导ISCOM基质的结构化和稳定化。

由于ISCOM在就尺寸和形状方面模拟病毒颗粒，因此已广泛探索ISCOM的抗原递送(Barr，1998)。ISCOM高免疫反应主要与展现强免疫刺激活性的QS(皂树)皂苷(特别是酰化组分(例如QS-21))的存在有关(Boyaka等人，2001)。这与ISCOM的特定性质组合提供总体佐剂效应，并且据报道可诱导体液和细胞免疫反应(Sun等人，2009)。

制造ISCOM所面临的最大挑战与胆固醇在水相中的“溶解”有关，因为该分子基本上不溶于水。形成ISCOM的基本思想是将胆固醇以混合胶束或被整合至由助洗剂(co-detergent)或磷脂形成的囊泡中的形式提供至主体溶剂。皂树皂苷的胶束溶液的添加导致胆固醇分子重新分布至皂苷胶束中，和该分子重新组织成特征性ISCOM颗粒。然而，该过程实际上产生在群体均匀性和颗粒数量方面的可变的结果。因此，需要多个下游纯化步骤以通过离心、超过滤、切向流或透析来消除聚集或残留的胆固醇和磷脂(例如磷脂酰胆碱)。此类技术必然在生产过程期间造成材料损失。对ISCOM的大规模生产更不利的是使用药物级磷脂(和有时是助洗剂)，这进一步增加制造成本。昂贵的半合成胆固醇(来自非动物来源)的损失还导致生产成本飙升。总之，产率和损失的这些变化成为大规模生产可负担得起的皂苷基佐剂纳米颗粒的严重阻碍。

Morein等人通过发现一种导致所谓的“G3”皂苷基纳米颗粒的新型的无磷脂制备方法解决了与ISCOM生产相关的一些配制问题，此描述于例如国际专利申请WO2013051994和WO2014163558中。然而，不幸的是，由于所获得的产物显示异质并且可变的颗粒尺寸分布，因此该制备方法还被证明难以以商业规模实施，并且本发明的发明人现已证实实际上产生具有不同于该两个专利申请中描述的形态的颗粒。

本发明人已尝试扩大描述于WO2013051994和WO2014163558中的程序的规模进行深入研究，但意识到描述于该专利申请中并且在电子显微照片上以约20nm圆形斑点出现的“G3”纳米颗粒不能通过遵循该申请中的指示再现。当不仅通过如在该两个专利申请案中所利用的透射电子显微镜(TEM)，而且通过动态光散射(DLS)和原子力显微镜(AFM)分析所获得的产物时，首先实现这一点。问题的简单之处在于所要求保护的20nm颗粒仅通过TEM分析可见，而用DLS或AFM则不可见。

分析技术在其方法方面和在其分析前样品制备方面显著不同。在TEM中，将几微升的胶体溶液(在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)沉积至金属网格上并且在真空下干燥，然后用造影剂喷溅并且用电子束观察。高电子密度(高分子密度)的区域被视为在2D平面中的投影。在AFM中，将几微升的样品沉积至原子平坦基板(新切下的云母片)上，干燥并且用仅几纳米厚的共振AFM尖端进行扫描。所生成的影像给出基板的表面的拓扑结构和表面上的颗粒以3D出现的位置。具体地，可测量颗粒的厚度。在DLS中，样品按原样(即，不干燥)进行分析，溶解于磷酸盐缓冲液中，并且给出颗粒尺寸分布的统计描述。在AFM成像中，“G3”颗粒以不同尺寸和形状的异质群体出现，有时是球形，有时是沿一个轴伸长(蠕虫状)，其中尺寸长达几百纳米长，并且仅4nm至10nm厚，始终不是具有20nm至30nm的规则直径的均匀球形。在DLS中，平均尺寸分布始终在50nm至60nm的范围内，而不是如WO2013051994和WO2014163558中所要求保护的20nm。因此，本发明人推测在WO2013051994和WO2014163558中在TEM中观察到的约20nm的“G3”颗粒是否可归因于样品制剂中的人为现象。通过TEM分析不包含胆固醇或皂苷但仅含磷酸盐缓冲液的样品证实了这一点，该样品产生的TEM影像实际上与公开于WO2013051994中的“G3”颗粒的图1A相同，参见图1。这证明如该两个专利申请中描述的具有约20nm的直径的“G3”纳米颗粒(参见例如WO2013051994的图1A)实际上是在样品蒸发时从缓冲系统沉淀，或通过与金属基板网格相互作用而形成(磷酸盐离子对金属表面具有亲和力)的磷酸盐晶体或聚集物。对单独的相同缓冲系统或沉积于碳基板网格而非金属网格上的缓冲系统中皂苷-胆固醇颗粒(真正的“G3”颗粒)的对照观察从未得出专利申请中所报告的直径是约20nm的盘状结构，证明其人造本质。通过DLS，未看到此类颗粒，因为磷酸盐在分析条件下溶解。

本发明的发明人决定更紧密地研究描述于WO2013051994和WO2014163558中的“G3颗粒”的性质和/或形态，因为该制剂已经毕竟例如在不同接种实验中证实了生物学效应。为此目的，进行如WO2013051994中所公开的原始程序5次并且通过DLS分析所得的颗粒。结果是原始程序提供对于个体实验具有异质颗粒尺寸分布的颗粒(参见图2)和进一步在实验之间的很大可变性。结论是这种缺乏均质性对于商业佐剂是不可接受的。

因此，仍需要开发可用作药物的载剂/递送颗粒和用作疫苗佐剂的皂苷基纳米颗粒的可靠并且可扩展规模的程序。

发明概述

本发明的发明人现已发现，通过改变一些关键反应参数；特别是通过在高温下孵育颗粒并且在初始制剂中调整皂苷与胆固醇之间的比率，可显著改变通过如WO2013051994中所公开的原始制造程序获得的颗粒的形态和尺寸分布。与描述于图2(其显示不同表观尺寸的两种或更多种类型的颗粒)的DLS图中的颗粒对比，根据本发明方法生产的颗粒在通过DLS测量时具有均匀尺寸(单分散，参见图4)。

因此，在本发明的第一方面中，因此提供包含胆固醇和三萜皂苷的纳米颗粒，例如来自莫利纳皂树的组分，例如

或自其分离的组分，例如级分QS-7、QS-8、QS-17、QS-18和QS-21，或来自巴西皂树(Quillaja brasiliensis)的组分，例如级分QB-90，其特征在于所述纳米颗粒是线状(丝状)。此后，这些纳米颗粒在本申请全文中称为“NanoQuilF70”颗粒。

在第二方面中，本发明提供一种用于生产第一方面的NanoQuil F70纳米颗粒的方法，该方法包括以下步骤：

a)通过从胆固醇在选自一种或多种C₁-C₆醇、C₂-C₆酮、C₁-C₃羧酸的C₁-C₆烷基酯和线性或环状C₄-C₈醚的有机溶剂中的非水溶液移除溶剂，在反应容器的内表面和/或在位于所述反应容器中的水不溶性、多孔制品的表面上制备胆固醇层，

b)添加水性反应介质，该介质可以是一种或多种盐的溶液、缓冲溶液或无盐蒸馏水，优选预热至70℃±5℃，

c)添加三萜皂苷(例如皂树皂苷)的溶液至1mg/ml至10mg/mL的最终浓度，以产生最终比率为10:1至20:1、优选16:1(w/w)的皂苷:胆固醇，

d)在70℃±5℃加热反应混合物约一小时，

e)使该反应混合物冷却至4℃±2℃过夜，分离所形成的颗粒并且例如通过尺寸排阻色谱(SEC)移除过量的皂苷。

通过根据本发明第二方面的方法制备的“NanoQuil F70”纳米颗粒实质上不同于包括描述于WO2013051994和WO2014163558中的现有技术的所谓的“G3”纳米颗粒，尤其是当通过DLS分析测量时其的形态(线状(丝状)形状相对于圆形/球形)和颗粒分散(均匀相对于不均匀)的独特组合上不同。

将如WO2013051994中所公开的程序的方法步骤与本发明的方法步骤进行比较，明显的是，限定第二方面的NanoQuil F70纳米颗粒的结构特性是由于相对于描述于WO2013051994和WO2014163558中的程序对制造程序的修改。

根据本发明的纳米颗粒可作为一种或几种化合物的递送系统例如用于药物，包括用于治疗癌症和营养相关化合物的药物，其中该另外物质提供另外的功能和互补作用方式。

在第三方面中，NanoQuil F70纳米颗粒和包含其的组合物可按原样用作例如药物，任选地用于进一步包含药学上可接受的缓冲剂、稀释剂、赋形剂、添加剂、佐剂和/或载剂的药物组合物。

可选自抗原、佐剂、靶向分子、药学化合物和营养物的两亲性和疏水性分子可被整合至根据本发明的纳米颗粒中，或与其混合成组合物。或者，将不同化合物掺入至分开的纳米颗粒中。

该药物组合物可用作佐剂，例如，与疫苗组合使用，与季节性流感病毒疫苗组合使用，与大流行性流感疫苗组合使用或与紧急疫苗(例如针对生物武器的疫苗)组合使用。

因此，如上文所述，本发明还涉及包含根据本发明的NanoQuil F70颗粒(特别是作为佐剂)的药物疫苗制剂。

本发明还涉及一种用于治疗或预防由生物体引起或恶化的疾病的方法，该方法包括对有此需要的人施用根据本发明的药物疫苗制剂。

此外，本发明涉及一种用于治疗癌症(包括实体瘤)的方法，该方法包括对有此需要的患者施用药物有效量的根据本发明的NanoQuil F70纳米颗粒或包含其的组合物。

此外，本发明还涉及NanoQuil F70纳米颗粒或包含其的组合物，其用于治疗癌症，所述治疗包括对有此需要的患者施用药物有效量的NanoQuil F70纳米颗粒或包含其的组合物。

上文提及的G3颗粒和本发明的NanoQuil F70纳米颗粒两者对各种类型的癌细胞的治疗效应被认为是由于该纳米颗粒通过终止有丝分裂周期而将癌细胞转化为凋亡细胞的能力引起的。

NanoQuil F70纳米颗粒或包含其的组合物可肠胃外施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下注射、输注技术的静脉内、肌肉内、皮内注射、电穿孔(EP)、就无针注射而言-喷射注射、基因枪、生物喷射器以及口服、气雾剂施用。

本发明还涉及一种用于评估根据本发明的治疗癌症的方法针对个体患者的适用性的方法，包括

·使来自该患者的癌细胞与根据本发明的NanoQuil F70纳米颗粒或包含此类纳米颗粒的药物组合物体外接触，

·测量指示该纳米颗粒或药物组合物对该癌细胞的治疗效应的至少一种效应；

其中，如果该纳米颗粒或药物组合物显示指示对该癌细胞的治疗效应的显著效应，则该方法被评估是适用于该个体患者。

附图简述

图1A.WO2013051994的图1A的复印图，其被描述为“电子显微镜(EM)显示包含摩尔比率是1:1:0.5的胆固醇、QHC和双萜的纳米颗粒。根据本发明，该颗粒的平均直径是约17至20nm”。

图1B.不含胆固醇或皂苷但仅含磷酸盐缓冲液的样品的电子显微术。在与图1A相似的样品制备后，该TEM照片上捕获的20nm“纳米颗粒”仅是在所需的磷酸盐缓冲液蒸发期间沉淀的磷酸盐。

图2.根据描述于WO201305199中的程序生产的3个批次的DLS颗粒尺寸分析。可看出，该颗粒包含至少两种主要级分。

图3A和B.使用PBS(图3A)或蒸馏水(图3B)作为水性反应介质并且在70℃孵育约一小时时间的根据本发明的NanoQuil F70颗粒的透射电子显微术。TEM照片显示，不管反应介质如何，所产生的F70颗粒具有丝状(线状)形状，即，相比WO2013051994所声称的盘状纳米颗粒的形态完全不同的形态。

图3C.显示根据上述NanoQuil F70生产方案，使用4种不同水性反应介质：蒸馏水(D.W.)、盐水溶液(在D.W.中的0.85％NaCl)、乙酸盐缓冲液(pH4.6)和PBS(pH7.4)生产的NanoQuil F70纳米颗粒的条形图。

在这些制剂中，通过DLS观察到颗粒尺寸(流体动力学直径)差异：配制于PBS中的NanoQuil F70具有最大尺寸(约42nm)，其次是配制在生理盐水中的NanoQuil F70(约35nm)。配制在乙酸盐缓冲液(pH4.6

)和蒸馏水中的NanoQuil F70颗粒的颗粒尺寸分别是约25和24nm。

图4.现通过DLS分析与图3A中TEM分析相同的颗粒的颗粒尺寸分布。这表明，当在PBS中制备时，根据本发明的颗粒以42.2nm±1.0nm的平均流体动力学直径单分散。对于在PBS以外的其他介质中产生的颗粒，参见图3C。

图5.在通过SEC纯化之前，在PBS中制备的NanoQuil F70的三个批次的动态光散射(DLS)分析。

图6:在Sephacryl S300-HR上通过SEC纯化的NanoQuil F70的RP-HPLC色谱图。通过HPLC分析从13mL Sephacryl S300-HR盒以6mL洗脱并且含有纯化的NanoQuil F70的级分。将信号在20mL与32mL之间的积分(灰色条)用于定量级分中的皂苷。信号在39mL的积分用于定量胆固醇。

图7:SEC级分中收集到的QuilA(浅灰色)和胆固醇(深灰色)的相对量。将1mL体积的NanoQuil F70以4.2mg/mL QuilA负至Sephacryl S300-HR管柱上并且收集1mL级分以用于HPLC定量分析。显示包含可测量的量的QuilA的SEC级分(4mL至13mL)。NanoQuil F70和QuilA显示为参考。

图8:NanoQuil F70的Sephacryl S300-HR SEC级分的溶血效应。

图9：仅用QuilA进行的溶血分析。该图显示从红细胞(RBC)释放的血红蛋白随RBC稀释变化。

在该测定中，在0.4mg/mL下，QuilA显示出完全溶血潜力。从0.3mg/mL往下观察到溶血效应降低。

方法：将20μL QuilA添加至180μL在PBS中的新鲜羊血液中，以从0.9x稀释至0.1x。在37℃孵育混合物45min，并且以500xg 5min沉淀细胞。通过测量580nm的吸光度来测量上清液中的血红蛋白。

图10A和B：使用NanoQuil F70颗粒的溶血测定。该图显示从红细胞(RBC)释放的血红蛋白随RBC稀释变化。测试方法如图9。

图10A:与单独的QuilA(图9)相比，未纯化的(原始)NanoQuil F70在1mg/mL的等效QuilA浓度下显示溶血效应。在2mg/mL原始NanoQuil F70下，溶血效应类似于0.2mg/mL游离QuilA诱导的溶血效应。

图10B:S300-HR纯化的NanoQuil F70不显示溶血效应直到2mg/mL的等效QuilA浓度。在4mg/mL纯化的NanoQuil F70下，溶血效应低于或类似于0.1mg/mL游离QuilA或1mg/mL原始NanoQuil F70引起的溶血效应。

图11:NanoQuil F70颗粒与G3颗粒的佐剂效应的比较。在G3-VAX与NanoQuil颗粒之间没有发现显著差异。然而，NanoQuil F70似乎产生比G3略更有效的ab反应和更少的变异。

定义

除非另外具体指出，否则本说明书中的所有术语和词语应被解释为具有相关技术中通常赋予其的含义。为了清楚起见，以下定义一些术语。

疫苗制剂是预防性使用并且改良/增强针对一种或多种特定疾病的保护性免疫力的药物制剂。

当对与疾病有关的组分具有特异性的抗原包含于本发明的制剂中时，或特别是用于癌症治疗，该抗原存在于癌症/肿瘤中时，根据本发明的治疗性疫苗可用于治愈或治疗该疾病。疫苗包含在所治疗的受试者中引起免疫反应的“抗原”和任选地被添加至疫苗以改良免疫反应的被称为“佐剂”或“免疫刺激剂”的物质。

因此，“抗原”是疫苗中的活性特异性部分并且可以是整个微生物，例如病毒或细菌，从而导致疫苗旨在改良针对其的免疫力的疾病。其还可以是所述微生物的一部分，亚单位，例如蛋白质(亚单位)，蛋白质的一部分，从病原微生物分离的蛋白质或通过rDNA技术生产或合成生产的通常被称为肽的蛋白质。肽具有比蛋白质更少的氨基酸并且一般没有有序的3D结构折叠。

“佐剂”是增强对预防性或治疗性疫苗的抗原部分的免疫反应的程度和/或品质的疫苗成分。

发明详述

本发明人已发现，令人惊讶的是，所观察到的根据WO2013051994的程序制备的颗粒的异质性(当通过动态光散射DLS分析时)可通过在高温下孵育颗粒并且调整初始制剂中皂苷与胆固醇之间的比率来克服。其他过程参数(例如胆固醇膜的表面积和厚度和溶剂极性)也可起作用。通过根据本发明的程序生产的“NanoQuil F70”颗粒的形态与通过公开于WO2013051994中的程序生产的表观盘状“G-3”颗粒的形态的不同之处在于根据本发明的NanoQuil F70颗粒是丝状(“线状”)，并且可显示为开放形状(即，蠕虫或面条状)或封闭形状/圆形(与WO2013051994中的表观盘状形式相反)，参见图3A和B。与例如ISCOM和ISCOM基质佐剂制剂相反，根据本发明的NanoQuil F70纳米颗粒没有用磷脂或助洗剂例如MEGA-10配制，并且不包含磷脂或助洗剂(例如MEGA-10)。

因此，在本发明的第一方面中，提供包含胆固醇和三萜皂苷(例如来自莫利纳皂树的组分，例如

或自其分离的组分，例如级分QS-7、QS-8、QS-17、QS-18和QS-21，或来自巴西皂树的组分，例如级分QB-90)的纳米颗粒(“NanoQuil F70”)，其特征在于该纳米颗粒是线状(丝状)的。

如上文所述，已通过TEM分析发现根据第一方面的纳米颗粒以两种分离形式存在，两者均具有特征性线状(丝状)形状。一种形式是开放式的，即蠕虫状或面条状，另一种形式是封闭、并且实质上圆形的。根据下文描述的方法生产的纳米颗粒通常包含这两种形式。

在一个实施方案中，NanoQuil F70纳米颗粒可因此包含两种形式：

·形式A，包含封闭、实质上圆形的纳米颗粒，和

·形式B，开放式蠕虫状纳米颗粒。

形式A:形式B的比率受所采用的反应溶剂的性质和/或所采用的反应溶剂的pH以及其他参数的影响。

在另一个实施方案中，形式A和形式B的所述混合物具有20:80至45:55，例如30:70至40:60，例如约35:65的比率。

在另一个实施方案中，形式A和B的所述混合物具有5:95至10:90的比率。

在一个实施方案中，根据第一方面的纳米颗粒基本上仅由一种形式组成，即，该纳米颗粒包含至少约95％的形式A或形式B。

在另一个实施方案中，形式A的实质上圆形纳米颗粒具有10至15nm的半径和形式B的开放式纳米颗粒具有35至45nm的长度，该两个值均通过TEM测量。

在一个实施方案中，细丝直径或厚度是4至8nm，优选是5至7nm，例如5.8±0.8nm。

在另一个实施方案中，形式A的实质上圆形纳米颗粒具有65至120nm，例如70至80nm，例如80至90nm或例如85至120nm的周长。

在另一个实施方案中，形式A的实质上圆形纳米颗粒具有75±7nm的周长。

在另一个实施方案中，形式A的实质上圆形纳米颗粒具有103.5±17nm的周长。

在另一个实施方案中，皂树皂苷与胆固醇之间的比率是12:1至18:1，例如14:1至17:1，优选16:1。

根据本发明第一方面的NanoQuil F70纳米颗粒实质上不同于包括描述于WO2013051994和WO2014163558中的现有技术的所谓的“G3”纳米颗粒，尤其是在其形态(丝状/线状相对于盘状)和颗粒分散(均匀相对于不均匀)的独特组合上不同。

线状纳米颗粒已经在药物递送系统领域引起相当大的兴趣。在由B.Karagoz等人“Polymerization-Induced Self-Assembly(PISA)–control over the morphology ofnanoparticles for drug delivery applications.”,Polym.Chem.,2014记录的研究中，显示将圆柱状和蠕虫状纳米颗粒在递送药物至乳腺癌细胞时，其致命性是传统球形纳米颗粒的七倍，但对健康细胞的毒性不大。

这些结果在由Elizabeth Hinde等人在“Pair correlation microscopy revealsthe role of nanoparticle shape in intracellular transport and site of drugrelease”,Nature Nanotechnology第12卷，第81-89页(2017)中记录的另一研究中得到证实。Hinde等人证实具有不同形状但表面化学性相同的聚合物纳米颗粒以不同速率移动越过各种细胞屏障，最终定义药物释放的位置。该小组测量了空心胶束、囊泡、杆(rod)和蠕虫如何进入细胞及其是否从核内体系统逃逸并且通过核孔复合物进入至细胞核。杆和蠕虫(但不是胶束和囊泡)通过被动扩散进入核。例如利用核定位信号来改良核进入，导致细胞核内部更多的多柔比星释放并且与更大细胞毒性相关。因此，该小组的结果证实，药物跨越主要细胞屏障(核被膜)的递送对于多柔比星效率很重要并且可通过合适形状的纳米颗粒来实现。

在本发明的第二方面中，提供第一方面的丝状(线状)NanoQuil F70颗粒的生产方法，该方法包括以下步骤：

d)在70℃±5℃加热反应混合物约一小时，

关于第二方面的a)，本领域技术人员将理解在水不溶性胆固醇与水溶性皂苷之间实现紧密接触以便生产本发明的NanoQuil F70颗粒的重要性。这需要产生胆固醇的大的、溶剂可及的表面。在本发明的一个实施方案中，这通过在反应容器(可随后添加皂苷溶液至该反应容器中)的内表面上制备和/或沉积尽可能薄的胆固醇层来进行。

或者，在另一个实施方案中，胆固醇层可被制备和/或沉积在可与皂苷溶液接触的水不溶性多孔制品的表面上。在上述两个实施方案中，胆固醇层实际上可通过蒸发胆固醇在合适有机溶剂中的溶液来制备或沉积。

最后，在本发明的一个不同实施方案中，还可在连续流微反应器中实现水不溶性胆固醇与水溶性皂苷之间的紧密接触，在该微反应器处，胆固醇和皂苷的分开的溶液在高速并且高湍流下混合。

本领域技术人员将理解，术语“反应容器”是指适于根据第一方面的过程中概括的单元操作并且与其兼容的任何种类和尺寸的容器(container)、试管、桶、培养瓶、壶、箱或容器(receptacle)。反应容器可方便地选自标准实验室设备，例如试管、离心管、单颈或多颈圆底或梨形培养瓶等，其通常由玻璃或合适的耐溶剂聚合物制成。用于扩大规模和生产目的的反应容器可选自中试规模和生产规模的反应器，其可以是玻璃内衬的或由不锈钢或其他合金生产而得。

本领域技术人员将进一步理解，术语“水不溶性、多孔制品”意指具有开孔结构和合适形状(例如中空纤维)并且由合适的水不溶性多孔材料(例如多孔玻璃、气凝胶及其他无机凝胶、多孔氧化铝、氧化锆或二氧化硅颗粒、金属泡沫和多孔聚合物)制成的合适尺寸的任何制品。

本领域技术人员将进一步理解，从胆固醇溶液移除溶剂可方便地通过溶液的蒸发进行。这包括在搅拌反应容器的内容物的同时施加适度真空，任选地利用加热。该搅拌可通过旋转反应容器或通过在反应容器内部施加内部搅拌器(例如搅拌棒或浆式搅拌器)来进行。

或者，从胆固醇溶液移除溶剂可通过将空气流、氩气流或氮气流通入反应容器中进行，任选地同时搅拌其中的内容物。

无论移除溶剂的方法如何，所述移除在反应容器的内部和/或多孔制品的表面上沉积具有可变厚度和粗糙度的胆固醇层。

关于第二方面的b)，NanoQuil F70纳米颗粒是根据上述NanoQuil F70生产方案使用以下4种不同水性反应介质来生产的：蒸馏水(D.W.)、盐水溶液(在D.W.中的0.85％NaCl)、乙酸盐缓冲液(pH4.6)和PBS(pH7.4)。

)和蒸馏水中的NanoQuil F70颗粒的颗粒尺寸分别是约25和24nm(参见图3C)。

通过DLS分析，给出的颗粒直径是流体动力学直径。流体动力学直径(或斯托克斯(Stokes)直径)是以与分析物相同的速率扩散的等效硬球的直径，即，具有与所测量颗粒相同的平移扩散系数的球体的直径，假设水化层围绕着颗粒。因此测量的是溶液中颗粒的回转半径。这不提供有关在“静态”条件下颗粒形态的信息；然而，这可通过TEM进行评估。

使用TEM分析，发现在上文b)中使用不同水性反应介质还导致颗粒形态的其他差异。从下表可以看出，产生于不同介质中的开放式纳米颗粒与封闭式纳米颗粒的比率(形式A:形式B)是不同的。对于PBS缓冲液，该比率是约8:92A:B，但对于蒸馏水和乙酸盐缓冲液，该比率是约40:60。所有值均通过TEM影像分析测量。

因此，NanoQuil F70颗粒形态可通过改变过程参数来微调，这是优于现有技术程序的巨大优势。申请人考虑了各种类型的颗粒和组成比率会找到各自的用途。

因此，在一个实施方案中，在b)中添加的水性反应介质是缓冲液，例如乙酸盐或PBS缓冲液。在另一个实施方案中，在b)中添加的水性反应介质是一种或多种盐的溶液，例如盐水(在蒸馏水中的0.85％NaCl)。在又一个实施方案中，在b)中添加的水性反应介质是无盐蒸馏水。在一个优选实施方案中，在b)中添加的水性反应介质是pH为约4.6的乙酸盐缓冲液。

在另一个实施方案中，用于NanoQuil F70颗粒的制造过程是在4至5的pH下进行。在另一个实施方案中，用于NanoQuil F70颗粒的制造过程是在5至6的pH下进行。在另一个实施方案中，用于NanoQuil F70颗粒的制造过程是在6至7的pH下进行。在另一个实施方案中，用于NanoQuil F70颗粒的制造过程是在7至8的pH下进行。

关于第二方面的c)，QuilA(或另一皂树级分)的添加优选使用浓度为约1mg/ml的水溶液进行。添加足够量的此类溶液以产生最终比率为10:1至20:1、优选最终比率为16:1(w/w)的皂苷:胆固醇。

在根据第二方面的过程的d)中加热所得反应混合物是本发明的基本特征，其相对于WO2013051994的颗粒显著改变所产生的颗粒的形态和颗粒尺寸分布，如上文上述。

因此，在一个优选实施方案中，将根据第二方面的过程的d)中的所得反应混合物加热至70℃±5℃约一小时。本领域技术人员将理解，尽管加热是本发明的基本特征，但精确的反应温度、加热的时间、加热的速率和加热和随后冷却期间的温度曲线，特别是当将生产方法扩展至新规模时，是全部需要分析和优化的参数。分析和优化过程参数是本领域技术人员理解的任务，并且被视作为要进行的例行任务，其不需要创造性技巧。

关于第二方面的e)，本发明的NanoQuil F70颗粒的最终分离包括纯化步骤。包括该步骤是因为根据本发明第二方面的由于配制皂苷与胆固醇的过程所产生的“原始”NanoQuil F70颗粒永远不完全不含残留的游离皂苷胶束，并且因此NanoQuil F70粗产物可包含批次间不同量的游离皂苷胶束。最终的纯化步骤将批次间的可变性降低至可接受的程度，这将在下文中进行讨论。

来自皂树物种的皂苷，例如QuilA(来自莫利纳皂树的部分纯化的皂苷的商业混合物)与许多其他皂苷一样，当作为包含在水性缓冲液中的胶束递送时，对生物膜具有固有溶解活性(Kensil,C.R.等人(1991).Separation and characterization of saponins withadjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex.The Journal ofImmunology,146(2),431-437；Oda,K.,等人(2000).Adjuvant and haemolyticactivities of 47saponins derived from medicinal and food plants.BiologicalChemistry,381(1),67-74)。以该形式，皂树皂苷当作为疫苗佐剂进行注射时诱导不良急性发炎综合征，此是由于其有效的细胞膜溶解效应(一种导致细胞破坏或溶解的反应)。

具有亲水性和亲脂性部分的皂苷分子的结构为这些分子提供显著去污效应。

注射后，皂苷分子按原样与细胞膜上的胆固醇和磷脂相互作用，由此充当去污剂。如下文实验部分中所述，该效应是在对羊红细胞进行的溶血测定中定量。

皂苷的溶剂效应导致与接种物周围的组织发生溶解反应。因此，使用皂苷作为疫苗佐剂的剂量推荐必须反映实现良好免疫刺激效应的平衡，而不在注射部位引起临床上显著的不良反应(以溃疡、坏死等形式)。然而，这在施用这些佐剂时针对剂量赋予一些限制。

在制备NanoQuilF-70以及其他含皂苷颗粒佐剂时，可能存在过量的游离皂苷，该游离皂苷在该情况下无法通过掺入至具有胆固醇的NanoQuil F70复合物中而固定。

如上文所述，该游离皂苷仍将具有在周围组织中诱导溶解反应的能力。为了皂苷基佐剂在疫苗接种中被接受，其膜溶解潜力需要尽可能低而不影响皂苷的免疫增强效应。为此目的，必须进行NanoQuil F70纳米颗粒的纯化步骤以确保可接受的产物。

申请人已发现，凝胶过滤(在下文中称为尺寸排阻色谱，SEC)令人满意地从粗产物移除过量的皂苷。此外，SEC方法易于扩展至工业生产规模。

凝胶过滤(还称为尺寸排阻色谱，SEC)在分子通过包装在柱中的凝胶过滤介质时根据尺寸差异分离分子。与离子交换或亲和力色谱不同，分子不结合至色谱介质，因此缓冲液组合物不直接影响解析(峰之间的分离度)。因此，凝胶过滤的一个显著优势是条件可被改变以适合样品类型或进一步纯化、分析或储藏的要求而不改变分离。

在一个实施方案中，残留皂苷的移除是使用例如Sephacryl 300或本领域技术人员将能够在无需付出创造性劳动而选择的另一凝胶过滤介质来进行。SEC方法能够分离平均尺寸为～5nm的残留皂苷胶束与平均尺寸为20至50nm(取决于反应介质的流体动力学直径)的NanoQuil F70颗粒并且由此获得具有高度减小的溶解效应的产物。

过量皂苷的移除对NanoQuil F70纳米颗粒的溶血活性的影响充分记录于下文的实验部分中，并且可通过将“原始”纳米颗粒与SEC纯化颗粒的溶血效应进行比较来轻易地证实，参见图9和10。

所分析的NanoQuil F70纳米颗粒(其包含复合的QuilA)的溶血效应最有效地以“等效QuilA”呈现。与QuilA本身相比，未纯化的(原始)NanoQuil F70在1mg/mL的等效QuilA浓度下引起溶血效应。在2mg/mL的未纯化的NanoQuil F70下，溶血效应类似于0.2mg/mL游离QuilA的溶血效应。因此，可认为该制剂的溶血效应相对于QuilA本身降低约10x。

Sephacryl 300-HR纯化的NanoQuil F70不显示任何溶血效应直到2mg/mL的等效QuilA浓度。在4mg/mL下，纯化的NanoQuil F70展现溶血效应低于或类似于由0.1mg/mL游离QuilA或1mg/mL未纯化的NanoQuil F70引起的溶血效应。因此，可认为经纯化的NanoQuilF70纳米颗粒的溶血效应相对于QuilA本身降低至少40x，或相对于原始NanoQuil F70降低约4x。

NanoQuil F70颗粒的SEC纯化的该效应(溶解效应的降低)令人惊讶地高，并且此外从治疗角度来看很重要，因为其提高可安全地注射的含皂苷佐剂的量的上限而同时不增加局部反应原性。因此，使用NanoQuil F70颗粒作为佐剂可使得其可诱导针对给定注射的更高免疫反应。

在本发明的一个优选实施方案中，借助于针对原始或粗制的NanoQuil F70纳米颗粒进行的凝胶过滤技术(例如，尺寸排阻色谱(SEC))发现，与相同皂苷(例如QuilA，呈纯化的、非复杂形式)诱导的溶血效应相比，含皂苷的NanoQuil F70纳米颗粒诱导的溶血效应降低至少20x，例如20x、30x或40x。

将如WO2013051994中所公开的程序的方法步骤与本发明的方法步骤进行比较，明显的是，限定第二方面的NanoQuil F70纳米颗粒的结构特性是制造过程的修改的直接结果。

因此，在一个特定实施方案中，根据本发明的第一方面的纳米颗粒可通过根据第二方面的方法获得。

除了其用作疫苗佐剂的用法之外，根据本发明的NanoQuil F70纳米颗粒还可作为递送系统用于一种或几种化合物，例如用于药物，包括用于治疗癌症和营养相关化合物的药物，其中另外的物质提供另外的功能和互补作用方式。

合适的药学上可接受的载剂和/或稀释剂包括任何和所有已知溶剂、分散介质、填充剂、固体载剂、水溶液、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂和类似物。此类介质和试剂用于药物活性物质的用途是本领域中众所周知的，并且描述于(作为实例)Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Edition,Mack Publishing Company,Pennsylvania,USA中。除非迄今为止任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则可考虑将其用于本发明的药物组合物中。补充活性成分还可掺入至组合物中。

本发明还包括药物组合物，其进一步包含至少一种药物活性化合物，例如抗癌药物、铂配位化合物、紫杉烷化合物、喜树碱化合物、抗肿瘤长春花生物碱、抗肿瘤核苷衍生物、氮芥或亚硝基脲烷基化剂、抗肿瘤蒽环霉素衍生物、曲妥珠单抗和抗肿瘤鬼臼毒素衍生物、莫利纳皂树及其子片段、针对抗体或单克隆抗体的受体例如Fc受体或金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的DD、用于治疗癌症的药剂，例如选自阿糖胞苷、道诺霉素(Daunorubicin)、紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、Toricsel和Trabectidin的药剂，所述活性化合物可被整合至纳米颗粒中或与组合物混合。

其他抗癌剂优选选自铂配位化合物、紫杉烷化合物、喜树碱化合物、抗肿瘤长春花生物碱、抗肿瘤核苷衍生物、氮芥或亚硝基脲烷基化剂、抗肿瘤蒽环霉素衍生物、曲妥珠单抗和抗肿瘤鬼臼毒素衍生物。

术语“铂配位化合物”在本文中用于表示提供呈离子形式的铂的任何肿瘤细胞生长抑制铂配位化合物。优选的铂配位化合物包括顺铂、卡铂、氯(二亚乙基三胺)-氯化铂(II)；二氯(乙二胺)-铂(II)；二胺(1,1-环丁烷二羧酸)-铂(II)(卡铂)；螺铂；异丙铂；二胺(2-乙基丙二酸)-铂(II)；(1,2-二氨基环己烷)丙二酸铂(II)；(4-羧基邻苯二甲酸-1,2-二氨基环己烷)铂(II)；(1,2-二氨基环己烷)-(异柠檬酸)铂(II)；(1,2-二氨基环己烷)-顺-(丙酮酸)铂(II)；(1,2-二氨基环己烷)-草酸-铂(II)；奥马铂和四铂。

顺铂可以例如以商样名称Platinol从Bristol Myers Squibb Corporation作为用于使用水、无菌盐水或其他合适媒介物重构的粉末商购获得。其他铂配位化合物及其药物组合物可商购和/或可通过常规技术来制备。

紫杉烷化合物包括例如来自Bristol Myers Squibb的紫杉酚、来自Rhone-Poulenc Rorer的多烯紫杉醇(多西紫杉醇(Taxotere))和来自Sanofi Pasteur的卡巴他赛。其他紫杉烷化合物可以例如如EP253738、EP253739和WO92/09589中所述的常规方式或通过类似于其的过程来制备。

喜树碱化合物包括伊立替康和拓扑替康。伊立替康可例如以商品名称Campto从Rhone-Poulenc Rorer商购并且可例如如欧洲专利第137145号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。拓扑替康可例如以商品名称Hycamtin从SmithKline Beecham商购并且可例如如欧洲专利第321122号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。其他喜树碱化合物可以以常规方式(例如通过类似于以上针对伊立替康和拓扑替康所述的过程的过程)制备。

抗肿瘤长春花生物碱包括以上提及的长春花碱、长春新碱和长春瑞滨。长春花碱可例如以商品名称Velban从Eli Lilly and Co呈注射用硫酸盐商购，并且可例如如德国专利第2124023号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。长春新碱可例如以商品名称Oncovin从Eli Lilly and Co呈注射用硫酸盐商购，并且可例如如以上德国专利第2124023号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。长春瑞滨可例如以商品名称Navelbine从Glaxo Wellcome呈注射用酒石酸盐商购并且可例如如美国专利第4307100号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。其他抗肿瘤长春花生物碱可以以常规方式(例如通过类似于以上针对长春花碱、长春新碱和长春瑞滨所述的其过程的过程)来制备。

抗肿瘤核苷衍生物包括以上提及的5-氟尿嘧啶、吉西他滨和卡培他滨。5-氟尿嘧啶是可广泛商购的，并且可例如如美国专利第2802005号中所述来制备。吉西他滨可例如以商品名称Gemzar从Eli Lilly商购并且可例如如欧洲专利第122707号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。

卡培他滨可例如以商品名称Xeloda从Hoffman-La Roche商购并且可例如如欧洲专利第698611号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。其他抗肿瘤核苷衍生物可以以常规方式(例如通过类似于以上针对卡培他滨和吉西他滨所述的过程的过程)来制备。

氮芥化合物包括环磷酰胺和苯丁酸氮芥。环磷酰胺可例如以商品名称Cytoxan从Bristol-Myers Squibb商购并且可例如如英国专利第1235022号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。苯丁酸氮芥可例如以商品名称Leukeran从Glaxo Welcome商购并且可例如如美国专利第3046301号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。用于根据本发明的用途的优选的亚硝基脲化合物包括以上提及的卡莫司汀和洛莫司汀。卡莫司汀可例如以商品名称BiCNU从Bristol-Myers Squibb商购并且可例如如欧洲专利第902015号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。洛莫司汀可例如以商品名称CeeNU从Bristol-MyersSquibb商购并且可例如如美国专利第4377687号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。

抗肿瘤蒽环霉素衍生物包括以上提及的道诺霉素、多柔比星和伊达比星。道诺霉素可例如以商品名称Cerubidine从Bedford Laboratories呈盐酸盐商购并且可例如如美国专利第4020270号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。

多柔比星可例如从Astra呈盐酸盐商购并且可例如如美国专利第3803124号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。伊达比星可例如以商品名称Idamycin从Pharmacia&Upjohn呈盐酸盐商购，并且可例如如美国专利第4046878号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。其他抗肿瘤蒽环霉素衍生物可以以常规方式(例如通过类似于以上针对道诺霉素、多柔比星和伊达比星所述的过程的过程)来制备。

曲妥珠单抗可以商品名称Herceptin从Genentech商购并且可如美国专利第5821337号说明书或PCT专利WO94/04679和WO92/22653说明书中所述来获得。

抗肿瘤鬼臼毒素衍生物包括依托泊苷和替尼泊苷。依托泊苷可例如以商品名称VePesid从Bristol-Myers Squibb商购并且可例如如欧洲专利第111058号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。替尼泊苷可例如以商品名称Vumon从Bristol-Myers Squibb商购并且可例如如PCT专利第WO93/02094号说明书中所述或通过类似于其的过程来制备。其他抗肿瘤鬼臼毒素衍生物可以以常规方式(例如通过类似于以上针对依托泊苷和替尼泊苷所述的过程的过程)来制备。

因此，抗癌药物可例如选自：

1.多官能烷基化剂：

亚硝基脲、氮芥(氮芥子气)、甲磺酸酮(白消安)、乙烯亚胺

2.其他烷基化药物：

丙卡巴肼(甲基苯肼)、达卡巴嗪(DTIC)、六甲蜜胺(Hexalen)、顺铂(Platinol)

3.抗代谢物：

抗叶酸化合物(甲氨蝶呤)、氨基酸拮抗剂(Azaserine)

4.嘌呤拮抗剂：

巯基嘌呤(6-MP)、硫鸟嘌呤(6-TG)、磷酸氟达拉滨、克拉屈滨(Leustatin)、喷司他丁(Nipent)

5.嘧啶拮抗剂：

氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(ARA-C)、阿扎胞苷

6.植物生物碱：

长春花碱(Velban)、长春新碱(Oncovin)、依托泊苷(VP-16、VePe-sid)、替尼泊苷(Vumon)、拓扑替康(Hycamtin)、伊立替康(Camptosar)、紫杉醇(Taxol)、多西他赛(Taxotere)

7.抗生素：

蒽环霉素、多柔比星(Adriamycin、Rubex、Doxil)、道诺霉素(DaunoXome)、更生霉素(Cosmegen)、伊达红霉素(Idamycin)、普利霉素(Mithramycin)、丝裂霉素(Mutamycin)、博来霉素(Blenoxane)

8.单克隆抗体，

9.激素剂：

他莫昔芬(Nolvadex)、氟他胺(Eulexin)、促性腺激素释放激素激动剂(亮丙瑞林和戈舍瑞林(Zoladex))、芳香酶抑制剂、氨基鲁米特、阿那曲唑(Arimidex)、

10.其他抗癌药：

安吖啶、羟基脲(Hydrea)、天冬酰胺酶(El-spar)、米托蒽醌(Novantrone)、米托坦、视黄酸衍生物、骨髓生长因子、氨磷汀。

可选自抗原、佐剂、靶向分子、药物化合物和营养物的两亲性和疏水性分子可整合到根据本发明的NanoQuil F70纳米颗粒中，或与其混合在组合物中。根据本发明的组合物还可包含掺入至分开的纳米颗粒中的不同的两亲性和疏水性分子。

包含本发明的NanoQuil F70纳米颗粒的药物组合物可如上所述用作疫苗佐剂，例如，与正在开发或已经在许可疫苗中实施的疫苗组合使用，与季节性流感病毒疫苗组合使用，与大流行性流感疫苗组合使用或与紧急疫苗(例如针对生物武器的疫苗)组合使用，或用作药物递送系统中的组分。因此，本发明的NanoQuil F70纳米颗粒可用作用于人类和兽医用途的疫苗中的佐剂。

因此，如上文所述，本发明还涉及包含根据本发明的NanoQuil F70颗粒(并且特别是作为佐剂)的药物疫苗制剂(例如人类或兽医疫苗)。

在一个优选实施方案中，包含QS-21皂苷的NanoQuil F70颗粒特别适合用作人类疫苗中的佐剂。在另一个优选实施方案中，包含QuilA皂苷的NanoQuil F70颗粒特别适合用作兽医疫苗中的佐剂。

在另一个实施方案中，该药物组合物进一步包含二萜，例如一种或多种甜菊糖苷。

此外，本发明涉及一种用于治疗癌症的方法，该方法包括对有此需要的患者施用药物有效量的根据本发明纳米颗粒或组合物。根据一个实施方案，该癌症是白血病、淋巴癌、骨髓癌、乳腺癌、前列腺癌、肾癌、胰腺癌、卵巢癌、脑癌、宫颈癌、肺癌、肝癌、肾癌、口腔癌、血液癌症。癌症可能位于肾上腺(肾上腺癌，肾上腺腺癌，肾上腺皮质癌；肛门，肛门癌(肛门鳞状细胞癌)；膀胱癌(膀胱鳞状细胞癌)，膀胱癌(膀胱过渡性细胞癌)；血液，弥散性血管内凝血，低钠血症，中性粒细胞减少性败血症，肿瘤溶解综合征；骨，软骨内瘤(软骨瘤，奥利尔病)，尤文氏肉瘤，骨肉瘤，(成骨肉瘤)，骨转移瘤、骨癌(软骨的软骨肉瘤)；骨髓，慢性粒细胞白血病、多发性骨髓瘤、早幼粒细胞白血病(PML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、慢性淋巴细胞白血病、急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)；脑，脑癌(脑多形性胶质母细胞瘤)、脑肿瘤(脑胶质瘤)、脑淋巴瘤、成神经管细胞瘤/原始神经外胚层肿瘤(PNET)[成神经管细胞瘤/原始神经外胚层肿瘤(PNET)]、脑膜瘤、神经母细胞瘤、脑的原始神经外胚层肿瘤(PNET)、脑转移、听神经瘤、脑肿瘤(脑星形细胞瘤)；乳房，乳腺癌(乳房的癌),乳腺癌(乳房发炎性癌),男性乳腺癌(Male Breast Carcinoma),乳腺癌(浸润性乳腺癌)[浸润性乳腺癌(乳腺癌)],乳腺癌(浸润前小叶癌；原位小叶癌；LCIS)[浸润前小叶癌(原位小叶癌；LCIS；乳腺癌)]，乳腺癌(浸润前导管癌；导管原位癌；DCIS)[浸润前导管癌(导管原位癌；DCIS；乳腺癌)]；盲肠，肠癌(盲肠腺癌)；宫颈，宫颈癌(宫颈鳞状细胞癌)；结肠直肠，结肠癌(结肠腺癌)、直肠癌(直肠腺癌)1；头颈部，扁桃体癌(扁桃体淋巴瘤)、喉部癌(喉癌、喉鳞状细胞癌)、咽癌(咽部鳞状细胞癌)、舌癌(舌鳞状细胞癌)、喉癌(扁桃体鳞状细胞癌)、口腔癌(口底鳞状细胞癌)；肾，肾癌(肾细胞癌；RCC)；肝脏，肝癌(肝细胞癌)、肝脏转移癌；肺，肺癌(肺大细胞癌)、胸腔积液、肺癌(肺腺癌)、小细胞肺癌(肺癌)、非小细胞肺癌(NSCLC)、胸膜恶性间皮瘤，肺癌(肺鳞状细胞癌)；淋巴系统；霍奇金淋巴瘤，霍奇金氏淋巴瘤；非霍奇金淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、脑淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤(非霍奇金淋巴瘤)、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、外周T细胞淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)；肌肉、胆管癌(胆管癌胆汁癌)、肌肉平滑肌肉瘤、肌肉横纹肌肉瘤、软组织肉瘤；食道，食道癌(食道鳞状细胞癌)、食道癌(食道腺癌)；卵巢，卵巢癌(卵巢腺癌)；胰腺，胰腺癌(胰腺腺癌)、胰腺神经内分泌肿瘤(PNET)；阴茎，阴茎癌(阴茎鳞状细胞癌)、佩罗尼氏病；垂体，垂体癌(垂体癌)，抗利尿激素分泌不当综合征(SIADH)[抗利尿激素分泌不当综合征(SIADH)]；前列腺，前列腺癌(前列腺神经内分泌癌)、前列腺癌(前列腺腺癌)；皮肤，皮肤癌(皮肤基底细胞癌)、皮肤癌(皮肤鳞状细胞癌)、默克尔细胞癌(MCC)、皮肤癌(恶性皮肤黑色素瘤)、痣(良性色素病变、良性黑色素细胞病变、黑色素细胞痣，痣细胞痣)；小肠，小肠癌(小肠淋巴瘤)、小肠癌(小肠腺癌)；脊髓、脊髓胶质瘤、脊髓脑膜瘤、脊髓转移瘤、脊髓星形细胞瘤(肿瘤)、脊髓癌(脊髓淋巴瘤)；胃，佐林格-埃里森综合征(胃泌素瘤)、胃淋巴瘤(胃淋巴癌)、胃癌(胃腺癌)；睾丸，睾丸癌(睾丸精原细胞瘤)、睾丸癌(睾丸畸胎瘤)；甲状腺，甲状腺癌(甲状腺滤泡细胞)，甲状腺髓质细胞，甲状腺乳头状细胞，甲状腺癌(甲状腺间变性)；子宫，妊娠滋养细胞疾病(磨牙妊娠)[磨牙妊娠(妊娠滋养细胞疾病，GTD)]，子宫癌(子宫内膜腺癌)；外阴，外阴癌(外阴鳞状细胞癌)；其他癌症，原发性未知肿瘤(TUP)、慢性疼痛综合征、类癌和类癌综合征、神经内分泌肿瘤；其他癌症疾病、慢性病性贫血、癌症疼痛、背部手术失败综合征(FBSS)、HIV AIDS(人类免疫缺陷病毒和获得性免疫缺陷综合征)、肾脏疾病-慢性肾功能衰竭、营养不良、耳毒性、瘀点性皮肤紫癜、前列腺上皮内瘤变(PIN)。

在下文实施例部分中给出NanoQuil F70纳米颗粒在癌细胞上的效应的实例。

药物组合物可呈无菌可注射水性或油性悬浮液的形式。该悬浮液可根据已知技术使用上文已提及的其合适分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制。无菌可注射制剂还可以是包含在无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如诸如包含在1,3-丁二醇中的溶液。可使用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌、固定油通常用作溶剂或悬浮介质。基于此目的，可使用任何无刺激性固定油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。此外，脂肪酸(例如油酸)可用于制备可注射剂。

该溶液或悬浮液还可包含以下佐剂中的至少一个：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂、抗菌剂(例如苄醇或对羟基苯甲酸甲酯)、抗氧化剂(例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠)、螯合剂(例如乙二胺四乙酸)、缓冲剂(例如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐)和用于调整张力的试剂(例如氯化钠或右旋糖)。可将肠胃外制剂密封于由玻璃或塑料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量容器中。

一般而言，本发明的NanoQuil F70颗粒以药物有效量施用。实际施用的颗粒的量将通常由医师根据相关情况来确定，包括待治疗的病情、所选择的施用途径、所施用的实际化合物、个体患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重度等。

根据本发明的纳米颗粒可在针对任何微生物的任何疫苗中用作佐剂。其可用于任何动物，例如禽类、哺乳动物(例如人类)、家畜例如猫、狗、绵羊、山羊、猪、牛和马)。根据一个实施方案，本发明用作针对于动物中的链球菌和马中的流行性感冒的疫苗中的佐剂。

在下文实施例部分中给出用作疫苗佐剂的NanoQuil F70纳米颗粒的效应的实例。

用于人类和兽医用途的剂量可根据所包含的其他化合物改变。鉴于治疗的持续时间，剂量可在<50μg至1mg或更多/天的范围内。

实施例

实施例1-使用PBS或乙酸盐缓冲液作为反应介质生产原始NanoQuil F70纳米颗粒

材料

·植物胆固醇。批次SCOL129-2。材料代码：C1231，Sigma-Aldrich。

·Quil A储液100mg/mL，Brenntag Biosector A/S。

·PBS缓冲液pH7.4、或乙酸盐2-10mM缓冲液pH4.6。

·蒸馏水。

·盐水溶液(在蒸馏水中的0.85％NaCl)。

·丙酮，Ph.Eur.≥99.5％。

·50mL Cellstar管

·气泵。Eheim 200，型号3702010。

·具有智能控制的恒温振荡器和块体恒温器。MKR13来自Hettich LabTechnology，The Netherlands。

·Sorvall ST16R离心机，Thermo Scientific。

·LaminAir通风罩，Holten.Thermo Fisher Scientific。

·真空过滤，1000mL，SFCA，0.22μM灭菌，VWR欧洲制品编号514-1058。

·移液器和吸头(经灭菌的)。

程序

1.称取植物衍生的胆固醇3.125mg/管×5管＝15.625mg。

2.添加5mL丙酮至胆固醇，使用涡旋完全溶解

3.将该胆固醇溶液分装成1mL/管。

4.在旋转管的同时经由将空气泵入该管中来蒸发丙酮，以便将该胆固醇均匀地沉积在试管的V形底部。

5.添加70℃温水性反应介质(50mL/管)：蒸馏水、盐水溶液(0.85％NaCl)、乙酸盐缓冲液(pH4.6)或PBS缓冲液(pH7.4)。

6.添加500μL/管的100mg/mL Quil A储液以得到1mg/mL Quil A溶液。

7.在MKR13(参见材料)上于70℃孵育60min。

8.在4℃直接冷却降温。

9.在4℃储藏过夜。

10.以4696x G离心45min。

11.使已合并在一起的上清液通过0.22μm过滤器过滤。

实施例2-再现性测试

为了评估概述于上文实施例1中的程序的再现性，于2018年7月18日、19日和20日连续三天三次生产NanoQuil F70纳米颗粒。以5个50mL Falcon管/批(250mL)配制这三批(测试-1、测试-2和测试-3)NanoQuil F70并且在70℃孵育1小时，其名称为NanoQuil F70(在70℃的制剂)。作为一个非限制性实例，可如下简化配制方案：

·称取15.625mg植物胆固醇。

·添加5mL丙酮至该胆固醇，完全溶解。

·将该胆固醇溶液以1mL/管分装于5个50mL Falcon管中。

·在旋转管的同时通过将空气泵入该管中来蒸发丙酮，以便将该胆固醇均匀地沉积在各管的V形底部。

·添加70℃PBS，50mL/管。

·添加500μL/管的100mg/mL Quil A储液以得到1mg/mL Quil A溶液。

·在70℃孵育60min。

·在4℃直接冷却降温。

·在4℃储藏过夜。

·以4696x g离心45min。

·使已合并在一起的上清液通过0.22μm过滤器过滤。

·在4℃储藏

结果和讨论

1.产物中Quil A的回收

使用苔黑酚测试(还称为比阿耳氏测试)测量所生产的NanoQuil F70纳米颗粒的Quil A含量。结果图示于图12中。

对于该三个测试批次，Quil A回收率很高，分别为91.5％、93.8％和98.3％，即，均高于90％。

2.颗粒尺寸

通过动态光散射(DLS)分析测量的三种制剂的平均颗粒尺寸分别为46.32±1.48nm、40.07±0.98nm和42.20±0.74nm，参见图5。图13显示了DLS测量的图示概述。

3.溶血效应的减少

该三个批次的溶血减少率相当相似：测试-1为31％，测试-2为29％和测试-3为31％(参见图14中的条形图)。这可视为实现了通过配制Quil A到F70中的副作用减少的相似程度，即，副作用减少的高度再现性。然而，观察到所有测试批次均诱导溶血至对于疫苗佐剂而言是无法接受地高的程度。

4.在其他反应介质中生产的NanoQuil F70纳米颗粒

使用4种不同溶剂根据NanoQuil F70方案来生产NanoQuil F70纳米颗粒：蒸馏水(D.W.)、盐水溶液(在D.W.中的0.85％NaCl)、乙酸盐缓冲液(pH4.6)和PBS(pH7.4)。在这些制剂中，通过DLS观察到颗粒尺寸(流体动力学直径)差异：配制于PBS中的NanoQuil F70具有最大尺寸(约42nm)，其次是配制在生理盐水中的NanoQuil F70(约35nm)。配制在乙酸盐缓冲液(pH4.6)和蒸馏水中的NanoQuil F70颗粒的颗粒尺寸分别为约25和24nm(参见图15中的条形图)。

实施例3-用Sephacryl S300-HR色谱对原始NanoQuil F70颗粒进行尺寸分离

为了从NanoQuil F70颗粒移除易于增加细胞溶解的游离(未掺入的)皂苷，通过尺寸排阻色谱(SEC)纯化粗制NanoQuil F70产物。

将13mL体积的Sephacryl S300-HR(GE Healthcare Life Sciences)置于PD-10盒中并且用PBS缓冲液或乙酸盐缓冲液平衡。将根据上文实施例1生产的1mL体积的原始NanoQuil F70颗粒负载于柱顶部上并且允许通过重力渗透穿过Sephacryl材料。收集1mL级分以使用RP-HPLC分析皂苷和胆固醇含量，以及测试溶血活性。

NanoQuil F70 SEC级分的RP-HPLC

HPLC被用作检测和量化S300-HR级分中皂苷和胆固醇的工具。总皂苷和胆固醇含量表示为来自HPLC带电气溶胶检测器(CAD)的信号积分，并绘制为S300-HR洗脱体积的函数。与尼罗红荧光检测方法(见下文)一样，S300-HR色谱图显示皂苷的两个峰集中在6-7mL和9-10mL，胆固醇主要与6-7mL处的峰相关，如使用NanoQuil颗粒所预期的。

方法：

使用短色谱图在Kromasil C4柱上分析来自NanoQuil F70 SEC分馏的100μL每种S300HR级分。图16中的条形图显示了S300HR级分的积分CAD信号，对应于皂苷峰和胆固醇峰的总和。

尼罗红荧光分析

使用荧光团尼罗红分析S300-HR SEC级分(45μL级分+5μL NileRed@10μM用于荧光读数)显示皂苷的分布，参见图17中的条形图。尼罗红(NR)荧光由极性分子例如水淬灭，因此在水性环境中仅显示微弱的荧光。然而，当尼罗红与非极性分子(如皂苷的三萜核心)相互作用或掺入到胶束结构中时，其荧光会增强几个数量级。尼罗红用作示踪剂以监测S300-HR级分中游离QuilA皂苷或NanoQuil颗粒的存在。

S300-HR色谱图显示了以级分6mL为中心(对应于NanoQuil颗粒(经TEM确认))和9mL(对应于QuilA胶束)的两个峰。

级分6和7mL的NR荧光光谱(未显示)显示了nanoQuil的典型蓝移(表明与胆固醇的相互作用)，最大发射波长为570nm，而级分9和10mL显示了具有在620nm处的发射峰的QuilA胶束的典型光谱。

NanoQuil F70 SEC级分的溶血测定

将来自NanoQuil F70 SEC分馏的120μL的每种级分添加到480μL经抗凝剂处理的稀释新鲜羊血中。NanoQuil F70 SEC级分的稀释倍数为5倍，而羊血在含有2mM EDTA的PBS缓冲液中稀释12.5倍。在37℃孵育45分钟后，通过离心使细胞沉淀，并通过415和540nm处的吸光度测量上清液中释放的血红蛋白量。溶血活性表示为540nm处吸光度值的函数，以及针对0.4mg/mL至1.0mg/mL的QuilA皂苷的校准范围表示。结果示于图18中。

溶血性最强的S300-HR级分，即9mL和10mL，是含有游离QuilA的那些级分。含有NanoQuil F70的6mL和7mL级分在测定条件下不显示溶血作用。

这也可以用“等效QuilA”表示，参见图19中的条形图。

另一方面，原始NanoQuil F70产物确实显示出1mg/mL等效QuilA及以上的溶血效应。结果示于图20中。

结果

图6显示用于定量分析NanoQuil F70纳米颗粒的典型RP-HPLC色谱图。对于固定量的1mg/mL的QuilA皂苷，加标0.1mg/mL至0.8mg/mL的胆固醇在该浓度范围内产生线性反应，这可用于校准和评估未知级分中的胆固醇含量(NanoQuil F70的SEC级分)。

通过HPLC分析从13mL Sephacryl S300-HR盒以6mL洗脱并且含有纯化的NanoQuilF70的级分。使用20mL与32mL的信号积分(以图6中水平灰色条表示)来定量级分中的皂苷。在39mL的信号积分用于定量胆固醇。

在对NanoQuil F70进行SEC分馏并且通过RP-HPLC进行定量分析后，图7清楚地显示NanoQuil F70颗粒首先被洗脱，在级分5mL至8mL中同时发现QuilA皂苷和胆固醇，而残留的不含胆固醇的QuilA皂苷是在9mL至12mL的后续级分中被洗脱。该结果与SEC分馏的工作方式一致，其中颗粒越大，其越少地渗透至Sephacryl珠粒的聚合物网格中；因此，其越早从柱洗脱。NanoQuil F70颗粒具有20至50nm(取决于反应介质)的流体动力学直径，而QuilA皂苷胶束具有约5nm的直径。NanoQuil颗粒和QuilA皂苷胶束的分离还与Sephacryl S300-HR的分级分离范围一致。仅将QuilA皂苷负载至SEC柱上的对照实验显示QuilA皂苷在相同条件下以级分8至11mL洗脱。这证实当注射NanoQuil F70(图7)时，在级分5至8mL中发现的QuilA皂苷确实与胆固醇有关。级分5至8mL中该材料的TEM照片证实NanoQuil F70颗粒的身份。SEC分馏还显示在该批次中游离QuilA皂苷胶束(无可值测的胆固醇)的量占原始NanoQuil F70产物中QuilA皂苷总量的约50％。最终，在原始NanoQuil F70产物中测量的胆固醇/QuilA皂苷初始比率是3％，而在5ml至8mL的组合的SEC级分中，发现初始比率是13％。

将1mL体积的4.2mg/mL QuilA的NanoQuil F70负载至Sephacryl S300-HR柱上并且收集1mL级分以用于HPLC定量分析。显示了包含可测量的量的QuilA(4mL至13mL)的SEC级分。NanoQuil F70和QuilA显示为参考。

测量每个SEC级分的溶血活性并且与1mg/mL的QuilA皂苷参考以及1mg/mL QuilA的NanoQuil F70原始产物进行比较。不同样品的溶血活性表示为在540nm的吸光度值，该值与释放至细胞外介质中的血红蛋白的量直接相关。图8清楚地显示，仅针对SEC级分9至11mL观察到溶血活性，其中基本上发现游离的QuilA胶束。在级分5至8mL中未记录到溶血活性，其中洗脱经纯化的NanoQuil(关于参考，参见图7)。这证实在SEC级分中洗脱的物质的身份，因为已知游离的QuilA皂苷胶束具有显著溶血活性，例如图8中1mg/mL的QuilA参考。结果还显示级分6mL中的包含约12％胆固醇/QuilA(w/w)的经纯化的NanoQuil F70使用根据本公开内容的方案未显示显著溶血活性(图8)，因此证明胆固醇直接掺入至QuilA皂苷胶束中，并且此导致NanoQuil F70，还导致对QuilA皂苷的溶血效应的强力抑制。

结论

证明使用Sephacryl S300-HR珠粒进行尺寸排阻色谱可成功地从残留游离QuilA皂苷胶束分离NanoQuil F70颗粒。通过RP-HPLC和UV-吸光度检测对SEC级分进行定量分析，可测定胆固醇/QuilA皂苷比率，并且证实每个级分中材料的身份(NanoQuil F70或游离QuilA皂苷)。包含游离QuilA皂苷的级分显示显著的溶血效应，而包含经纯化的NanoQuilF70的级分不显示任何溶血效应。最后，显示与包含类似量的游离QuilA相比，甚至包含约50％QuilA皂苷作为游离残留皂苷胶束的原始NanoQuil F70样品仅呈现有限溶血活性。这证实使用本发明中的方案直接用胆固醇配制QuilA皂苷的有效性，以便显著降低QuilA皂苷的固有细胞膜溶解活性。

实施例4-NanoQuil F70的佐剂效应

此研究的目的是比较NanoQuil F-70颗粒与描述于WO2013051994和WO2014163558中的G3颗粒的疫苗佐剂效应。

研究概述：

·抗原：抗原x，10ug/免疫接种

·佐剂：G3-VAX(Adjuvaq-Vl00，#150609)或NanoQuil(#70，180326)，5ug/免疫接种

·动物：雌性BALB/c小鼠，8只/组

·免疫接种：总共3次s.c免疫接种，每第4周一次

·样品：上一次免疫接种后2周收集血清

·分析：ELISA(山羊抗小鼠IgG/血清/TWIN-抗原/ST-HRP/TM)

结果图示于图11中。

结论

·在G3-VAX与NanoQuil之间没有发现显著差异。

·然而，NanoQuilF-70似乎比G3产生略更有效的ab反应和更少的变异。

实施例5-NanoQuil F70对U937-1癌细胞的凋亡效应

实验目的

此实验目的是探讨NanoQuil F70对癌细胞系U937-1的凋亡效应。U937细胞是最初从男性患者的组织细胞淋巴瘤分离的模型细胞系并且被表征为人类急性髓性白血病(AML)细胞系。

设备

·无菌层流罩，Biowizard Golden Line Ergosilence,Kojair

·涡旋，IKA MS3 basic

·培养箱，Forma Steri-Cycle CO2培养箱，TermoFisher Scientific

·冰箱

·离心机；Allergra X-22R，Beckman Coulter

·显微镜

·Bürker室

·分光光度计(Labsystems Multiskan RC，型号351)

材料

·如通过上文所述的方法获得的NanoQuil F70颗粒

·U937-1细胞由Kenneth Nilsson教授(Rudbeck laboratory,UppsalaUniversity,Uppsala,Sweden)友情提供。

·RPMI 1640(产品代码：992605；批次(batch)16-8082；SVA，Uppsala)，其包含最终浓度为10％的胎牛血清(Sigma Aldrich)、PeSt(60μg/ml青霉素；50μg/ml链霉素(目录号992450，SVA，Uppsala)和2mM L-谷氨酰胺(目录号992005，SVA，Uppsala)

·细胞培养板，96孔。产品代码：83.3924.500，批次(Lot)：4025001，SARSTEDT

·磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH5.9-6.0，来自Uppsala University Hospital基层部门(substrate department)。

·

细胞存活率试剂10X，即用型溶液

·蒸馏H₂O

·细胞培养瓶，

细胞培养瓶，表面积75cm²，目录号CLS430641-100EA，Sigma Aldrich

·FINNTIP 300μl(VWR，613-2614)

·移液器吸头1000μl FINNTIP，目录号613-4485，VWR

·96孔V形底部的板(Nunc，Denmark)

·台盼蓝(Trypan Blue)，目录号T8154，批次RNBD3142，Sigma

·试剂储槽100ml，目录号89094-656，批次：96817，VWR

安全指示

皂苷可引起一些人的眼睛和呼吸道刺激以及皮肤接触的发炎。

·戴手套以避免皮肤与皂苷等接触

·在通风橱中操作以避免吸入氯仿

实验设置

在PBS pH7.4中制备浓度从1000μg/ml降至0.32μg/ml(1:5稀释)的NanoQuil F70颗粒的连续稀释液。细胞上的最终浓度是细胞上的100μg/ml至0.032μg/ml。使用PBS以用于空白细胞对照。

方法

存活率测试

·将培养基中的U937-1细胞倒入至falcon管中

·以200g离心细胞5至10分钟

·倒出细胞培养基

·将细胞再悬浮在预热的新培养基中

·通过台盼蓝染色计数细胞并且确定存活率(存活率应是≥90％)

·将细胞浓度调整至0.11×10⁶个细胞/mL

·将细胞以约20000个细胞/孔的细胞密度接种于96孔微量滴定板中(180μl)

·添加NanoQuil F70制剂至孔(20μl)(在未处理的对照细胞中使用PBS)

·在孵育时间期间，在37℃，将板置于包含5％CO₂的潮温气氛中

·66小时后，添加20μl Alamar blue并且通过分光光度法在570和620nm每小时测量荧光(或吸光度)信号6小时(总共72小时)。

结果

如WO2013051994和WO2014163558中所述，先前已显示配制成纳米颗粒的皂树皂苷的QS-21级分诱导几种癌细胞系的凋亡。通过Alamar blue测定测量的本文所测试的NanoQuil F70颗粒对单核细胞系U937-1的凋亡效应显示孵育3天后0.15mg/ml至0.25mg/ml的EC50。

Claims

1.纳米颗粒，其包含胆固醇和三萜皂苷，例如来自莫利纳皂树(Quillaja saponariaMolina)的组分，例如Quil

或自其分离的选自级分QS-7、QS-8、QS-17、QS-18和QS-21的组分，其中皂树皂苷与胆固醇之间的比率是10:1至20:1，并且其中所述纳米颗粒是线状(丝状)的。

2.权利要求1的纳米颗粒，其中所述线状纳米颗粒具有4至8nm的细丝直径或厚度。

3.权利要求1或2的纳米颗粒，其包括两种形式：

·形式A，其包含半径10至15nm的封闭式、基本上圆形的纳米颗粒，和

·形式B，其包含长度是35至45nm的开放式、蠕虫状纳米颗粒。

4.权利要求3的纳米颗粒，其中所述混合物中形式A与形式B的比率是20:80至45:55，例如30:70至40:60，例如约35:65。

5.权利要求1-4中任一项的纳米颗粒，其中皂树皂苷与胆固醇之间的比率是12:1至18:1，例如14:1至17:1，优选16:1。

6.前述权利要求中任一项的纳米颗粒，其进一步包含至少一种两亲性或疏水性分子，所述分子选自抗原、佐剂、靶向分子、药物化合物和食品相关化合物。

7.一种药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项的一种或多种纳米颗粒，任选地进一步包含药学上可接受的缓冲剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或载剂。

8.权利要求7的药物组合物，其进一步包含至少一种药物活性化合物，例如抗癌药物、铂配位化合物、紫杉烷化合物、喜树碱化合物、抗肿瘤长春花生物碱、抗肿瘤核苷衍生物、氮芥或亚硝基脲烷基化剂、抗肿瘤蒽环霉素衍生物、曲妥珠单抗和抗肿瘤鬼臼毒素衍生物、抗代谢物、类固醇、雷帕霉素的哺乳动物靶标的抑制剂(mTOR)、用于治疗癌症的药剂，例如选自阿糖胞苷、道诺霉素(Daunorubicin)、紫杉醇、多烯紫杉醇、卡巴他赛、Toricsel和Trabectidin的药剂，所述活性化合物可被整合至纳米颗粒中或与组合物混合。

9.权利要求1-6中任一项的纳米颗粒或权利要求7和8中任一项的组合物，其任选地被配制成药物组合物，所述药物组合物进一步包含用于治疗癌症例如白血病的药学上可接受的缓冲剂、稀释剂、赋形剂、佐剂和/或载剂。

10.一种用于生产权利要求1至6中任一项的纳米颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：

a.通过从胆固醇在选自一种或多种C₁-C₆醇、C₂-C₆酮、C₁-C₃羧酸的C₁-C₆烷基酯和线性或环状C₄-C₈醚的有机溶剂中的非水溶液移除溶剂，在反应容器的内表面和/或在位于所述反应容器中的水不溶性、多孔制品的表面上制备胆固醇层，

b.添加水性反应介质，所述介质可以是一种或多种盐的溶液、缓冲溶液或无盐蒸馏水，优选预热至70℃±5℃，

c.添加三萜皂苷例如来自莫利纳皂树的组分，例如Quil

或自其分离的选自级分QS-7、QS-8、QS-17、QS-18和QS-21的组分的溶液至1mg/ml至10mg/mL的最终浓度，以产生最终比率为10:1至20:1、优选16:1(w/w)的皂苷:胆固醇，

d.在70℃±5℃加热所述反应混合物约一小时，

e.使所述反应混合物冷却至4℃±2℃过夜，分离所形成的颗粒并且例如通过尺寸排阻色谱(SEC)移除过量的皂苷。

11.权利要求10的方法，其中所述有机溶剂是乙醇和/或丙酮。

12.权利要求10或11中任一项的方法，其中所述有机溶剂通过蒸发移除。

13.权利要求10-12中任一项的方法，其中所述水性反应介质是乙酸盐缓冲液。

14.权利要求10-12中任一项的方法，其中所述水性反应介质是PBS缓冲液。

15.权利要求10-14中任一项的方法，其中移除过量皂苷是在合适凝胶过滤介质例如Sephacryl S300-HR上通过尺寸排阻色谱(SEC)进行的。